CN102947449A - 同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的方法 - Google Patents

同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供可以通过简便的操作有效地同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的方法。本发明提供一种方法，其特征在于，调制含有离液盐和抗酸菌的混合液，接着，使用内部熔接有细孔径10～100μm的细孔结构连续体的吸头重复进行前述混合液的抽吸及排出，由此同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离。抽吸及排出的重复次数优选为3次以上。

Description

同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的方法
技术领域
本发明涉及通过简便的操作同时进行以结核杆菌为代表的抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的方法。
背景技术
结核是在日本有复燃苗头的细菌性疾病，其诊断方法的改良极其重要。作为结核的诊断方法，近年来，进行了可以在短时间内得到高精度结果的基因检查以替代需要数周时间的培养检查。
结核的基因检查如下进行：通过使用结核杆菌基因特异性引物进行的聚合酶链反应(PCR、polymerase chain reaction)，来鉴定喀痰试样中的结核杆菌的存在。为了进行基因检查，作为前处理，需要将试样中的作为检查对象的菌细胞溶菌(破坏)、接着分离其核酸。
然而，以结核杆菌为代表的抗酸菌由于具有含有霉菌酸的脂质层的坚固的细胞壁，与大肠杆菌等通常的细菌相比难以溶菌。
作为抗酸菌的通常的溶菌方法，可以举出使用超声波物理性地破坏菌细胞的方法(参照专利文献1)，使用苯酚作为溶菌剂破坏菌细胞的方法，加热至60～100℃来将抗酸菌溶菌的方法(参照专利文献2)。
这些以往公知的抗酸菌的溶菌方法，具有费用高、操作烦杂、缺乏安全性或溶菌效率低的问题，均无法令人满意。另外，这些方法需要在抗酸菌的溶菌后另外进行抗酸菌的核酸的分离操作，因此存在操作整体烦杂的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2007/094506
专利文献2：日本特开平6-319527
发明内容
发明要解决的问题
本发明是鉴于上述现有技术的现状而提出的，其目的在于，提供可以通过简便的操作有效地同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的方法。
用于解决问题的方案
本发明人为了达成上述目的进行了深入研究，结果发现，首先，使抗酸菌与离液盐接触、使菌的细胞壁变得柔软后，使其反复通过具有特定细孔径的细孔结构连续体内，由此可以有效地破坏细胞壁、同时进行抗酸菌的溶菌和核酸的分离，至此完成了本发明。
本发明具有以下的(1)～(6)的技术方案。
(1)一种方法，其特征在于，调制含有离液盐和抗酸菌的混合液，接着，使用内部熔接有细孔径10～100μm的细孔结构连续体的吸头（tip）重复进行所述混合液的抽吸及排出，由此同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离。
(2)根据(1)所述的方法，其特征在于，混合液中的离液盐的浓度为2～6M。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其特征在于，混合液的pH为4.5～6.5。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，使混合液的温度为35～80℃来重复进行混合液的抽吸及排出。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，抽吸及排出的重复次数为3次以上。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其特征在于，混合液还含有0.1～1.0M浓度的乙酸盐。
(7)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其特征在于，混合液还含有0.05～0.5M浓度的Good’s缓冲液，该缓冲液具有pH4.5～6.5的缓冲pH范围。
发明的效果
本发明的方法，由于使细胞壁已经因为离液盐而变得柔软的抗酸菌反复通过内部熔接有具有特定细孔径的细孔结构连续体的吸头内，因此可以简单有效地同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离。
附图说明
图1为本发明的方法中使用的吸头的结构的一例的简图。
具体实施方式
以下，对本发明的方法进行详细说明。
本发明的方法的特征在于，使用内部熔接有具有特定细孔径的细孔结构连续体的吸头重复进行含有离液盐和抗酸菌的混合液的抽吸及排出，由此同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离。
