CN102918053A - 用于疫苗的重组蛋白质、针对所述蛋白质的抗体及包括所述蛋白质和抗体的诊断和治疗方法 - Google Patents

用于疫苗的重组蛋白质、针对所述蛋白质的抗体及包括所述蛋白质和抗体的诊断和治疗方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102918053A
CN102918053A CN2011800077474A CN201180007747A CN102918053A CN 102918053 A CN102918053 A CN 102918053A CN 2011800077474 A CN2011800077474 A CN 2011800077474A CN 201180007747 A CN201180007747 A CN 201180007747A CN 102918053 A CN102918053 A CN 102918053A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
seq
fragment
derivative
treponema
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800077474A
Other languages
English (en)
Inventor
A·罗桑德
M·普林格尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN102918053A publication Critical patent/CN102918053A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及蛋白质和/或其片段和衍生物及它们在疫苗和生物技术方法中的应用。该疫苗特别包括从牛蹄炎分离出的密螺旋体的免疫原性蛋白质。本发明进一步涉及针对所述蛋白质或其片段的抗体，和所述蛋白质在诊断方法中的应用，其中检测所述抗体作为牛蹄炎的标志。

Description

用于疫苗的重组蛋白质、针对所述蛋白质的抗体及包括所述蛋白质和抗体的诊断和治疗方法
本发明涉及蛋白质和/或其片段和衍生物及它们作为疫苗和在生物技术方法中的应用。所述疫苗特别包括从牛蹄炎(digital dermatitis)分离出的密螺旋体(Treponema spp.)的免疫原性蛋白。本发明进一步涉及针对所述蛋白质或其片段产生的抗体，和所述蛋白质在诊断方法中的应用，其中检测抗体作为牛蹄炎的标志。
背景技术
蹄炎(DD)是一种引起牛跛行的传染性蹄病，其在集约化奶牛场生产中最为常见。该疾病最初于1974年在意大利公开。最近在瑞典公开了患有蹄炎的第一个畜群
Figure BPA00001609930500011
和Bergsten，2005)，而以前只有零星的、非典型病例报告(Manske等，2002)。湿/脏的蹄环境和DD的发生率之间有强的联系(Rodriguez-Lainz等，1996)，例如在隔间系统中小巷内的粪便和尿液的堆积是一个典型的卫生问题。除了动物健康问题外，由于牛奶产量的减少和体重减轻导致的经济损失也与DD相关(Losinger，2006)。
对DD病变抗生素治疗的快速反应强烈的地支持细菌为病因。已经从DD病变中分离出来许多不同属的细菌，如密螺旋体属(Treponema)，梭杆菌属(Fusobacterium)，Dichelobacter，普氏菌属(Prevotella)和Prophyromonas已经从DD病变中分离出来，经常讨论多种微生物的病因。但是，有强有力的旁证证明密螺旋体是DD疾病的主要病因。早在1964年从牛的表现为“脚腐烂”表现的不同变种的涂片中观察到螺旋体(Gupta等，1964)。另一个螺旋体的早期观察是在1988年，当时DD在英国第一次被公开时(Blowey和Sharp，1988)。最早的来源于DD的第一个螺旋体培养物在1995年被报道(Walker等，1995)。在DD病变组织的组织学制备物中，发现密螺旋体侵入较深层表皮(Moter等，1998)。已经被证实在感染的牛中产生额外的针对密螺旋体的体液免疫反应(Walker等，1997；Trott等，2003)。在1966年公开了通过DD病变的新鲜刮擦接种使疾病成功实验性传播(Read和Walker，1996)。也通过组织病理学证实在接种后1-2周螺旋体侵入组织(Read等，1998)。
