发明内容
本发明依据NK细胞借助抗体发挥ADCC作用的理论,首先,通过噬菌体随机肽库技术,分别筛选到了一条能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”(肿瘤细胞高表达的一种抗原,广泛存在于各种恶性肿瘤细胞中)特异结合的多肽:Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr ThrGly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr;以及一条能与CD16特异结合的多肽:Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr。在此基础上,通过人工肽合成的方式,将这两条肽的特点(氨基酸序列)合成在一条完整的肽链上,即本发明所指的多肽HA-FC。该多肽的氨基端具有模拟抗体的功能,能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合;多肽的羧基端则模拟抗体的Fc段功能,能够与NK细胞上的CD16分子结合。通过HA-FC多肽的桥梁作用,NK细胞与肿瘤细胞更贴近、结合更加牢固,最终使NK细胞通过释放穿孔素与颗粒酶杀伤肿瘤细胞的效率更高。
本发明的关键技术是获得了(筛选到了)能与天冬酰胺羟化酶特异结合的肽序列和能与CD16结合的肽序列。申请者采用噬菌体随机肽库的方法,分别以天冬酰胺羟化酶以及CD16为目标蛋白,对噬菌体肽库中能与天冬酰胺羟化酶结合的克隆以及肽库中能与CD16结合的克隆分别进行了筛选。筛选所用的目标蛋白是采用人工合成的天冬酰胺羟化酶肽段以及人工合成的CD16肽段,以这两种合成的多肽分别包被96孔板进行筛选。
本发明的目的在于公开了一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽。
本发明的第二个目的在于公开了具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽,其中,所述多肽的序列如序列表1所示。
一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽,其中,所述多肽包括如序列表1所示的多肽序列。
一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽,其中,所述多肽为在序列表1所示序列中插入其他氨基酸后与序列表1所示序列保持80%以上同源性的多肽。
上述技术方案所述的具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明应用噬菌体随机肽库技术,筛选到了能与天冬酰胺羟化酶特异结合的肽进而获得了其氨基酸序列信息(Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His TyrGly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr)。应用噬菌体随机肽库技术,筛选到了能与CD16特异结合的肽进而获得了其氨基酸序列信息(Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln GlnSer Asn Glu Asp Pro tyr Thr)。依据这两条肽的氨基酸序列信息,随后人工合成出了一条多肽Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr TyrPhe Asp Tyr Gly Gly Ser Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn GluAsp Pro tyr Thr(对应序列的符号为QHIRELPYTGGSARHYGSSYYFDYGGSINPAWFAYGGSQQSNEDPYT),其一端(氨基端)能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合,另一端(羧基端)又能与NK及NKT细胞表面CD16分子特异结合。通过体外抗肿瘤活性的比较,确认该多肽(以下简称HA-FC)具有明显的增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。该多肽链中能与“天冬酰胺羟化酶”特异结合的氨基端序列为:Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr ThrGly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr;能与CD16特异结合的肽羧基端序列为:Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明多肽的氨基端能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合;其羧基端能够与NK细胞上的CD16分子结合,通过该多肽的桥梁作用,NK细胞与肿瘤细胞更贴近、结合更加牢固,最终使NK细胞通过释放穿孔素与颗粒酶杀伤肿瘤细胞的效率更高。
2、将本发明的多肽应用于肿瘤的治疗时可使人NK细胞及NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性提高20%以上;分别给肿瘤动物模型注射该多肽时,动物肿瘤模型上的瘤体明显缩小。
具体实施方式:
为使本发明的技术方案便于理解,以下结合具体试验例对本发明所述的多肽(以下简称“HA-FC”)作进一步的说明。
实施例1:
一、随机肽库的筛选
PH.D.-12噬菌体随机肽库试剂盒购自美国NewEngland Biolabs公司。用于筛选的靶标蛋白分别为:天冬酰胺羟化酶第61—100位的氨基酸序列人工合成肽;人CD16第11-50位的氨基酸序列人工合成肽。筛选方法参照噬菌体肽库产品的说明书进行。筛选的噬菌体克隆,经序列测定,确定其基因序列并推导出其能与靶标蛋白结合的蛋白氨基酸序列。
