CN111467580B - 一种用于治疗牙周疾病的温敏组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于治疗牙周疾病的温敏组合物，其包含：水性介质；羧甲基纤维素钠；治疗有效量的聚赖氨酸改性的透明质酸或其药学上可接受的盐；以及，温敏材料羟丙基甲壳素，在所述羟丙基甲壳素中，羟丙基对甲壳素的取代度为1.0至1.5，并且，其中，所述温敏组合物中羧甲基纤维素钠的量为足以使得所述温敏组合物在室温下具有10Pa·s至40Pa·s的粘度。本发明的温敏组合物在施用于口腔内部之前呈粘性溶液状态，当施用于口腔内部时可快速形成凝胶状态，并且能够很好地粘附在施用位点，从而延长了凝胶中活性成分聚赖氨酸改性的透明质酸对患处的作用时间，进而提高治疗效果；同时，本发明的温敏组合物中的活性成分聚赖氨酸改性的透明质酸在保留了透明质酸的生理活性的同时具有抗菌特性。

Description

一种用于治疗牙周疾病的温敏组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用生物材料领域，具体而言，其涉及一种用于治疗牙周疾病的温敏组合物及其制备方法。

背景技术

口腔健康是全身健康不可或缺的一部分，2017年原国家卫计委发布的《第四次全国口腔流行病学调查》结果显示，我国成年人的牙周健康率仅为9.1％，牙周疾病是常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。牙周疾病是指发生在牙齿支持组织(包括牙龈、牙周膜、齿槽骨和牙骨质)的慢性、非特异性、感染性的疾病。根据疾病侵犯的部位分为两大类牙龈炎和牙周炎。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是糖胺聚糖中的一种，属于酸性黏多糖，广泛分布于人体各部位，具有抗炎、抗水肿、促进组织重建和创伤愈合等作用。HA作为单独或辅助用药对牙周病的非手术治疗及手术治疗均具有良好的临床效果。但天然的HA半衰期短，易降解，同时机械性能较差，流动性强不易粘附，这在一定程度上限制了HA的临床应用。因此，越来越多的研究关注于透明质酸衍生物的开发，从而不断扩大其在生物医学领域的应用。

用于牙周疾病治疗的药物制剂在给药时通常需要较好的流动性以利于有效成分深入如龈沟、牙周袋等较狭小的部位。然而，口腔环境湿润，在唾液的冲洗作用下，流动性强的制剂在给药后很难在有效时间内保留，因此，制剂的粘附性对给药后药物有效成分在口腔内的作用时间具有重要影响。温敏型凝胶制剂的设计思路是：可以使产品以溶液状态给药至使用部位，因使用部位温度改变从而发生相变，从溶液状态变化至凝胶状态，这一特点符合牙周疾病治疗用制剂设计的要求。目前常用的温敏性材料如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)和羟丙基甲基纤维素等，当温度上升时，这些温敏性材料分子中的亲水基团与水分子之间的氢键减弱，导致亲水性下降，凝胶变得疏水而逐渐发生收缩，虽然凝胶强度变大，但其粘度却随之降低，甚至消失，因此，此类温敏性凝胶的组织粘附效果较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于治疗牙周疾病的、在温度从室温到33℃至38℃转变的条件下能够发生可逆相变并且具有良好组织粘附性能的温敏组合物。

本发明的目的通过以下技术措施来实现：本发明的用于治疗牙周疾病的温敏组合物包含：

·水性介质；

·羧甲基纤维素钠；

·治疗有效量的聚赖氨酸改性的透明质酸或其药学上可接受的盐；以及

·温敏材料，其是羟丙基甲壳素，在所述羟丙基甲壳素中，羟丙基对甲壳素的取代度为1.0至1.5，其中，所述温敏组合物中羧甲基纤维素钠用于调节温敏组合物在室温下的粘度，其在温敏组合物中的用量为足以使得所述温敏组合物在室温下具有10Pa·s至40Pa·s的粘度。

在本发明的一种实施方式中，在所述羟丙基甲壳素中，羟丙基对甲壳素的取代度为1.0至1.4，或1.1至1.4，或1.15至1.4，或1.2至1.4，或1.25至1.4，或1.3至1.4，或1.0至1.35，或1.15至1.35，或1.2至1.35，或1.25至1.35。

