CN102943063A

CN102943063A - 提高骨髓单个核细胞心肌细胞保护及迁移能力的处理方法

Info

Publication number: CN102943063A
Application number: CN2012103639022A
Authority: CN
Inventors: 王建安; 胡新央; 徐银川
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN102943063B

Abstract

本发明提供了一种提高骨髓单个核细胞迁移能力及心肌细胞保护能力的预处理方法，所述方法为：将新鲜分离的骨髓单个核细胞先以Valsartan溶液培养30分钟，再以Angiotensin II溶液培养2小时，得到处理后的骨髓单个核细胞用于移植治疗急性心肌梗死；本发明通过预处理间接激活骨髓单个核细胞血管紧张素2型受体， AT2R激活的骨髓单个核细胞分泌一氧化氮增加，迁移能力及心肌细胞保护能力增强，一定程度上可提高其移植治疗急性心肌梗死的疗效。

Description

提高骨髓单个核细胞心肌细胞保护及迁移能力的处理方法

（一）技术领域

本发明涉及一种提高骨髓单个核细胞心肌细胞保护能力及迁移能力的预处理方法，可提高其移植治疗急性心肌梗死的疗效。

（二）背景技术

目前充血性心力衰竭发病率逐年升高，全球有1500万受累者，在美国有500万患者，每年新发病例为46.5万，是65岁上人群的首位住院原因，也是心血管死亡的最主要原因。细胞移植疗法可促进梗死局部血管新生和心肌再生而改善心肌梗死后心功能，已成为目前心血管领域的研究热点。骨髓单个核干细胞（BMMNCs）是具多分化方向能力的成体干细胞，进行自体移植无排异及来源的限制，也不涉及伦理问题，是细胞移植治疗的理想细胞来源。大量的基础研究和初步的临床试验已显示了骨髓单个核细胞移植治疗缺血性心肌病的安全性和可行性。然而随着研究的深入，发现干细胞移植治疗心力衰竭仍存在一些问题，主要是移植疗效不够理想。因此，提高移植疗效是目前干细胞移植领域亟待解决的问题。

作为临床应用，经静脉或冠脉注射移植细胞，细胞迁移至局部受损组织是干细胞修复损伤组织的第一步也是最关键的一步。动物研究表明经静脉注射干细胞尽管能迁移到局部损伤区域，但迁移至局部损伤的细胞数量是不充分的，它严重制约着干细胞修复梗死心肌的能力，也是导致移植疗效不够理想的主要原因之一。因此提高骨髓干细胞的迁移能力及心肌细胞保护能力是确保移植疗效的关键，将有助于提高干细胞移植疗法在临床应用中的价值。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种提高骨髓单个核细胞心肌细胞保护能力及迁移能力的预处理方法，从而提高其移植治疗急性心肌梗死的疗效。

本发明采用的技术方案是：

一种提高骨髓单个核细胞迁移能力及心肌细胞保护能力的预处理方法，所述方法为：将新鲜分离的骨髓单个核细胞先以Valsartan溶液培养30分钟，再以Angiotensin II溶液培养2小时，得到处理后的骨髓单个核细胞用于移植治疗急性心肌梗死；所述Valsartan溶液中Valsartan终浓度为0.5~2μmol/L，溶剂为低糖DMEM培养基；所述Angiotensin II溶液中Angiotensin II终浓度为50~150nmol/L，溶剂为低糖DMEM培养基。

AngiotensinII为非特异性血管紧张素受体激动剂，可同时激活血管紧张素1型受体（AT1R）和血管紧张素2型受体（AT2R），是美国SigmaAldrich公司生产的化学试剂（分子式：C₅₀H₇₁N₁₃O₁₂；分子量1046.18；产品号：A9525）。

Valsartan是特异性血管紧张素1型受体（AT1R）激动剂，由北京诺华制药公司提供（分子式：C₂₄H₂₉N₅O₃；分子量435.5）。终浓度为1μmol/L，溶剂为低糖DMEM培养基。

所述培养均在常规条件下进行，具体于37℃下，在CO₂体积浓度5%、空气体积浓度95%的混合气体中进行。

优选的，所述Valsartan溶液中Valsartan终浓度为1μmol/L。

优选的，所述Angiotensin II溶液中Angiotensin II终浓度为100nmol/L。

本发明的有益效果主要体现在：通过预处理间接激活骨髓单个核细胞血管紧张素2型受体 AT2R激活的骨髓单个核细胞分泌一氧化氮增加，迁移能力及心肌细胞保护能力增强，一定程度上可提高其移植治疗急性心肌梗死的疗效。

（四）附图说明

图1 为利用transwell技术比较未处理骨髓单个核细胞（A）、CGP42112A预处理骨髓单个核细胞（C）、AngiotensinII与Valsartan联合预处理骨髓单个核细胞（B）的体外迁移能力，标尺为100μm；

