CN102925400B

CN102925400B - 重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法

Info

Publication number: CN102925400B
Application number: CN201210412487.5A
Authority: CN
Inventors: 孙二琳; 韩瑞发
Original assignee: TIANJIN INSTITUTE OF UROLOGY
Current assignee: TIANJIN INSTITUTE OF UROLOGY
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2032-10-25
Also published as: CN102925400A

Abstract

本发明公开了一种重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其是将重组干扰素-α-2b-BCG菌种接种于含卡那霉素30微升/毫升的改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得一级活化种子液，再按1-4%比例接种至改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得OD₆₀₀A值=2的二级种子液；发酵罐内改良的苏通马铃薯液体培养基高压灭菌后，按2-6%的比例加入二级种子液，发酵运行7-10天，收集发酵液，离心，取沉淀物用PBS洗涤，再次离心收获菌种。这样生产的重组人干扰素-α-2b-BCG单次生产量大，生长过程易检测，培养条件参数可控，根据生长过程调节培养过程中酸碱度、氧气和营养物质的需求，直接收获富集的散在菌体，避免了研磨等容易造成污染的操作。

Description

重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术，具体是一种适合于工业化生产重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法。

背景技术

卡介苗(BCG)是一种由毒力极强的牛型分枝杆菌形成的生物免疫调节剂，全世界广泛用于预防结核病，已证明其有高度的安全性和极少的严重并发症。膀胱腔内灌注BCG在预防肿瘤复发、治疗残留肿瘤和原位癌等方面已经取得了令人满意的临床疗效，但仍有30%-45%的病人对腔内BCG灌注治疗无反应，长期随访的患者甚至可达50%。此外，腔内BCG灌注亦可引起膀胱局部和全身反应，5%患者可出现严重并发症，0.5%甚至可以危及生命，也使BCG腔内灌注用于预防和治疗浅表膀胱肿瘤受到一定的限制。

卡介苗的工业制备通常采用培养瓶静置培养收获菌膜地方法，其步骤为：BCG种子液接种于装有苏通马铃薯培养基的培养瓶中，39℃恒温、静置培养7-14天，收集菌膜压干后，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速，控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨，加入适量无致敏原保护液，并稀释成一定浓度的原液。虽然操作成本低廉，但是操作复杂，生长缓慢，生产过程可控性差。

中国专利1597931 公开了一种重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法，菌种保藏号CGMCC No.1121。其是将构建的phIFN-α-2B穿梭质粒，转导到BCG内，构建出rBCG-hIFN-α-2B菌株。这样制备的本发明由于能够分泌干扰素IFN-α-2B，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下可较野生型BCG降低用量，从而降低了毒副作用；避免了直接使用细胞因子所带来的高额费用和反复灌注的缺点；能够在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。因此，为其应用于膀胱肿瘤的治疗奠定了基础。

但是，上述重组人干扰素-α-2b-BCG的制备尚处于实验室水平，远远不能满足临床治疗的批量需要，因此，大批量生产重组人干扰素-α-2b-BCG势在必行。

发明内容

本发明就是为了解决工业化大批量生产重组人干扰素-α-2b-BCG的问题，而提供一种重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其生产步骤是：

a.采选重组干扰素-α-2b-BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜改良的苏通马铃薯液体培养基中，获得一级活化种子液；

b.按体积百分比将1-4%的一级活化种子液接种至改良的苏通马铃薯液体培养基中，震摇培养7~9天获得浓度达标准OD₆₀₀的 A值=2，得二级种子液；

c.发酵罐内最终装料容积比6~7:10改良的苏通马铃薯液体培养基高压灭菌后，按体积百分比在培养基内加入2-6%的二级种子液，发酵运行7~10天，取样涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD₆₀₀值达2.0以上，收集发酵液；

d.发酵液离心，取沉淀物用0.01M磷酸缓冲盐溶液洗涤，再次离心收获菌种。

所述重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其改良的苏通马铃薯液体培养基121℃ 30min高压灭菌后，稳定于35~38℃，接入过滤空气的通气速度1.0 SLPM，转速150rpm稳定2h后，确定溶氧度D0-1值为100%，PH稳定至7.0 ~7.5，根据溶氧度80~90%关联调节通气速度保持1.0~2.0 SLPM和转速150~400 rpm，进行发酵培养。

所述重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其采选重组干扰素-α-2b-BCG菌种是冷冻或低温保存重组干扰素-α-2b-BCG种子批的液体培养复苏菌种。

