CN102921000B - 乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙酰胆碱酯酶(AChE)作为核酸酶的应用。首次公开了AChE在调节核酸稳定性、调节细胞凋亡方面的新用途，可基于此开发一系列具有应用价值的制剂，如促进或抑制细胞凋亡的试剂、抑制肿瘤的试剂、保护核酸不受损伤的试剂等；并且还首次公开了AChE与入核引导物组合后可成为肿瘤的新型“杀手”。

Description

乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用。

背景技术

细胞凋亡对于生物体，尤其是高等有机体是非常重要的一个生理过程。由于细胞凋亡的存在，发育过程中的器官及形态结构的形成，细胞合理数量的动态维持，以及对于不需要的甚至是有害的细胞(如肿瘤)的清除才变得有可能。

细胞凋亡过程中最显著的标志就是染色体断裂以及核酸降解。一般而言，在凋亡细胞中，染色体经过凝集之后，首先染色体被降解为50～300kb长度的DNA大片段，继而在核小体连接处进行有规律断裂，形成180-200bp或200bp整倍数的DNA片段，随后含片段化DNA的凋亡小体被巨噬细胞或邻近细胞吞噬，最终DNA被彻底降解，从而使细胞彻底失去基因组复制和基因转录的能力，导致凋亡不可逆的进行下去。生物化学与遗传学研究表明，细胞凋亡过程中染色体DNA的降解是一个包括不同活性，不同底物特异性的多种核酸酶共同参与的非常复杂的生物化学过程。凋亡过程中，上述多种核酸酶之间或者与其它辅助因子之间相互配合，一步一步地推进着染色体断裂以及DNA降解的过程。尽管这一过程极其重要，但是它是如何激活的，如何被具体执行的？染色体DNA的降解是凋亡的原因还是结果？这些问题至今无法给出答案。另外，尽管体内实验已证实有一部分核酸酶参与了这个过程，但是参与凋亡过程中染色体DNA降解的酶远不止已发现的这些，还有很多的酶在特定的情况下也参与了凋亡细胞染色体DNA的降解。

目前已认知的，哺乳动物细胞中参与凋亡过程中染色体DNA降解的DNA酶主要为CAD/DFF40(Caspase activated deoxyribonuclease/40-kDa DNA fragmentationfactor)，AIF(apoptosis inducing factor)以及Endo G(Endonuclease G)4。这三种酶各自在空间分布以及底物的偏好上有着非常明显的差异。在正常生长的细胞中，CAD/DFF40主要分布在细胞质内，它与其抑制因子ICAD/DFF45形成复合体而处于沉默状态。当凋亡启动后，在活化的Caspase3/7的作用下，ICAD/DFF45被剪切失活，释放出游离的CAD。CAD进入细胞核，在组蛋白H1(Histone H1)，高速迁移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)以及拓扑异构酶II(Topoisomerase II)等染色体蛋白的帮助下，促进核小体间DNA剪切，形成3’端带有羟基(3’-OH)的DNA片段。AIF最初被认为是线粒体内的一个氧化还原酶。当细胞受到凋亡刺激后，由于线粒体膜通透性的改变，AIF被释放到线粒体外，并进入细胞核引起染色体凝集和DNA断裂大片段(50kDa)的生成。由于AIF没有传统的核酸酶结构域以及有记载的核酸酶活性，有人认为AIF是通过与某个核酸酶效应分子(nuclease effector)来发挥染色体片段化的功能。与AIF类似，Endo G也是一个在线粒体里被发现的不依赖于Caspase激活的核酸酶。当细胞受到凋亡刺激后，Endo G被释放到线粒体外并进入细胞核，引起染色体凝集DNA的断裂。在DFF45缺失小鼠中，残存的DNA片段化作用是由Endo G所介导。一般认为Endo G在凋亡细胞的DNA清除过程中，扮演的是CAD/DFF40的辅助角色，此外还参与后续的核小体DNA的清除过程。体外实验发现，与CAD/DFF40相比较，Endo G诱导DNA降解时，需要更高的浓度(比CAD/DFF40高100倍)。推测，单凭Endo G的作用是不够的，还需要其他核酸酶或辅助因子的参与；Endo G和AIF这两种线粒体蛋白可能在Caspase被有限激活或Caspase被损伤时以确保细胞核降解。总之，核酸酶在体内可能协同作用以确保凋亡细胞中DNA的有效降解。虽然针对这三种酶的基因敲除能有效抑制凋亡DNA清除的进程，但是并不能完全阻止它的发生。比如CAD/DFF40缺失的哺乳动物细胞中，还是能够观察到染色体DNA的断裂和片段化，说明了还有别的核酸酶参与了这个过程。

本发明人已经发现，采用多种方法诱导多种类型细胞凋亡时，都能观察到乙酰胆碱酯酶(AChE)表达上升这一现象。但是AChE在细胞凋亡过程中究竟发挥了什么功能尚不清楚。因此，有必要深入地研究AChE在细胞凋亡过程中的作用，以期基于此开发调节细胞事件(如细胞凋亡)的新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用。

在本发明的第一方面，提供乙酰胆碱酯酶或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节核酸(如DNA)稳定性或调节细胞凋亡的组合物(如药物)。

在一个优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶用于作为核酸酶。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是：S型乙酰胆碱酯酶(AChES)、R型乙酰胆碱酯酶(AChER)或H型乙酰胆碱酯酶(AChEH)。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶选自：

(a)如SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽；

(b)如SEQ ID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；

(c)如SEQ ID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽；

(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；

(e)如SEQ ID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；

(f)SEQ ID NO:5中第2-398位氨基酸序列的多肽；

(g)SEQ ID NO:5中第32-578位氨基酸序列的多肽；

(h)GenBank登录号NP_033729.1所示的氨基酸序列中第32-579位氨基酸序列的多肽；

(i)如(a)、(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、365位和/或478位发生变异(如S234A、E365A、H478A)的多肽；

(j)将(a)-(i)任一(即选自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)任一)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(k)具有(a)多肽功能的(a)-(j)任一(即选自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)任一)多肽的片段(较佳地，其与SEQ ID NO:5的序列相同性高于20％；更佳地高于30％；更佳地高于40％；更佳地高于50％；更佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)；或

(l)具有(a)多肽功能的包含(a)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，(i)或(j)项中，不包括：仅含有SEQ ID NO:5中第2-72位氨基酸序列的多肽或其截短体。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶的激动剂选自：引导乙酰胆碱酯酶或其编码基因进入细胞核的试剂(如入核引导物)，镁离子，钙离子或可以形成镁离子和/或钙离子的物质。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶激动剂是促进乙酰胆碱酯酶损伤核酸或促进乙酰胆碱酯酶诱导细胞凋亡的激动剂。

在另一优选例中，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸(如肿瘤细胞基因组DNA，病毒基因组DNA或RNA)，或所述的细胞是肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备抑制肿瘤的组合物。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂用于制备保护核酸和/或抑制细胞凋亡的组合物。

在另一优选例中，所述的抑制剂选自：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶、蛋白结合分子、EDTA。

在另一优选例中，所述的核酸抑制物选自：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的干扰分子。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂是抑制乙酰胆碱酯酶的调节核酸稳定性或调节细胞凋亡相关活性的抑制剂。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶分子量较佳地小于80kD；更佳地小于70KD；更佳地小于60KD。

在本发明的另一方面，提供一种分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，其选自：

(b)如SEQ ID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；

(c)如SEQ ID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽；

(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；

(e)如SEQ ID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；

(f)SEQ ID NO:5中第2-398位氨基酸序列的多肽；

(g)SEQ ID NO:5中第32-578位氨基酸序列的多肽；

(h)GenBank登录号NP_033729.1所示的氨基酸序列中第32-579位氨基酸序列的多肽；

(i)如(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、365位和/或478位发生变异(如S234A、E365A、H478A)的多肽；

(j)将(b)-(i)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)任一)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:5多肽功能的多肽；

(k)具有SEQ ID NO:5多肽功能的(b)-(j)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)任一)多肽的片段(较佳地，其与SEQ ID NO:5的序列相同性高于20％；更佳地高于30％；更佳地高于40％；更佳地高于50％；更佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)；或

(l)具有SEQ ID NO:5多肽功能的包含(b)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，(i)、(j)或(k)项中，不包括：仅含有如SEQ ID NO:5中第2-72位氨基酸序列的多肽或其截短体。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体不包括全长的乙酰胆碱酯酶(如SEQ ID NO:5序列的乙酰胆碱酯酶)。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列选自(但不限于)：

(i)如SEQ ID NO:4中第4-414位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第2-138位氨基酸序列的多肽)；

(ii)如SEQ ID NO:4中第第4-573位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第2-191位氨基酸序列的多肽)；

(iii)如SEQ ID NO:4中第第4-741位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第2-247位氨基酸序列的多肽)；

(iv)如SEQ ID NO:4中第第4-1194位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第2-398位氨基酸序列的多肽)；或

(v)如SEQ ID NO:4中第94-1734位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第32-578位氨基酸序列的多肽)。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体。

在本发明的另一方面，提供所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体、所述的多核苷酸、所述的载体或所述的宿主细胞的用途，用于制备调节核酸(如DNA)稳定性或调节细胞凋亡的组合物或用于制备抗肿瘤的药物。

在本发明的另一方面，提供一种保护核酸和/或抑制细胞凋亡的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的物质，其包括：

(1)乙酰胆碱酯酶或乙酰胆碱酯酶的激动剂或拮抗剂；和

(2)引导乙酰胆碱酯酶，或乙酰胆碱酯酶的激动剂或拮抗剂进入细胞核的入核引导物。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是：S型乙酰胆碱酯酶(AChES)、R型乙酰胆碱酯酶(AChER)或H型乙酰胆碱酯酶(AChEH)。

在另一优选例中，所述的物质还包括：

(3)细胞或组织靶向性物质；和/或

(4)蛋白质转导结构域多肽。

在另一优选例中，所述的细胞靶向性物质选自(但不限于)：识别特定细胞的表面分子的结合分子(如抗体(较佳地为单抗)、配体、化学小分子或多肽)。

在另一优选例中，蛋白质转导结构域多肽选自(但不限于)：TAT、Antp、VP22或低分子质量鱼精蛋白(LMWP)。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶共价或非共价连接蛋白质转导结构域多肽。

在另一优选例中，所述的物质中，(1)、(2)、(3)和或(4)通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包裹或包埋的方式相互结合。

在另一优选例中，所述的入核引导物选自(但不限于)：核定位信号或核转运蛋白(karyopherin)或它们的核心片段(保留有核定位或核转运功能)，甾体激素，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒，阳离子聚合物，放射性核素，纳米球。

在一个选择方式中，入核引导物为核定位信号序列或具有核定位功能的核定位信号序列的片段，核定位信号序列包括：Simian Virus40(SV40)large T NLS，M9NLS，c-myc NLS，nucleoplasmin NLS，Xenopus N1NLS，FGF3NLS，and PARP NLS，antennapedia peptide，TAT peptide，c-myc peptide，VirD2peptide，nucleoplasminpeptide，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)peptide，a polyoma largeT antigen nuclear localization signal sequence，an adenovirus E1a nuclear localizationsignal sequence，and an adenovirus E1b nuclear localization signal sequence，theadenoviral NLS，the HIV-I Tat protein NLS，the lymphoid enhancer factor 1 NLS，anIBD-oligolysine peptide，a dual function CD46targeting peptide/adenoviral NLS，H2B，v-Jun，Dorsal，NIN2，SWI5，RB，PTHrP，HnRNP，Pho4，rpL23a，rpL25，Protamine(鱼精蛋白)NLS，MTA1，CBP80，Rev，STAR NLS，hTAP，Mata2NL。

在一个选择方式中，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒选自(但不限于)：JC病毒，JC病毒VP1蛋白，JC病毒样颗粒(VLP)，鸡贫血病毒，鸡贫血病毒VP3、Apoptin。

在一个选择方式中，阳离子聚合物选自(但不限于)：β-羧基酰胺化的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)和聚L-赖氨酸(PLL)。

在一个选择方式中，入核引导物包括(但不限于)：Auger-emitting radionuclides suchas(99m)Tc，persulfated molecular umbrella，glucose-derived carbon nanospheres，estradiol-pheophorbide。

在另一优选例中，所述的核定位信号序列如SEQ ID NO:3。

在另一优选例中，所述的物质是融合蛋白，其包括乙酰胆碱酯酶和入核引导物。

在一个选择方式中，所述的融合蛋白由乙酰胆碱酯酶和入核引导物组成。

在一个选择方式中，乙酰胆碱酯酶和入核引导物之间带有或不带有连接序列(如连接肽)。

在另一优选例中，所述的融合蛋白含有：乙酰胆碱酯酶(具有核心序列)以及核定位信号(具有核心序列)。

在另一优选例中，所述的核定位信号序列选自：SEQ ID NO:6中第1-19位或第2-19位或第3-10位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的核定位信号可以是单个重复单位的核定位信号，或可以是多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)串联的重复单位的核定位信号。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码前面任一所述的物质(融合蛋白)。

在本发明的另一方面，提供一种表达构建物(如质粒载体、病毒载体)，其含有编码所述物质(融合蛋白)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达构建物中，还包括与编码所述的融合蛋白的多核苷酸操作性连接的特异性启动子，所述的特异性启动子选自：细胞(如癌细胞)特异性启动子、组织特异性启动子、或细胞核特异性启动子。

在另一优选例中，所述的启动子为肿瘤细胞特异性启动子，选自(但不限于)：癌胚抗原(CEA)启动子，甲胎蛋白(AFP)启动子，survivin(SUR)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子，分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukoprotease inhibitor，SLPI)启动子，鳞状细胞癌抗原2(squamous cell carcinoma antigen2，SCCA2)启动子，前列腺癌特异性启动子PSAe(AREc)-PSMAe-TARPp[P(A)PTp]，前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)，酷氨酸激酶的基因启动子，酪氨酸蛋白酶1(tyrosinase protein l)基因的5’区特异启动子，上皮粘蛋白(MUC)-1基因启动子，肿瘤耐药基因启动子，组织特异性启动子OSP-1(ova-specificpromoter-1)，PSMA启动子，乳腺癌特异性基因1(BCSG1，breast cancer-specific gene1)启动子，多药耐药基因启动子。

