CN102936321A - 聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用，尤其公开了一种通过活性聚合法制备聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的应用。本发明首先合成一种新的硅烷化RAFT聚合链转移试剂，将该RAFT链转移试剂通过一步反应固定到球形固相载体表面后，再通过RAFT聚合法在接枝有该RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，得到聚丙烯酸球刷。本发明的聚丙烯酸球刷材料经过活化后，进行蛋白固定得到球刷与蛋白的复合物，从而实现了在蛋白高密度固定化中的应用。本发明的方法大大缩短了聚丙烯酸球刷的合成步骤与时间，提高了反应效率；并使得聚丙烯酸球刷具有较高的接枝密度和羧基含量，为蛋白固定化提供了更多的位点。

Description

聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用，尤其涉及一种通过活性聚合合成路线制备聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的应用，属于生物材料技术领域。

背景技术

活性自由基聚合是上个世纪末在传统自由基聚合基础上逐步发展起来的一种聚合技术。目前获得较好发展的代表性方法有氮氧稳定自由基聚合法(NMP)、原子转移自由基聚合法(ATRP)和断裂-加成链转移自由基聚合法(RAFT)。通过活性自由基聚合法得到的聚合物具有可控的分子量和分子量分布，以及活性的端基，因此使得活性自由基聚合法成为合成具有新型结构材料以及实现材料的结构控制的有力手段。

球刷是将聚合物链的一端连接到球形固相载体表面所形成的复合结构。其中，聚丙烯酸球刷由于具有简单规整的结构、丰富的羧基功能基团、良好的分散稳定性以及环境响应特性而得到了广泛的研究与应用。早期主要使用常规自由基聚合法合成聚丙烯酸球刷。近几年随着活性自由基聚合技术的发展，活性自由基聚合法逐渐成为合成聚丙烯酸球刷的主要方法。借助活性聚合技术可以实现对聚丙烯酸毛刷长度的裁制与调控，从而获得结构更为规整可控的球刷。

对现有技术的文献检索发现，Rutnakornpituk等在《高分子》第52期987-995页发表的“用于叶酸偶联的聚丙烯酸接枝的磁性纳米颗粒”(Poly(acrylicacid)-grafted magnetic nanoparticle for conjugation with folic acid，Polymer，52，(2011)，987-995)中报道了利用ATRP法制备了聚丙烯酸球刷并实现了对叶酸的偶联。由于ATRP法并不适用于包括丙烯酸在内的带有羧基单体的聚合，因此该文献采用先聚合丙烯酸叔丁酯，然后在强酸性环境中脱除叔丁基的方法来获得聚丙烯酸球刷。这种方法虽然能够获得聚丙烯酸球刷，但显然增加了合成步骤，且由于需要在强酸性条件下进行脱保护，因此存在容易引起球刷结构破坏、颗粒团聚等问题。

RAFT聚合法作为另一种代表性的活性自由基聚合方法，能够直接聚合丙烯酸，因而更加适合用于制备聚丙烯酸球刷。进一步的文献检索发现，Hong等在《材料化学杂志》第19期5155-5160页发表的“含有介孔球核与pH响应性壳层的智能纳米载体的制备及其在药物可控携载和释放中的应用”(Fabrication ofsmart nanocontainers with a mesoporous core and a pH-responsive shell forcontrolled uptake and release，J.Mater.Chem.，2009，19，5155-5160)中报道了用RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷。这一工作首先是在介孔氧化硅的外层进行环氧修饰，并通过开环与偶联反应固定RAFT链转移试剂，然后借助RAFT聚合成功地在介孔氧化硅外表面形成聚丙烯酸球刷结构。但在这一工作中，RAFT链转移试剂的固定化共涉及三步表面化学反应，其合成路线仍较为繁琐。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种采用简便、高效而通用的活性聚合合成路线来合成聚丙烯酸球刷。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种借助RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷的简便、高效而通用的新合成路线。

为实现上述目的，本发明提供了一种聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法以及将该聚丙烯酸球刷材料实现在蛋白高密度固定化中的应用及其方法。

具体地，本发明首先将RAFT链转移试剂通过一步反应固定到球形固相载体表面；然后，通过RAFT聚合方法在接枝有RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，最终得到聚丙烯酸球刷。