所述重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其改良的苏通马铃薯液体培养基是按以下重量份数比的原料制备的，

a.马铃薯200份切块，去离子蒸馏水中煮沸20~30分钟，静置冷却后过滤，-20℃冷冻12~24h，静置于常温水中浸泡至完全溶化后，脱脂棉过滤，G3砂芯漏斗抽滤；滤汁经速冻结冰后再解冻，薯细胞聚呈棉絮状沉淀，过滤去沉淀得澄清薯汁；

b.所得薯汁及称取的天门冬素4份、柠檬酸 2份、磷酸氢二钾 0.5份、硫酸镁0.5份柠檬酸高铁铵0.05份、0.1%硫酸锌1份、蒸馏水300-500份，加热至全部溶解，用G3滤斗过滤除杂质，加入甘油60份至溶解，加蒸馏水到1000份；

c.用纯氢氧化铵矫正PH至7.2~7.7，分装，经15磅121℃，20分钟灭菌备用。

按照本发明方法生产的重组人干扰素-α-2b-BCG，单次生产量大，生长过程易检测，培养条件参数可控，可以更好的根据生长过程调节培养过程中酸碱度、氧气和营养物质的需求，直接收获富集散在的菌体，避免了研磨等容易造成污染的操作。

附图说明

图1是本发明的生产工艺流程图；

图2是发酵培养菌体镜下均匀散在的分布图；

图3是静置培养菌体成团成片聚集的油镜x 1000镜下分布图；

图4是重组hIFN-α-2B- BCG-PCR产物电泳图；

图5是重组hIFN-α-2B-BCG的PCR产物测序图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

一．生产步骤，参见图1。

1．种子活化

冷冻或低温保存重组干扰素-α-2b-BCG种子批的液体培养复苏，菌种采选后接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的改良的苏通马铃薯液体培养基50mL中，恒温35~38℃、转速100~200rpm、饱和湿度下培养7~14天获得一级活化种子液。

2．二级种子制备

新鲜的活化种子液按1-4%比例接种至改良的苏通马铃薯液体培养基50mL中，含卡那霉素30微升/毫升，于2000mL烧瓶中震摇，35~39℃、饱和湿度下、100~200rpm震摇培养7~9天获得二级种子（浓度达标准OD₆₀₀的 A值=2）。

3．发酵制备

（1）培养基采用改良的苏通马铃薯液体培养基，培养基配置后调节PH至7.0~7.5，体积约3~4升（美国NBS BIOFLO415的工作容积5升发酵罐为例），高压灭菌后开始发酵时的最终装料容积比6~7:10；

（2）培养基121℃ 30min高压灭菌后，稳定于35~38℃，接入过滤空气的通气速度1.0 SLPM（stard liter per minute），转速150rpm稳定2h后，确定溶氧度（D0-1）值为100%，PH约稳定至 7.0 ~7.5；

（3）取二级种子新鲜培养液50mL（标准OD₆₀₀的 A值为2时的BCG种子液，加料比2~6%）无菌情况下经加料孔加入发酵罐；

（4）设定发酵参数，接入过滤空气通气的起始速度1.0 SLPM，起始转速150rpm，根据溶氧度80~90%关联调节通气速度保持1.0~2.0 SLPM和转速150~400 rpm，温度维持35~39℃，消泡剂采用sigma玉米油；

（5）发酵运行7~10天，取样涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD₆₀₀值达2.0以上收获物料，参见图2、3。

4．离心富集洗涤收获沉淀

收集发酵液，采用大容量水平转子离心机4000rpm（3752g）离心10~15分钟后，取沉淀用0.01M 磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，再次离心收集沉淀。

磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌后常温保存备用。

二.改良的苏通马铃薯培养基制备方法

1. 马铃薯切块，不锈钢锅去离子蒸馏水中煮沸20分钟，静置冷却后脱脂棉纱布过滤，放置于-20℃冷冻12~24h，静置于室温或自来水中浸泡至完全溶解（禁止用热水和摇动）后，5~6层脱脂棉过滤，G3砂芯漏斗抽滤。马铃薯煮汁经过速冻结冰后再解冻时，汤汁中的薯细胞会聚成棉絮状沉淀，经过滤即可得无沉淀的澄清薯汁，利于发酵培养后发酵培养液进行离心沉淀分离富集菌体；