图2 为利用共培养技术比较未处理骨髓单个核细胞（B）、CGP42112A预处理骨髓单个核细胞（D）、AngiotensinII与Valsartan联合预处理骨髓单个核细胞（C）的体外心肌细胞保护能力，标尺为100μm；箭头所指为凋亡心肌细胞；图A为缺氧缺血清直接诱导心肌细胞凋亡，作为阳性对照；

图3 为利用定量PCR技术比较未处理骨髓单个核细胞、CGP42112A预处理骨髓单个核细胞、AngiotensinII与Valsartan联合预处理骨髓单个核细胞移植入大鼠心梗模型后的迁移情况；* p<0.05 vs 未处理骨髓单个核细胞移植组；

图4为利用经胸心脏超声技术比较低糖DMEM培养基、未处理骨髓单个核细胞、CGP42112A预处理骨髓单个核细胞、AngiotensinII与Valsartan联合预处理骨髓单个核细胞经尾静脉途径移植入大鼠心梗模型后心功能改善情况；其中图A为各组大鼠心脏M型超声图（其中a为假手术组（正常大鼠组），b为低糖DMEM培养基组，c为未处理骨髓单个核细胞组，d为CGP42112A预处理组，e为AngiotensinII与Valsartan联合预处理组），图B为各组大鼠左室射血分数比较柱状图，图C为各组大鼠心脏短轴缩短率比较柱状图；* p<0.05 vs 未处理骨髓单个核细胞移植组；

图5为利用经胸心脏超声技术比较低糖DMEM培养基、未处理骨髓单个核细胞、CGP42112A预处理骨髓单个核细胞、AngiotensinII与Valsartan联合预处理骨髓单个核细胞经心肌途径移植入大鼠心梗模型后心功能改善情况；其中图A为各组大鼠心脏M型超声图（其中a为假手术组（正常大鼠组），b为低糖DMEM培养基组，c为未处理骨髓单个核细胞组，d为CGP42112A预处理组，e为AngiotensinII与Valsartan联合预处理组），图B为各组大鼠左室射血分数比较柱状图，图C为各组大鼠心脏短轴缩短率比较柱状图；* p<0.05 vs 未处理骨髓单个核细胞组；

图4、图5的B、C中，MI即心梗模型，BMMNCs即骨髓单个核干细胞AngII即AngiotensinII，Val即Valsartan，CGP即CGP42112A，“+”表示添加，“—”表示未添加。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.骨髓单个核细胞分离：无菌条件下取心梗7天后Sprague Dawley（SD）大鼠的股骨及胫骨，用注射器冲洗骨髓腔收集骨髓液。将骨髓液置于Ficoll（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）溶液上，1800rpm离心20分钟后取中间云雾状细胞层，再以1000rpm离心10分钟，弃上清，细胞沉淀以低糖DMEM培养基（美国Gibco公司）重悬。

2．骨髓单个核细胞血管紧张素2型受体（AT2R）激活：

（1）直接AT2R激活：骨髓单个核细胞以含10nmol/L CGP42112A（美国Sigma Aldrich公司）的低糖DMEM培养基于37℃，含5% CO₂饱和湿度（CO₂ 5%，空气95%，ｖ/v）的细胞培养箱（Forma 3111，美国Thermo Fisher公司）内处理2小时；

（2）间接AT2R激活：骨髓单个核细胞先以含1μmol/L Valsartan（由北京诺华制药公司提供）的低糖DMEM培养基于37℃，含5% CO₂饱和湿度（CO₂ 5%，空气95%，ｖ/v）的细胞培养箱内处理半小时，再以100nmol/L的AngiotensinII（美国Sigma Aldrich公司）于37℃，含5% CO₂饱和湿度（CO₂ 5%，空气95%，ｖ/v）的细胞培养箱内处理2小时。

3. 利用Transwell评价骨髓单个核细胞的体外迁移能力：

分别获得未预处理的骨髓单个核细胞及AT2R激活处理后的骨髓单个核细胞，各采用200ul含1%（v/v）FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）的低糖DMEM培养基重悬，制备成5×10⁵cell/200μl的细胞悬液，接种于Transwell小室（美国Costar公司，孔径为8μm）中，小室外添加500μl含20%FBS的低糖DMEM培养基，置于37℃，含5% CO₂和饱和湿度（CO₂ 5%，空气95%，ｖ/v）的细胞培养箱孵育24小时。随后，取出Transwell小室，用棉签擦去小室膜上层细胞，PBS轻柔洗涤2次后，置于4%（w/w）多聚甲醛（美国Sigma公司）内，37℃固定30分钟，PBS洗涤2~3次后，采用1μg/ml Hoechst 33258（美国Invitrogen公司）室温避光染色15分钟，荧光显微镜（日本Olympus公司）拍照记录，结果见图1。

由图1可见：AT2R激活处理后的骨髓单个核细胞（CGP42112A 预处理或Angiotensin II 与Valsartan联合与处理）迁移至下层小室的能力增强。

