CN102942918A

CN102942918A - 一种聚甜菜碱荧光标记剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102942918A
Application number: CN2012104442863A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 赵江; 杨京法
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2012-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2013-02-27

Abstract

本发明公开了一种聚甜菜碱荧光标记剂及其制备方法。该荧光标记剂如式Ⅰ所示，式Ⅰ中，R₁为氢或甲基；R₂为羧基或磺酸基；R₃为氢或甲基；FR为有机共轭荧光基团；X为O或NH，Y为O或NH；m为1~3之间的自然数，n为1~6之间的自然数，p为2~4之间的自然数；q₂为0.1~10之间的数，且q₁+q₂为50~2000之间的数。本发明提供的聚甜菜碱的荧光标记方法在水溶液中完成，减少了使用有机反应介质对环境污染的压力，符合环保和可持续发展的要求；且荧光标记的聚甜菜碱试剂由RAFT型可控自由基聚合反应在一步反应内完成，反应步骤简单，反应产率高（可大于95%）、经简单步骤纯化即可除去>98%的荧光杂质分子；易于较大量生产，降低了成本；该方法所得到的荧光标记试剂呈现水溶性、环境响应型、荧光亮度高、发光稳定。

Description

一种聚甜菜碱荧光标记剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种荧光标记试剂及其制备方法，具体涉及一种聚甜菜碱荧光标记剂及其制备方法。

背景技术

智能聚合物是一大类能对各种外加环境刺激（包括温度、离子强度、pH值、光辐射、电场、磁场和力场等）作出特定响应的聚合物，作为新型功能材料可广泛用于国民经济的各个方面。对响应型聚合物做荧光标记，是把荧光基团引入到聚合物链上，它可使聚合物表现出双重或多重响应特征，也便于借助丰富的荧光分析技术研究聚合物的响应机理和功能特性，深入理解其结构-性能的关系，进而为设计更新型、高效的智能聚合物提供理论依据。可发荧光的响应型聚合物可广泛应用到分析化学、材料科学、生命科学和医学等领域。

聚甜菜碱类的线形链和凝胶在水中具有典型的温度响应特征，提出具有高临界会溶温度（UCST）型相图，相变点可以调节到生理温度附近，非常适合用作制备药物控制释放、生物体温度传感器等材料。近年来发现，聚甜菜碱类具有非常优异的阻止蛋白质非特异性吸附、高度的生物相容性的特点，其性能比四十年来一直为主流所用的聚（乙二醇）更优，并且其化学稳定性也更高，非常适合用于组织工程支架、人造血管、生物传感器等材料。对聚甜菜碱的荧光标记有助于使用荧光法研究其响应型起源，也有利于使用荧光法探索、推广其生物医学应用，对生物医学研究和材料应用具有一定的现实意义。

现有对水溶性响应型聚合物做荧光标记的方法多数需要使用昂贵的功能化聚合物前体或者需要合成可发荧光的自由基引发剂、链转移剂，存在着步骤复杂、所用原料昂贵（很多带功能基的染料需要进口）、标记效率较低且不易控制、产量不高、标记后纯化处理复杂且不彻底等诸多不足之处。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚甜菜碱荧光标记剂及其制备方法；该方法在水溶液中完成，减少了使用有机反应介质对环境污染的压力；且反应、提纯步骤简单、易于较大量生产，降低了成本；该方法所得到的荧光标记试剂呈现水溶性、环境响应型、荧光亮度高、发光稳定，适用于生命科学研究和生物医学材料应用。

本发明所提供的聚甜菜碱荧光标记剂如式Ⅰ所示，

式Ⅰ

式Ⅰ中，R₁为氢或甲基；R₂为羧基或磺酸基；R₃为氢或甲基；FR为有机共轭荧光基团；X为O或NH，Y为O或NH；m为1～3之间的自然数，n为1~6之间的自然数，p为2~4之间的自然数；q₂为0.1~10之间的数，且q₁+q₂为50~2000之间的数。

上述的聚甜菜碱荧光标记剂，m为2，n为1~3之间的自然数，p为2；q₂为0.5~0.7之间的数，且q₁+q₂为150~1121之间的数，如q₂为0.5，q₁为820；q₂为0.7，q₁为1120或q₂为0.65，q₁为150。