将能与天冬酰胺羟化酶结合的2株噬菌体克隆,测序,如图1和图2所示,获得的第一株噬菌体克隆的基因序列如序列表2所示为:CAG CAC ATT CGA GAA CTC CCA TAC ACC,第二株噬菌体克隆的基因序列如序列表4所示为GCT CGT CAC TAT GGC TCC TCC TAT TATTTC GAC TAT;推导的氨基酸序列分别为:Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr(序列表3所示)和Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr(序列表5所示)。通过连接子Gly-Gly-Ser将Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr与Ala Arg His Tyr GlySer Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr连接,获得了能与天冬酰胺羟化酶结合的氨基酸序列:GlnHis Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr TyrPhe Asp Tyr(序列表10所示)。
将能与CD16结合的2株噬菌体克隆,测序,如图3和图4所示,获得的第三株噬菌体克隆的基因序列如序列表6所示为ATT AAC CCC GCA TGG TTT GCT TAT,第四株噬菌体克隆的基因序列如序列表8所示为CAA CAA TCT AAT GAA GAT CCA TAC ACA;推导的氨基酸序列为:Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr(如序列表7所示)和Gln Gln Ser AsnGlu Asp Pro Tyr Thr(如序列表9所示)。通过连接子Gly-Gly-Ser将Ile Asn Pro Ala TrpPhe Ala Tyr和Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr连接,获得了能与CD16结合的氨基酸序列:Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu AspPro Tyr Thr(如序列表11所示);
能与天冬酰胺羟化酶结合的氨基酸序列以及能够与CD16结合的氨基酸序列通过Gly-Gly-Ser连接子连接,形成了本专利的多肽‘HA-FC’:Gln His Ile Arg Glu Leu ProTyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly SerIle Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr(序列表1所示)。
上述图1、图2、图3和图4中的碱基序列与峰之间从左至右依次对应。
二、人工合成多肽
具有ADCC活性的多肽‘HA-FC’由47个氨基酸组成,多肽的合成由美联生物科技有限公司完成,合成方法采用化学合成法,合成肽的纯度在85%以上;本发明以下的多肽合成均由美联生物科技有限公司完成。
以下通过具体试验例来说明本发明的人工合成多肽所具有的提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性有益效果。
试验例1:多肽提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的体外实验
96孔培养板,肽实验孔按照不同的肽浓度分为6个组,每组4孔。另设有不加肽的对照组4个孔。以上每孔分别加入50万个NK细胞(效应细胞)后,每孔再分别加入10万个肿瘤细胞K562(靶细胞),在效靶比为5:1条件下测定NK细胞对靶细胞的杀伤活性。每孔总体积200μl(液体为含10%小牛血清的1640培养液),6组肽实验组,各孔中‘HA-FC’的浓度分别为0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.001mg/ml、0.0005mg/ml。37℃CO2培养箱4h,每孔加入20μl MTT细胞活性检测试剂,37℃CO2培养箱2h,550nm波长测定吸光值,计算杀伤率。同时设只有NK细胞以及只有K562细胞的对照孔。按照公式(一)计算杀伤率,人NK细胞的获取,采用NK细胞分离试剂盒,从人的外周血单个核细胞中分离,杀伤实验结果如表1所示:
公式(一):杀伤率(%)=〔1-(ODe+t-ODe)/ODt〕×100%;
其中ODe:单纯效应细胞孔即NK细胞孔的OD值;
ODt:单纯靶细胞孔即K562细胞孔的OD值;
ODe+t:效应细胞加靶细胞孔的OD值;
表1不同浓度‘HA-FC’对NK细胞杀伤K562肿瘤细胞的影响
从表1的实验结果可以看出,随着多肽浓度的提高,NK细胞对杀伤K562的杀伤率也逐渐提高,说明多肽‘HA-FC’提高NK杀伤肿瘤细胞具有明显的浓度依赖,证明了‘HA-FC’具有提高人NK细胞杀伤肿瘤活性的生物学特征。
为了验证多肽HA-FC单独氨基端或单独羧基端对NK细胞的活性有无影响,分别单独合成了多肽HA-FC的氨基端片段(N段:Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly SerAla Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr),以及多肽HA-FC的羧基端片段(C段:Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr),采用与上述相同的方法(将上述杀伤试验中的HA-FC多肽替换为N段或C段),分别对N段和C段对NK细胞杀伤肿瘤细胞活性的影响进行验证。结果证明,单独的HA-FC氨基端或单独的HA-FC羧基端都不能提高NK细胞的杀伤活性,结果如表2和表3所示。综合表1、表2和表3的结果,可见只有完整的HA-FC多肽才具有增强人NK细胞杀伤活性的作用。