本发明的温敏组合物在室温下呈粘度值为10Pa·s至40Pa·s的溶液状态，在33℃至38℃下呈粘度值为300Pa·s至600Pa·s的凝胶状态。所述温敏组合物在从溶液状态到凝胶状态的相变是可逆的。所述凝胶状态具有良好的粘附性和疏水性，适于粘附于人体口腔粘膜。

在本发明的一种实施方式中，所述羟丙基甲壳素的质量百分含量为0.1％至10％，或0.5％至5％。

在本发明的一种实施方式中，所述羧甲基纤维素钠的质量百分含量为0.1至10％，或0.1至3％；并且，所述羧甲基纤维素钠的取代度可以为0.6至1.2，或0.7至0.9。

在本发明的一种实施方式中，所述水性介质是水。

在本发明的一种实施方式中，所述聚赖氨酸改性的透明质酸通过如下步骤制备：

(1)提供透明质酸的水溶液并且活化该透明质酸中的羧基；

(2)提供聚赖氨酸的水溶液并与步骤(1)中羧基活化后的透明质酸水溶液混合进行反应，从而得到聚赖氨酸改性的透明质酸，

其中，透明质酸与聚赖氨酸的质量比为3:1至10:1，所述透明质酸的平均分子量为800,000～4,000,000或1,000,000～2,000,000；所述聚赖氨酸为ε-聚赖氨酸，其分子量为3600-4300。

其中，所述活化透明质酸的羧基包括向所述透明质酸的水溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑并在酸性条件下进行反应；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的质量比或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑的质量比为1:0.5至3:1，或1:1至2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述羟丙基甲壳素通过如下步骤制备：

(a)提供甲壳素的碱性水溶液并向其中加入1,2-环氧丙烷进行反应，

(b)加入盐酸溶液终止步骤(a)的反应，得到羟丙基甲壳素，

其中，所述甲壳素与所述1,2-环氧丙烷的质量比为1:10至1:30。

在本发明的一种示例性实施方式中，用于治疗牙周疾病的温敏组合物包含：水，聚赖氨酸改性的透明质酸，羟丙基甲壳素和羧甲基纤维素钠；其中，在该羟丙基甲壳素中，羟丙基对甲壳素的取代度为1.25至1.35，聚赖氨酸改性的透明质酸的质量百分含量为0.1％至5％，羟丙基甲壳素的质量百分含量为0.5％至5％，羧甲基纤维素钠的质量百分含量为0.1％至10％，并且余量为水。

本领域技术人员还可根据需要向本发明的温敏组合物中添加其他药物制剂领域常用的辅剂，所述辅剂包括但不限于：增稠剂、矫味剂、着色剂、pH调节剂、成膜促进剂，等等，本领域技术人员可根据药物制剂领域常识来调节这些辅剂的用量。

用于制备本发明的温敏组合物的方法包括：

(1)提供羟丙基甲壳素并将其在水性介质中分散，得到羟丙基甲壳素的水性溶液；

(2)向步骤(1)得到的羟丙基甲壳素的水性溶液中加入羧甲基纤维素钠，得到混合溶液；

(3)提供聚赖氨酸改性的透明质酸的水性分散液并将其加至步骤(2)得到的混合溶液中进行搅拌，得到所述温敏组合物。

上述温敏组合物制剂还可进一步进行减压脱泡处理和灭菌处理，以包装待用。所述减压脱泡在例如压力为10×10^-5至4×10^-5Pa的条件下脱泡10至20分钟进行。

由于本发明的用于治疗牙周疾病的温敏组合物包含水性介质、羧甲基纤维素钠、治疗有效量的聚赖氨酸改性的透明质酸以及温敏材料剂羟丙基甲壳素，该温敏组合物在室温下呈粘度值为10Pa·s至40Pa·s的溶液状态，当施用于口腔内部时，在33～38℃的接近体温条件下可快速形成凝胶状态，粘度值为300Pa·s至600Pa·s，并且能够很好地粘附在施用位点，从而延长了凝胶中活性成分聚赖氨酸改性的透明质酸对患处的作用时间，进而提高治疗效果；同时，本发明的温敏组合物中的活性成分聚赖氨酸改性的透明质酸在保留了透明质酸的生理活性的同时具有抗菌特性，从而减少化学抗菌药物的使用，这进一步提高了本发明的温敏组合物的生物安全性并且聚赖氨酸对透明质酸的改性也提高了透明质酸抗降解能力，进一步延长了活性成分对患处的作用时间，改善温敏组合物患处愈合的促进作用。