在本发明的另一方面，提供所述的物质、编码所述物质的多核苷酸或含有所述多核苷酸的表达构建物的用途，用于(进入到细胞核，)损伤核酸和/或促进细胞凋亡；或用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。

在另一优选例中，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸，或所述的细胞是肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的物质用于制备抗肿瘤的药物。

在本发明的另一方面，提供一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括：所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或所述的载体，或所述的物质，或所述的编码所述物质的多核苷酸，或含有所述多核苷酸的表达构建物；以及

药学上或生理学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物抑制肿瘤或病毒。

在另一优选例中，所述的损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物是抗肿瘤的药物。

一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括：乙酰胆碱酯酶，所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或所述的载体，或所述的物质，或所述的多核苷酸，或所述的表达构建物；及

镁离子和/或钙离子。

在另一优选例中，所述的组合物的pH值是5-10。

在另一优选例中，所述的组合物的pH值是7-10。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物，其pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8，更佳地，pH约为7-8。

在本发明的另一方面，提供一种损伤(如剪切)核酸的方法(较佳地为非治疗性的方法)，包括：将乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或其激动剂或表达乙酰胆碱酯酶或其激动剂的载体，或所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或所述的载体与核酸相接触。

在本发明的另一方面，提供一种促进细胞凋亡的方法(较佳地为非治疗性的方法)，包括：

以乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或其激动剂，或表达乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)的载体，或所述的物质，或所述的编码所述物质的多核苷酸，或所述的含有多核苷酸的表达构建物处理细胞；或

使细胞表达乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或其激动剂，或所述的物质；或所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体；或

引导乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体进入到细胞核内。

在本发明的另一方面，提供一种保护核酸或抑制细胞凋亡的方法(较佳地为非治疗性的方法)，包括：

以乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)的抑制剂(特别是针对核酸酶活性位点(如SEQ ID NO:5中第2-138位)设计的抑制药物)处理细胞；

使细胞表达乙酰胆碱酯酶的抑制剂；或

阻止乙酰胆碱酯酶进入到细胞核内。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括：

(1)用候选物质处理表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；和

(2)检测所述体系中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性；

其中，若所述候选物质可提高(优选显著提高，如提高20％以上，较佳的提高50％；更佳的提高80％以上)乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若所述候选物质可降低(优选显著降低，如降低20％以上，较佳的降低50％；更佳的降低80％以上)乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

在另一优选例中，所述的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系是细胞，步骤(2)还包括：

观察乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因的入核情况，若乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因在细胞核内的比例提高(优选显著提高，如提高20％以上，较佳的提高50％；更佳的提高80％以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因在细胞核内的比例下降(优选显著下降，如下降20％以上，较佳的下降50％；更佳的下降80％以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质；或者，

步骤(2)还包括：

观察细胞核内DNA断裂情况，若DNA断裂增加(优选显著增加，如增加20％以上，较佳的增加50％；更佳的增加80％以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若DNA断裂减少(优选显著减少，如减少20％以上，较佳的减少50％；更佳的减少80％以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达、活性或入核情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；

如果测试组中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达、活性或入核在统计学上提高(优选显著提高，如提高20％以上，较佳的提高50％；更佳的提高80％以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；如果测试组中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达、活性或入核在统计学上降低(优选显著降低转录、表达或活性，如降低20％以上，较佳的降低50％；更佳的降低80％以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物；或表达乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的重组质粒；或乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体与入核引导物的融合蛋白或其编码基因等。

在另一优选例中,所述的体系选自：细胞体系(如表达乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于核酸稳定性或细胞凋亡有用的物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括：

(1)在测试组中，用候选物质处理表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞；和

(2)检测所述测试组的细胞内DNA断裂情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞；

其中，若与对照组相比，所述测试组细胞中DNA断裂显著增加(优选显著增加，如增加20％以上，较佳的增加50％；更佳的增加80％以上)，则表明该候选物质是抑制细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物。

在另一优选例中，所述的细胞是固定化的细胞；和/或所述的细胞是细胞膜经穿透处理的细胞。

在另一优选例中，所述的细胞固定化或穿透处理不引起DNA的断裂。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于核酸稳定性或细胞凋亡有用的物质。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体是不包括酯酶活性位点(如人源乙酰胆碱酯酶的第234位或附近位点、第365位或附近位点和/或第478位或附近位点)的乙酰胆碱酯酶的片段。

在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是乙酰胆碱酯酶的N端片段，例如第32-138位、第2-138位、第33-138位、第2-191位等。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括：

(1’)用候选物质处理体系(如体外的体系，溶液体系)，所述体系中含有乙酰胆碱酯酶或乙酰胆碱酯酶的片段或变异体以及核酸(如DNA，或含有DNA的质粒)；和

(2’)检测所述体系中核酸断裂情况，若核酸断裂增加(优选显著增加，如增加20％以上，较佳的增加50％；更佳的增加80％以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若核酸断裂减少(优选显著减少，如减少20％以上，较佳的减少50％；更佳的减少80％以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1’)中，包括：在测试组中，用候选物质处理所述体系；步骤(2’)中，包括：检测所述测试组的核酸断裂情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体以及核酸的体系；若核酸断裂增加，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若核酸断裂减少，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、不同方法诱导凋亡的不同细胞中AChE表达。

A、4种不同来源的细胞系在Etoposide(50μg/ml)或A23187(4μM)处理18h后，细胞裂解物通过抗AChE和anti-PARP抗体进行免疫印迹分析，以肌动蛋白(Actin)的表达为参照。

B、HeLa细胞用H₂O₂处理15h或不处理，对细胞进行免疫荧光染色并观察AChE蛋白与活化的Caspase-3(cleaved caspase3)，用Hoechst染料染核。

C、分别瞬转siRNA1和siRNA2于HeLa细胞细胞，24小时后以H₂O₂处理15h，测定裂解物中AChE表达情况。以瞬转无关siRNA(Scramble，为合成公司提供的随机合成物)的细胞作为对照。

D、HeLa细胞分别转染siRNA1、siRNA2、Scramble或共转siRNA1＋AChE表达质粒(编码人S-AChE蛋白的质粒)24小时后，FACS分析HeLa细胞凋亡情况，计算DNA片段数量。数据为3次重复实验的平均值±标准差。**P<0.01。

E、D的代表性Histogram。

图2、AChE在正常或凋亡细胞中的亚细胞分布。

A、正常生长或以H₂O₂(50μM)处理15h的HeLa细胞的共聚焦显微镜影像，正常生长或以血清饥饿处理15h的PC-12细胞的共聚焦显微镜影像。为了显示细节，白箭头所示的位置被放大于每个图的右侧。

B、A中所述的各种处理的细胞进行核-质分离，之后进行免疫印迹分析。细胞核(N)和细胞质(C)片段分别利用抗Histone H3抗体和抗α-tubulin抗体鉴定。

C、转染AChE-GFP编码质粒和Histone H2b-RFP编码质粒共转HeLa细胞内，之后以100μM H₂O₂诱导细胞凋亡，利用活体细胞实时成像系统跟踪拍摄在细胞凋亡启动后AChE的位置变化情况。

图3、AChE在核中表达启动HeLa细胞凋亡，AChE裂解超螺旋结构(supercoiled，SC)质粒DNA为缺刻(Nick)及线性结构(Linear)的DNA。

A、核定位信号(NLS)将AChE从细胞质引入到细胞核中。编码GFP、AChE-GFP和NLS-AChE-GFP的质粒瞬转入HeLa细胞后，在激光共聚焦显微镜下观察。GFP和NLS-AChE-GFP在细胞质和核中都有定位，而AChE-GFP仅分布于细胞质。

B、A中每组细胞的FACS筛选富集。GFP阳性细胞被转于96孔板，在图示时间点进行MTT试验。进行2次独立实验，数据以平均值±标准差表示。

C、转染编码GFP、Histone H2b-GFP、AChE-GFP和NLS-AChE-GFP的质粒的HeLa细胞的TUNEL染色。GFP和Histone-GFP被用作核内定位蛋白对照。

D、pEGFP-C1质粒DNA与人或小鼠AChE蛋白(0，0.5，1和2μg)共同孵育6h后进行1％琼脂糖电泳的结果。用EcoR I指示线性DNA。MK表示分子量标记。

E、随着pEGFP-C1质粒DNA(150ng)与人或小鼠AChE蛋白(1μg)孵育时间的增加，质粒分解情况。以上实验被重复三次。

图4、AChE的核酸酶活性鉴定。

A、纯化的人(Homo)和小鼠(Mus)AChE蛋白的银染分析。

B、纯化的人和小鼠AChE蛋白的免疫印迹。

C、去除小鼠AChE蛋白阻止了体外DNA剪切。偶联AChE抗体或兔IgG的蛋白G玻璃珠加入到体外DNA剪切系统中，30分钟后离心取上清，加入底物pEGFP-C1质粒DNA在37℃孵育6h。兔IgG用作标准特异性对照(iso-specific control)。该结果代表3次独立实验的结果。

D、pEGFP-C1质粒DNA与小鼠AChE蛋白和DNase I共同孵育后的电泳结果。G-Actin是DNase I抑制剂，在加入底物pEGFP-C1质粒DNA之前加入。

E、人工合成人(Homo)AChE的第32-72AA片段(T41)和第32-138AA片段(T107)，将肽段按照不同的剂量与小鼠基因组DNA共同孵育6h，随后进行DNA凝胶电泳。

F、人工合成人(Homo)AChE的第32-72AA片段(T41)和第32-138AA片段(T107)，将该肽段与小鼠基因组DNA共同孵育不同时间，随后进行DNA凝胶电泳。

G、商品化的分离自鳗鱼(Eel)的AChE按照不同剂量与质粒DNA共同孵育，同时以购自不同公司的两种牛血清白蛋白(BSA1，BSA2)作为对照，孵育5h后进行DNA凝胶电泳。

H、商品化的分离自鳗鱼(Eel)的AChE与质粒DNA共同孵育不同时间，同时以购自不同公司的两种牛血清白蛋白(BSA1，BSA2)作为对照，随后进行DNA凝胶电泳。

图5、AChE的DNA酶活性的生物化学条件分析。

A、在2.5mM CaCl₂、5mM MgCl₂、0.5mM EGTA、0.5mM EDTA或它们的组合存在下，质粒DNA(pEGFP-C1质粒)与人AChE蛋白孵育6h。

B、pH值对于AChE核酸酶活性的影响。质粒DNA与人AChE蛋白在不同pH条件下孵育3h。

图6、AChE核酸酶活性不受AChE酯酶活性抑制的影响，及AChE蛋白的DNA结合位点的结构分析。

A、通过Ellman’s方法确定AChE活性。三种AChE抑制剂(10μM Huperzine A，1μM Tacrine和5μg/ml Donepenzile)被加入以测定是否存在抑制。以iso-OMPA(BChE的抑制剂，购自Sigma公司)作为阴性对照。

B、质粒DNA与小鼠AChE蛋白共孵育，同时加入或不加入AChE抑制剂。AChE抑制剂在加入底物质粒DNA之前的30min加入。(-)代表不加AChE，(+)代表加AChE。

图7、NLS-AChES基因(NLS-AChES)诱导结肠癌SW620细胞凋亡(×100)。

A.流式筛选72h后，倒置荧光显微镜示NLS-AChES转染阳性细胞率及细胞形态学变化。

B.MTT检测流式筛选72h后NLS-AChES促细胞死亡率(n=2，p<0.001)。

图8、NLS-AChES基因显著诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡。

A.荧光倒置相差显微镜示流式细胞仪筛选细胞阳性率及NLS-AChES基因诱导细胞呈现凋亡形态学特征(×200)。

B.Tunnel染色示NLS-AChES基因诱导细胞死亡方式为凋亡。

C.MTT检测流式筛选后24h-72h内，与EGFP基因及AChES基因相比，NLS-AChES基因促使细胞死亡，表明AChES蛋白入核后发挥促凋亡功能(n=2)。

图9、NLS-AChES基因显著诱导肝癌BEL7404细胞凋亡

A.荧光倒置相差显微镜示流式细胞仪筛选细胞阳性率及NLS-AChES基因诱导细胞呈现凋亡形态学特征(×200)。

B.Tunnel染色示NLS-AChES基因诱导细胞死亡方式为凋亡。

C.MTT检测流式筛选后24h-72h内，与EGFP基因及AChES基因相比，NLS-AChES基因促使细胞死亡，表明AChES蛋白入核后发挥促凋亡功能(n=2)。

图10、免疫组化检测示临床肝癌组织样本中AChE蛋白表达下调。

A.左图，组织芯片AChE蛋白免疫组化结果(×40)；

右图，左图的分析统计结果

B.癌旁与相应癌组织样本的放大图(×600)。

图11、NLS-AChES基因抑制BEL-7404肝癌细胞在裸鼠皮下成瘤。

A.荧光体视显微镜检测流式筛选后24hr、72hr时，转染pEGFP或pEGFP-NLS-AChES质粒的BEL-7404细胞在裸鼠皮下的存在情况。

B.流式筛选后的细胞种植于裸鼠皮下，28天内肿瘤体积的变化曲线。

C.第28天时，裸鼠照片示长瘤情况。

第一排，种植pEGFP细胞，明显成瘤(右起第3、第4只，瘤太大以至于磨破)；

第二排，种植pEGFP-NLS-AChES细胞，均未成瘤。

D.28天从pEGFP组体内取出的瘤体。

E.石蜡切片HE染色显示瘤体组织细胞特征(左图×100；右图×600)。

图12、鉴定AChE蛋白分子中发挥促凋亡功能的片段。

A.AChE蛋白分子的缺失突变示意图。

B.将A所示各突变质粒分别转染HeLa细胞，经流式细胞仪分选出转染阳性细胞，将之种植于96孔板，72小时时荧光倒置相差显微镜示细胞形态学变化情况(×200)。可见，2-138AA片段及较之更长的片段均使细胞呈现死亡特征；而2-72AA片段则对细胞生存无明显影响。