表2单独‘HA-FC’氨基端对NK细胞杀伤K562肿瘤细胞的影响
表3单独‘HA-FC’羧基端对NK细胞杀伤K562肿瘤细胞的影响
试验例2:多肽提高NK细胞在动物体内抗肿瘤活性的实验
SCID小鼠(SPF级动物房中饲养)每只注射约5×107人PBMC,建立具有人免疫应答特征的人-鼠嵌合动物SCID-Hu。该小鼠分为6个组(肝癌组、肺癌组、乳腺癌组、胃癌组、卵巢癌组、宫颈癌组),每组8只。各组每只小鼠左大腿背侧皮下分别接种3×106个肿瘤细胞。各组中再分为2小组(每小组4只),一小组为不注射多肽的对照组,另一小组为注射多肽‘HA-FC’的治疗组组。治疗组每间隔2天,每只小鼠腹腔注射‘HA-FC’0.5mg。20天后测量瘤体体积,比较注射‘HA-FC’的治疗组与不注射‘HA-FC’的对照组瘤体体积的差别,6组中,‘HA-FC’均有明显的抑制肿瘤细胞生长的特点,治疗组与对照组,瘤体体积相差均显著如表4所示。
表4多肽对SCID-Hu荷瘤小鼠体内肿瘤生长的影响(n=4,x±s,mm3)
试验例3:多肽氨基端与天冬酰胺羟化酶特异结合的实验
一、抗多肽氨基端抗体的制备:
为了验证本专利多肽氨基端的Gln His IleArg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala ArgHis Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr(简称N-肽段)能与肿瘤细胞上的天冬酰胺羟化酶结合,首先需要制备具有针对N-肽段的特异性抗体。为此,特别合成了上述的N-肽段。以N-肽段免疫小鼠,制备抗N-肽段的抗体。免疫过程:将N-肽段0.5mg(溶解在0.5ml生理盐水中)与0.5ml的弗氏完全佐剂混合研磨,小鼠皮下多点免疫注射,每只小鼠接种5点,每点0.1ml;10日后再取0.5mgN-肽段(溶解在0.5ml生理盐水中)与0.5ml的不完全弗氏佐剂混合研磨,小鼠皮下多点免疫注射,每只小鼠接种3点,每点0.1ml;一周后加强免疫,小鼠腹腔注射N-肽段0.3mg;一周后采小鼠血,分离血清,检测抗体的效价。
效价的检测采用ELISA方法,通过包被N-肽段的ELISA板,加待测鼠血清,再加酶标羊抗鼠二抗及底物显色的常规ELISA方法确定小鼠血清中抗N-肽段的抗体效价。结果免疫小鼠血清中的抗N-肽段效价达到了1:10000的水平。最后小鼠血清提取IgG后备用。
二、N-肽段与天冬酰胺羟化酶特异结合的实验:
ELISA板包被人工合成的天冬酰胺羟化酶肽段(Ile Ala Leu Leu Gly Val Trp Thr SerVal Ala Val Val Trp Phe Asp Leu Val Asp Tyr Glu Glu Val Leu Gly Lys Leu Gly Ile Tyr AspAla Asp Gly Asp Gly Asp Phe Asp Val),随后加入本发明的多肽‘HA-FC’,37℃放置1小时,使其与天冬酰胺羟化酶结合;洗涤后加入上述制备的抗N-肽段抗体,37℃放置1小时,洗涤后加入酶标二抗作用并进行显色。
结果包被合成的天冬酰胺羟化酶肽段的OD值为0.92;而阴性对照(包被人白蛋白)的OD值很低,为0.08,与空白对照的0.05接近,该结果证实,N-肽段能与天冬酰胺羟化酶特异结合。
试验例4:多肽羧基端与CD16结合的实验
一、抗多肽羧基端抗体的制备:
为了验证本专利多肽羧基端的Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln SerAsn Glu Asp Pro tyr Thr(简称C-肽段)能与NK细胞上的CD16结合,首先需要制备具有针对C-肽段的特异性抗体。为此,特别合成了上述的C-肽段。
以C-肽段免疫小鼠,制备抗C-肽段的抗体。免疫过程:将C-肽段0.5mg(溶解在0.5ml生理盐水中)与0.5ml的弗氏完全佐剂混合研磨,小鼠皮下多点免疫注射,每只小鼠接种5点,每点0.1ml;10日后再取0.5mg C-肽段(溶解在0.5ml生理盐水中)与0.5ml的不完全弗氏佐剂混合研磨,小鼠皮下多点免疫注射,每只小鼠接种3点,每点0.1ml;一周后加强免疫,小鼠腹腔注射C-肽段0.3mg;一周后采小鼠血,分离血清,检测抗体的效价。效价的检测采用ELISA方法,通过包被肽段的ELISA板,加待测鼠血清,再加酶标羊抗鼠二抗及底物显色的常规ELISA方法确定小鼠血清中抗C-肽段的抗体效价。结果免疫小鼠血清中的抗C-肽段效价达到了1:20000的水平。提取小鼠血清IgG备用。
二、C-肽段与CD16特异结合的实验:
ELISA板包被人工合成的CD16肽片段(Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp SerVal Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn GluSer Leu Ile Ser Ser Gln Ala),随后加入本发明的多肽‘HA-FC’,37℃放置1小时,使其与CD16结合。洗涤后加入上述制备的抗C-肽段抗体;洗涤后加入酶标二抗并进行显色。结果包被合成的CD16肽段的OD值为1.21;而阴性对照(包被人白蛋白)的OD值很低,为0.06,与空白对照的0.05接近。这一结果证实,C-肽段能与CD16特异结合。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上和实质上的限制,凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用以上所揭示的技术内容,而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。