作为成为本发明方法的溶菌对象的抗酸菌，可以举出例如鸟型结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellularae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、人型结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、牛型结核分枝杆菌(M.bovis)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、草分枝杆菌(M.phlei)、海分枝杆菌(M.marinum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、转黄分枝杆菌(M.flavescens)、土地分枝杆菌(M.terrae)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、海鱼分枝杆菌(M.malmoense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、通俗分枝杆菌(M.triviale)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、M.thermoresistable及包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)。
本发明的方法中使用的离液盐为具有使蛋白质等分子结构不稳定化的性质的化学物质，是在生物化学领域中抽提核酸时作为溶解细胞的溶菌剂而使用的物质。作为离液盐，可以使用以往公知的物质，例如可以为胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾、尿素、溴化钠、溴化钾、溴化钙、溴化铵、高氯酸钠、硫氰酸钠、硫氰酸钾、异硫氰酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化铵。其中，从细胞溶解性和核酸回收效率方面考虑，优选为胍盐。作为胍盐，可以举出盐酸胍、胍硫氰酸盐(硫氰酸胍)、胍硫酸盐、异硫氰酸胍，其中，从溶菌效率方面考虑，优选为盐酸胍或胍硫氰酸盐。这些盐可以单独使用或组合多种而使用。
抗酸菌和离液盐以含有两者的混合液的状态使用，通过使离液盐和抗酸菌溶解于水、缓冲液等适当的溶剂中，可以容易地调制成混合液。例如通过使离液盐和缓冲剂溶解于去离子水中，向其中添加将抗酸菌调制成一定浓度的菌液，从而可以调制混合液。
混合液中的离液盐的浓度优选为2～6M(mol/L)，更优选为3～5M(mol/L)。混合液中的离液盐的浓度小于上述下限时，抗酸菌细胞壁的溶解效率有可能降低，另外，超过上述上限时，离液盐有可能析出。
混合液的pH优选为4.5～6.5，更优选为5.0～6.0。混合液的pH小于上述下限或者超过上述上限时，核酸的分离效率有可能降低。
为了将混合液的pH维持在上述范围内，优选向溶液中添加适当的缓冲剂。作为这种缓冲剂的一例，可以举出乙酸盐。乙酸盐中，乙酸钾、乙酸钠等一价金属的乙酸盐是特别有效的。从缓冲效果方面考虑，优选这些乙酸盐在混合液中的浓度为0.1～1.0M(mol/L)。另外，作为这种缓冲剂的其它例子，可以举出MES(2-吗啉代乙磺酸)、ACES(N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸))等在酸性侧具有缓冲能力的Good’s缓冲液。从缓冲效果方面考虑，优选这些Good’s缓冲液在混合液中的浓度为0.05～0.5M(mol/L)。
在本发明的方法中，虽然可以直接在常温下使用含有离液盐和抗酸菌的混合液，但优选加热至特定的温度来使用。加热温度为35～80℃，优选为40～75℃。虽然加热时容易提高离液盐的溶解效果，但加热温度过高时，增加溶液的蒸发，有可能产生离液盐的浓度变化。另外，核酸向细孔结构连续体的吸附能力有可能降低。
对加热方法没有特别限定，可以举出将混合液放入适当的管中，利用加热块、水浴、微波炉、空气浴等公知的加热手段进行加热的方法。抗酸菌可以最初就添加到混合液中，或者将混合液加热至规定的温度后再添加。
本发明的方法的特征在于，通过使用内部熔接有细孔径10～100μm的细孔结构连续体的吸头重复抽吸及排出上述混合液，抗酸菌与细孔结构连续体内的细孔接触，不仅能进行抗酸菌的溶菌、还能同时进行抗酸菌的核酸的分离。
本发明的方法中使用的吸头的结构的一例的简图如图1所示。本发明中使用的吸头1基本上具有以往公知的结构(例如图1所示的细长的倒锥形状的中空体)，但是其特征在于，其内部从前端部开始持续一定长度熔接有细孔结构连续体2。细孔结构连续体具有连续的细孔结构，其细孔径为10～100μm、优选为20～70μm。细孔径在上述范围之外时，不能有效地进行抗酸菌的溶菌和核酸的分离。对细孔结构体的材质没有特别限定，优选为二氧化硅。这样的结构体还被称为“整体二氧化硅”（monolithSilica）或“二氧化硅整体”（Silica monolith）。整体二氧化硅具有三维网络状的骨架与细孔流路形成一体的结构，而且具有合成时可以对微米级的贯通孔及骨架表面的纳米级的细孔进行控制的特性。
细孔结构连续体通常可以通过溶胶-凝胶法制造，例如可以如下制造：将金属醇盐部分水解制作反应性单体，将该单体缩聚制作胶体状低聚物，从而生成溶胶，进而进行水解，促进聚合和交联，制作三维结构，从而生成凝胶。细孔结构体被调整至能容纳在吸头内部的尺寸后，例如使用超声波熔接到吸头内部。