上述的聚甜菜碱荧光标记剂，所述FR的结构式如式Ⅱ所示，

式Ⅱ

式Ⅱ中，R₄为氢、甲基或乙基；R₅为氢或甲基；R₆为NH₂、NH(CH₂CH₃)、N(CH₂CH₃)₂或OH；根据R₄、R₅、R₆基团的不同可以使用罗丹明110，罗丹明6G，罗丹明B或荧光素；式Ⅱ中，

表示该苯环上的取代位置可为1位取代、2位取代、3位取代或4位取代。

本发明提供的聚甜菜碱荧光标记剂，当X为O或NH时，分别代表（甲基）丙烯酸酯类甜菜碱或（甲基）丙烯酰胺类甜菜碱；当Y为O或NH时，分别代表（甲基）丙烯酸酯类荧光共聚单体或（甲基）丙烯酰胺类荧光共聚单体；当R₁和R₃为H时，代表丙烯酸酯类单体，为CH₃时，代表甲基丙烯酸酯类单体；当R₂为SO₃ ^-或COO^-时，分别对应磺酸型或羧酸型甜菜碱。

本发明提供的聚甜菜碱荧光标记试剂为共聚物，其分子量重均分子量M_w在15kDa到550kDa之间，且分布窄，M_w/M_n低至1.04。

本发明提供的式Ⅰ所示聚甜菜碱荧光标记剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）将式Ⅲ所示甜菜碱单体溶于缓冲溶液中，其中所述缓冲溶液的pH值为6.0~8.0；

式Ⅲ

式Ⅲ中，R₁、R₂、X、m和n的定义同式Ⅰ；

（2）在惰性气氛下，向步骤（1）得到的溶液中加入引发剂、链转移剂、式Ⅳ所示荧光共聚单体和无机盐，经聚合反应即得式Ⅰ所示聚甜菜碱荧光标记剂。

式Ⅳ

式Ⅳ中，R₃、Y、P和FR的定义同式Ⅰ。

上述的制备方法中，步骤（1）得到的溶液中，式Ⅲ所示甜菜碱单体的摩尔浓度可为0.3~1.0mol L^-1，具体可为0.6~1.0mol L^-1、0.6mol L^-1或1.0mol L^-1、；所述缓冲溶液可为磷酸盐类缓冲溶液，如磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液。

上述的制备方法中，步骤（2）中，所述引发剂可为偶氮类化合物或无机过氧化合物；

所述偶氮类化合物可为含羧基的偶氮类化合物，如式Ⅴ所示的含羧基的偶氮类化合物，

式Ⅴ

所述机过氧化合物可为过硫酸钾-硫代硫酸钠或过硫酸钾-亚硫酸钠；

所述链转移剂为双硫酯或三硫酯；所述三硫酯为含羧基等极性基团的三硫酯，如式Ⅵ所示的含羧基的双硫酯，

式Ⅵ

所述无机盐可为NaBr、NaCl、KCl和/或KBr。

上述的制备方法中，步骤（2）中，所述聚合反应的温度可为60~70℃，如65℃或70℃，时间可为5~30小时，如10~15小时、10小时或5小时；

式Ⅲ所示甜菜碱单体与式Ⅳ所示荧光共聚单体的摩尔比可为（50～5000）：1，如（200～2000）：1、200：1、667：1或2000：1，式Ⅲ所示甜菜碱单体与所述链转移剂的摩尔比可为（50～2000）：1，如（200～1600）：1、（200～1000）：1、200：1、1000：1或1600：1，所述链转移剂与所述引发剂的摩尔份数比可为（5～20）：1，如4：1、5：1或8.7：1；

所述无机盐是以其水溶液的形式加入的，所述水溶液中无机盐的摩尔浓度为0.5mol L^-1～1.0mol L^-1，如0.5mol L^-1。

上述的制备方法中，步骤（2）之后，所述方法还可包括后处理步骤；

所述后处理步骤为：将所述聚合反应完毕后的体系加入至有机溶剂，如丙酮中，得沉淀物，经分离、干燥即得所述聚甜菜碱荧光标记剂；所述有机溶剂的体积用量为所述聚合反应体系的7~10倍。

上述的制备方法中，所述方法还包括对所述聚甜菜碱荧光标记剂进行透析的步骤；

所述透析步骤为：将所述聚甜菜碱荧光标记剂溶解与NaBr水溶液中，然后加入至透析袋中，再置于去离子水中于15℃～50℃的条件下进行透析，然后经冷冻干燥即得，该冷冻干燥的工艺采用本领域技术人员常用方法。