C.对B中的细胞进行MTT检测，并绘制细胞生长曲线。2-138AA片段具备AChE全长的促凋亡功能，而2-72AA片段完全丧失这一功能。

图13、AChE乙酰胆碱酯酶活性位点与AChE蛋白的促细胞凋亡功能无关。

A.pEGFP-NLS-AChE(S234A，E365A，H478A)酯酶活性位点突变质粒转入宫颈癌HeLa细胞之后，荧光显微镜观察细胞形态学变化发现，与空质粒对照(pEGFP)相比，pEGFP-NLS-AChE(S234A，E365A，H478A)质粒显著促使细胞死亡。

B.MTT检测结果表明，pEGFP-NLS-AChE(S234A，E365A，H478A)质粒诱导细胞死亡程度与野生型质粒pEGFP-NLS-AChE相似。此数据表明，AChE乙酰胆碱酯酶活性位点与AChE蛋白的促细胞凋亡功能无关。

图14、给予HeLa细胞中，AChE蛋白组与BSA对照组相比的细胞内DNA断裂情况，可见AChE蛋白组的细胞内DNA发生显著的断裂。

具体实施方式

本发明人经过对乙酰胆碱酯酶(AChE)的深入研究，揭示了AChE在调节核酸稳定性、调节细胞凋亡方面的新用途。基于以上新发现，可开发一系列具有应用价值的制剂，如促进或抑制细胞凋亡的试剂、抑制肿瘤的试剂、保护核酸不受损伤的试剂等。并且，也可以AChE作为靶标，筛选一系列可通过调节AChE的表达或活性而发挥调节核酸稳定性或细胞凋亡的试剂。本发明还首次揭示了AChE与入核引导物组合后可成为肿瘤的新型“杀手”。

术语

如本文所用，所述的“核酸酶”是指对于核酸有损伤作用的酶，所述的损伤例如：剪切、降解。所述的核酸酶作用于核酸链的中间或首尾，使核酸断裂、刻缺或形成线性。所述的“核酸酶”较佳地为脱氧核糖核酸酶。

如本文所用，所述的“核酸”包括脱氧核糖核酸、核糖核酸，其是以A、T(或U)、C或G为基本的组成单位。所述的核酸包括了未经修饰的或部分位点经过修饰的形式。

如本文所用，所述的“入核引导物”是指一种靶向性物质，其对于细胞核具有靶向作用，可通过与被引导物(如AChE)共价连接(如融合)、偶联、附着、包裹或包埋等方式相互结合，之后将被引导物(如AChE)引入到细胞核内的物质的总称。

如本文所用，所述的“肿瘤”为各种良性或恶性肿瘤，鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。

如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

当用于描述序列时，所述的“含有”、“具有”或“包括”X多肽的氨基酸序列(或Y核苷酸序列)限定了有限的情况，除了核心的“X多肽的氨基酸序列(或Y核苷酸序列)”以外，其两端或其中一端仅可以增加有限多的氨基酸(或核苷酸)，如增加1-600个，较佳地增加1-500个，更佳地增加1-400个，更佳地增加1-300个，更佳地增加1-200个，更佳地增加1-100个，更佳地增加1-50个，更佳地增加1-30个，更佳地增加1-20个，更佳地增加1-10个，更佳地增加1-5个氨基酸。或如增加1-1800个，较佳地增加1-1500个，更佳地增加1-1200个，更佳地增加1-900个，更佳地增加1-600个，更佳地增加1-300个，更佳地增加1-150个，更佳地增加1-90个，更佳地增加1-60个，更佳地增加1-30个，更佳地增加1-15个核苷酸，更佳地增加1-5个核苷酸。

如本文所用，所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的“蛋白质转导结构域多肽”是指一种具有蛋白递送功能的蛋白，其能够与目的蛋白连接或偶联，并将目的蛋白递送到细胞内。

如本文所用，所述的“蛋白质转导(protein transduction)”是指目的蛋白(如乙酰胆碱酯酶)用重组技术或化学偶联等蛋白质转导(protein transduction)是指靶蛋白用重组技术或化学偶联等方法连接到蛋白质转导结构域上(protein transduction domains,PTDs)，然后通过例如PTD的作用可以直接将靶蛋白递送到细胞内的方法。已经发现的蛋白质转导结构域包括TAT、Antp和VP22等(Beerens A M J,Al Hadithy A F Y,Rots M G,et al.Protein transduction domain and their utility in gene therapy.Curr GeneTher，2003，3(5):486～494)。

如本文所用，所述的“核定位信号”是指一种具有细胞核定位功能的多肽，其能够与目的蛋白连接或偶联，并将目的蛋白递送到细胞核。所述的“核定位信号”可以采用本领域已知的可引导蛋白进入到核内的任何分子，只要其具有细胞核定位的作用。其中一类的核定位信号包含核心序列，所述的核心序列由含3-4个赖氨酸或者精氨酸的多肽(如六肽)构成，基本结构为Lys-Arg/Lys-X-Arg/Lys，不含酸性氨基酸和大分子的氨基酸；核心NLS的旁侧可以为脯氨酸或甘氨酸。所述的“核定位信号”可以是仅含有核心序列的蛋白、也可以还包含其它序列的更长序列的蛋白。

乙酰胆碱酯酶

乙酰胆碱酯酶(AChE)为一种现有技术中为本领域技术人员熟知的酶，其以往被人们熟知的功能是作为胆碱能神经突触和神经-肌肉接头处水解神经递质乙酰胆碱的重要分子，此外还参与一些“非经典功能”，如可能在神经突生成，细胞增殖，细胞黏附，突触发生，淀粉样纤维聚集，造血以及血小板生成过程中起作用。而本发明第一次揭示了其在调节核酸稳定性方面具有作用，也即可以作为一种核酸酶。

本发明人在广泛研究中意外发现，AChE除了水解ACh的活性外，还具有核酸酶活性，其参与了细胞凋亡过程中染色体DNA的降解的过程。细胞启动凋亡信号后，AChE的表达量上升并从细胞质向细胞核内转移。体外实验发现，分离纯化的人源和鼠源AChE蛋白都具有将超螺旋结构的质粒DNA剪切成缺刻和线性结构DNA的能力。更重要的是，在肿瘤细胞的细胞核内表达AChE引起细胞死亡。

在本发明中，所述的AChE蛋白(多肽)可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物。此外，所述的AChE蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组AChE蛋白。较佳地，可采用重组的AChE蛋白。

根据本发明的内容，不论是包括人类和小鼠在内的哺乳动物来源的AChE，还是鱼类(鳗鱼)来源的AChE，都能够引起基因组DNA和质粒DNA的降解，即都具有核酸酶的活性。因此应理解，任何来源的适合的AChE都可用于本发明，并都落在本发明的权利要求范围内，而不仅仅限于个别物种来源的AChE。

任何适合的AChE蛋白均可用于本发明。所述的AChE蛋白包括全长的AChE蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。例如，所述的AChE蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:5(或GenBank登录号P22303.1，或GenBank登录号NP_033729.1，或其他已知的不同动植物来源的AChE蛋白)所示的序列基本上相同。

作为本发明的优选方式，所述的AChE蛋白的生物活性片段选自：(b)如SEQ IDNO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；(c)如SEQ ID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽；(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；(e)如SEQ ID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；(f)SEQ ID NO:5中第2-398位氨基酸序列的多肽；(g)SEQ ID NO:5中第32-578位氨基酸序列的多肽；(h)GenBank登录号NP_033729.1所示的氨基酸序列中第32-579位氨基酸序列的多肽；(i)如(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、365位和/或478位发生变异(如S234A、E365A、H478A)的多肽；(j)将(b)-(i)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)任一)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:5多肽功能的多肽；(k)具有SEQ ID NO:5多肽功能的(b)-(j)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)任一)多肽的片段(较佳地，其与SEQ ID NO:5的序列相同性高于20％；更佳地高于30％；更佳地高于40％；更佳地高于50％；更佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％或99％)；(l)具有SEQ ID NO:5多肽功能的包含(b)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。上述AChE蛋白的生物活性片段保留了全长AChE蛋白的生物活性，并且乙酰胆碱酯酶活性位点突变体也完全保留了其野生型蛋白的促凋亡生物学功能。

AChE蛋白的氨基酸序列的N端第1-31位为信号肽序列，这是现有技术已知的，如参见J Neural Transm(2009)116:1435-1442；Pro-apoptotic protein-protein interactionsof the extended N-AChE terminus或THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY；Vol.279，No.28，Issue of July9，pp.29740-29751，2004中所报导的。信号肽发挥了蛋白引导的作用，而通常并不是发挥蛋白活性的必要结构。因此，结合本发明的结果可以确定，AChE蛋白的第32-138位是可以发挥核酸酶的作用的。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的AChE蛋白或其生物活性片段的氨基酸序列也包括在本发明中。AChE蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等MolecularBiology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种AChE蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，AChE蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的AChE蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长AChE蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长AChE蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的AChE蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的AChE蛋白。所述经过修饰或改良的AChE蛋白可以是一种AChE蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的AChE蛋白可以是与天然存在的AChE蛋白具有较小的共同点，但也能发挥核酸酶的作用，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响AChE蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

AChE蛋白已经公知在许多动植物中以高度的保守性存在，例如在人和小鼠中，AChE蛋白的序列相同性(同源性)达到88％。因此，可以理解，来源于不同动植物的AChE均包含于本发明中。较佳地，它们是与SEQ ID NO:5或其生物活性片段所示氨基酸序列相比，序列相同性高于60％的，更佳地是高于70％，更佳地是高于80％，更佳地是高于85％，更佳地是高于88％，更佳地是高于90％，更佳地是高于95％，更佳地是高于98％。

在哺乳动物中，AChE蛋白为一个基因所编码，但由于其C端剪接形式不同而存在三种亚型，分别为S型乙酰胆碱酯酶(AChES)、R型乙酰胆碱酯酶(AChER)和H型乙酰胆碱酯酶(AChEH)。此三种亚型均保持了AChE本身所固有的经典功能，即在神经元突触以及周围神经系统的神经肌肉接头处水解乙酰胆碱，终止神经冲动传递等。AChER和AChEH也具有与AChES相同的第1-547位序列(含有核酸酶功能位点)，因此，它们均被包含在本发明中。

一旦分离获得了所述蛋白的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白。这通常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，对于较短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。

本发明还包括了编码所述的AChE蛋白的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码AChE蛋白的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的AChE蛋白的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的蛋白。

基于本发明人的新发现，本发明提供了AChE蛋白或其生物活性片段的用途，包括但不限于：用于作为核酸酶(可进行体外非治疗性地应用)，用于制备调节核酸(如DNA)稳定性的组合物，用于制备调节细胞凋亡的组合物，用于抑制肿瘤，用于筛选抑制调节核酸稳定性的物质，或用于筛选调节细胞凋亡的物质，等等。

AChE蛋白或其激动剂对于损伤核酸和/或促进细胞凋亡有显著的作用，这是非常具有应用价值的。肿瘤是一种恶性细胞过度增殖导致的疾病，可以利用AChE蛋白或其激动剂(特别是可引导AChE入核的物质)来损害肿瘤细胞的核酸，从而达到有效杀灭肿瘤细胞的效果。本发明的实施例已经证明，AChE与核定位信号的融合蛋白具有极其优异的杀灭肿瘤效果。

所述的AChE蛋白本身可以直接用于促进细胞凋亡，AChE蛋白通常为分子量小于约70kD的蛋白；而其片段则分子量更小。本领域已知，蛋白入核是通过扩散或转运，是否能够入核与蛋白分子的大小相关，分子量较小或直径小于10nm的蛋白可以通过扩散穿过核孔复合体(NPC)进入到核内(参见Virol Sin.2010Apr；25(2):79-85.Epub2010Apr9；The nucleocytoplasmic transport ofviral proteins)，从而发挥DNA降解作用。此外，也可以将AChE蛋白与入核物质相互结合，以更高效地进入到细胞核内。

调节剂

如本文所用，所述的AChE的激动剂包括了稳定剂、促进剂、上调剂等。任何可提高AChE蛋白的活性、维持AChE蛋白的稳定性、促进AChE蛋白的表达、延长AChE蛋白有效作用时间、促进AChE的基因转录和翻译以及的物质均可用于本发明，作为可用于损伤核酸和/或促进细胞凋亡的有效物质。AChE的激动剂还包括一些可以引导AChE进入到细胞核内的入核引导物，或者为AChE提供较好的作用环境的离子，如镁离子。

如本文所用，所述的AChE的拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低AChE蛋白的活性、降低AChE蛋白的稳定性、抑制AChE蛋白的表达、减少AChE蛋白有效作用时间或抑制AChE的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于保护核酸和/或抑制细胞凋亡的有效物质。一些对于保护核酸和/或抑制细胞凋亡有效的物质，可用于预防、缓解或治疗阿尔茨海默症(AD)、帕金森(PD)等退行性疾病。

基于本发明的新发现以及结合现有常识，本领域技术人员可以制备或设计出AChE的激动剂或抑制剂，这些激动剂或抑制剂也包括在本发明中。

作为本发明的优选方式，所述的AChE的激动剂包括(但不限于)：表达乙酰胆碱酯酶的质粒，引导乙酰胆碱酯酶或其编码基因进入细胞核的试剂(如入核引导物)，镁离子，钙离子或可以形成镁离子和/或钙离子的物质。