内部熔接有细孔结构连续体的吸头被安装到注射器等中，重复进行含有离液盐和抗酸菌的混合液的抽吸及排出。抽吸及排出的重复次数优选为3次以上。小于3次时，有可能不能充分进行抗酸菌的溶菌和核酸的分离。重复次数没有上限，但最多20次左右即已充分。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不被这些实施例所限定。
实施例1
(1)抗酸菌的准备
作为抗酸菌，使用牛型结核分枝杆菌Mycobacterium bovisBCG株(以下简称为BCG株)。将BCG株在3%小川培养基(日水制药制造)中于35℃下培养2周后，接种到抗酸菌培养用的液体培养基MycoBroth(极东制药工业制造)中，在37℃下进而培养6天。为了得到分散性高的菌液，培养后的液体培养基用孔径5μm的亲水性过滤器过滤后，用浊度计测定OD600，同时根据麦氏比浊法将菌液调整至麦氏比浊管1的浓度。接着，为了去除已经游离在液体培养基中的核酸，将1.0mL该菌液加入到1.5mL的管中，通过离心分离操作仅沉淀菌体，去除上清液，用1.0mL的磷酸缓冲液再次悬浊菌体。
(2)离液盐的溶液的准备
使作为离液盐的硫氰酸胍及作为缓冲剂的乙酸钾溶解在去离子水中，调制含有缓冲剂的离液盐的溶液。
(3)混合液的调制
在(2)中调制的离液盐的溶液500μL中，混合将(1)中准备的麦氏比浊管1的菌液用磷酸缓冲液稀释至1000倍而成的液体。混合液中的硫氰酸胍的浓度为5M，乙酸钾的浓度为0.8M，溶液的pH为5.5。
(4)抗酸菌的溶菌及核酸的分离抽提
接着，使用如图1所述那样的内部熔接有细孔结构连续体的吸头，进行混合液中的抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离抽提。具体地说，将市售的250μL吸头内熔接有细孔结构连续体(整体二氧化硅、细孔径30μm、截面积3.14平方毫米、厚度1mm)的吸头安装到Terumo Corporation制造的1mL注射器上，对混合液以100μL/秒的速度进行抽吸及排出10次，将混合液中的抗酸菌溶菌，使抗酸菌的核酸吸附到吸头中的细孔结构连续体上。完全排出混合液后，将吸头转移到加入有洗涤液500μL的管中，对洗涤液以100μL/秒的速度进行抽吸及排出3次来洗涤。再次重复该洗涤工序。最后将吸头转移到加入有洗脱液100μL的管中，对洗脱液以100μL/秒的速度进行抽吸及排出5次，洗脱吸附到吸头中的细孔结构连续体上的抗酸菌的核酸。为了抑制洗脱效率的降低，在抽吸及排出过程中，小心地使吸头内的细孔结构连续体不与空气接触。而且，作为洗涤液，使用在70%乙醇中含有0.8M乙酸钾的溶液，作为洗脱液，使用10mM氢氧化钾水溶液。
(5)通过实时PCR进行的抗酸菌基因的检出及定量
接着，将(4)中得到的核酸洗脱液作为对象，通过实时PCR进行抗酸菌基因的检出及定量。PCR的试剂组成以及PCR条件如下所示。
试剂组成：
寡核苷酸1                          250nM、
寡核苷酸2                          1500nM、
寡核苷酸3(5’末端被BODIPY-FL标记)  250nM、
×10缓冲液                         1μL、
dNTP                               0.2mM、
MgSO4                              4mM、
KOD plus DNA聚合酶                 0.2U、
洗脱液                             1μL
(用MilliQ水调整总量至10μL)
(寡核苷酸1～寡核苷酸3的序列如序列表的序列号1～3所示)。
PCR条件：
热变性：94℃·2分钟、98℃·0秒，退火：60℃·5秒(荧光检测)，50循环
上述试剂组成为可以特异性地检测B CG株的引物与探针的组合。作为阳性对照，使用将通过苯酚·氯仿法从BCG株抽提的基因组DNA用10mM的Tris缓冲液稀释以在1μL中含有1000个拷贝的溶液。实时PCR是基于扩增产物与探针杂交时标记在探针上的荧光色素的荧光消失来检测样品中的特定的核酸序列的技术。核酸的扩增及检测中使用Roche Diagnostics K.K.制LightCycler(注册商标)。关于测定模式，利用530nm，利用所得到的实时检测数据，算出退火时的QProbe猝灭率。进而，求得达到猝灭率2%时的循环数，与使用SYBR Green I的实时定量PCR法同样地进行分析。以阳性对照为100%时，以相对于阳性对照的百分率表示抗酸菌的核酸的回收效率。而且，抗酸菌的核酸的回收效率若为30%以上则认为良好。结果如表1所示。
实施例2
将(3)中得到的混合液加入到1.5mL的带螺旋盖的管中、在加热块上于65℃下加热5分钟，使用所加热的混合液，在(4)中进行抽吸及排出，除此以外与实施例1同样地进行，示出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例3
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为10μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例4
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为20μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例5