上述的制备方法中，所述透析袋的截留分子量可为3.5kDa～14kDa；所述NaBr水溶液的浓度可为0.05~0.1mol L^-1；所述透析的时间可为2~4天。

本制备方法中，所用的原料甜菜碱单体、荧光共聚单体可以为市售产品。或者通过下面方法制备而成：

甜菜碱单体的制备方法：由相应的N，N-甲铵烷基（甲基）丙烯酸酯与相应的烷基磺内酯反应得R₂为磺酸基的甜菜碱，或者由相应的N，N-甲铵烷基（甲基）丙烯酰胺与相应的ω-氯代烷基羧酸钠反应得R₂为羧基的甜菜碱。

荧光共聚单体的制备方法：由ω-（甲基）丙烯酸烷醇或ω-（甲基）丙烯酰胺烷醇与带异硫氰酸基团的荧光染料（罗丹明类等）反应。

在制备聚甜菜碱荧光标记试剂时，用到的引发剂以及链转移剂，均可从商业途径获得。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供的聚甜菜碱的荧光标记方法在水溶液中完成，减少了使用有机反应介质对环境污染的压力，符合环保和可持续发展的要求；且荧光标记的聚甜菜碱试剂由RAFT型可控自由基聚合反应在一步反应内完成，反应步骤简单，反应产率高（可大于95%）、经简单步骤纯化即可除去>98%的荧光杂质分子；易于较大量生产，降低了成本；该方法所得到的荧光标记试剂呈现水溶性、环境响应型、荧光亮度高、发光稳定。本发明所得到的水溶性的荧光标记的聚合物-荧光标记的聚甜菜碱试剂，该聚合物的分子量可控制在M_w在15kDa到550kDa、分布窄（M_w/M_n低至1.04），化学结构规整，且该聚合物的荧光亮度高、发光稳定，适用于生命科学研究和生物医学材料应用。

附图说明

图1本发明的聚甜菜碱荧光标记剂的核磁共振氢谱图，横轴为化学位移（单位：ppm）。

图2本发明的聚甜菜碱荧光标记剂的凝胶体积排除色谱图，其中横轴为流出时间（单位：分钟）。

图3本发明的聚甜菜碱荧光标记剂的荧光光谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的甜菜碱单体在使用前均经过如下处理：将甜菜碱单体溶于乙醇，加热至45~55℃，稳定10~15分钟，缓慢冷至室温，4℃存放12小时，滤去残液得固体，重复操作2次，真空干燥12小时，冷藏备用。

实施例1、

甜菜碱单体为N-（3-磺酸丙基）-N-（1-甲基丙烯酸乙基）-N，N-二甲基铵，结构式为：

共聚合荧光单体具有的FR基团为罗丹明B，简写为RB-MA，结构式为：

1g甜菜碱单体溶于pH为7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲水溶液中，单体浓度为0.6mol L^-1，调节NaBr的浓度为0.50mol L^-1，将所需量的RB-MA、链转移剂（CTA，S-异氰酸-N-乙基-N′-苯基二硫代氨基甲酸酯）和引发剂（V-501，偶氮二氰基戊酸）溶解于0.5mL甲醇中，两者相混合，反应投料摩尔比为：甜菜碱单体:[CTA]:[V-501]:[RB-MA]＝1600:1:0.2:2.4。使用液氮三次冻融循环彻底除去残余氧，然后在温度为70℃的条件下搅拌反应10小时；液氮淬冷终止反应。过量丙酮沉淀反应液4次，过滤、干燥沉淀物，即得到荧光标记的聚甜菜碱试剂粗品。

将上述粗品重新溶解于0.05mol L^-1的NaBr水溶液，装入7kDa透析袋中，使用去离子水在25℃透析2天，将透析袋内液冷冻干燥，即得到纯净的聚甜菜碱荧光标记试剂，为0.70g粉色聚合物固体，单体转化率为70%，估算聚合物分子量为3.14×10⁵gmol^-1。取少量此聚合物固体进行尺寸排阻色谱分析，使用0.1mol L^-1的NaNO₃水溶液为流动相，测试聚合物的分子量分布M_w/M_n为1.04，参见图2。取少量聚合物固体溶于氘代水，进行核磁共振氢谱测试，参见图1。

