CN102937613A - 一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测pcr的电化学安培检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于亚甲基蓝DNA指示剂技术定量检测PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法，并将其应用于正常人线粒体实际样品的PCR产物定量检测，包括如下步骤：根据待测基因扩增片段进行PCR扩增所需引物的设计及合成，本发明以正常人线粒体基因序列为例；将经过预处理的玻碳电极放置于含有扩增标本的PCR反应体系，并在体系中加入一定量的DNA杂交指示剂亚甲基蓝；根据目标片段设定相应的PCR反应条件，在进行扩增的同时，采用电化学电流-时间曲线法采集亚甲蓝的电流信号变化，实现PCR扩增产物的电化学检测。该法不仅选择性、灵敏度高，还实现了对PCR产物的定量检测，且与传统方法比较更为快捷、简便、经济。

Description

一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法

技术领域

本发明涉及一种基于亚甲基蓝DNA指示剂技术定量检测 PCR 扩增产物的电化学安培电流测定方法。

背景技术

随着分子生物学和生物技术的发展，特别是人类基因组计划的实施，让人们更深刻的认识到作为遗传信息的携带者，DNA 的结构变化会对生物体产生重大的影响，并且与多种遗传疾病的起因有关。因此，人们对 DNA 的检测手段变得越来越重要。在基因分析技术中，聚合酶链反应 (PCR) 技术以其简便、快速、灵敏的优势，成为基因诊断和分析的重要手段。但是 PCR 技术存在着急需解决的二大问题：一是不能定量，二是污染所致的假阳性。90年代初期，随着分子生物学技术研究的不断进展，定量 PCR 技术取得了突飞猛进的发展，其中实时定量 PCR (real-time quantitative PCR) 技术便是一种具有革命性意义的定量 PCR 技术，所谓实时定量PCR 是指在 PCR 指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。尽管如此，RT-PCR 所使用的光学仪器，因存在体积庞大，价格昂贵等问题，限制了它在临床和研究实验室的使用。因此，发展一种使用快速简单，仪器便携经济并且可用于床边定量检测DNA的分析方法在临床检测中有着广阔的前景。

电化学 DNA 生物传感器是近年来发展起来的一种新型的生物传感器。它能将目的 DNA 的存在转换为电信号，因为本身具有灵敏度高、成本低、易操作、简单化、并能与其它仪器兼容的特点，因而发展非常迅速，同时也使得分析化学和生命科学相结合成了当代科学跨领域研究的趋势。近年来有不少关于电化学传感检测 PCR 扩增产物的报道。但大部分关于电化学传感方法检测 PCR 扩增产物都需要使用到修饰探针的电极或者是应用不对称 PCR 扩增技术，目的就是为了生成一条互补的单链目标产物，从而可以电极面上的修饰探针相互杂交进行检测。在电极面上修饰探针不但操作复杂耗时，同时也增加了传感器构造的费用。而使用不对称或者固相 PCR 扩增技术扩增的效率明显不如常规液相中对称 PCR 扩增的效率和特异性来得高。有研究表明，在最佳优化条件下，液相中对称 PCR 扩增效率可达90%左右，不对称 PCR 扩增的效率仅为70%，而固相上对称PCR 扩增的效率也比液相中对称 PCR 扩增效率低20-30%。本发明选取亚甲基蓝（MB）作为电化学DNA指示剂，使用未修饰探针的裸电极实现对对称PCR扩增产物进行检测，能够很好地解决上述问题。

MB 作为一种电化学指示剂，由于其与双链 DNA(ds-DNA) 与单链DNA(ss-DNA)有着不同的亲和力，已经被广泛地应用于电化学传感器检测DNA杂交反应。有研究表面 MB 可以与DNA中的G 碱基特异性结合，从而使得修饰有DNA探针的电极面上可以检测到一定的电流信号，当杂交进行后，MB 难以接触到ds-DNA中的 G 碱基，所以电流信号减小。

下面所述为本发明人率先提出以 MB 作为电化学 DNA 杂交指示剂，将PCR技术与电化学传感技术相结合，首次设计了一种基于亚甲基蓝DNA指示剂技术的定量检测 PCR 扩增产物的电化学安培电流测定方法。在 PCR 扩增目标 DNA序列的同时，以MB作为杂交指示剂，对 PCR 扩增产物进行电化学安培电流强度检测。该方法通过检测电信号大小的变化，确定体系中是否有 PCR 扩增产物生成，同时还对不同循环数的 PCR 扩增产物量进行测定。该方法与传统方法比较更为简便、快捷、经济、灵敏。