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为40μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例6
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为50μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例7
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为70μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例8
作为离液盐，使用盐酸胍来替代硫氰酸胍，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例9
将抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的工序中的抽吸·排出次数变更为5次，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例10
将抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的工序中的抽吸·排出次数变更为20次，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例11
将加热温度变更为40℃，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例12
将加热温度变更为75℃，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
实施例13
将加热温度变更为95℃，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
比较例1
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为120μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
比较例2
将(4)的细孔结构连续体的细孔径变更为5μm，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
比较例3
使用MilliQ水来替代(2)的离液盐的溶液，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
比较例4
将抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离的工序中的抽吸·排出次数变更为1次，除此以外与实施例2同样地进行，示意出抗酸菌的核酸的回收效率。结果如表1所示。
[表1]
Figure BDA00002609383600121
由表1可知，在使用内部熔接有具有特定细孔径的细孔结构连续体的吸头重复进行抽吸及排出的实施例1～实施例13中，与用本发明的细孔径的范围之外的细孔结构连续体处理后的比较例1及比较例2、未使用离液盐的溶液的比较例3以及未重复进行抽吸及排出的比较例4相比，核酸的回收效率显著高。
产业上的可利用性
本发明的方法可以有效且通过简便的操作低成本、安全地同时进行由于为坚固的细胞壁而难以溶菌的抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离，因此对于结核杆菌的基因检查的前处理等来说非常有用。
序列表自由文本
序列号1为实施例中作为寡核苷酸1记载的所设计的多核苷酸的序列。
序列号2为实施例中作为寡核苷酸2记载的所设计的多核苷酸的序列。
序列号3为实施例中作为寡核苷酸3记载的所设计的多核苷酸的序列。
Figure IDA00002609384000011
Figure IDA00002609384000021

Claims (7)

1.一种方法，其特征在于，调制含有离液盐和抗酸菌的混合液，接着，使用内部熔接有细孔径10～100μm的细孔结构连续体的吸头重复进行所述混合液的抽吸及排出，由此同时进行抗酸菌的溶菌和抗酸菌的核酸的分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，混合液中的离液盐的浓度为2～6M。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，混合液的pH为4.5～6.5。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，使混合液的温度为35～80℃来重复进行混合液的抽吸及排出。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，抽吸及排出的重复次数为3次以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，混合液还含有0.1～1.0M浓度的乙酸盐。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，混合液还含有0.05～0.5M浓度的Good’s缓冲液，该缓冲液具有pH 4.5～6.5的缓冲pH范围。
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