密螺旋体的几个种系型可以存在于相同的病变中。已经从相同的动物中分离出了不同的种系型(Walker等，1995；Evans等，2008)和通过16S rRNA基因的克隆和测序，在来源于四头母牛的混合样品中，确定了五种不同的种系型(Choi等，1997)。通过DD病变活检的荧光原位杂交也已经证明了不同种系型之间在真皮层中分布的不同(Moter等，1998)。溃蚀齿样密螺旋体(Treponema phagedenis-like)种系型主要分布在角质层和棘层。一些种系型也还没有培养的报道。近来在一些研究中，溃蚀齿样密螺旋体种系型已经被确定是DD发病机制的关键因素(Klitgaard等.2008，Nordhoff等.2008，Yano等.2009)。
在DD广泛传播的国家中，经常使用含有抗生素的足浴。这些足浴迅速被粪便和污物污染，因此起到抗生素耐药性细菌的高选择性培养的作用。在瑞典使用四环素，但是仅用于个体动物的局部治疗，因此推荐含硫酸铜的畜牧水平足浴。
至今还没有用于DD的商业疫苗或血清学检测。针对密螺旋体的体液应答已经被证实存在于患有DD的牛中，并在研究中用于全细胞裂解物ELISA调查(Demirkan等.1999，Trott等.2003，Vink等.2009，Walker等.1997)。在21世纪早期的若干年，诺华公司生产了用于美国市场的全细胞裂解物DD疫苗(TrepShield)(Berry等.2004，Keil等.2002)。
疫苗开发的技术和策略描述于i.a.Vaccine Design：Innovative Approachand Novel Strategies(Caister Academic Press，2011)和Vaccines：From Conceptto Clinic：A Guide to the development and Clinical Testing of Vaccines forHuman Use(Informa Healthcare，1998)。在1997年Erdile等描述了重组蛋白作为疫苗的应用。
发明简述
本发明的目的在于提供有效的用于动物皮炎，特别是反刍动物中的蹄炎的诊断和免疫保护方法，以及用于所述目的的产品。
本发明围绕从牛蹄炎中分离的密螺旋体的免疫原性蛋白，更具体的是重组蛋白。
在第一个方面，本发明涉及分离的溃蚀齿样密螺旋体蛋白，TmpA、Ttm和PrrA，分别具有根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，涉及能够诱导对密螺旋体的免疫应答的片段和衍生物，和涉及能够结合由对象在针对所述蛋白的免疫应答中所产生的抗体的片段和衍生物，其如下进一步定义。
在本发明的一个实施方式中，密螺旋体蛋白和其片段和衍生物是重组产生的。
在一个方面，本发明涉及编码本发明的蛋白质、片段和衍生物的核酸分子。
本发明还涉及所述蛋白质、其片段和衍生物在兽药中的应用，特别是作为用于预防蹄炎的疫苗。
在另一方面，本发明提供一种用于预防蹄炎的兽用疫苗，其包含一或多种所述重组蛋白和/或其活性片段，和常规的和适宜的佐剂。为了得到更广的免疫应答，该疫苗可能进一步包括或不包括其它的密螺旋体免疫原或不同的密螺旋体的全细胞裂解物。
根据另一个方面，本发明还涉及一种在动物中预防蹄炎的方法，包括给有需要的动物施用所述疫苗的步骤。
根据仍然另一方面，提供一种用于检测样品中针对密螺旋体的抗体的存在的方法，其中所述重组蛋白和/或活性片段用于检测样品中针对密螺旋体的抗体的存在。
根据仍然另一方面，提供一种用于诊断动物中蹄炎的方法，其中所述重组蛋白和/或活性片段被用于检测动物中针对密螺旋体的抗体的存在。
在所述检测方法或诊断方法的实施方式中，所述重组蛋白和/或活性片段用于ELISA(酶联免疫吸附测定)方法中。
在一个方面，本发明涉及针对所述免疫原性蛋白或其免疫原性衍生物或片段的抗体。这种抗体在通过被动免疫方式治疗由密螺旋体所引起的疾病中是有用的，和在例如密螺旋体的免疫磁性分离的多种实验室方法中也是有用的。
附图简述