附图说明

图1显示了本发明的用于治疗牙周疾病的温敏组合物在15℃至35℃至15℃的温度变化环境中从粘性溶液状态至凝胶状态的可逆相变过程。

图2显示了本发明的用于治疗牙周疾病的温敏组合物在35℃水中的重量随时间的变化情况。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明涉及的各个方面进行详细说明，这些具体实施例仅用于举例说明本发明，并不对本发明的保护范围和实质内容构成限定。

实施例1：聚赖氨酸改性的透明质酸的制备

将379mg分子量为1500000的透明质酸溶解在80ml去离子水中，将395.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、230.1mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)缓慢加入到透明质酸的水溶液中，均匀搅拌30min，再向该混合溶液中加入128mg分子量为3600-4300的ε-聚赖氨酸(预溶于20mL去离子水中)，反应过程维持pH在4-5之间反应3小时后，室温下继续反应12h。反应后，将溶液在pH＝5的去离子水中透析纯化96h。将透析完成的产物置于-80℃下预冻12h，然后放在真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥持续72h，直至水分被完全抽干，得到聚赖氨酸改性的透明质酸，备用。

本领域已知的其他用于制备聚赖氨酸改性的透明质酸的方法也可用于本发明中。

实施例2：羟丙基甲壳素的制备

将6g甲壳素粉末于低温下均匀分散于74g 40％NaOH水溶液中，室温下搅拌过夜，加入220g冰块室温下搅拌至溶液澄清透明，最终得到2wt％甲壳素溶液待用。

称取100g 2wt％甲壳素溶液，低温下向甲壳素溶液中加入24g 1,2-环氧丙烷，低温下搅拌12小时，升温至25℃搅拌10h后加入盐酸溶液调pH至中性终止反应，反应产物透析72h后，经冷冻干燥得白色粉末状羟丙基甲壳素(该羟丙基甲壳素中羟丙基的取代度为1.25)备用。

本领域已知的其他用于制备羟丙基甲壳素的方法也可用于本发明中。

实施例3：用于治疗牙周疾病的温敏组合物制剂的配制

本实施例的温敏组合物采用如下方法配制：

(1)将实施例2制备得到的羟丙基甲壳素分散在水中，得到羟丙基甲壳素的水性溶液；

(2)向步骤(1)得到的羟丙基甲壳素的水性溶液中加入羧甲基纤维素钠，得到混合溶液；

(3)将实施例1制备得到的聚赖氨酸改性的透明质酸配制成水性分散液并将其加至步骤(2)得到的混合溶液中进行搅拌，得到温敏组合物。

通过上述方法采用不同配方分别得到温敏组合物A和B。

温敏组合物A包括：质量百分含量为0.2％的实施例1制备得到的聚赖氨酸改性的透明质酸，质量百分含量为1.5％的实施例2制备得到的羟丙基甲壳素，质量百分含量为0.5％的羧甲基纤维素钠，余量为水。

温敏组合物B包括：质量百分含量为0.25％的实施例1制备得到的聚赖氨酸改性的透明质酸，质量百分含量为1.0％的实施例2制备得到的羟丙基甲壳素，质量百分含量为1.0％的羧甲基纤维素钠，余量为水。

采用GB/T 10247-2008《粘度测量方法》中的旋转法进行测试，测定了温敏组合物A和B在室温25℃下的粘度分别为20.2Pa·s和31.0Pa·s。

实施例4：温敏组合物的温度敏感性实验

以温敏组合物A为例，取温敏组合物A大约10至15毫升放置于干净的小瓶中，通过肉眼直接观察小瓶中的温敏组合物在15℃至35℃至15℃的温度变化环境中的状态改变。

如图1所示，组合物A在15℃呈粘性溶液状，流动性好；当温度升高至35℃时呈凝胶状，样品倒置时凝胶能吸附在瓶底不落；当温度再次恢复至15℃时，凝胶恢复至粘性溶液状。上述实验结果表明本发明温敏组合物具有温度敏感性，温度较低时流动性较好适合给药，当温度接近体温时呈凝胶状且粘附性良好，同时本发明的温敏组合物在温度恢复到室温条件下之后还能够恢复到溶液状。