发明内容

本发明目的在于提出一种操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确的DNA指示剂定量检测PCR产物的电化学方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，为基于亚甲基蓝DNA指示剂技术检测基因PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法，通过亚甲基蓝的电流强度的变化实现实时监测基因扩增过程中PCR扩增产物数量的变化或者实现对扩增终产物的定量测定。

所述的基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于，所述的基因为待测正常人线粒体基因，是通过NCBI查找出检测对象的基因序列，应用Primer 5软件设计待检测片段相应的上下游引物以便进行PCR反应，设计的引物序列分别为：上游引物 5’-ATT GCG CCA GGT TTC AAT TTC -3’；下游引物 5’- ATC CGA CTC GTT CTC -3’。

所述的基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于依序包括如下步骤：（1）玻碳电极预处理；（2）PCR反应体系的条件设定，并向PCR反应体系中加入PCR扩增反应所需的标本、试剂以及电化学DNA指示剂亚甲基蓝；（3）在PCR扩增反应循环扩增同时，利用电流-时间曲线法对PCR扩增产物进行检测。

所述的基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于PCR反应体系的条件，是根据待测基因序列采用相应特定的变性-退火-延伸循环温度、时间以及循环圈数，确保待测基因序列扩增的特异性。

所述的基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于依据PCR反应体系的温度参数设定好控温加热仪，将三电极体系放置到PCR反应体系中，在PCR扩增反应循环同时，以亚甲基蓝作为电化学杂交指示剂，利用电流-时间曲线法对PCR扩增产物进行检测，电化学三电极体系：玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和KCl下的 Ag/AgCl电极为参比电极，初始电位为-0.16 V，实验时间根据所需测定扩增循环数所需时间而定。

所述的基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于玻碳电极依次经金相砂纸、1.0μm、0.3μm 和0.05μm Al₂O₃粉末和水混合物抛光，再依次经体积比V _HNO3 : V_H2O为1: 1的HNO₃，无水乙醇，去离子水中超声，利用浓度为0.1mmol/L 铁氰化钾与浓度为1mol/L KCl 溶液混合后的铁氰化钾探针考察玻碳电极性能，当铁氰化钾探针的氧化还原峰电位差值为60mV时，玻碳电极即达到预处理要求。

所述的基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于PCR反应体系的条件为：2 μl Taq酶 ( 5 U/μl )，10.0 μl 10×Taq缓冲液，8.0 μl dNTPs (10 mM)，上下游引物各4.0 μl (25 μM)， 6.0 μl DNA模板正常人线粒体基因，8.0 μl MgCl₂ (25 mM)，2.0 μl MB (1 mM)，56 μl水。PCR反应中，循环参数：95℃预变性5 min；95℃变性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环；72℃延伸7 min。

具体地说，所述的一种基于亚甲基蓝 DNA 指示剂技术定量检测PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法，通过设计特定的引物和相应的PCR扩增条件，该方法可以应用于不同的PCR扩增产物测定，本发明以正常人线粒体基因PCR产物定量检测为例对该发明过程进行描述，包括如下步骤：

（1）通过NCBI查找出检测对象的基因序列——正常人线粒体基因，应用Primer 5软件设计待检测片段相应的上、下游引物以便进行PCR反应，设计的引物序列分别为：上游引物 5’-ATT GCG CCA GGT TTC AAT TTC -3’；下游引物 5’- ATC CGA CTC GTT CTC -3’。

（2）玻碳电极依次经金相砂纸、不同粒径的 Al₂O₃粉末和水混合物抛光，再依次HNO₃，无水乙醇，去离子水中超声。利用铁氰化钾探针考察玻碳电极性能，当探针的氧化还原峰电位差值（△Ep）约为60mV时，玻碳电极即达到使用要求，备用。