图1：重组溃蚀齿样密螺旋体菌株V1免疫原性蛋白TmpA、Ttm和PrrA作为抗原的酶联免疫吸附测定。用来自患有急性蹄炎(黑条)的8只奶牛、蹄炎病史未知的2只奶牛和6-7个月大的5只小牛(灰色)的血清进行该测定。缀合辣根过氧化物酶(HRP)的兔抗牛IgG抗体(Sigma)(A)或单克隆22∶26抗牛IgG-HRP抗体(Svanova Biotech AB)(B)用作二抗。在450nm下测得校正的光密度值。
定义
“免疫原性剂”或“免疫原”能够在给对象施用时诱导针对自身的免疫应答，任选地与佐剂组合。
如在本说明书中使用的“活性片段”或“活性衍生物”是天然免疫原性剂的片段或衍生物，其能在给对象施用时诱导针对所述天然免疫原性剂的免疫应答，任选地与佐剂组合。活性片段或衍生物包括或模拟至少一种“表位”或“抗原决定簇”。
在本说明书中使用的“结合片段”或“结合衍生物”是天然免疫原性剂的片段或衍生物，其能免疫特异性结合由对象在针对所述天然免疫原性剂的免疫应答中产生的抗体。结合片段或衍生物包括或模拟至少一种“表位”或“抗原决定簇”。
蛋白质的“衍生物”可以是显示与原始蛋白具有大量序列同源性的蛋白质。序列同源性可以是氨基酸序列中的50％或更多的相同性，如65％、80％、85％、90％、95％或99％的相同性。取代的氨基酸优选是保守取代。取代的氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的B和/或T细胞应答的位点。B细胞表位可以是由连续的氨基酸或由蛋白质三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时被保留，然而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，一个表位通常包括至少3个氨基酸，通常更多个，至少5个或8-10个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括，例如，X-射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology，Vol.66，Glenn E.Morris，Ed.(1996)。
可以在显示一种抗体阻断另一种抗体与靶免疫原或其片段或衍生物的结合能力的简单的免疫分析中鉴定识别相同表位的抗体。
术语“抗体”是指完整的抗体，或其结合片段。抗体可能包括完整的抗体分子(包括多克隆、单克隆或嵌合)或包括其抗原结合片段。抗体片段包括F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fc和Fd片段，和可以被并入单域抗体、单链抗体、大抗体、微抗体、内抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、v-NAR和双-scFv(参见例如，Hollinger and Hudson，2005，Nature biotechnology，23，9，1126-1136)。
序列表
Figure BPA00001609930500051
发明详述
进一步概述本发明的方面和实施方式
本发明的一个方面涉及分离的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或其能够诱导对所述蛋白质的免疫应答的片段或衍生物，或其能够结合由对象在针对所述蛋白质的免疫应答中产生的抗体的片段或衍生物。所述蛋白质、片段或衍生物可用于兽药，如用于预防由密螺旋体所引起的疾病，例如蹄炎。
在另一方面，本发明涉及用于治疗或预防由密螺旋体引起的疾病的方法，包括给对象施用具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够诱导针对所述蛋白质的免疫应答的片段或衍生物。所述方法可用于例如蹄炎的疾病。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含具有SEQ ID NO：2、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够诱导针对所述蛋白质的免疫应答的片段或衍生物，和任选存在的药学上可接受的佐剂、载体和/或稀释剂。
在仍另一方面，本发明涉及检测样品中针对密螺旋体的蛋白质的抗体存在的方法，包括以下步骤：
-使所述样品接触具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够结合由对象在针对所述蛋白质的免疫应答中产生的抗体的片段或衍生物；和