4. 利用共培养体系评价骨髓单个核细胞的体外心肌细胞保护能力：

分别获得未预处理的骨髓单个核细胞及AT2R激活处理后的骨髓单个核细胞，各采用200ul低糖DMEM培养基重悬，制备成2×10⁵cell/mL的细胞悬液，接种于Transwell体系上层小室（美国Costar公司，孔径为3μm）中，下层小室接种2×10⁵cell的乳大鼠心肌细胞，置于37℃，含0.5% O₂（O₂ 0.5%，氮气99.5%，ｖ/v）的缺氧培养箱中孵育48小时。随后，取出Transwell小室，下层小室以PBS轻柔洗涤2次后，置于4%多聚甲醛（美国Sigma公司）内，室温固定10分钟，PBS洗涤2~3次后，采用DeadEnd^TM Fluorometric TUNEL System kit（美国 Promega公司）进行TUNEL染色，荧光显微镜（日本Olympus公司）拍照记录，结果见图2。

由图2可见：与AT2R激活处理过的骨髓单个核细胞共培养的乳鼠心肌细胞抵抗缺氧缺血清的能力增强。

5. 采用大鼠急性心梗模型的体内移植来评价骨髓单个核细胞的体内迁移能力：

雌性Sprague Dawley（SD）大鼠（浙江省医学科学院动物中心）经水合氯醛麻醉后，气管插管，小动物呼吸机支持，开胸，用6－0丝线在左心耳下方结扎左前降支冠脉，根据心电图变化和局部组织颜色变化确定心梗模型制成，关胸。分别获得未预处理的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞及AT2R激活处理后的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞，各采用1ml低糖DMEM培养基重悬，制备成1×10⁷cell/mL的细胞悬液，通过尾静脉注射入雌性SD大鼠心梗模型中，24小时后，引颈处死大鼠，取出心脏左室，称重，液氮研磨，采用Universal Genomic DNA ExtrationKit Ver.3.0 （日本TAKARA公司）提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用SYBR Premix Ex Taq kit（日本TAKARA公司）定量PCR检测SRY基因（特异性表达与Y染色体，代表雄性移植细胞）表达水平。引物序列：Forward Sry：CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA；Reverse Sry: ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC。计算公式：所取材中的细胞总数=（实时定量PCR检测所得SRY的平均数×被检DNA的稀释倍数）×[原取材质量（mg）/用来提取DNA的标本质量（mg）]，结果见图3。

由图3可见：AT2R激活的骨髓单个核细胞迁移至缺血心肌病变部位的能力增强。

6. 采用大鼠急性心梗模型的体内移植来评价骨髓单个核细胞移植治疗急性心肌梗死疗效：

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（浙江省医学科学院动物中心）经水合氯醛麻醉后，气管插管，小动物呼吸机支持，开胸，用6－0丝线在左心耳下方结扎左前降支冠脉，根据心电图变化和局部组织颜色变化确定心梗模型制成，关胸。

（1）分别获得未预处理的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞及AT2R激活处理后的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞，各采用1ml低糖DMEM培养基重悬，制备成1×10⁷cell/mL的细胞悬液，通过尾静脉注射入雄性SD大鼠心梗模型中，28天后行经胸心脏超声检查评价心功能改善状况；

（2）分别获得未预处理的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞及AT2R激活处理后的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞，各采用150μl低糖DMEM培养基重悬，制备成3×10⁶cell/mL的细胞悬液，经心肌途径注射入雄性SD大鼠心梗模型中，28天后行经胸心脏超声检查评价心功能改善状况，结果见图4、图5。

由图4、图5可见：AT2R激活的骨髓单个核细胞经尾静脉途径或经心肌途径移植，均能改善心梗后心功能状况。

结论：血管紧张素2型受体（AT2R）激活（CGP42112A预处理或AngiotensinII和Valsartan联合预处理）处理骨髓单个核细胞能提高其体内体外的运动迁移能力及心肌保护能力，从而进一步提高其移植治疗急性心肌梗死的效果。

Claims

1.一种提高骨髓单个核细胞的心肌细胞保护能力及迁移能力的预处理方法，所述方法为：将新鲜分离的骨髓单个核细胞先以Valsartan溶液培养30分钟，再以Angiotensin II溶液培养2小时，得到处理后的骨髓单个核细胞；所述Valsartan溶液中Valsartan终浓度为0.5~2μmol/L，溶剂为低糖DMEM培养基；所述Angiotensin II溶液中AngiotensinII终浓度为50~150nmol/L，溶剂为低糖DMEM培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养均在37℃下，在CO₂体积浓度5%、空气体积浓度95%的混合气体中进行。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述Valsartan溶液中Valsartan终浓度为1μmol/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述Angiotensin II溶液中Angiotensin II终浓度为100nmol/L。