（3）向PCR反应体系中加入扩增反应所需的标本、试剂以及电化学DNA指示剂MB；并对PCR反应中相关的温度、时间、循环数等参数进行设定。

（4）依据PCR循环参数设定好控温加热仪，将三电极体系放置于PCR反应混合体系中，在PCR反应循环同时，以MB作为电化学杂交指示剂，利用电流-时间曲线法对PCR扩增产物进行检测。电化学检测过程中，电化学三电极体系：玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl （饱和KCl）为参比电极。所用电化学检测技术为电流-时间曲线。

本发明的优点为：与现有技术相比，本发明将电化学技术与PCR技术相结合，在PCR反应的同时，将电化学传感器置于含有确定浓度MB的PCR扩增体系中，PCR扩增反应进行前，体系中含有大量的游离MB，MB在电极面上发生氧化还原的电子转移保持恒定。但随着PCR扩增反应的进行，体系中生成越来越多的ds-DNA，由于MB嵌入到扩增产物ds-DNA中，且MB与ds-DNA复合物不具有电活性，此时检测的游离的MB电化学信号明显降低，并且在PCR循环的延伸时测得的MB指示剂电化学信号远低于PCR循环开始时的电化学信号。通过MB产生的信号差异，对PCR产物进行测定。本发明方法可应用于临床上各种基因诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确，有利于推广使用。

附图说明

图1为本发明的基于亚甲基蓝DNA指示剂技术定量检测PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法的机理图。

图2为本发明的 MB 在不同PCR体系经历95℃变性-58℃退火-72℃延伸35个循环的时间-电流图。图中：(a) 不含模板DNA的PCR体系 (含 20 μM MB), (b) 35循环的PCR扩增产物 (含 20 μM MB), (c) 不含模板DNA的PCR体系 (不含 20 μM MB), (d) 35循环的PCR扩增产物 (不含 20 μM MB)。

图3为本发明的同一变温加热循环中不同温度下，电极分别置于含有20μM MB 的不同混合溶液体系的电流强度直方图。图中：阴影部分：不含模板DNA的PCR混合缓冲体系，空白部分：35循环的PCR扩增产物的PCR混合体系。

图4为本发明的PCR扩增循环数与相应的不含模板DNA的PCR体系分别与不同循环的阳性样品PCR扩增产物和不含dNTP的PCR扩增体系所检测出的MB电流信号差值的关系图。

图5A为本发明的通过干式加热器进行PCR反应后的PCR扩增产物电泳图。图中，第 1 泳道为DNA marker, 第 2-7 泳道分别为阳性样品35，30，20，15，10，5，0循环扩增产物。

图5B为本发明的通过PCR仪进行PCR反应后的PCR扩增产物电泳图。图中，第 1 泳道为DNA marker, 第 2-7 泳道分别为阳性样品35，30，20，15，10，5，0循环扩增产物。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例是这样实现的，一种基于亚甲基蓝 DNA 指示剂技术定量检测PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法，并将其应用于正常人线粒体基因PCR产物定量检测，包括如下步骤：

（1）通过NCBI查找出检测对象的基因序列——正常人线粒体基因，应用Primer 5软件设计待检测片段相应的上、下游引物以便进行PCR反应，设计的引物序列分别为：上游引物 5’-ATT GCG CCA GGT TTC AAT TTC -3’；下游引物 5’- ATC CGA CTC GTT CTC -3’。

（2）玻碳电极（GCE，

＝3 mm）依次经金相砂纸、1.0μm、0.3 μm 和0.05μm Al₂O₃粉末和水混合物抛光，再依次 HNO₃（V _HNO3 : V_H2O为1: 1），无水乙醇，去离子水中超声。利用铁氰化钾探针（0.1mmol/L 铁氰化钾＋1mol/L KCl 溶液）考察玻碳电极性能，当探针的氧化还原峰电位差值（△Ep）约为60mV时，玻碳电极即达到使用要求，备用。

（3）PCR反应体系相关条件设定，并向反应体系中加入扩增反应所需的标本、试剂，总体积为100 μl，体系组成如下：2 μl Taq酶 ( 5 U/μl )，10.0 μl 10×Taq缓冲液，8.0 μl dNTPs (10 mM)，上下游引物各4.0 μl (25 μM)， 6.0 μl DNA模板正常人线粒体基因，8.0 μl MgCl₂ (25 mM)，2.0 μl MB (1 mM)，56 μl水。PCR反应中，循环参数：95℃预变性5 min；95℃变性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环；72℃延伸7 min。