-检测结合所述蛋白质、片段或衍生物的抗体。
本发明另一方面涉及用于在体外诊断由密螺旋体引起的疾病的方法，包括以下步骤：
-从对象获取体液或组织样品；
-使所述样品接触具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够结合由对象在针对所述蛋白质的免疫应答中产生的抗体的片段或衍生物；和
-检测结合所述蛋白质、片段或衍生物的抗体；其中结合所述蛋白质、片段或衍生物的抗体的存在表示是由密螺旋体引起的疾病。
所述方法可用于例如蹄炎的疾病。
本发明另一方面涉及抗体或其结合片段，其特异性结合具有SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质。
本发明的另一个方面涉及治疗或预防由密螺旋体引起的疾病的方法，其包含给对象施用所述抗体。蹄炎是此类疾病的一个实例。
本发明另一方面涉及从样品中分离密螺旋体属细菌的方法，包括以下步骤：
-使所述样品与结合至固相的所述抗体接触；
-使所述抗体与所述密螺旋体属细菌中的密螺旋体蛋白质结合；和
-从所述样品中分离所述固相，
由此从所述样品中分离出所述密螺旋体属细菌。
在所述方法中，所述分离可以通过例如免疫磁性分离实现。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的蛋白质、片段或衍生物的核酸分子。在一个实施方式中编码所述蛋白质的核酸分子具有选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和其部分的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及载体，其包含所述核酸分子和任选存在的用于在宿主细胞中表达的调控序列。
本发明的另一个方面涉及包含所述载体的转基因宿主细胞。
本发明还涉及用于产生本发明的蛋白质、片段或衍生物的方法，包括以下步骤：
-在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞；和
-从所述培养基分离所述蛋白质、片段或衍生物。
详述
鸟枪法噬菌体展示用于在与溃蚀齿螺旋体密切相关的DD密螺旋体属种系型的分离株(V1)中鉴定三种免疫原性蛋白质。该种系型已经在许多研究中被确定为DD发病机制的一个关键因素(Klitgaard等.2008，Nordhoff等.2008，Yano等.2009)。针对来自用活细菌免疫的兔子的抗体来选择所述噬菌体文库。
鉴定出苍白密螺旋体苍白亚种(T.pallidum subsp.pallidum)已充分表征的免疫原性蛋白TmpA的同源物，以及与任何已知的螺旋体蛋白不具有同源性的两种蛋白质。从通过454SequencingTM产生的V1基因组序列预测出这些蛋白质的完整的氨基酸序列。这三种具体的免疫原性蛋白质和它们的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：2、4和6中。
根据本发明的第一个方面的蛋白质、片段和衍生物可以从与溃蚀齿螺旋体菌株V1密切相关的密螺旋体属种系型培养物中分离，或者，优选地如下面所描述重组产生。
进行了免疫印迹来显示来自免疫的兔子和天然被感染的牛的抗体结合重组产生的TmpA同源物和Ttm片段。
已进行ELISA预实验，记录到患有和未患有DD的牛的血清之间的吸光度差异(表1)。健康组和感染组的结果之间，使用单抗原(TmpA同源物或Ttm片段)仅有一些重叠，而使用两种抗原的组合没有重叠。
本发明的免疫原性蛋白质和其活性片段，可用于针对至少部分由与溃蚀齿螺旋体或其他密螺旋体密切相关的密螺旋体属种系型所引起的疾病的疫苗。
在某些实施方式中，疫苗中施用完整蛋白。在某些实施方式中，仅施用包含相关表位的片段。在默写实施方式中，一或多种蛋白质的一个或多个表位被组合在单一分子中并在疫苗中使用。重组蛋白、其衍生物或片段因此可以单独或以不同的组合或作为结合表位的融合蛋白来使用。
方法
辅助噬菌体、细菌菌株、生长环境和DNA技术