所述的AChE的激动剂通过影响AChE而实现对核酸对损伤作用或促进细胞凋亡。从而可用于制备损伤核酸或促进细胞凋亡的药物，特别是抗肿瘤药物。

所述的AChE的拮抗剂可以是核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶、蛋白结合分子、EDTA，其能够下调乙酰胆碱酯酶蛋白或其编码基因的表达。作为本发明的优选方式，所述的AChE的拮抗剂是基于AChE的基因序列设计的核酸抑制物，如小干扰分子。较佳地，所述的小干扰分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。根据特定的靶序列来设计干扰分子是本领域技术人员已知的，目前用于构建干扰分子的质粒完全可以通过商购途径获得。所述的干扰RNA分子可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。根据已知的蛋白，筛选可以抑制其活性的抗体(单抗或多抗)也是本领域常规的技术。

所述的AChE的抑制剂通过影响AChE而实现对核酸的保护作用或抑制细胞凋亡。尤其是当细胞凋亡发生时，AChE会进入到核内，这时候利用AChE的抑制剂处理可以阻止AChE的入核，或抑制AChE的表达或活性，从而起到抑制细胞凋亡的作用。对于一些由于AChE入核导致细胞凋亡的有益细胞，可采用AChE的抑制剂加以保护，减缓其凋亡的进程或抑制其凋亡。

入核物质

核酸通常存在于细胞核内，因此，一些可以引导AChE或其激动剂或拮抗剂进入到核内的物质是对于调节核酸稳定性或调节细胞凋亡有用的物质。因此，本发明还提供了一种包括(1)AChE或其激动剂或拮抗剂；和(2)引导AChE或其激动剂或拮抗剂进入细胞核的入核引导物的物质。(1)和(2)通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附或附着、包埋或包裹的等方式相互结合。

入核引导物可以采用本领域已知的可引导蛋白或其编码基因进入到核内的任何分子，只要其具有靶向细胞核的作用。例如所述的入核引导物可以是(但不限于)：核定位信号(NLS)，核转运蛋白(karyopherin)或它们的核心片段(保留有核定位或核转运功能)，甾体激素，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒，阳离子聚合物，放射性核素，纳米球。

入核引导物包括：Simian Virus40(SV40)large T NLS，M9NLS，c-myc NLS，nucleoplasmin NLS，Xenopus N1 NLS，FGF3NLS，and PARP NLS，antennapediapeptide，TAT peptide，c-myc peptide，VirD2peptide，nucleoplasmin peptide，arylhydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)peptide，a polyoma large T antigennuclear localization signal sequence，an adenovirus E1a nuclear localization signalsequence，and an adenovirus E1b nuclear localization signal sequence，the adenoviralNLS，the HIV-I Tat protein NLS，the lymphoid enhancer factor 1 NLS，anIBD-oligolysine peptide，a dual function CD46targeting peptide/adenoviral NLS，H2B，v-Jun，Dorsal，NIN2，SWI5，RB，PTHrP，HnRNP，Pho4，rpL23a，rpL25，Protamine(鱼精蛋白)NLS，MTA1，CBP80，Rev，STAR NLS，hTAP，Mata2 NL。

在一个选择方式中，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒选自(但不限于)：JC病毒，JC病毒VP1蛋白，JC病毒样颗粒(VLP)，鸡贫血病毒，鸡贫血病毒VP3、Apoptin。

所述的入核引导物可以是肿瘤细胞特异性的，例如病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒。更具体地如JC病毒(JCV)，能形成病毒样颗粒(VLP)，可在内部包裹荧光染料Cy3或药物，直接转运进入细胞核；或如JC病毒(JCV)的VP1蛋白，能将目的蛋白转运进入细胞核，可将之与AChE制备融合蛋白(参见中华微生物学和免疫学杂志，2005年02期，JC病毒样颗粒可直接转运进入细胞核)。另外的入核引导物如来自于鸡Anemia病毒的病毒蛋白3(viral protein3(VP3 or Apoptin)from Chicken Anemia Virus)，该蛋白的C末端具有肿瘤细胞特异性的核定位信号(tNTS)，可以有效地定位到肿瘤或转移肿瘤细胞的细胞核(参见Drug Resist Updat.2006Feb-Apr;9(1-2):40-50.Epub2006Apr18；Tumor-specific nuclear targeting:promises for anti-cancer therapy?)。另外的入核引导物是阳离子聚合物，如β-羧基酰胺化的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)和聚L-赖氨酸(PLL)，其是从负电向正电翻转的新型细胞核靶向的药物载体，用于将药物直接输送到癌细胞的细胞核中，其可包埋抗肿瘤药物如AChE并有效地将药物输送到细胞核中(参见高分子通报,Polymer Bulletin,编辑部邮箱2010年12期电荷翻转型药物载体用于肿瘤细胞核靶向药物输送的研究)。

所述的入核引导物也可以是一些肿瘤细胞非特异性的物质，例如Auger-发射放射性核素(radionuclides)，如(99m)Tc，参见J Biol Inorg Chem.2011Jun25.[Epub ahead ofprint]；Nuclear targeting with cell-specific multifunctional tricarbonyl M(I)(M is Re,(99m)Tc)complexes:synthesis,characterization,and cell studies。或例如过硫酸分子伞(persulfated molecular umbrella)，参见Bioconjug Chem.2008Aug;19(8):1510-3.Epub2008Aug6.Cellular entry and nuclear targeting by a highly anionic molecular umbrella。或例如葡萄糖来源的碳纳米球(glucose-derived carbon nanospheres)，参见Nano Lett.2008Oct;8(10):3182-8.Epub2008Sep19.Intrinsically fluorescent carbon nanospheres asa nuclear targeting vector：delivery of membrane-impermeable molecule to modulate geneexpression in vivo。或例如雌二醇-脱镁叶绿酸(estradiol-pheophorbide)，参见PhotochemPhotobiol Sci.2006Nov;5(11):996-9.Epub2006Oct9.Synthesis ofestradiol-pheophorbide a conjugates:evidence of nuclear targeting,DNA damage andimproved photodynamic activity in human breast cancer and vascular endothelial cells。

作为本发明的优选方式，所述的AChE或其激动剂或拮抗剂(或其与入核引导物的复合体)还可与细胞或组织靶向性物质通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包裹或包埋等方式相互结合。所述的细胞或组织靶向性物质包括：识别特定细胞的表面分子的结合分子(如抗体(较佳地为单抗)、配体、化学小分子或多肽)，甾体激素。例如，当所述的细胞为乳腺癌细胞时，所述的结合分子是抗Her2的抗体；当所述的细胞为前列腺癌时，所述的结合分子是LHRH多肽。

作为本发明的优选方式，所述的AChE或其激动剂或拮抗剂(或其与入核引导物的复合体)还可与蛋白质转导结构域多肽通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包裹或包埋等方式相互结合。已经发现的蛋白质转导结构域包括TAT、Antp和VP22等(Beerens A M J,Al Hadithy A F Y,Rots M G,et al.Protein transductiondomain and their utility in gene therapy.Curr Gene Ther,2003,3(5):486～494)。从鱼精蛋白自然衍生出的无毒肽称为低分子质量鱼精蛋白(low mo lecu lar w e igh t pro tamine，LMWP)。它具有较高的Arg含量，并具有类似TAT(目前已知非常重要的蛋白转导域多肽)的重要序列。因此，LMWP具备穿透生物膜的能力，使原本不能透过生物膜的蛋白大分子等进入细胞并保持蛋白的功能。例如，一种蛋白质转导结构域多肽参见中国生物工程杂志；2004年5月第24卷第5期“多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送”中所报导的。又例如，一种蛋白质转导结构域多肽参见Proc NatlAcad Sci U S A.2002Apr2;99(7):4489-94.Epub2002Mar19.Ability of thehydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Crerecombinase:a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes所报导的，通过将目的蛋白(如AChE)连接到蛋白质转导结构域上(protein transduction domains,PTDs)，然后通过PTD的作用可以直接将靶蛋白递送到细胞内的方法。

作为本发明的优选方式，所述的对于调节核酸稳定性或调节细胞凋亡有用的物质是一种AChE与入核信号分子的融合蛋白；较佳地是AChE与核定位信号(NLS)的融合蛋白。

本发明所述的核定位信号(NLS)可以是包含核心序列(Lys-Arg/Lys-X-Arg/Lys)，不含酸性氨基酸和大分子的氨基酸的核定位信号，参见HallMN,Craik C,Hiraoka Y.Homeodomain of yeast rep ressor al2pha2contains a nuclear localization signal.ProcNatl Acad Sci USA,1990,87:695426958。

融合蛋白的制备是本领域技术人员已知的，所述的AChE与入核信号分子之间可以包括或不包括多肽连接子(连接肽)。较佳地，所述的融合蛋白是SEQ ID NO:5或其中第1-547位氨基酸序列与SEQ ID NO:3的核苷酸序列所编码的氨基酸序列相融合而成，两者之间可包括一些连接肽序列。较佳地，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

编码所述的融合蛋白的核酸也包含在本发明内，该核酸可以是天然的AChE或NLS的核酸序列连接而成；也可以是它们的变异体或简并体。包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体也包含在本发明内。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。包含编码所述融合蛋白的核酸的宿主细胞也包含在本发明内。

本发明的AChE与入核引导物的结合体或编码AChE与入核引导物的结合体的构建物在引入到细胞内后，可发挥出乎意料的促进细胞(包括肿瘤细胞)凋亡的效果，这对于消除有害细胞(如肿瘤细胞)是非常有用的。因此，AChE与入核引导物的结合体是一种极其优异的抗肿瘤分子。

本发明在实施例中首次证实，编码AChE与入核信号分子的融合蛋白的NLS-AChES基因导入多种肿瘤细胞之后，显著诱导细胞凋亡，凋亡率约100％；此外，NLS-AChES基因完全抑制人肿瘤细胞在裸鼠皮下的成瘤能力。上述实验数据证明，NLS-AChES基因是一种新型抑癌基因。无论在诱导细胞凋亡方面，还是在它所作用的细胞类型普遍性方面，NLS-AChES融合基因都具p53基因无可比拟的优越性。NLS-AChES融合基因是一种更为有效的“肿瘤杀手”基因，是抗肿瘤基因治疗药物的新型先导性基因，可望为癌症患者的康复带来新曙光。

基于上述实验的反复验证，本发明人断定：NLS-AChES融合基因在肿瘤细胞中过表达后能高效促进细胞凋亡；通过含肿瘤组织特异性启动子的载体靶向性启动该基因表达，可特异性导致体内恶性肿瘤细胞高效性死亡。一些肿瘤组织特异性启动子例如如表1所示。

表1

AChES具备以下的优点：第一，单基因导入可有效诱导肿瘤细胞凋亡；第二，位于凋亡信号通路下游，这样导入的野生型基因功能的发挥不受凋亡通路中其它基因突变的干扰。不仅AChES单基因导入可致使肿瘤细胞凋亡率约100％，而且该基因位于AChE凋亡信号通路最下游，其蛋白入核后直接执行DNA降解功能，故野生型AChES导入肿瘤细胞之后其功能的发挥免受通路中其它基因突变的制约。

载体和细胞

本发明还包括了包含编码所述AChE蛋白(或其生物活性片段)、或编码AChE蛋白(或其生物活性片段)与入核引导物和/或细胞或组织靶向性物质和/或蛋白质转导结构域多肽的核酸的载体(表达载体)。所述的表达载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、病毒如植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒)或其他载体；包括原核载体和真核载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码所述AChE蛋白(或其生物活性片段)、或含编码AChE蛋白(或其生物活性片段)与入核引导物和/或细胞或组织靶向性物质的核酸的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。或者可以直接作为基因治疗物质给予需要治疗的对象。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

此外，包含编码所述AChE蛋白(或其生物活性片段)、或编码AChE蛋白(或其生物活性片段)与入核引导物和/或细胞或组织靶向性物质的核酸的重组细胞也包括在本发明中。“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

组合物

本发明还提供了一种调节DNA损伤或细胞凋亡的组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的上述调节物质(包括：所述的AChE蛋白或其激动剂或拮抗剂，或乙酰胆碱酯酶或其激动剂或拮抗剂与入核引导物和/或细胞或组织靶向性物质和/或蛋白质转导结构域多肽组成的物质)，以及药学上可接受的载体。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的上述调节物质以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的组合物还可制成缓释制剂。

本发明所述的调节物质的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的AChE蛋白或其激动剂或拮抗剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的AChE蛋白或其激动剂或拮抗剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

当所述的调节物质是AChE蛋白或其激动剂，或乙酰胆碱酯酶或其激动剂与入核引导物组成的物质，所述的组合物可以制备成一种抗肿瘤的药物，经证明其具有极其优异的抗肿瘤效果。

药物筛选

在得知了所述的AChE蛋白的新功能后，可以基于该特征来筛选调节AChE的转录、表达、活性或入核状况的物质，从而找到可通过影响AChE而影响核酸稳定性或细胞凋亡状况的药物。

因此，本发明提供一种筛选可调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达或含有AChE的体系；和检测所述体系中AChE的转录、表达或活性；其中，若所述候选物质可提高AChE的转录、表达或活性，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若所述候选物质可降低AChE的转录、表达或活性，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

在本发明的优选方式中，所述的表达或含有AChE的体系是细胞体系，从而，还包括：观察乙酰胆碱酯酶或其编码基因的入核情况，若乙酰胆碱酯酶或其编码基因在细胞核内的比例提高，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若乙酰胆碱酯酶或其编码基因在细胞核内的比例下降，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。

在本发明的提示下，本领域技术人员均能够去初步地选择一些候选物质，如认为潜在有用的物质。例如，所述的候选物质包括(但不限于)：针对乙酰胆碱酯酶或其编码基因设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物；或表达乙酰胆碱酯酶的重组质粒；或乙酰胆碱酯酶与入核引导物的融合蛋白或其编码基因等。

在进行筛选时，为了更易于观察到AChE的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达AChE的体系。