（4）依据PCR循环参数设定好控温加热仪，将处理好的电极放置到步骤（3）的100 μl的已经进行特定循环扩增的PCR反应混合体系中，在PCR反应循环同时，以MB作为电化学杂交指示剂，利用电流-时间曲线法对PCR扩增产物进行检测。电化学三电极体系：玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl （饱和KCl）为参比电极。初始电位为-0.16 V，实验时间根据所需测定扩增循环数所需时间而定。通过MB产生的信号差异，对PCR产物进行测定。

如图1所示，为本发明的基于亚甲基蓝DNA指示剂技术定量检测PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法的机理图，因为亚甲基蓝（MB）是经典的具有电化学活性的DNA嵌入指示剂，所以本发明以MB作为电化学DNA杂交指示剂，利用其与双链DNA（ds-DNA）作用前后所产生电化学信号的区别，通过电流-时间曲线法实现对PCR扩增产物的检测。具体机理如下：将电化学传感器置于分别含有确定浓度MB的空白体系（即不含DNA模板，无法生成PCR产物的空白缓冲液）和PCR扩增体系中，通过比较特定温度和时间下两个体系中检测出来的游离MB所产生电流大小的差值，说明是否有PCR产物生成。空白体系由于不含有DNA模板，所以反应过程中不产生双链PCR产物，体系中的游离MB量不变，其产生的电流信号仅随温度变化而变化。而PCR扩增反应进行前，体系中含有大量的游离MB，MB在电极面上发生氧化还原的电子转移保持恒定。但随着PCR扩增反应的进行，体系中生成越来越多的ds-DNA，由于MB嵌入到扩增产物ds-DNA中，且MB与ds-DNA复合物不具有电活性，此时检测的游离的MB电化学信号明显降低，且在PCR循环的延伸的终点时，测得的两体系间MB指示剂电化学信号差值为最大。与原有方法相比较，本发明降低了实验成本、操作简单、所需设备经济便携。本发明有望通过PCR体系中游离MB所产生的时间-电流曲线的变化实现对PCR扩增过程的实时监控。

如图2所示，为本发明的实例的 MB 在不同PCR体系经历95℃变性-58℃退火-72℃延伸35个循环的时间-电流图。图中：(a) 不含模板DNA的PCR体系 (含 20 μM MB), (b) 35循环的PCR扩增产物 (含 20 μM MB), (c) 不含模板DNA的PCR体系 (不含 20 μM MB), (d) 35循环的PCR扩增产物 (不含 20 μM MB) ；本发明选用MB作为PCR扩增产物检测的电化学指示剂，除了因为MB作为一种有机的氧化还原指示剂，其氧化还原分子嵌入DNA分子后扩散系数远低于溶液中游离状态下的MB氧化还原分子的扩散系数，因此，氧化还原分子嵌入DNA分子后产生的电流强度远小于游离态产生的电流强度。此外，还因为MB具有较好的耐高温性质，能够耐得住PCR反应过程的变性高温（95℃），且通过对MB浓度的控制，MB对PCR过程基本不发生影响，而PCR热循环也不会影响到MB与DNA的嵌入作用。为了说明MB能够通过电化学信号的变化指示PCR扩增是否进行，我们将电极置于不同的PCR体系中，分别在95℃（变性），58℃（复性）和72℃（延伸）3个不同温度下进行三个PCR扩增循环的检测。如图2所示，当测定的PCR体系中不存在有MB（曲线c、d）时，不管体系中是否含有正常人线粒体基因扩增产物ds-DNA，电流随着温度的变化而变化，温度升高则电流信号放大，温度降低电流信号减小，但是电流信号变化很小且两者间不存在明显的差异。当PCR体系中含有MB时，由于体系中存在大量游离的MB分子并在电极面上发生氧化还原的电子转移，因此曲线a和曲线b的电流信号较曲线c和曲线d大。随着温度的变化，比较曲线a和曲线b，可以看出，在变性温度95℃下，曲线b的电流值经过一段时间后与曲线a的电流值基本一致，这有可能是因为在当温度刚上升到95℃，体系中的模板ds-DNA或经PCR扩增形成的ds-DNA并未完全解链，此时还有一定的双链DNA存在，因此仍有一定量的MB嵌入在ds-DNA扩增产物中，体系中游离的MB浓度减小，所以电极面上MB的电子扩散减小，测得的电信号较小。另外，还有一部分MB结合在解链后的ss-DNA链上，影响到MB在溶液中的扩散，这也使得检测到的电信号有所减小。当温度降至58℃时，此时曲线b电流信号值明显低于曲线a电流电流信号值，这可能是因为模板DNA以及PCR扩增ds-DNA经加热变性成单链后，在此温度下，引物与模板DNA单链或变性后的PCR扩增ds-DNA通过碱基互补序列配对结合再次形成双链，部分游离的MB再次被嵌入到ds-DNA，因此含有PCR扩增产物体系检测所得的曲线a的电流值小于不含PCR扩增产物体系检测所得的曲线b电流值。当温度升至72℃时， 曲线b与曲线a电流信号差值逐渐变大，这是因为在这个温度下，反应体系中形成的ds-DNA数量达到每个扩增循环（95℃-58℃-72℃）的最大量，此时嵌入ds-DNA的MB含量也是每个扩增循环中最多的，因此游离在体系中的MB数量达到最低，检测出来的电流信号差异最大。因此，本发明记录MB电信号差值选择在PCR循环的延伸（72℃）终点时间（第60秒）。