2.按附表1中各组分的量分别称取，倒入三角瓶内加蒸馏水，加热使全部溶解，用G3滤斗过滤除杂质，趁热加入甘油60ml，将其倒入量筒内加蒸馏水到1000ml；

3.用纯氢氧化铵NH4OH约3ml矫正PH至7.2~7.7；

4.制备种子液的培养基用三角瓶进行分装，经15磅121℃，20分钟灭菌备用；

表1 改良的苏通马铃薯培养基成分

5.发酵罐培养用的培养基直接加入罐内，补足蒸馏水后121℃，20分钟灭菌备用。

三．工艺效果对比结果

温度（38℃），转速/摇速（150rpm），PH(7.2)等起始条件一致情况下，本发明和按照传统的静置苏通马铃薯培养9天后，收获产物的检测结果对比见表2，本发明IFN-α-2b分泌水平达683±25.9pg/mL，菌体湿量872.6±6.9mg/L，平板法测活菌量7.63±0.61 x10⁷CFU/mL。可见本发明培养重组人干扰素-α-2b-BCG显著优于传统传统苏通马铃薯静置法。

表2 本发明与传统培养法的结果对比 (n=3，±s)

四.检测方法：

1. 质粒鉴定：引物设计、合成，根据hIFN-a-2b序列设计上下游引物；

上海生工合成，上游5’CAAGGGATCCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG 3’，下游 5’GCCGGAATTCTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT 3’

2. 模板制备：取发酵后的菌液1ml，10000rpm离心10分钟，去上清，用双蒸水洗涤沉淀三遍，离心去上清。在沉淀物中加入30μl双蒸水，混匀，煮沸10分钟。10000rpm离心10分钟后，取上清液20μl作为模板进行PCR反应。

3.PCR反应及电泳

PCR反应体系：

反应条件：

将上述反应产物在1%琼脂糖凝胶90V，30min电泳，UV下观察分析拍摄，并将产物送检测序。

4.结果：

①hIFN-a-2b片断的检测结果：

将重组BCG 的单克隆菌落，随机选取5个扩增后制成模板，根据hIFN-a-2B序列设计一对引物，进行PCR反应，凝胶电泳，在500bp出现目的条带。参见图4，说明发酵对重组BCG中插入基因片断没有影响，保持了基因的稳定性。图中：DNA Marker DL2000，各条带由上向下依次为2000、1000、750、500、250、100bp；2、3、4、5、6为rBCG的PCR产物，1是DNA Marker。

② 测序结果证实发酵工艺产物含重组构建的hIFN-α-2b片段，参见图5，确是本发明目的菌株重组人干扰素-α-2b-BCG。

SEQUENCE LISTING

<110> 韩瑞发, 孙二琳,

天津市泌尿外科研究所

<120> 重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> 上游引物

<222> (1)..(33)

<400> 1

caagggatcc tgtgatctgc ctcaaaccca cag 33

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> 下游引物

<222> (1)..(33)

<400> 1

gccggaattc tcattcctta cttaaacttt ctt 33

Claims

1.一种重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其生产步骤是：

b.按体积百分比将1～4%的一级活化种子液接种至改良的苏通马铃薯液体培养基中，震摇培养7～9天获得浓度达标准OD₆₀₀的A值=2，得二级种子液；

c.发酵罐内最终装料容积比6～7:10改良的苏通马铃薯液体培养基高压灭菌后，按体积百分比在培养基内加入2～6%的二级种子液，发酵运行7～10天，取样涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD₆₀₀值达2.0以上，收集发酵液；

d.发酵液离心，取沉淀物用0.01M磷酸缓冲盐溶液洗涤，再次离心收获菌种；

所述步骤a和b中改良的苏通马铃薯液体培养基是按以下重量份数比的原料制备的，

①.马铃薯200份切块，去离子蒸馏水中煮沸20～30分钟，静置冷却后过滤，-20℃冷冻12～24h，静置于常温水中浸泡至完全溶化后，脱脂棉过滤，G3砂芯漏斗抽滤；滤汁经速冻结冰后再解冻，薯细胞聚呈棉絮状沉淀，过滤去沉淀得澄清薯汁；

②.所得薯汁及称取的天门冬素4份、柠檬酸2份、磷酸氢二钾0.5份、硫酸镁0.5份、柠檬酸高铁铵0.05份、0.1%硫酸锌1份、蒸馏水300-500份，加热至全部溶解，用G3滤斗过滤除杂质，加入甘油60份至溶解，加蒸馏水到1000份；

③.用纯氢氧化铵矫正pH至7.2～7.7，三角瓶分装，经15磅121℃，20分钟灭菌备用；

所述步骤c中改良的苏通马铃薯液体培养基121℃30min高压灭菌后，稳定于35～38℃，接入过滤空气的通气速度1.0SLPM，转速150rpm稳定2h后，确定溶氧度D0值为100%，pH稳定至7.0～7.5。

2.根据权利要求1所述重组人干扰素-α-2b-BCG的生产方法，其特征在于：采选重组干扰素-α-2b-BCG菌种是冷冻或低温保存重组干扰素-α-2b-BCG种子批的液体培养复苏菌种。