本实施例制备的荧光标记剂的结构式如式Ⅰ所示，其中，R₁为甲基；R₂为磺酸基；R₃为甲基；FR为罗丹明B；X为O，Y为O；m为2，n为3，p为2；q₂为0.70，q₁为1120。

由此制备的聚甜菜碱在溶剂为0.1mol L^-1的NaCl水溶液中发出明亮的荧光，使用543nm光激发所得的荧光光谱如图3，最大吸收峰为583nm。无需再处理即可进行多种荧光分析实验研究。

实施例2、

甜菜碱单体为N-（3-磺酸丙基）-N-（1-甲基丙烯酰胺乙基）-N，N-甲基铵，结构式为：

共聚合荧光单体的FR基团为罗丹明6G，简写为R6G-MA，结构式为:

1g甜菜碱单体溶于pH为6.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲水溶液中，单体浓度为1.0mol L^-1，调节NaBr的浓度为0.50mol L^-1，将所需量的共聚荧光单体、链转移剂（CTA，S-异氰酸-N-乙基-N′-苯基二硫代氨基甲酸酯）和引发剂（V-501，偶氮二氰基戊酸）溶解于0.5mL甲醇中，两者溶液相混合，反应投料摩尔比为：甜菜碱单体:[CTA]:[V-501]:共聚荧光单体=1000:1:0.15:2.0。使用液氮三次冻融循环彻底除去残余氧，然后在温度为65℃的条件下搅拌反应15小时；液氮淬冷终止反应。过量丙酮沉淀反应液4次，过滤、干燥沉淀物，即得荧光标记的聚甜菜碱试剂粗品。

将上述粗品重新溶解于0.1mol L^-1的NaBr水溶液，装入7kDa透析袋中使用去离子水在25℃透析3天，将透析袋内液冷冻干燥，即得到纯净的聚甜菜碱荧光标记试剂，称得0.82g粉色聚合物固体，单体转化率为82%，估算聚合物分子量为2.27×10⁵g mol^-1。取少量此聚合物固体进行尺寸排阻色谱分析，使用0.1mol L^-1的NaNO₃水溶液为流动相，测试聚合物的分子量分布M_w/M_n为1.06。取少量聚合物固体溶于氘代水，进行核磁共振氢谱测试，显示出目标产物的化学结构：-CH₃，δ=1.8，3H；-CO-N-CH₂，δ=3.4，2H；-C-CH₂-C，δ=1.9，4H；-NCH₃，δ=3.1，6H；-NCH₂，δ=3.3，4H；-CH₂SO₃，δ=2.9，2H。

本实施例制备的荧光标记剂的结构式如式Ⅰ所示，其中，R₁为甲基；R₂为磺酸基；R₃为甲基；FR为罗丹明6G；X为NH，Y为O；m为2，n为3，p为2；q₂为0.5，q₁为820。

由此制备的聚甜菜碱在溶液中受532nm激光照射后发出明亮的荧光，无需再处理即可进行多种荧光分析实验研究。

实施例3、

甜菜碱单体为N-（3-羧酸乙基）-N-（1-甲基丙烯酸乙基）-N，N-二甲基铵，结构式为：

1g甜菜碱单体溶于pH为7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲水溶液中，单体浓度为1.0mol L^-1，调节NaBr的浓度为0.50mol L^-1，将所需量的共聚荧光单体、链转移剂（CTA，S-异氰酸-N-乙基-N′-苯基二硫代氨基甲酸酯）和引发剂（V-501，偶氮二氰基戊酸）溶解于0.5mL甲醇中，两者溶液相混合，反应投料摩尔比为：甜菜碱单体:[CTA]:[V-501]:共聚荧光单体=200:1:0.25:1.0。使用液氮三次冻融循环彻底除去残余氧，然后在温度为65℃的条件下搅拌反应10小时；液氮淬冷终止反应。过量丙酮沉淀反应液4次，过滤、干燥沉淀物，即得到荧光标记的聚甜菜碱试剂粗品。将此粗品重新溶解于0.1mol L^-1的NaBr水溶液，装入3.5kDa透析袋中使用去离子水在25℃透析3天，将透析袋内液冷冻干燥，即得到纯净的聚甜菜碱荧光标记试剂，称得0.75g粉色聚合物固体，单体转化率为75%，估算聚合物分子量为3.5×10⁴g mol^-1。取少量此聚合物固体进行尺寸排阻色谱分析，使用0.1mol L^-1的NaNO₃水溶液为流动相，测试聚合物的分子量分布M_w/M_n为1.08。取少量聚合物固体溶于氘代水，进行核磁共振氢谱测试，显示出目标产物的化学结构：-CH₃，δ=1.8，3H；-OCH₂，δ=4.6，2H；-NCH₂，δ=3.6-3.7，4H；-NCH₃，δ=3.1，6H；-CH₂COO，δ=2.7，2H。