实施例5：温敏组合物的粘附性测试

实验组：温敏组合物A

对照组：去除温敏组合物A配方中的羟丙基甲壳素后所配制的组合物C

取实验组与对照组各1g，按1cm×1cm大小均匀涂布于载玻片上，称取初始重量，将载玻片置于恒温35℃烘箱中30s后，转至装有200mL水的烧杯中，烧杯已提前置于35℃恒温水浴锅中预热，保持水浴锅温度不变，每隔20min取出载玻片，沥干水分，称取重量。凝胶重量随时间的变化如图2所示。

从图2可以看出，含羟丙基甲壳素的组合物A在35℃水中保留时间是对照组组合物C的两倍，由此可知本发明的温敏组合物在接近体温的湿润环境下粘附性更好，保留时间更长。

实施例6：温敏组合物的细胞毒性实验

参照GB/T 16886.12-2017中第十章的规定，采用含血清的MEM培养基为浸提介质。首先准确称取温敏组合物A和B各1mL置于洁净的具塞玻璃容器中；然后量取组合物5倍体积的含血清培养基，加入至盛放组合物的洁净具塞玻璃容器中37±1℃浸提24±2h。取试验液按GB/T 16886.5–2017规定的浸提液体外细胞毒试验方法进行，结果按GB/T 14233.2-2005规定评级。

表4、本发明的温敏组合物的体外细胞毒性测试

组合物	100％浸提液浓度的相对增值率(％)	细胞毒性评级
			组合物A	105.8	0
组合物B	103.9	0

由表4可知，本发明的用于治疗牙周疾病的温敏组合物的细胞毒性评级均不超过1级，符合生物安全性要求。

实施例7：温敏组合物的抗菌性测试

实验组：温敏组合物A和温敏组合物B

对照组：用未改性透明质酸替换聚赖氨酸改性的透明质酸得到的组合物D

实验菌种：金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，大肠杆菌(ATCC25922)

实验方法：称取5g牛肉膏，10g蛋白胨，10g氯化钠溶解于1000mL的ddH2O，充分搅拌至完全溶解，调节pH值至7.2～7.4，高压灭菌后得液体培养基。将15g琼脂粉溶于1000mL，高压灭菌后降温至70℃左右，注入到直径为90mm的无菌玻璃培养皿内，制成4mm厚平板，置于4℃冰箱中作为固体培养基待用。将菌种接种到液体培养基中37℃培养18h，取1mL细菌液体培养液于无菌试管内，用PBS稀释至5×105–5×106CFU/mL，得细菌悬浮液。取100μL悬菌液均匀涂布于固体培养基，放置约30min使其凝固。用打孔器在平板上打出3个孔，分布均匀，距边1.5cm，用灭菌牙签将琼脂块挑出，火焰封底。每个孔注入0.5mL待测样品，于37℃进行培养24h。测得抑菌圈结果如表5所示：

表5.温敏组合物的抑菌性测试

从上表5的抑菌性测试结果可以看出，本发明的温敏组合物A与B具有优良的抗菌性；组合物A与组合物D结果对比可知，含有聚赖氨酸改性的透明质酸的组合物A的抗菌性远远优于含未改性的透明质酸的组合物D；对比组合物A与组合物B的结果可知，聚赖氨酸改性的透明质酸的含量越高抑菌性越好。由此可见，本发明的包含聚赖氨酸改性的透明质酸的温敏组合物具有明显的抗菌特性。

实施例8：温敏组合物的小鼠创伤愈合试验

实验组：温敏组合物A和温敏组合物B

对照组：用未改性透明质酸替换聚赖氨酸改性的透明质酸制备得到的组合物D

空白对照：生理盐水E

试验方法：术前两天在大鼠背部脊柱两侧用80g/L硫化钠脱毛备皮。术前腹腔注射20g/L戊巴比妥钠40mg/kg麻醉大鼠，取俯卧位暴露大鼠背部，术区常规用碘附消毒后，在距脊柱正中两侧旁开1cm处用使用直径为1cm的角膜环钻做全层皮肤缺损创面，左右各1个，止血并用生理盐水冲洗伤口，消毒后备用。分别在在大鼠创口注射100μL组合物A、组合物B和组合物D及生理盐水，组合物A和组合物B于创口部位凝固为凝胶状态。连续观察15天，3天测量一次创口长径和短径，并计算创口面积。