作为一种选择方式，基于本发明的新发现，可筛选抗AChE核酸酶活性的药物，例如，抗AD和PD的药物。以往使用筛选ACHE抑制剂的方法是利用ACHE的酯酶活性，筛选治疗AD的药物。因为，能抑制ACHE的酯酶活性的药物，就是ACHE抑制剂。但是，抑制ACHE的酯酶活性的药物，不一定抑制细胞凋亡，更不一定抑制DNA酶活性。本发明人发现ACHE具有核酸酶活性，新核酸酶活性与酯酶活性或功能区无关，因此要筛选ACHE的核酸酶抑制剂，必须检测该酶是否具有剪切DNA的能力。本发明的新方法，可以用于检测某蛋白质是否具有剪切DNA的能力的方法。以后筛选治疗AD药物时，只要用ACHE最小片段，如SEQ ID NO:5中第2-138第片段或更小的如第33-138aa的片段，该片段有剪切DNA的作用，侯选抑制剂加入后，核酸酶活性消失，说明该侯选抑制剂抗细胞凋亡有效，也是抗AD有效。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节细胞凋亡或核酸稳定性真正有用的物质。

作为本发明的优选方式，在利用AChE进行筛选时，优选采用不包括全部或部分AChE酯酶活性关键位点的AChE片段(如人源乙酰胆碱酯酶的第234位或附近位点、第365位或附近位点和/或第478位或附近位点)，从而筛选获得的物质是通过调节AChE的核酸酶活性位点来起作用的。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次揭示了AChE的一种全新的功能，即作为核酸酶的功能，并为凋亡细胞DNA降解这一生理过程的机制提供了新的理解。

(2)本发明首次揭示了AChE与入核引导物结合后入核可以极其有效地促进细胞凋亡，其可作为肿瘤的新型“杀手”。以本发明为基础，可开发新型抗肿瘤基因治疗药物，突破目前恶性肿瘤的治疗困境，为癌症患者带来新希望。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I、材料和方法

细胞培养

人宫颈癌细胞HeLa，结肠腺癌细胞HT-29，神经胶质瘤细胞SK-N-SH，微血管内皮细胞HMEC-1，胚肾细胞HEK293T，大鼠肾上嗜铬细胞瘤细胞PC-12，人结肠腺癌SW620细胞，肝癌BEL-7404细胞来自美国细胞菌种库(ATCC)。

MCDB131，DMEM，Opti-MEMI培养基，马血清购自GIBCO-BRL；新生牛血清购自四季青。HMEC-1细胞按照生产商建议(Invitrogen)培养在完全的MCDB131培养基中。当细胞生长到饱和状态时，转移到新的明胶包被的培养瓶中；细胞传到7代稳定后用于实验。PC-12的储存培养和细胞培养分别在RPMI1640培养基(含10％的FBS)中。HeLa，SK-N-SH，HT-29和HEK293T细胞培养在DMEM培养基(含10％的FBS)中。

试剂及材料

兔抗剪切的Caspase-3的多抗(no.9661)，兔抗PARP的多抗(no.9542)购自CellSignaling technology，MA，USA；小鼠抗β-actin抗体(AC-15)购自Sigma；羊抗人AChE抗体(N-19)，羊抗Histone H3抗体(C-16)，鼠抗α-Tubulin抗体(B-5-1-2)，辣根过氧化物酶偶联羊抗兔Ig G二抗购自Santa Cruz Biotechnology；逆转录酶M-MLV购自Promega Life Science；高保真酶KOD-Plus购自TOBOYO；BCA购自PierceBiotechnology。TUNEL检测试剂盒购自Roche。转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen。G-actin蛋白购于Cytoskeleton(Denver，CO，USA)。

质粒和siRNA

含有编码人S型乙酰胆碱酯酶(S-AChE蛋白)的序列的质粒获自The HebrewUniversity of Jerusalem，Israel。根据需要，可再将人源全长的AChE cDNA序列(GenBank登录号：M55040)克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-N1(Clontech，MountainView，CA)中，获得表达AChE-GFP的质粒pEGFP-AChE。针对人AChE的两组siRNA寡聚核苷酸序列如下：

siRNA1，AAGUCUCCCGCGUUGAUGAGGGCCU(SEQ ID NO:1)；

siRNA2，AAGAAGCGGCCAUCGUACACGUCCA(SEQ ID NO:2)。

核定位信号SV40NLS的序列(末端含HindIII酶切位点AAGCTT)如下：5’-ATGGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGGTAGGACCAAAGAAGAAGCGTAAGGTT(SEQ ID NO:3)AAGCTT-3’。(编码的是MAPKKKRKVG PKKKRKV；其中核心片段PKKKRKVG)。

制备质粒DNA

质粒的小量制备：挑单菌落接种于3ml LB培养液中，37℃振荡培养12-16小时。4000rpm离心5分钟收集菌体，吸干。用预冷的100μl Solution I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA)悬浮混匀。加入200μl新鲜配制的SolutionII(0.2M NaOH，1％SDS)20mL，混匀。再加150μl预冷的Solution III(3M NaAC，5M HAC，pH4.8)，混匀后冰浴3-5分钟。12000rpm离心10分钟。收集上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇，震荡。12000rpm室温离心5分钟。上清转移，加2倍体积乙醇沉淀DNA。最后用70％乙醇漂洗沉淀，真空干燥，溶于适量TE(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)。质粒的大量制备用质粒中抽试剂盒(Plasmid Midi Kit，QIAGEN)。

重组质粒构建

pEGFP载体购自Clontech公司。

表达AChE-GFP质粒构建：将人源全长的AChEcDNA序列(GenBank登录号：M55040)克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-N1(购自Clotech)的BglII/EcoRI位点中，获得pEGFP-AChE。

表达AChE(1-547AA)质粒构建：将人源AChE cDNA中编码1-547AA的序列克隆到表达载体pEGFP-N1的BglII/EcoRI位点中，获得pEGFP-AChE(1-547AA)。

表达AChE(1-548AA)质粒构建：将鼠源AChE cDNA(GenBank登录号：NM_009599.3)中编码1-548AA的序列克隆到表达载体pEGFP-N1的BglII/EcoRI位点中，获得pEGFP-AChE(1-548AA)。

表达Histone H2b-RFP融合蛋白的质粒：pDsRed2-N1购自clontech公司；将常规的人源Histone H2B基因克隆到上述质粒的SalI/NotI限制性酶切位点之间。

表达Tubulin-GFP融合蛋白的质粒构建：pEGFP-c1质粒(购自clontech公司)；将常规的人源tubulin基因克隆到上述质粒的BglII/SalI限制性酶切位点之间。

带有核定位信号(NLS)的人源AChE质粒构建：获得编码人源AChE的cDNA序列，在其5’端(不含ATG)之前加上编码NLS序列(MAPKKKRKVGPKKKRKV)的DNA，获得融合基因，插入到pEGFP的BglII/EcoRI位点中，获得pEGFP-NLS-AChE。

基于pEGFP-NLS-AChE，对其中的AChE编码序列进行突变(相应于人AChE第234、365、478位，即S234A、E365A、H478A突变)采用常规的定点突变技术。

AChE蛋白分子的缺失突变体

为了研究AChE蛋白中具体发挥核酸酶作用的位点，构建一系列突变体，包括：第2-398位，第2-247位，第2-191位，第2-138位，第2-72位(注：序列位点的计算基于SEQ ID NO:5的人源AChE蛋白序列)。

获得编码上述蛋白片段的DNA序列后，在其5’端带上NLS序列。首先，将NLS序列插入到表达载体pEGFP的BglII/EcoRI位点中，获得pEGFP-NLS载体。然后，在此载体的HindIII/EcoRI位点之间，分别插入野生型AChE序列(SEQ ID NO:4)的4bp-1194bp、4bp-741bp、4bp-573bp、4bp-414bp、4bp-216bp碱基片段序列，即分别获得pEGFP-NLS-AChE(2-398AA)，pEGFP-NLS-AChE(2-247AA)，pEGFP-NLS-AChE(2-191AA)，pEGFP-NLS-A ChE(2-138AA)，pEGFP-NLS-A ChE(2-72AA)。

细胞处理及常规质粒转染

一般情况下，细胞置于含10％新生牛血清，以及链霉素(100μg/ml)和青霉素(100单位/ml)的DMEM培养液中，培养在含5％二氧化碳的37℃培养箱中。细胞计数并以5×10⁴细胞/ml传代。处理前，以一定密度将细胞接种于6孔板，培养使其18小时后的覆盖率达到约70％。将2μg质粒与125μl有血清无抗生素的Opti-MEMI培养液混匀(溶液A)，室温放置5分钟。将5μl Lipofectamine2000与125μl有血清无抗生素的Opti-MEMI培养液混匀(溶液B)。合并溶液A和溶液B，混匀后室温放置20分钟。吸去培养板中含抗生素的培养液，每孔加750μl有血清无抗生素Opti-MEMI培养液覆盖细胞，加入上述250μl Lipofectamine-DNA混合液，轻晃混匀。37℃，5％CO₂条件下培养6小时。吸去转染混合液，重新加入1500μl DMEM完全培养液，继续培养。

肿瘤细胞瞬时转染质粒

种植于Φ10cm的培养皿的细胞转染：肿瘤细胞种植密度2.8×10⁶个/皿。种植24h后，细胞分3组：

对照组I：瞬时转染pEGFP载体；

对照组II：瞬转pEGFP-AChES；

实验组：瞬转pEGFP-NLS-AChES。

转染混合液配制如下：OPTIMEM750uL/皿，FuGENE HD试剂(Roche)45ul/皿，质粒总量为15ug/皿。轻轻混匀后，室温下静置孵育10分钟，最后滴加到细胞培养皿中。

种植于24孔板的细胞转染：细胞种植密度8×10⁴个/孔；转染混合液中含OPTIMEM25uL/孔，FuGENE HD试剂(Roche)1.5ul/孔，质粒总量为500ng/孔。

其余参数同上。

常规流式细胞分选或分析

细胞经胰蛋白酶消化后，用预冷的PBS洗一次，离心收集，然后用70％乙醇-20℃固定过夜。固定后的细胞离心去除乙醇，预冷的PBS洗两次。然后将细胞悬浮于含200μg/ml RNase A和50μg/ml PI(碘化乙啶)的PBS中，37℃放置30分钟，然后用Becton&Dickinson公司的FACS calibur完成流式细胞分析并用FCS3.0软件进行结果分析，每次至少分析10⁶个细胞。对于GFP阳性细胞的流式分析，细胞经胰蛋白酶消化后，用预冷的PBS洗一次，离心收集，用4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后用预冷的PBS洗两次。用0.1％(v/v)Triton x-100/0.1％％(w/v)柠檬酸钠溶液室温穿透5分钟，然后预冷的PBS洗两次。将细胞悬浮于含200μg/ml RNase A和50μg/ml碘化乙啶的PBS中37℃放置30分钟，然后用Becton&Dickinson公司的FACSCalibur完成流式细胞分析并用FCS3.0软件进行结果分析，每次至少分析10⁶个GFP阳性细胞。需要分选的细胞则是经胰蛋白酶消化后，用37℃预热的培养液重悬，直接经BD FACS Aria II分选。

流式细胞仪筛选肿瘤细胞

细胞转染相应质粒24h后，胰酶消化法收集细胞，离心后重悬于培养液中(300uL/Φ10cm皿)。培养液中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为100ug/ml。之后，上机分选获得远离阴性细胞区的绿色荧光蛋白强阳性区域细胞。最后，将分选后的细胞种植于96孔板，2×10⁴/孔，每组种植12个平行孔。

细胞MTT试验

流式筛选后的细胞，在不同时间点(如0，8，24，48，72小时)时，分别进行MTT检测细胞在570nm下的光吸收值，获得细胞生长曲线。具体操作如下：与检测前4小时，直接向各组每孔中分别加入20ul MTT贮液(5mg/ml)(购自生工生物工程有限公司)，置于培养箱内继续培养4h；弃各孔上清液，分别加入DMSO100μL，室温下摇床10min；以溶剂DMSO调零，酶标仪检测各样品于570nm下的OD值。

TUNEL法检测细胞凋亡

细胞转染相应质粒第24h时，弃细胞培液，PBS室温洗涤1次，5分钟。4％多聚甲醛室温固定10分钟。PBS洗涤3次，5分钟/次。0.5％Triton-X100透膜，室温10分钟。PBS洗涤3次，5分钟/次。50μl TUNEL反应混合液(Roche)，37℃反应1h。PBS洗涤3次，5分钟/次。加入10μg/mL的Hoechst33258250uL染细胞核，室温染色1分钟，PBS洗涤3次，5分钟/次。激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

AChE酯酶活性测定

细胞抽提液中的AChE相对酶活性，根据Ellman等人的方法，使用分光光度计在405nm用96孔板测定(Ellman GL，Courtney KD，Andres V，Jr，Feather-Stone RM.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.BiochemPharmacol1961;7:88-95)。收集的细胞用PBS洗两次，离心后重悬于抽提液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.4，1M NaCl，0.5％Tween-20)，冰上放置1小时。然后在4℃以12000rpm离心10分钟，取蛋白上清液，总蛋白量用BCA法测定。根据测定的总蛋白量，每个样品取等量的总蛋白来测定AChE相对活性。测活系统中预先加入了丁酰胆碱酯酶(BChE)的专一抑制剂iso-OMPA(终浓度为0.75mM)处理30分钟以排除可能的丁酰胆碱酯酶活性的干扰。

AChE在37℃、每分钟水解1μmol底物表示为一个活力单位(U)。在表示AChE相对活性时，转染空载体细胞裂解液中AChE的活性被设为1，其他处理的样品活性被表示为它的倍数。纯化的AChE蛋白活性测定时，以1μg BSA蛋白测得值为1，其他处理的样品活性被表示为它的倍数。