如图3所示，为本发明实例中的同一变温加热循环中不同温度下，电极分别置于含有20μM MB 的不同混合溶液体系的电流强度直方图。图中：阴影部分：不含模板DNA的PCR混合缓冲体系，空白部分：35循环的PCR扩增产物的PCR混合体系；通过将电极分别置于含有20 μM MB 的不含模板DNA的PCR混合缓冲体系和第35循环的PCR扩增产物的PCR混合体系中，对同一PCR扩增变温加热循环中不同温度电流终点值进行比较（如图4所示），结果表明，在72℃下，两者的电流差值最大（302 nA），这是因为PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下一轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至58℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，形成ds-DNA。由此可以看出，在每个变温加热循环中，延伸阶段的终点所含的ds-DNA量是这个循环中最多。因此，在延伸终点（72℃），MB结合到ds-DNA中的量也是该循环中最多的，此时，游离在溶液中的MB量达到最少，所以检测到的电流强度最小，与含有20μM MB 的不含模板DNA的PCR混合缓冲体系所检测到的电流强度差值最大，能够很好的说明PCR扩增已经进行。因此，选择每个PCR变温加热循环中延伸阶段终点的MB电流强度进行比较。

如图4所示，为本发明实例的PCR扩增循环数与相应的不含模板DNA的PCR体系分别与不同循环的阳性样品PCR扩增产物和不含dNTP的PCR扩增体系所检测出的MB电流信号差值的关系图，该图说明本发明可以通过MB电流强度的变化实现实时监测扩增过程中PCR扩增产物数量的变化，而并非只能实现对扩增终产物的测定。我们对PCR扩增循环数与相应的不含模板DNA的PCR体系和含有不同模板的不同循环PCR扩增产物所检测出的MB电流信号差值（ΔI =I _non-template - I _amplicon）的关系进行研究。不同的PCR扩增循环数被选定进行检测，分别是第0，5，10，15，20，30，35个循环。从图4中可以明显的看出，随着扩增循环数的增加，阴性对照组所测得的MB电流信号值并没有发生明显的变化，基本与不含模板DNA的PCR体系检测MB电路信号相同，所以其差值（ΔI）没有明显增大趋势。这是因为阴性对照组不含有dNTP，因而反应体系中不进行ds-DNA扩增，游离状态下的MB浓度基本不发生改变，所以测得的电流信号与同样无法进行扩增的不含模板DNA的PCR体系测得的MB电流信号基本一致。而含有引物扩增目标DNA序列模板正常人线粒体基因的阳性实验组，随着PCR扩增循环数的增加，PCR扩增ds-DNA产物数量呈指数级增加，嵌入ds-DNA中的MB数量随之增加，游离状态下的MB浓度减小，此时检测到的电流信号降低，而与相同循环数下不含模板DNA 的PCR体系中同样浓度游离MB所检得的电流信号差值自然不断增大，因此，阳性样品相应的不同循环的PCR扩增产物中检测MB电流信号差值（ΔI）增大趋势越来越明显。