表6.大鼠创口面积

由表6结果可知，相比于空白对照生理盐水组E，组合物A、B、D都具有促进大鼠伤口愈合的作用，其中，本发明的含有聚赖氨酸改性的透明质酸的温敏组合物A和B促愈合能力优于含未改性的透明质酸的组合物D，且聚赖氨酸改性的透明质酸含量高的温敏组合物B促愈合能力优于温敏组合物A。由此可见，本发明的含有聚赖氨酸改性的透明质酸的温敏组合物具有促进伤口愈合的效果。

以上结合具体实施例对本发明进行了具体说明，这些具体实施例仅仅是示例性的，不能以此限定本发明的保护范围，本领域技术人员在不背离本发明的实质和范围的前提下可对本发明进行各种修改、变化或替换。因此，依照本发明所作的各种等同变化仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (12)

1.一种用于治疗牙周疾病的温敏组合物，其包含：

水性介质；

羧甲基纤维素钠；

治疗有效量的聚赖氨酸改性的透明质酸或其药学上可接受的盐；以及

温敏材料，其是羟丙基甲壳素，在所述羟丙基甲壳素中，羟丙基对甲壳素的取代度为1.0至1.5；

其中，

所述羧甲基纤维素钠的质量百分含量为0.1至10％，

所述羟丙基甲壳素的质量百分含量为0.1％至10％，

所述温敏组合物在室温下呈粘度值为10Pa·s至40Pa·s的溶液状态，在33℃至38℃下呈凝胶状态，并且，所述温敏组合物在从溶液状态到凝胶状态的相变是可逆的。

2.如权利要求1所述的温敏组合物，其中，在所述羟丙基甲壳素中，羟丙基对甲壳素的取代度为1.25至1.35。

3.如权利要求1所述的温敏组合物，其中，所述温敏组合物在33℃至38℃下呈粘度值为300Pa·s至600Pa·s的凝胶状态。

4.如权利要求1所述的温敏组合物，其中，所述凝胶状态为适于粘附于人体口腔粘膜。

5.如权利要求1所述的温敏组合物，其中，所述羧甲基纤维素钠的质量百分含量为0.1至3％。

6.如权利要求1所述的温敏组合物，其中，所述羟丙基甲壳素的质量百分含量为0.5％至5％。

7.如权利要求1所述的温敏组合物，其中，所述聚赖氨酸改性的透明质酸通过如下步骤制备：

(1)提供透明质酸的水溶液并且活化该透明质酸中的羧基；

(2)提供聚赖氨酸的水溶液并与步骤(1)中羧基活化后的透明质酸水溶液混合进行反应，从而得到聚赖氨酸改性的透明质酸，

其中，透明质酸与聚赖氨酸的质量比为3:1至10:1。

8.如权利要求7所述的温敏组合物，其中，所述透明质酸的平均分子量为800,000～4,000,000。

9.如权利要求7所述的温敏组合物，其中，所述透明质酸的平均分子量为1,000,000～2,000,000。

10.如权利要求7所述的温敏组合物，其中，所述聚赖氨酸为ε-聚赖氨酸，其分子量为3600-4300。

11.如权利要求1或2所述的温敏组合物，其中，所述羟丙基甲壳素通过如下步骤制备：

(a)提供甲壳素的碱性水溶液并向其中加入1,2-环氧丙烷进行反应，

(b)加入盐酸溶液终止步骤(a)的反应，得到羟丙基甲壳素，

其中，所述甲壳素与所述1,2-环氧丙烷的质量比为1:10至1:30。

12.制备权利要求1至11中任一项所述的温敏组合物的方法，其包括：

(1)提供羟丙基甲壳素并将其在水性介质中分散，得到羟丙基甲壳素的水性溶液；

(2)向步骤(1)得到的羟丙基甲壳素的水性溶液中加入羧甲基纤维素钠，得到混合溶液；

(3)提供聚赖氨酸改性的透明质酸的水性分散液并将其加至步骤(2)得到的混合溶液中进行搅拌，得到所述温敏组合物。

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