蛋白免疫印迹

未经处理或经药物处理的细胞经胰蛋白酶消化后离心收集，溶于1×SDS PAGE凝胶上样缓冲液(50mM Tris pH6.8，100mM DTT，2％(w/v)SDS，10％(v/v)甘油，新鲜加入1μg/ml抑肽酶(aprotinin)和10mM PMSF)中煮沸10分钟。蛋白浓度用BCA方法测定。加入溴酚蓝后上等量的样品进行SDS PAGE胶电泳，转膜，在含5％脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl pH7.8，100mM NaCl，0.05％Tween-20)中封闭1小时，然后加入用5％的脱脂奶粉稀释的相应一抗：1：500稀释的抗AChE抗体，1：1000稀释的抗PARP的抗体，1：3000稀释的抗Histone H3抗体，1：2000稀释的抗Tubulin抗体，1：4000稀释的α-actin抗体，4℃条件下孵育12小时。用TBST洗三次后加入相应的用HRP偶联的抗羊，抗兔或抗小鼠Ig G的二抗(用5％脱脂奶粉1：2000稀释)，在37℃下孵育1.5小时。最后用ECL方法显色，并在FUJIFILM的LAS-4000中检测结果。

用荧光显微镜，共聚焦荧光显微镜，或活体显微镜观察AChE的亚细胞定位细胞培养于盖玻片上，并以药物或者质粒转染等进行相关操作。1ml4％的多聚甲醛在4℃固定40分钟。检测内源性蛋白时，用800μl穿透液(0.1％Triton X-100和0.1％柠檬酸钠溶于PBS中)在37℃穿透5-10分钟，PBS洗3遍。用100μl封闭液(3％BSA溶于PBS中)室温下封闭40分钟。用抗AChE抗体以合适的比例稀释，4℃孵育过夜。用PBS洗3次后再以80μl二抗(1/100稀释于封闭液中)于室温孵育2小时，用PBS洗3次。PBS洗后用Hoechst33258染色液避光染色10分钟。50％甘油封片。在Olympus IX51荧光显微镜，或Leica TCS SP5激光共聚焦荧光显微镜上观察AChE的亚细胞定位。活细胞成像则直接将细胞置于Leica活细胞多维成像工作站进行观测。

AChE蛋白的纯化

在体外系统内所使用的AChE蛋白进行如下纯化：在HEK293细胞内转染并筛选出能稳定表达AChE1-547AA(人)或AChE1-548AA(鼠)个氨基酸序列多肽的细胞株(保留了AChE的活性，但去除了557位Gly上的糖基化位点以及疏水的C端，得到可溶的单体AChE蛋白)，并在无血清培养液中培养(Ultraculture cell culture medium，Biowhittaker)。由于带有分泌信号，AChE被分泌到细胞培养液中，每三天收集一次培养液。以偶联有AChE的可逆抑制剂Fasciculins的亲和层析柱进行纯化(Marchot P，Ravelli RB，Raves ML，Bourne Y，Vellom DC，Kanter J et al.Soluble monomericacetylcholinesterase from mouse:expression，purification，and crystallization in complexwith fasciculin.Protein Sci1996;5(4):672-9)。所得到的蛋白再进一步进行电泳和AChE酯酶活性检测来鉴定其纯度和活性。

体外AChE的DNA酶活性检测

使用纯化的质粒DNA来作为检测底物。在剪切质粒DNA的实验中，0.15μg转染级纯度的质粒DNA(pEGFP-C1质粒，Clotech)被加入到10μl含(5.0mM Tris-HCl，PH7.5；2.5mM CaCl₂；5.0mM MgCl₂)的缓冲体系中。再加入1μg(或实施例中所描述的量)纯化的人源或鼠源的AChE蛋白(相对于人是AChE1-547AA；相对于鼠为AChE1-548AA)，在37℃孵育。在6h(或者实施例中所描述的时间点)取样。

AChE酯酶活性抑制剂实验中，AChE蛋白与抑制剂在体外缓冲体系中，37℃环境下孵育30分钟，再加入底物DNA继续孵育6h。

在AChE消除的实验中，偶联有AChE抗体或是IgG的protein G玻璃珠在体外缓冲体系中，37℃环境下孵育30分钟，然后离心1000rpm，2min，将上清小心移到另一个试管中(尽量不要吸取到沉淀)，再加入底物DNA继续孵育6h。最后加入适量的DNA电泳上样缓冲液，于1％的琼脂糖胶内，在1×TAE缓冲液中以150mA进行电泳30min，紫外下拍摄照片。

石蜡切片免疫组化实验

首先，脱蜡水化。将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤30分钟，二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中分别浸泡10分钟；二甲苯与酒精混合液(V:V=1:1)中5分钟；无水乙醇I、无水乙醇II、95％(v/v)酒精、85％酒精、70％酒精分别浸泡5分钟；50％酒精中浸泡2分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟。然后，取pH6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500mL)高压法抗原修复。修复后，高压锅降至室温。取出玻片，蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；PBS(pH7.2-7.4)冲洗2次，每次3分钟。3％H₂O₂-甲醇混合液(30％H₂O₂:CH₃OH=1:9)室温封闭内源过氧化物酶15min。PBS洗3次，各5分钟。0.5％TritonX-100透膜15分钟。PBS洗3次，各5分钟。滴加正常山羊血清封闭液，室温(20-28℃)20分钟。甩去多余液体，直接滴加一抗(N-19，购自Santa Cruz)，湿盒4℃过夜(≥18h)。PBS洗3次，各10分钟。滴加二抗(A5420，购自Sigma)，37℃30分钟。PBS洗3次，各10分钟。DAB显色5-10分钟，显微镜下掌握染色程度(避光)。终止染色：蒸馏水泡洗即可。苏木素染色3-5分钟，核呈紫蓝色；直接用1％酒精盐酸分化3-5秒，自来水冲洗30分钟，返蓝。脱水，依次经过85％酒精、90％、95％酒精Ⅰ、95％酒精Ⅱ、无水乙醇Ⅱ脱水，然后再经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ分别脱水2分钟。最后，采用中性树胶封片。

人BEL-7404细胞裸鼠皮下成瘤实验

细胞分2组：

对照组，转染pEGFP质粒；

实验组，转染pEGFP-NLS-AChE。

流式筛选出的转染阳性细胞离心后，重悬于不含小牛血清的DMEM培养基中，细胞密度为5×10⁶个/100uL。细胞种植于Bal B/C裸鼠前肢附近皮下，注射细胞数为5×10⁶/只。在种植后24h和第72h，荧光体视显微镜观察种植细胞荧光情况，并拍照；从第七天起直至第28天，每3天用电子游标卡尺(上海申韩量具有限公司)测量一次瘤体的长于宽。计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。第28天，断椎法处死裸鼠，拍照观察成瘤情况。

统计分析

所有试验均至少重复3次。结果显示为平均值±标准偏差。用双尾Student’s t-test进行分析，P<0.05被认为是有显著性差异。

II.实施例

实施例1、在采用不同方法诱导凋亡的不同细胞中AChE表达上升，且AChEsiRNA能保护细胞免于凋亡

为验证凋亡过程中AChE表达上升是一个保守而普遍的现象，四种不同的人源细胞株(包括人宫颈癌细胞HeLa，结肠腺癌细胞HT-29，神经胶质瘤细胞SK-N-SH，微血管内皮细胞HMEC-1)以A23187(购自Sigma)或者依托泊苷(Etoposide)处理来诱导凋亡。在所有四种细胞株内，都检测到AChE表达量随凋亡进程推进而增高(以PARP(多聚(ADP-核糖)聚合酶)的剪切作为凋亡标志)，见图1A。

为进一步揭示AChE的表达与细胞凋亡的关系，本发明人将用过氧化氢(50μM)处理而引起凋亡的细胞进行免疫荧光染色并观察，发现与正常组细胞相比较，凋亡组细胞的细胞核发生明显固缩，AChE表达上调并且AChE蛋白与活化的Caspase-3共定位，见图1B。此数据表明，AChE参与了过氧化氢诱导的细胞凋亡过程。

为确定AChE在细胞凋亡过程中的作用，本发明人设计了两条AChE的siRNA(25mer)，即siRNA1和siRNA2。这两组AChE siRNA都能有效抑制凋亡过程中AChE表达量的上升，见图1C。

将siRNA1和siRNA2瞬转HeLa细胞，之后将瞬转AChE siRNA的HeLa细胞用Etoposide(50μg/ml)处理来凋亡诱导，再利用流式细胞术(FACS)进行凋亡率检测。与转染有Scramble siRNA的对照组相比，转染有AChE siRNA的细胞中DNA片段化程度明显降低，细胞凋亡受到抑制。但当同时转染AChE表达质粒(含有编码S-AChE蛋白序列的质粒)时，上述凋亡抑制现象消失，见图1D-E。

综上，一方面，在不同类型细胞中用不同方式进行凋亡诱导时，AChE表达均上调，并且其表达量与凋亡进程成正相关关系；另一方面，AChE siRNA有效保护细胞免于凋亡。上述结果表明，AChE参与了细胞凋亡过程，并在其中发挥重要作用。

实施例2、AChE在凋亡过程中向细胞核内迁移

欲明确AChE在细胞凋亡过程中究竟发挥了怎样的作用，首先需了解细胞凋亡前后AChE的细胞亚定位情况。为此，首先利用共聚焦显微镜观察内源AChE在细胞凋亡前后的分布是否发生改变。本发明人选择了2种模式细胞株：本底不表达AChE的HeLa细胞株以及AChE本底表达水平较高的PC12细胞株。结果发现，与正常生长细胞相比较，凋亡细胞中AChE不仅仅局限于细胞质区域，重要的是其分布发生了改变，还呈现出细胞核分布状态，见图2A。

为进一步验证这个结果，本发明人将正常生长状态下及凋亡状态下的PC-12及HeLa进行核-质分离并利用免疫印迹技术(immunoblot，IB)分别检测细胞核及细胞质中AChE蛋白的表达情况。在正常培养的HeLa内检测不到AChE的表达；在PC-12细胞内，只在细胞质组分中检测到了AChE的表达，细胞核内未能检测到。与上述正常组不同，在凋亡状态下，HeLa细胞和PC-12细胞内都能检测到AChE蛋白表达并且表达水平明显上调；更为重要的是，在细胞核组分中也能检测到AChE的大量表达(图2B)。此结果与Confocal观察结果一致，即凋亡状态下，AChE表达上升并向细胞核内迁移。其中，α-Tubulin作为细胞质组分的标志，Histone H3作为细胞核组分的标志。

为观察在凋亡过程中AChE向细胞核内迁移的动态过程，以便为解开AChE功能之谜提供一些线索，本发明人将表达AChE-GFP融合蛋白(pEGFP-AChE)以及HistoneH2b-RFP融合蛋白(用以定位细胞核)的2种质粒共转入HeLa细胞内，之后以100μMH₂O₂诱导细胞凋亡，利用活体细胞实时成像系统跟踪拍摄在细胞凋亡启动后AChE的位置变化情况。正如所料，未加入H₂O₂前，AChE-GFP完全分布在细胞质中，而Histone H2b-RFP完全分布在细胞核中(图2C，time0)；从加入H₂O₂130min开始，尤其是150min后，在细胞质与细胞核内都能明显地观察到AChE-GFP。值得注意的是，几乎在相同的时间段内，细胞核开始逐渐固缩，并呈现出明显的凋亡特征(图2C)。但是，在共转pEGFP-AChE、pRFP-Histon H2b-RFP质粒的未处理组中，AChE-GFP始终未发生核迁移；再者，共转pEGFP-Tubulin、pRFP-Histone H2b质粒的细胞，在凋亡诱导之后，Tubulin-GFP未发生入核现象(图2C)；这表明，只有凋亡时AChE-GFP融合蛋白才发生核转位，并且这种核转位并非是由GFP蛋白将其带入核内的。提示这是与其发挥功能相关的细胞主动性核定位。

综上所述，在正常生长的细胞内，无论是本底表达还是外源过表达的AChE都分布在细胞质中，而一旦细胞启动凋亡程序，AChE便会向细胞核内迁移，并且从时间上来看，AChE入核的时间与细胞核的启动固缩的时间相近。蛋白分子在细胞中的定位与其发挥功能紧密相关，故而，AChE在细胞内新定位的发现为本发明人探索其新功能提供了一个很重要的线索。

实施例3、瞬时表达定位于细胞核内的AChE引起细胞死亡

一般而言，在细胞凋亡过程中，蛋白转位到细胞核，其作用主要分为两个方面：第一，调节基因转录(一般为早期进入)；第二，参与细胞核固缩以及染色体DNA断裂降解的过程。为进一步探索AChE在细胞凋亡过程中核转位的生物学意义，本发明人构建了带有核定位信号(NLS)的人源AChE质粒pEGFP-NLS-AChE。将质粒瞬转入HeLa细胞24h后，在激光共聚焦显微镜下观察。在转有pEGFP-AChE质粒的对照组细胞中，AChE-GFP融合蛋白分布于细胞质(图3A)；用流式细胞仪将上述转染阳性细胞筛选富集(sorting)后，进行三天的MTT生长曲线测定后发现，其生长状态与表达GFP的对照组相比并无明显变化(图3B)；同时，其TUNEL检测结果也呈阴性(图3C)。

上述结果表明，在转有pEGFP-NLS-AChE质粒的细胞中，NLS-AChE-GFP融合蛋白能表达于细胞核内(图3A)，尽管未引入外界凋亡刺激，但其细胞代谢率显著降低(图3B)。

TUNEL检测结果显示，细胞核内表达NLS-AChE-GFP的细胞的DNA都发生断裂，而转染阴性的细胞则正常(图3C)，提示在细胞核内表达AChE能直接引起细胞死亡。尽管Histone H2B-GFP融合蛋白或GFP的表达也是在细胞核内，但其阳性细胞能够正常生长(图3B-C)，说明上述观察到的细胞死亡并非是由转染操作或蛋白入核本身引起的非特异性死亡。