本实施例制备的荧光标记剂的结构式如式Ⅰ所示，其中，R₁为甲基；R₂为羧基；R₃为甲基；FR为罗丹明B；X为O，Y为O；m为2，n为2，p为2；q₂为0.65，q₁为150。

Claims

1.式Ⅰ所示聚甜菜碱荧光标记剂，

式Ⅰ

式Ⅰ中，R₁为氢或甲基；R₂为羧基或磺酸基；R₃为氢或甲基；FR为有机共轭荧光基团；X为O或NH，Y为O或NH；m为1~3之间的自然数，n为1~6之间的自然数，p为2~4之间的自然数；q₂为0.1~10之间的数，且q₁+q₂为50~2000之间的数。

2.根据权利要求1所述的聚甜菜碱荧光标记剂，其特征在于：m为2，n为1~3之间的自然数，p为2；q₂为0.5~0.7之间的数，且q₁+q₂为150~1121之间的数。

3.根据权利要求1或2所述的聚甜菜碱荧光标记剂，其特征在于：所述FR的结构式如式Ⅱ所示，

式Ⅱ

式Ⅱ中，R₄为氢、甲基或乙基；R₅为氢或甲基；R₆为NH₂、NH(CH₂CH₃)、N(CH₂CH₃)₂或OH。

4.式Ⅰ所示聚甜菜碱荧光标记剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）将式Ⅲ所示甜菜碱单体溶于缓冲溶液中，其中所述缓冲溶液的pH值为6.0～8.0；

式Ⅲ

式Ⅲ中，R₁、R₂、X、m和n的定义同式Ⅰ；

（2）在惰性气氛下，向步骤（1）得到的溶液中加入引发剂、链转移剂、式Ⅳ所示荧光共聚单体和无机盐，经聚合反应即得式Ⅰ所示聚甜菜碱荧光标记剂；

式Ⅳ

式Ⅳ中，R₃、Y、P和FR的定义同式Ⅰ。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）得到的溶液中，式Ⅲ所示甜菜碱单体的摩尔浓度为0.3~1.0mol L^-1；所述缓冲溶液为磷酸盐类缓冲溶液。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述引发剂为偶氮类化合物或无机过氧化合物；

所述偶氮类化合物为含羧基的偶氮类化合物；

所述机过氧化合物为过硫酸钾-硫代硫酸钠或过硫酸钾-亚硫酸钠；

所述链转移剂为双硫酯或三硫酯；

所述无机盐为NaBr、NaCl、KCl和/或KBr。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述聚合反应的温度为60~70℃，时间为5~30小时；

式Ⅲ所示甜菜碱单体与式Ⅳ所示荧光共聚单体的摩尔比为（50～5000）：1，式Ⅲ所示甜菜碱单体与所述链转移剂的摩尔比为（50～2000）：1，所述链转移剂与所述引发剂的摩尔份数比为（5～20）：1。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）之后，所述方法还包括后处理步骤；

所述后处理步骤为：将所述聚合反应完毕后的体系加入至有机溶剂中，得沉淀物，经分离、干燥即得所述聚甜菜碱荧光标记剂；所述有机溶剂的体积用量为所述聚合反应体系的7~10倍。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括对所述聚甜菜碱荧光标记剂进行透析的步骤；

所述透析步骤为：将所述聚甜菜碱荧光标记剂溶解与NaBr水溶液中，然后加入至透析袋中，再置于去离子水中于15℃～50℃的条件下进行透析，然后经冷冻干燥即得。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为3.5kDa～14kDa；所述NaBr水溶液的浓度为0.05~0.1mol L^-1；所述透析的时间为2~4天。