本发明是通过以下具体技术方案实现的：

一方面，本发明合成了一种新型结构的RAFT链转移试剂。

本发明的RAFT链转移试剂为硅烷化RAFT链转移试剂，由于该RAFT链转移试剂带有硅烷结构，即RAFT试剂的离去基团带有硅烷功能基团，因此该硅烷化RAFT链转移试剂可以通过一步反应简便地固定到球形固相载体表面。

本发明的硅烷化RAFT链转移试剂用下述通式(I)表示：

其中：R为C₂-C₁₂的直链烷基(-C_nH_2n+1，n＝2-12)、或苄基(-C₇H₇)；例如乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基辛基、正癸基、或正十二烷基等。

另一方面，本发明提供了一种聚丙烯酸球刷及其合成路线。

本发明所述的聚丙烯酸球刷，包括作为聚丙烯酸球刷的球核结构的球形固相载体，该聚丙烯酸球刷为在固相载体的表面接枝聚丙烯酸的毛刷结构。其中，所述球形固相载体的表面带有羟基功能基团，且能与硅烷化试剂发生偶联反应。

在本发明中，球形固相载体为本领域常用的微球，优选采用《胶体与界面科学杂志》1968年第26期62-69页报道的方法制备得到的单分散氧化硅微球。

在本发明中，合成聚丙烯酸球刷的路线使用如上所述的硅烷化RAFT链转移试剂，该合成路线包括以下步骤：

步骤一，制备硅烷化RAFT链转移试剂；

步骤二，通过一步法在微球表面接枝步骤一制备得到的硅烷化RAFT链转移试剂；

步骤三，通过RAFT聚合方法在接枝有RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，最终得到聚丙烯酸球刷。

在本发明的具体实施方式中，步骤一中制备硅烷化RAFT链转移试剂的具体过程如下：

首先，将R-SH与碱溶于有机溶剂中，于10-60℃下反应10-60分钟；然后将二硫化碳逐滴加入该体系中，加完于10-60℃下继续反应10-60分钟，溶液变为淡黄色或黄色；再向体系中加入对氯4-苯基三甲氧基硅烷，于10-60℃下继续反应2-24小时，溶液变为黄色或深黄色，有大量固体析出；浓缩有机相，加入非极性有机溶剂，过滤，将得到的黄色或深黄色液体浓缩后通过柱层析纯化，得到硅烷化RAFT链转移试剂。

其中，所述碱与R-SH的摩尔比优选为1∶1-4；R-SH与二硫化碳的摩尔比优选为1∶1-4；R-SH与对氯4-苯基三甲氧基硅烷的摩尔比优选为1∶1-4。

在本发明中，所述碱优选为氢氧化钠、碳酸钠、磷酸钾或氢氧化钾等无机碱。有机溶剂优选为四氢呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮等；非极性有机溶剂优选为二氯甲烷、丙酮或甲苯等。

在本发明的较佳实施方式中，步骤一中，浓缩液进行柱层析时淋洗剂为乙酸乙酯(EA)-石油醚(PA)、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚体系；淋洗剂的配比优选为1∶1-100。

在本发明的较佳实施方式中，步骤二中通过一步法在微球表面接枝步骤一制备得到的硅烷化RAFT链转移试剂的具体过程如下：

将微球与硅烷化RAFT链转移试剂分散在乙醇中，通过油浴加热的方式使体系回流反应24小时，产物经乙醇洗涤后稳定分散在乙醇中，得到表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的微球。

在本发明的另一较佳实施方式中，步骤三中制备聚丙烯酸球刷的具体过程如下：

将制备得到的表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的微球重新分散在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入丙烯酸、自由的RAFT链转移试剂、偶氮二异丁腈，通过油浴加热的方式使体系在70℃下发生聚合反应3小时，产物经乙醇洗涤后稳定分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷。

在本发明中，所述自由的RAFT链转移试剂是指与上述硅烷化RAFT链转移试剂结构类似，但不含硅烷功能基团的RAFT链转移试剂。其结构可以是例如C₆H₅CH₂SCS₂C₂H₅、C₆H₅CH₂SCS₂C₃H₇、C₆H₅CH₂SCS₂C₄H₉、C₆H₅CH₂SCS₂C₁₂H₂₅或C₆H₅CH₂SCS₂CH₂C₆H₅，但并不限于上述结构中的一种。