如图5 A所示，为本发明的PCR扩增产物电泳图。图中：通过干式加热器进行正常人线粒体基因PCR反应后的PCR产物，如图5B所示，通过PCR仪进行正常人线粒体基因PCR反应后的PCR产物，(图5A) 和(图5B)图中，第 1 泳道为DNA marker, 第 2-7 泳道分别为阳性样品35，30，20，15，10，5，0循环扩增产物；作为对照，采用上述发明方法的步骤（3）PCR扩增的相同条件分别在发明方法所用的干式加热器和PCR仪上进行了相同目标基因的PCR扩增，并将产物分别进行凝胶电泳。从图5B中可看出，第 2 、3泳道代表的阳性样品35循环和30循环扩增产物在 500 bp 左右出现的明亮条带，而其它泳道的 PCR 产物未见任何条带，由此结果可以推断，加入20μM MB 并不影响PCR的扩增，能够扩增出 500bp 左右的阳性片段，很好地区分阴性阳性样品。由此可以说，本发明采用的电化学检测方法能够很好的区分PCR阴性阳性样品，结果与凝胶电泳一致，并且随着扩增产物的增加，其相应的MB电流差值增大，可以实现对不同循环数的PCR产物的实时监测。因此，该方法有望应用于临床上各种基因诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。

本发明方法可应用于临床上各种基因诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确，有利于推广使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，为基于亚甲基蓝DNA指示剂技术检测基因PCR扩增产物的电化学安培电流测定方法，通过亚甲基蓝的电流强度的变化实现实时监测基因扩增过程中PCR扩增产物数量的变化或者实现对扩增终产物的定量测定。

2.根据权利要求1所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于，所述的基因为待测正常人线粒体基因，是通过NCBI查找出检测对象的基因序列，应用Primer 5软件设计待检测片段相应的上下游引物以便进行PCR反应，设计的引物序列分别为：上游引物 5’-ATT GCG CCA GGT TTC AAT TTC -3’；下游引物 5’- ATC CGA CTC GTT CTC -3’。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于依序包括如下步骤：（1）玻碳电极预处理；（2）PCR反应体系的条件设定，并向PCR反应体系中加入PCR扩增反应所需的标本、试剂以及电化学DNA指示剂亚甲基蓝；（3）在PCR扩增反应循环扩增同时，利用电流-时间曲线法对PCR扩增产物进行检测。

4.如权利要求3 所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于PCR反应体系的条件，是根据待测基因序列采用相应特定的变性-退火-延伸循环温度、时间以及循环圈数，确保待测基因序列扩增的特异性。

5.根据权利要求4 所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于依据PCR反应体系的温度参数设定好控温加热仪，将三电极体系放置到PCR反应体系中，在PCR扩增反应循环同时，以亚甲基蓝作为电化学杂交指示剂，利用电流-时间曲线法对PCR扩增产物进行检测，电化学三电极体系：玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和KCl下的 Ag/AgCl电极为参比电极，初始电位为-0.16 V，实验时间根据所需测定扩增循环数所需时间而定。

6.根据权利要求3所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于玻碳电极依次经金相砂纸、1.0 μm、0.3 μm 和0.05 μm Al₂O₃粉末和水混合物抛光，再依次经体积比V _HNO3 : V_H2O为1: 1的HNO₃，无水乙醇，去离子水中超声，利用浓度为0.1mmol/L 铁氰化钾与浓度为1mol/L KCl 溶液混合后的铁氰化钾探针考察玻碳电极性能，当铁氰化钾探针的氧化还原峰电位差值为60mV时，玻碳电极即达到预处理要求。

7.根据权利要求5所述的一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测PCR的电化学安培检测法，其特征在于PCR反应体系的条件为：2 μl Taq酶 ( 5 U/μl )，10.0 μl 10×Taq缓冲液，8.0 μl dNTPs (10 mM)，上下游引物各4.0 μl (25 μM)， 6.0 μl DNA模板正常人线粒体基因，8.0 μl MgCl₂ (25 mM)，2.0 μl MB (1 mM)，56 μl水。

8.PCR反应中，循环参数：95℃预变性5 min；95℃变性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环；72℃延伸7 min。

Images