上述数据表明：AChE在细胞凋亡过程中发生核转位之后，可能行使重要的促凋亡功能。

在细胞核内过表达AChE导致染色体DNA断裂的原因本发明人认为有两个：第一，AChE蛋白具有DNA酶活性，入核后直接剪切染色体DNA；第二，AChE入核后激活了凋亡通路中某个原本因空间隔离而沉默的重要因子，使其下游的DNA酶被活化，从而剪切了染色体DNA。为明确上述假设，在体外无细胞体系中，将纯化的人源或鼠源AChE蛋白(其序列的GenBank登录号：NP_033729.1)(获自美国UC，SanDiego)与质粒DNA(pEGFP-C1质粒)于37℃下共孵育，结果发现，两种AChE蛋白均能有效切割质粒DNA，将质粒DNA从超螺旋结构(SC)剪切成缺刻(Nick)及线性结构(Linear)。这种剪切能力与AChE蛋白浓度以及时间成正相关关系(图3D-E)。

上述结果提示：在细胞凋亡过程中，AChE表达上升并向细胞核内转移的意义可能在于参与染色体DNA的降解。

实施例4、AChE具有DNA酶活性的鉴定以及外源污染的排除

由于DNase I作为一种分泌酶，广泛分布在于血液及消化道中，参与了从DNA损伤修复到食物消化以及外源感染病毒、细菌DNA的清除等过程。AChE对DNA的上述剪切作用是否为外源DNA酶污染所造成的假象？为明确这一问题，本发明人利用凝胶蛋白电泳结合银染方法对蛋白纯度进行分析显示，AChE蛋白主带清晰，未见其他杂带(图4A-B)。

AChE对DNA的剪切作用是否为体系本身造成的非特异性？为搞清这一问题，首先以BSA作为阴性对照，发现BSA蛋白没有质粒DNA剪切功能(图4C-D)。

为进一步检测AChE剪切DNA的特异性，本发明人设计如下两个实验方案：方案一，用偶联有AChE抗体的Protein G玻璃珠与AChE预孵育1h，离心将体系中的AChE去除(deplete)，再与质粒DNA孵育；方案二，用DNase I特异性抑制剂G-Actin蛋白(Lacks SA.Deoxyribonuclease I in mammalian tissues.Specificity of inhibition byactin.J Biol Chem1981;256(6):2644-8)与AChE蛋白预孵育，再检测孵育后的AChE能否剪切质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示，AChE特异性抗体明显削弱了AChE蛋白对质粒DNA的剪切能力(图4D)；G-Actin虽然显著抑制DNase I的活性，但是对AChE剪切DNA的能力基本没有影响(图4C)。

上述实验都是本发明人为尽力排除外源DNA酶污染可导致的假阳性结果的努力，以求将外源DNA酶污染的可能性降到最低，在每一个实验中都引入了严格的对照。从分析AChE蛋白纯度，到运用AChE抗体和DNase I抑制剂等多种途径验证了本发明人假说的可靠性，即AChE具有剪切DNA的新功能。

此外，本发明人人工合成了人(Homo)AChE的第32-72AA片段(T41)和第32-138AA片段(T107)，将肽段按照不同的剂量与小鼠基因组DNA共同孵育6h；以及人工合成了人(Homo)AChE的第32-72AA片段(T41)和第32-138AA片段(T107)，将该肽段与小鼠基因组DNA共同孵育不同时间。结果发现，AChE的32-72AA部分(T41)和对照(水)相同，并没有降解消化基因组DNA的能力；而第32-138AA片段(T107)则能够降解消化基因组DNA，并且这种降解是剂量依赖性和时间依赖性的(图4E-F)。

为进一步检测AChE作为核酸酶剪切和降解消化DNA的能力与AChE的来源物种无关，本发明人采购了商品化的分离自鳗鱼的AChE(购自SIGMA，品名Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus(electric eel)；Product Number：C2888-1KU)，同时采购了两种来自不同供应商的牛血清白蛋白(BSA)(BSA1购自Amresco、BSA2购自上海生工)作为对照，发现来自鳗鱼的AChE同样能够降解消化DNA，作为对照的BSA则并无此核酸酶活性，并且这种降解是剂量依赖性和时间依赖性的(图4G-H)。

实施例5、AChE剪切DNA活性的生物化学条件的分析

据文献报道，凋亡过程中，细胞内金属阳离子浓度会显著提高(Rizzuto R，Pinton P，Ferrari D，Chami M，Szabadkai G，Magalhaes PJ et al.Calcium and apoptosis:facts andhypotheses.Oncogene2003;22(53):8619-27；Zhivotovsky B，Cedervall B，Jiang S，Nicotera P，Orrenius S.Involvement of Ca2+in the formation of high molecular weightDNA fragments in thymocyte apoptosis.Biochem Biophys Res Commun1994;202(1):120-7)。研究表明，大部分酶(包括DNA酶)的活性依赖于金属阳离子。

为更多了解AChE的DNA酶性质，本发明人检测了金属阳离子对AChE的DNA酶活性的影响。发现，当体系中没有Mg²⁺和Ca²⁺的情况下，AChE剪切DNA的活性很微弱；当Mg²⁺单独存在时，其活性显著恢复；而Ca²⁺则是一种微弱激活剂，其单独存在时，AChE的DNA酶活性略有增加(图5A)。此结果被另一实验进一步证实，即当体系中存在EDTA时，AChE剪切DNA的活性被显著抑制；与EDTA不同，EGTA对此剪切抑制效果却不明显(图5A)。上述数据说明，AChE的DNA酶活性依赖于Mg²⁺。

除阳离子之外，正常生长细胞与凋亡细胞内pH环境也是不同的(Lang F，HuberSM，Szabo I，Gulbins E.Plasma membrane ion channels in suicidal cell death.ArchBiochem Biophys2007;462(2):189-94；Fernandez-Segura E，Canizares FJ，Cubero MA，Warley A，Campos A.Changes in elemental content during apoptotic cell death studied byelectron probe X-ray microanalysis.Exp Cell Res1999;253(2):454-62)。对于凋亡酶而言，其最适pH值一般在7.5至9.5之间(Deng G，Podack ER.Deoxyribonucleaseinduction in apoptotic cytotoxic T lymphocytes.FASEB J1995;9(8):665-9)。

为确定AChE的DNA酶活性的最适pH值，本发明人配制了一系列不同pH值(pH5-10)的DNA水解反应缓冲液。将AChE与质粒DNA(pEGFP-C1质粒)在上述缓冲液中分别孵育，发现，在pH值7-10的较宽范围内，AChE剪切DNA的能力都能有效发挥。而在pH5-6范围内，其剪切DNA的活性小幅降低，所产生的线状DNA量明显减少(图5B)。

AChE蛋白与DNase I呈现相似结合曲线。软件分析得知，DNaseI与DNA间Kd值约为1.14e-6M，AChE与DNA间Kd值1.53e-6M。Kd值与亲和力成反比关系，结果表明AChE与DNA间亲和力大约为DNaseI的74％。

由上述实验可知，AChE的DNA酶活性依赖于Mg²⁺，而Ca²⁺对此只能起到微弱的辅助作用；在pH7-10这么一个较宽的pH范围内(与凋亡过程中体内pH环境相似)，AChE都能比较充分地发挥其剪切DNA的功能。而且在体外实验中，AChE显示了与DNA较高的亲和性，其与DNA间亲和力大约为DNaseI的74％。

实施例6、AChE发挥DNA酶活性的位点寻找以及结构分析

前述结果已表明，AChE具有DNA酶活性，能将超螺旋构象的质粒进行剪切，使之呈现缺刻或线性状态。但是，AChE的经典功能是水解乙酰胆碱，具有乙酰胆碱酯酶活性。乙酰胆碱酯酶与DNA酶都属于酯酶，均能将酯键进行水解、使之断裂。那么，AChE的乙酰胆碱酯酶活性中心是否在其DNA酶中发挥作用？本发明人将AChE蛋白与AChE酯酶活性抑制剂Huperzine A、Tacrine以及Donepezil(Huperzine A、Tacrine和Donepezil购自Sigma)分别预孵育，之后再加入质粒DNA。结果显示，三种抑制剂均能显著抑制AChE酯酶活性(图6A)，然而对其DNA酶活性没明显影响(图6B)。提示AChE酯酶活性位点在其DNA酶中可能不起作用。为进一步明确此推论，将AChE酯酶活性位点的催化三联体氨基酸进行了定点突变(S234A、E365A以及H478A)，并构建到带有NLS序列的GFP载体上，获得pEGFP-NLS-AChES234A/E365A/H478A突变质粒。此质粒瞬转入HeLa细胞24h后，酯酶活性检测证实突变后的AChE蛋白酯酶活性已丧失。如果AChE的乙酰胆碱酯酶活性位点在其DNA剪切功能中发挥作用，突变后的蛋白将失去DNA剪切功能，在无其他凋亡刺激诱导下即便过表达且定位于细胞核内，也将丧失凋亡触发能力。但是，突变蛋白过表达不能补救细胞凋亡(图13)。由此可见，AChE的乙酰胆碱酯酶活性位点与其DNA酶功能无关。

实施例7、AChE入核后触发多种肿瘤细胞凋亡

本发明人构建了pEGFP-NLS-AChE质粒，该质粒表达融合蛋白NLS-AChE；AChE蛋白在NLS介导下可进入细胞核内。

pEGFP-NLS-AChE质粒被转入结肠癌SW620细胞后的检测结果见图7，电镜图(图7A)可见与空质粒对照(pEGFP)相比，NLS-AChE转染阳性细胞发生极其显著的凋亡。MTT检测结果，细胞OD₅₇₀值接近于0。

pEGFP-NLS-AChE质粒被转入宫颈癌HeLa细胞后的检测结果见图8。电镜图(图8A)可见与空质粒对照(pEGFP)相比，NLS-AChE转染阳性细胞发生极其显著的凋亡。图8B中，Hochest染色阳性、GFP染色阳性且能够重合说明表达的融合蛋白进入了细胞内。图8C可见与空质粒对照(pEGFP)相比，NLS-AChE转染阳性细胞发生极其显著的凋亡，MTT检测结果细胞OD₅₇₀值接近于0。单AChE(无NLS)转染阳性细胞也有一定的凋亡，但凋亡的效率低于NLS-AChE转染阳性细胞。

pEGFP-NLS-AChE质粒被转入肝癌BEL7404细胞后的检测结果见图9。电镜图(图9A)可见与空质粒对照(pEGFP)相比，NLS-AChE转染阳性细胞发生极其显著的凋亡。图9B中，Hochest染色阳性、GFP染色阳性且能够重合说明表达的融合蛋白进入了细胞内。图9C可见与空质粒对照(pEGFP)相比，NLS-AChE转染阳性细胞发生极其显著的凋亡，MTT检测结果细胞OD₅₇₀值接近于0。单AChE(无NLS)转染阳性细胞也有一定的凋亡，但凋亡的效率低于NLS-AChE转染阳性细胞。

可见，NLS-AChE转染后可有效触发多种肿瘤细胞凋亡，MTT检测凋亡率约100％。因此，本发明首次通过多种细胞系得到充分论证，证实新型凋亡诱导基因AChE所表达的蛋白AChE入核后触发多种肿瘤细胞凋亡。

实施例8、肿瘤患者中AChE蛋白水平下降

鉴于基因组DNA降解是细胞凋亡的一个显著性特征，AChE蛋白又具有DNA降解功能，由此可知NLS-AChE基因无论转入何种肿瘤细胞，NLS-AChE蛋白表达之后，都将入核并且直接触发细胞死亡。

鉴于以上发现，提示AChE基因是一种抑癌基因，在癌组织中表达可能受到抑制。因此，本发明人通过免疫组化的方法检测了24例肝癌患者的癌组织中AChE基因表达情况。结果如图10，发现在24例肝癌患者的癌组织中，AChE蛋白水平严重下调的约占75％(与癌旁组织比较)。

上述数据提示，如果将AChE基因在肿瘤细胞中强制性表达，并且使其蛋白定位到核内，那么肿瘤细胞将死亡并且丧失成瘤能力。

综上，肝癌及癌旁组织中AChE蛋白水平的免疫组化检测结果支持了AChE基因是一种抑癌基因的结论。

实施例9、NLS-AChE基因抑制肿瘤细胞的成瘤能力

为了进一步鉴定NLS-AChE的抑癌效果。本发明人进行了小鼠体内实验。将NLS-AChE基因转染到肝癌BEL7404细胞中之后，NLS-AChE蛋白表达并进入核内。将该种重组表达的细胞种植于Bal B/C裸鼠前肢附近皮下，观察小鼠的成瘤情况。

结果如图11，图11A为荧光体视显微镜检测流式筛选后24hr、72hr时，转染pEGFP或pEGFP-NLS-AChE质粒的BEL-7404细胞在裸鼠皮下的存在情况。在72hr时，与转染pEGFP组相比，pEGFP-NLS-AChE组细胞荧光信号极其微弱，表明细胞大量丧失。

图11B为流式筛选后的细胞种植于裸鼠皮下，28天内肿瘤体积的变化曲线。pEGFP-NLS-AChE组细胞始终没有成瘤；pEGFP组细胞成瘤后，从第7天至第25天，瘤体体积趋近于线性增长。瘤体积计算公式：V=(长×宽²)π/4。

图11C-E为流式筛选后第28天时，裸鼠照片示长瘤情况。第一排小鼠，种植转染pEGFP的细胞，明显成瘤(右起第3、第4只，瘤太大以至于磨破)，4只小鼠体内分离出的瘤体分别见图11D，瘤体组织细胞特征见图11E；第二排小鼠，种植转染pEGFP-NLS-AChE的细胞，均未成瘤。

因此，AChE蛋白促使BEL7404细胞死亡，BEL7404在裸鼠皮下的成瘤能力完全受到抑制。

实施例10、鉴定AChE蛋白分子中发挥促凋亡功能的片段

为了找出AChE蛋白分子中发挥促凋亡功能的关键性片段，本发明人构建了多个AChE蛋白分子的缺失突变体(图12A)；以及人AChE蛋白的第32-138AA片段(T107)。