另一方面，本发明还提供了一种根据如上所述合成路线所制备得到的聚丙烯酸球刷的应用，尤其提供了该聚丙烯酸球刷材料在蛋白高密度固定化中的应用。

本发明的聚丙烯酸球刷材料在实现蛋白高密度固定化中的应用方法，包括以下步骤：

步骤一，对聚丙烯酸球刷进行活化；

步骤二，将蛋白固定在活化后的聚丙烯酸球刷上；

步骤三，对步骤二形成的球刷与蛋白的复合物进行洗涤、封闭与保存。

在本发明的优选实施方式中，聚丙烯酸球刷材料在实现蛋白高密度固定化中的具体应用方法如下：

步骤一，将聚丙烯酸球刷重新分散到缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)，该体系在室温下混合15分钟，得到活化后的聚丙烯酸球刷，用该缓冲液洗涤三次；

步骤二，将活化后的聚丙烯酸球刷与蛋白在缓冲液中混合，在37℃下恒温反应2小时，得到球刷与蛋白的复合物；

步骤三，首先，用含有对氨基基团具有淬灭作用的封闭液洗涤复合物三次；然后将复合物分散在封闭液中并在4℃下混合过夜；最后，用保存液洗涤复合物三次，最终将复合物分散在该保存液中。

在本发明的较佳实施方式中，步骤一中，反应物的用量优选为聚丙烯酸球刷1～2mg/mL，EDC 25mg/mL，NHS 25mg/mL；步骤二中，可根据球刷羧基的含量加入不同浓度的蛋白以获得球刷的饱和蛋白结合量，在达到蛋白饱和结合量之前，加入的蛋白均能以共价键结合的方式固定到球刷表面。优选地以每100个羧基结合2个蛋白为基准投料量，以该基准反应比附近来估算饱和结合量。

在本发明的具体实施方式中，所述缓冲液是指但不限于：10mM的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，该缓冲液的pH为7.2～7.6，含有或不含有0.05wt.％的吐温-20。

所述封闭液是指但不限于：含有0.1wt.％BSA(牛血清白蛋白)、0.2wt.％BSA或0.5wt.％甘氨酸的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，该封闭液的pH为7.2～7.6。

所述保存液是指但不限于：含有0.1wt.％BSA和0.05wt.％吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液，该保存液的pH为7.2～7.6。

本发明采用新型的合成方法合成了聚丙烯酸球刷。与传统合成路线相比，该合成路线大大缩短了合成的步骤与时间，提高了反应效率，并且使得所得到的聚丙烯酸球刷具有较高的接枝密度和羧基含量，为蛋白固定化提供了更多的位点。当将采用本发明方法制备得到的聚丙烯酸球刷用于蛋白的固定化应用时，可实现大幅度提高蛋白固定化能力。经检测采用本发明合成的聚丙烯酸球刷对链霉亲和素蛋白(SA)的结合量高达1950μg/mg球刷，与已有文献报道的非球刷结构的聚丙烯酸改性氧化硅微球对SA的固定化能力相比，其对SA蛋白的固定化能力提高了45倍。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的实施例2的RAFT链转移试剂修饰的氧化硅微球的紫外-可见分光光度光谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

在实施例中，所采用的试剂除另有说明外均为市售商品。其中，微球为采用《胶体与界面科学杂志》1968年第26期62-69页报道的方法制备得到的单分散氧化硅微球。

实施例1

合成硅烷化RAFT链转移试剂：

向50mL的样品瓶中加入C₂H₅SH(6.6mmol)和K₃PO₄(6.6mmol)，加入丙酮(20mL)溶剂，25℃搅拌10mins，反应体系中有白色不溶物；然后向体系中逐滴加入CS₂(18.0mmol)，加完继续搅拌反应10mins，溶液变为淡黄色，仍有不溶物。最后，对体系进行除氧操作后，向体系中加入对氯4-苯基三甲氧基硅烷(6.6mmol)，反应13h，溶液变为黄色并且浑浊，有大量固体析出；浓缩有机相，加入二氯甲烷(25mL)，过滤，浓缩滤液得到黄色液体；将浓缩液进行柱层析，淋洗剂为EA∶PE＝1∶20，得到黄色液体1，产率76％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.60(d，J＝7.9Hz，2H)，7.37(d，J＝7.8Hz，2H)，4.62(s，2H)，3.61(s，9H)，3.38(q，J＝7.4Hz，2H)，1.36(t，J＝7.4Hz，3H).

¹³C NMR(CDCl₃)δ223.37，137.90，135.10，128.80，128.06，50.86，41.13，31.70，13.04.

m/z(EI)348.1，211.2.

实施例2

制备聚丙烯酸球刷：

1、制备尺寸为80nm的单分散氧化硅微球；将制备得到的氧化硅微球洗涤后分散在无水乙醇中，其中，微球的含量为3wt.％。

2、取氧化硅微球的乙醇分散液70mL加入到100mL干燥的圆底烧瓶中，加入0.5％(v/v)的硅烷化RAFT链转移试剂化合物1。圆底烧瓶上加装冷凝回流装置与氮气球保护，通过抽真空-充氮气的方式将体系气氛置换为氮气后，升温至80℃回流反应24小时，得到硅烷化的RAFT链转移试剂修饰的氧化硅微球产物；将该产物用乙醇洗涤三次后稳定分散在无水乙醇中，其中微球的含量为3wt.％。

将制备得到的RAFT链转移试剂修饰的氧化硅微球通过紫外-可见分光光度计的检测，检测结果如图1所示：其中SiO₂RAFT表示经硅烷化RAFT链转移试剂修饰的氧化硅微球，SiNPs表示没有经过修饰的二氧化硅微球，RAFT CTA表示硅烷化RAFT链转移试剂。在图1中，SiO₂RAFT中显示了硅烷化RAFT链转移试剂的特征吸收峰，说明SiO₂RAFT颗粒表面附有硅烷化RAFT链转移试剂，即硅烷化RAFT链转移试剂被成功地修饰到二氧化硅颗粒的表面。

3、取上述氧化硅微球的乙醇分散液3mL，通过离心、超声重悬的方式将微球重新分散在DMF中，并转移到25mL Schlenk反应管中。加入丙烯酸、偶氮二异丁腈和自由的RAFT链转移试剂C₆H₅CH₂SCS₂C₁₂H₂₅，使得氧化硅微球、丙烯酸、偶氮二异丁腈和自由的RAFT链转移试剂的浓度分别为1.5wt.％、4.5M、5mM和15mM；将反应管密封。将体系进行液氮冷冻-抽气-充氮，该循环重复三次以彻底排除体系中的氧气。加热使体系在70℃下发生聚合反应3小时。然后用冰浴冷却体系并将体系敞口以淬灭聚合反应，得到以氧化硅为球核的聚丙烯酸球刷。产物用DMF稀释后通过离心收集，并用乙醇洗涤三次后稳定分散在乙醇中。

所制得的以氧化硅为球核的聚丙烯酸球刷为：在球核为80nm的氧化硅微球的表面接枝聚丙烯酸分子的毛刷结构。其中，聚丙烯酸毛刷的含量为24.2wt.％，氧化硅球核的含量为75.8wt.％。聚丙烯酸的接枝密度为0.24nm^-2，分子量为17.1KD，分子量多分散系数为1.59。该制得的聚丙烯酸球刷在去离子水中的流体力学直径为246nm，羧基含量为1.68mmol/g。

实施例3

采用实施例2制备得到的以氧化硅为球核的聚丙烯酸球刷进行蛋白固定化。其中，蛋白选用链霉亲和素，具体过程如下：

首先，取实施例2中制得的聚丙烯酸球刷的乙醇分散液(其中含有球刷1.5mg)，重新分散至10mM的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(pH＝7.6，含有0.05wt.％吐温-20)中，加入EDC和NHS，使得最终体系的体积为400μL，且EDC和NHS的浓度分别为25mg/mL和12.5mg/mL。室温下混匀15分钟将聚丙烯酸球刷活化，活化后的聚丙烯酸球刷用上述磷酸缓冲液洗涤3次。

然后，将活化后的聚丙烯酸球刷分散在上述磷酸缓冲液中，加入过量的链霉亲和素蛋白，37℃下反应2小时，得到聚丙烯酸球刷与蛋白的复合物。

最后，用含有0.1wt.％BSA的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(封闭液，pH＝7.6)洗涤复合物三次，然后将复合物分散在封闭液中并在4℃下混合过夜；再用含有0.1wt.％BSA、0.05wt.％吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(保存液，pH＝7.6)洗涤复合物三次，最终将复合物分散在该保存液中。