将包含各突变体质粒(含EGFP-NLS-AChE突变体的编码序列)分别转染HeLa细胞，经流式细胞仪分选出转染阳性细胞，将之种植于96孔板，72小时时荧光倒置相差显微镜示细胞形态学变化情况(×200)。结果见图12B，可见2-138AA片段及较之更长的片段均使细胞呈现死亡特征。

对上述获得的细胞进行MTT检测，并绘制细胞生长曲线。结果如图12C，可见2-138AA片段具备AChE全长的促凋亡功能，而2-72AA片段则丧失这一功能。

人AChE的第32-138AA片段(T107)加上入核信号序列NLS在HeLa细胞内表达，对于体外培养的肿瘤细胞也具有显著的杀伤作用，使细胞呈现死亡特征。

2-138AA、32-138AA片段入核之后，可完全行使AChE的促凋亡功能；再者，2-138AA、32-138AA片段是AChER，AChES，AchEH的共有区段。为此，3种类型的AChE均具备促肿瘤细胞凋亡之功能。

实施例11、筛选方法

(1)方法1

如实施例4，将人AChE蛋白与质粒DNA(pEGFP-C1质粒)于37℃下共孵育，得到共孵育体系，同时设置以下两组：

测试组：用候选物质处理的上述共孵育体系；

对照组：不用候选物质处理的上述共孵育体系。

在处理后适当时间，观察AChE切割质粒DNA的效率，如与对照组相比，测试组效率提高20％以上，则说明该候选物质是潜在的对于促进细胞凋亡有用的物质。如与对照组相比，测试组效率降低20％以上，则说明该候选物质是潜在的对于抑制细胞凋亡有用的物质。

(2)方法2

选择内源表达AChE蛋白的HeLa细胞，以过氧化氢(50μM)处理而引起凋亡，同时设置以下两组：

测试组：用候选物质处理的上述细胞；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞。

测定AChE蛋白的表达量，如与对照组相比，测试组AChE蛋白的表达量显著下降30％以上，则说明该候选物质是潜在的对于抑制细胞凋亡有用的物质。

采用前述的siRNA1和siRNA2作为候选物质，测试其处理上述细胞后AChE蛋白的表达量，结果AChE蛋白的表达量显著被抑制30％以上。因此，该抑制剂可作为抑制细胞凋亡有用的物质。

(3)方法3

筛选方法如下：

HeLa细胞按60％密度铺96孔板，待完全贴壁后以4％PFA使细胞固定10min，再以0.1％柠檬酸钠+0.1％Triton X-100穿透细胞，10min，两次。以PBS清洗后，细胞分为五组，如下：

HeLa细胞组：为正常细胞对照，如上固定和穿透处理；

AChE蛋白组：HeLa细胞，在固定和穿透处理后，给予AChE蛋白(1μg/μl)处理；

BSA对照组：HeLa细胞，含有AChE蛋白，在固定和穿透处理后，给予BSA蛋白(2.5μg/μl)处理；

AChE蛋白＋候选物质组：HeLa细胞，含有AChE蛋白，在固定和穿透处理后，给予候选物质处理；

标准阳性参照组：HeLa细胞，含有AChE蛋白，在固定和穿透处理后，给予DNase酶处理；该参照组为了体现DNA断裂的一般情况而设。

各组细胞各自37℃孵育1-2hr。PBS洗两次，并以4％PFA固定10min。加入Tunnel试剂，37℃孵育1hr。后以PBS洗三次，并Hoechest染色。荧光显微镜观察。

将AChE蛋白组与BSA对照组相比，可见AChE蛋白组的细胞内DNA发生显著的断裂，如图14。

若观察到所述候选物质处理后，与AChE蛋白组相比，AChE蛋白＋候选物质组的DNA断裂情况减少或不断裂，则说明所述候选物质是AChE蛋白的抑制剂，能够抑制AChE蛋白的核酸酶活性。该方法筛选获得的AChE蛋白的抑制剂潜在地可用于作为防治或缓解阿尔茨海默症(AD)或帕金森症(PD)的药物。

讨论

长期以来，AChE作为胆碱能神经突触和神经-肌肉接头处水解神经递质乙酰胆碱的重要分子受到广泛关注以及深入的研究。然而，除神经系统外，AChE还广泛分布在多种其它类型的细胞中，诸如上皮细胞，血液细胞以及血管内皮细，说明AChE还参与了一些“非经典功能”。已有报道的AChE的“非经典功能”包括神经突生成，细胞增殖(Xiang AC，Xie J，Zhang XJ.Acetylcholinesterase in intestinal cell differentiationinvolves G2/M cell cycle arrest.Cell Mol Life Sci2008;65(11):1768-79)，细胞黏附，突触发生，淀粉样纤维聚集，造血以及血小板生成。这些功能的具体机制目前尚不清楚。

近年来，尽管已有报导显示诱导细胞凋亡时，能观察到乙酰胆碱酯酶(AChE)表达上升这一现象；但是这一现象如何解释并不清楚，可以解释为凋亡过程的产物，也可以解释其为细胞代谢失常导致的副产物，也可解释为其参与凋亡通路。因此，AChE在细胞凋亡过程中究竟扮演哪种角色此前尚不清楚。

本发明人意外地发现，AChE在凋亡过程中除了表达量上升外，还有向细胞核内迁移的趋向性。在正常生长的细胞内，无论是本底表达还是外源过表达的AChE都分布在细胞质中，而一旦细胞启动凋亡程序，AChE便会向细胞核内迁移，并且从时间上来看，AChE入核的时间与细胞核启动固缩的时间相近。蛋白分子在细胞中的定位与其发挥功能紧密相关，故而，AChE在细胞内新定位的发现为探索其新功能提供了一个很重要的线索。

本发明人进一步研究了AChE进入细胞核的时间和时机，认为AChE有可能参与了细胞核固缩以及染色体DNA断裂降解的过程。为了验证这个设想，本发明人在AChE的N端插入了一个核定位信号肽(NLS)，这样表达出的融合蛋白具有主动向细胞核内转移的性质。通过观察本发明人发现，在细胞核内表达AChE能在不引入外界凋亡诱导刺激的情况下直接启动凋亡，并使染色体DNA的TUNEL染色呈阳性。用MTT对转染NLS-AChE并用FACS阳性富集后的细胞进行分析后本发明人发现，与表达非核定为的AChE或GFP的细胞相比，转染NLS-AChE的细胞的存活率明显降低。尽管Histone H2B-GFP融合蛋白或GFP的表达也是在细胞核内，但其阳性细胞能够正常生长，说明上述观察到的细胞死亡并非是由转染操作或蛋白入核本身引起的非特异性死亡。

在细胞核内过表达AChE导致染色体DNA断裂的原因本发明人推测有两个：第一，AChE蛋白具有DNA酶活性，入核后直接剪切染色体DNA；第二，AChE入核后激活了凋亡通路中某个原本因空间隔离而沉默的重要因子，使其下游的DNA酶被活化，从而剪切了染色体DNA。为明确上述假设，在体外无细胞体系中，将纯化的人源或鼠源AChE蛋白与质粒DNA于37℃下共孵育，结果发现，两种AChE蛋白均能有效切割质粒DNA，将质粒DNA从超螺旋结构(SC)剪切成缺刻(Nick)及线性结构(Linear)。这种剪切能力与AChE蛋白浓度以及时间成正相关关系。

AChE对DNA的剪切作用是否为体系本身造成的非特异性？为搞清这一问题，首先以BSA作为阴性对照，发现BSA蛋白没有质粒DNA剪切功能(图s3d和e)。为进一步检测AChE剪切DNA的特异性，本发明人设计如下两个实验方案：方案一，用偶联有AChE抗体的Protein G玻璃珠与AChE预孵育1h，离心将体系中的AChE去除(deplete)，再与质粒DNA孵育；方案二，用DNase I特异性抑制剂G-Actin蛋白19与AChE蛋白预孵育，再检测孵育后的AChE能否剪切质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示，AChE特异性抗体明显削弱了AChE蛋白对质粒DNA的剪切能力(图4d)；G-Actin虽然显著抑制DNase I的活性，但是对AChE剪切DNA的能力基本没有影响(图4c)。

同时，本发明人对AChE剪切DNA的环境特征进行了检测。AChE发挥DNA酶活性是Mg2+依赖的，而Ca2+能起到微弱的辅助作用(图5a)。在PH7.0-10.0这么一个较宽的PH范围内(与凋亡过程中体内PH环境相似)，AChE都能比较充分地发挥其剪切DNA的功能(图5b)。而且根据Bio Core T100测定AChE与DNA之间的解离常数的结果显示，AChE与DNA之间有较高的亲和性，其与DNA间亲和力大约为DNaseI的74％。

AChE的DNA酶活性与其水解乙酰胆碱(ACh)的酯酶活性是否有关系呢？通过在体外剪切体系中加入三种AChE酯酶活性抑制剂(Huperzine A，Tacrine和Donepenzile)以及在细胞内过表达AChE酯酶活性位点突变的实验，本发明人发现所有三种抑制剂对于其剪切DNA的活性都没明显的影响(图6b)。另一方面，将AChE酯酶活性位点的氨基酸进行定点突变(分别为S234A，E365A以及H478A)，并连接在带有NLS序列的表达载体上于HEK293T内表达的实验也证实了这个结果，即AChE发挥DNA酶活性的活性中心与其发挥水解ACh的酯酶活性中心是不同的。

综上所述，在细胞凋亡过程中，AChE表达上升并进入细胞核内。利用NLS信号肽在细胞核内表达AChE会直接导致细胞凋亡。体外实验表明AChE具有结合并剪切DNA的能力。针对AChE的siRNA能显著降低细胞凋亡过程中染色体DNA断裂的程度，说明AChE参与了凋亡过程中染色体DNA的降解清除的过程并在其中扮演了重要角色。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (30)

1.乙酰胆碱酯酶或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节核酸稳定性的组合物；所述的激动剂选自：镁离子或钙离子；所述的拮抗剂选自：SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的干扰分子。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备损伤核酸的组合物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备抑制结肠癌、宫颈癌或肝癌的组合物。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶拮抗剂用于制备保护核酸的组合物。

6.一种分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，其选自：

(b)如SEQ ID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；

(c)如SEQ ID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽；

(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；

(e)如SEQ ID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；或

(f)SEQ ID NO:5中第2-398位氨基酸序列的多肽。

7.一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码如权利要求6所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列选自：

(i)如SEQ ID NO:4中第4-414位核苷酸序列的多核苷酸；

(ii)如SEQ ID NO:4中第4-573位核苷酸序列的多核苷酸；

(iii)如SEQ ID NO:4中第4-741位核苷酸序列的多核苷酸；或

(iv)如SEQ ID NO:4中第4-1194位核苷酸序列的多核苷酸。

9.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7或8所述的多核苷酸。

10.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求9所述的载体；或其基因组中整合有权利要求7或8所述的多核苷酸。

11.一种权利要求6所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求10所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求6所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体。

12.权利要求6所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体、权利要求7或8所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体或权利要求10所述的宿主细胞的用途，用于制备调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的组合物或用于制备抗肿瘤的药物，所述的肿瘤是宫颈癌。

13.一种保护核酸的乙酰胆碱酯酶拮抗剂，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示。

14.一种调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的物质，其包括：

(1)分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，选自：

(b)如SEQ ID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；

(c)如SEQ ID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽；

(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；

(e)如SEQ ID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；或

(f)SEQ ID NO:5中第2-398位氨基酸序列的多肽；和

(2)引导(1)所述的分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体进入细胞核的入核引导物。

15.如权利要求14所述的物质，其特征在于，还包括：

(3)细胞或组织靶向性物质；和/或

(4)蛋白质转导结构域多肽。

16.如权利要求15所述的物质，其特征在于，(1)、(2)、(3)和(4)通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包埋的方式相互结合。

17.如权利要求14或15所述的物质，其特征在于，所述的入核引导物选自：核定位信号或核转运蛋白或它们的核心片段，甾体激素，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒，阳离子聚合物，放射性核素，纳米球。

18.如权利要求14或15所述的物质，其特征在于，所述的物质是融合蛋白，其包括所述的分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体和入核引导物。

19.如权利要求18所述的物质，其特征在于，所述的融合蛋白含有：

所述的分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体以及核定位信号。

20.一种多核苷酸，其编码权利要求18-19任一所述的物质。

21.一种表达构建物，其含有权利要求20所述的多核苷酸。

22.如权利要求21所述的表达构建物，其特征在于，其中还包括与编码所述的融合蛋白的多核苷酸操作性连接的特异性启动子，所述的特异性启动子选自：细胞特异性启动子、组织特异性启动子、或细胞核特异性启动子。

23.权利要求14-19任一所述的物质、权利要求20所述的多核苷酸或权利要求21或22所述的表达构建物的用途，用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。

24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸，或所述的细胞是肿瘤细胞。

25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述的物质用于制备抗肿瘤的药物，所述的肿瘤是宫颈癌。

26.一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括：

权利要求6所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求9所述的载体，或权利要求14-19任一所述的物质，或权利要求20所述的多核苷酸，或权利要求21或22所述的表达构建物；以及

药学上或生理学上可接受的载体。

27.一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括：

权利要求6所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求9所述的载体，或权利要求14-19任一所述的物质，或权利要求20所述的多核苷酸，或权利要求21或22所述的表达构建物；及

镁离子和/或钙离子。

28.如权利要求26或27所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的pH值是5-10。

29.一种损伤核酸的非治疗性的方法，包括：将乙酰胆碱酯酶或其激动剂或表达乙酰胆碱酯酶的载体，或权利要求6所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求9所述的载体与核酸相接触；所述的激动剂选自：镁离子或钙离子。

30.一种保护核酸的非治疗性的方法，包括：

以乙酰胆碱酯酶的拮抗剂处理细胞；

使细胞表达乙酰胆碱酯酶的拮抗剂；或

阻止乙酰胆碱酯酶进入到细胞核内；

所述的乙酰胆碱酯酶的拮抗剂选自：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的干扰分子。