该分散有复合物的封闭液经BCA法检测，其链霉亲和素的固定量为1950μg/mg球刷。

实施例4

合成RAFT链转移试剂：

向50mL的样品瓶中加入C₁₂H₂₅SH(6.6mmol)和K₃PO₄(13.2mmol)，加入丙酮(10mL)溶剂，室温搅拌10mins，有白色不溶物，然后向体系中逐滴加入CS₂(18.0mmol)，加完继续搅拌反应搅拌10mins，溶液变为淡黄色，仍有不溶物，对体系进行除氧操作，然后向体系中加入对氯4-苯基三甲氧基硅烷(13.2mmol)，反应24h，溶液变为黄色并且浑浊，有大量固体析出；浓缩有机相，加入丙酮(25mL)，过滤，浓缩滤液，得到黄色液体。将浓缩液进行柱层析，淋洗剂为EA∶PE＝1∶50，得到黄色液体2，产率73％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.48(d，J＝7.8Hz，2H)，7.23(d，J＝7.9Hz，2H)，4.59(s，2H)，3.55(s，9H)，3.24(t，J＝7.6Hz，2H)，1.26-1.93(m，20H)，0.88(s，3H).

¹³C NMR(CDCl₃)δ226.2，140.7，137.1，132.1，127.3，55.8，45.2，35.8，31.9，31.0，29.6，29.3，28.2，22.7，14.1.

m/z(EI)488.2，368.2.

制备的聚丙烯酸球刷以及SA的固定化应用：

本实施例合成的化合物2作为RAFT链转移试剂在氧化硅微球表面固定RAFT链转移试剂、制备聚丙烯酸球刷以及后续的蛋白固定化方法均与实施例2、3相同。

其中，将制备得到的由RAFT链转移试剂修饰的氧化硅微球通过紫外-可见分光光度计的检测，其检测结果显示二氧化硅颗粒的表面附有硅烷化RAFT链转移试剂。由化合物2所制得的以氧化硅为球核的聚丙烯酸球刷为：在球核为80nm的氧化硅微球的表面接枝聚丙烯酸分子的毛刷结构。其中，聚丙烯酸毛刷的含量为22.5wt.％，氧化硅球核的含量为77.5wt.％。聚丙烯酸的接枝密度为0.24nm^-2，分子量为17.0KD，分子量多分散系数为1.55。该制得的聚丙烯酸球刷在去离子水中的流体力学直径为240nm，羧基含量为1.65mmol/g。经检测，该聚丙烯酸球刷对链霉亲和素的固定量约为1900μg/mg球刷。

实施例5

合成硅烷化RAFT链转移试剂：

向50mL的样品瓶中加入1-甲基戊硫醇(6.6mmol)和KOH(13.2mmol)，加入CH₂Cl₂(10mL)溶剂，20℃搅拌10mins，有白色不溶物，然后向体系中逐滴加入CS₂(18.0mmol)，加完继续搅拌反应搅拌10mins，溶液变为淡黄色，仍有不溶物，对体系进行除氧操作，然后向体系中加入对氯4-苯基三甲氧基硅烷(13.2mmol)，反应24h，溶液变为黄色并且浑浊，有大量固体析出；浓缩有机相，加入丙酮(25mL)，过滤，浓缩滤液，得到黄色液体。将浓缩液进行柱层析，淋洗剂为EA∶PE＝1∶75，得到黄色液体3，产率85％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.57(d，J＝7.8Hz，2H)，7.25(d，J＝7.8Hz，2H)，4.61(s，2H)，3.59(s，9H)，2.70(m，1H)，1.92(m，2H)，1.37(d，J＝7.5Hz，3H)，1.25-1.33(m，4H)，0.90(t，J＝7.0Hz，3H).

制备的聚丙烯酸球刷以及SA的固定化应用：

本实施例合成的化合物3作为RAFT链转移试剂在氧化硅微球表面固定RAFT链转移试剂、制备聚丙烯酸球刷以及后续的蛋白固定化方法均与实施例2、3相同。

其中，由化合物3所制得的以氧化硅为球核的聚丙烯酸球刷为：在球核为80nm的氧化硅微球的表面接枝聚丙烯酸分子的毛刷结构。其中，聚丙烯酸毛刷的含量为20.8wt.％，氧化硅球核的含量为75.8wt.％。聚丙烯酸的接枝密度为0.22nm^-2，分子量为16.8KD，分子量多分散系数为1.50。该制得的聚丙烯酸球刷在去离子水中的流体力学直径为240nm，羧基含量约为1.58mmol/g。经检测，该聚丙烯酸球刷对链霉亲和素的固定量约为1800μg/mg球刷。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、合成硅烷化RAFT链转移试剂；

步骤二、将所述硅烷化RAFT链转移试剂通过一步反应接枝固定到球形固相载体表面；

步骤三、通过RAFT聚合方法在所述接枝有RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，最终得到聚丙烯酸球刷；

其中，所述球形固相载体为表面带有羟基基团的微球；

所述硅烷化RAFT链转移试剂的分子结构如下：

其中：R为-C_nH_2n+1，n＝2-12、或苄基。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤一的具体过程如下：

将R-SH与无机碱溶于有机溶剂中，于10-60℃下反应10-60分钟；然后将二硫化碳逐滴加入该体系中，加完于10-60℃下继续反应10-60分钟；再向体系中加入对氯4-苯基三甲氧基硅烷，于10-60℃下继续反应2-24小时；浓缩有机相，加入非极性有机溶剂，过滤，将得到的液体浓缩后通过柱层析纯化，得到硅烷化RAFT链转移试剂；

其中，所述无机碱与R-SH的摩尔比为1∶1-4；R-SH与二硫化碳的摩尔比为1∶1-4；R-SH与对氯4-苯基三甲氧基硅烷的摩尔比为1∶1-4。

3.如权利要求2所述的制备方法，其中，所述无机碱为氢氧化钠、碳酸钠、磷酸钾或氢氧化钾；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮；所述非极性有机溶剂为二氯甲烷、丙酮或甲苯。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述浓缩液进行柱层析时淋洗剂为乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚体系，淋洗剂的配比为1∶1-100。

5.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤二的具体过程如下：

将所述球形固相载体与硅烷化RAFT链转移试剂分散在乙醇中，加热回流24小时，产物经乙醇洗涤后分散在乙醇中，得到表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的球形固相载体。

6.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤三的具体过程如下：

将表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的球形固相载体分散在N，N-二甲基甲酰胺中，加入丙烯酸、自由的RAFT链转移试剂、偶氮二异丁腈，在70℃反应3小时，产物经乙醇洗涤后分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷；

其中，所述自由的RAFT链转移试剂为C₆H₅CH₂SCS₂C₂H₅、C₆H₅CH₂SCS₂C₃H₇、C₆H₅CH₂SCS₂C₄H₉、C₆H₅CH₂SCS₂C₁₂H₂₅或C₆H₅CH₂SCS₂CH₂C₆H₅。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的聚丙烯酸球刷。

8.如权利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的应用。

9.一种如权利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，对聚丙烯酸球刷进行活化；

步骤二，将蛋白固定在活化后的聚丙烯酸球刷上；

步骤三，对步骤二形成的球刷与蛋白的复合物进行洗涤、封闭与保存。

10.如权利要求9所述的应用方法，其特征在于，具体应用过程如下：

步骤一，对聚丙烯酸球刷分散在缓冲液中，加入EDC和NHS，室温下混合后得到活化后的聚丙烯酸球刷，用所述缓冲液洗涤三次；

步骤二，将所述活化后的聚丙烯酸球刷与蛋白在所述缓冲液中混合，并在37℃下反应2小时，得到球刷与蛋白的复合物；

步骤三，用封闭液洗涤所述复合物；将复合物分散在所述封闭液中并在4℃下混合过夜；然后用保存液洗涤复合物，最终将复合物分散在所述保存液中；

其中，所述缓冲液为10mM的含有或不含有0.05wt.％的吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，所述缓冲液的pH为7.2～7.6；

所述封闭液为含有0.1wt.％BSA、0.2wt.％BSA或0.5wt.％甘氨酸的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液；

所述保存液为含有0.1wt.％BSA和0.05wt.％吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液。

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