噬菌体R408(Promega)被用作辅助噬菌体。大肠杆菌TG1(Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rk -mk -)thi-1 supE[F′traD36 proAB lacIqZΔM15]；Stratagene)在设计噬菌体或噬菌粒的所有试验中用作宿主，生长在Luria-Bertani肉汤(LB)或Luria-Bertani琼脂(LA)上。当合适时，加入50μg/ml氨苄西林(C16H18N3O4SNa，Roche)。在37℃孵育。来源于密螺旋体菌株V1的染色体DNA用于构建噬菌体文库。该密螺旋体菌株在含FABGS(苛养厌氧菌肉汤，LAB 71，LabM，Lancashire，UK，每升2.0g D-葡萄糖和25％胎牛血清，S 0115，Biochrom AG，Germany)的烧瓶中生长，37℃下在摇床上的厌氧罐中培养。用等张盐水(pH 6.3)洗涤肉汤培养物3次，随后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.3)洗涤一次。通过常规的苯酚-氯仿提取制备密螺旋体DNA。限制酶和修饰酶从MBI Fermentas AB获得，根据制造商的说明使用。使用QLAprepTM Miniprep(QIAGEN)制备质粒。
免疫和多克隆抗体纯化
这部分的研究获得Uppsala(C 300/8)的动物实验伦理委员会的批准。使用密螺旋体菌株V1的活性培养物皮下免疫新西兰白兔。一剂约109细菌洗涤两次并配制于0.5ml体积的等张盐水，间隔20天注射两次。来自第一次免疫后的第38天的最终放血的血清用于纯化本研究的抗体(IgG)。10ml血清通过0.45μm注射过滤器无菌过滤和施加于5ml HiTrapTM Protein G HP柱(GE healthcare)。根据制造商的说明，使用Ab缓冲液试剂盒(GE Healthcare)纯化兔IgG。使用Zeba Spin脱盐柱(Pierce)对纯化抗体的洗脱液进行脱盐并在PBS中零下20℃存储。
密螺旋体噬菌体展示文库的构建和结合噬菌体的选择(淘选)
噬菌体文库构建于pG8SAEF噬菌体载粒中。通过超声处理将密螺旋体菌株V1染色体DNA片段化直至多数片段的长度在0.4-1.5kb之间。这些片段通过T4DNA聚合酶和T4DNA激酶处理成平末端，然后使用Ready-To-GoTM T4DNA连接酶管(GE Healthcare)连接到SnaB1-消化和去磷酸化的噬菌粒载体pG8SAET上。通过将连接的材料电转化至大肠杆菌TG1细胞(2.5kV，25μF，360Ω)、用辅助噬菌体感染以及增殖噬菌体颗粒而形成最终的文库。这个过程产生了被认为是单克隆的4×107转化体，其中86％携带插入，这通过菌落PCR对14个随机选择的克隆进行测定。最终的文库具有每毫升1×1011菌落形成单位的滴度。
通过针对兔抗密螺旋体菌株V1IgG的淘选分离出展示免疫原性多肽的噬菌体。进行三个淘选试验。微孔(MaxiSorpTM，Nalge Nunc International)用Zymed重组G蛋白G(Invitrogen)包被，浓度为200μl的50mM碳酸钠中的10μg，pH 9.5。然后，这些微孔用pH 7.4的含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)封闭。加入兔-抗密螺旋体菌株V1 IgG，浓度为在200μl PBS或100μl PBS+100μl粗大肠杆菌裂解产物(用于封闭)中的85μg或215μg。在洗涤之后，加入200μl的噬菌体文库。这些微孔在室温下孵育培养3h，或在2℃下过夜，然后洗涤25次，之后在通过加入pH 2.0的50mM柠檬酸钠/140mM NaCl洗脱噬菌体。洗脱液立即用pH 8.0的2M Tris缓冲液中和，并用于感染涂布在含有氨苄西林的LA-平板(LAamp)上的大肠杆菌TG1。在一个淘选试验中，也通过结合噬菌体直接感染添加到微孔中的TG1细胞来进行洗脱。在培养孵育过夜之后，菌落计数，100个菌落转移到LAamp平板上。然后这些菌落被转移到硝酸纤维素滤膜上用于使用鼠抗-Etag抗体(GE Healthcare)和第二辣根过氧化物酶标记的羊抗-鼠抗体(GE Healthcare)筛选E-tag表达。剩下的菌落从平板上洗下并用辅助噬菌体重复感染以制备富集文库/噬菌体储备物，用于根据相同方案的第二次富集循环(再淘选)。总计，进行了两次再淘选。超过200个E-tag阳性菌落被选出用于质粒制备并使用引物SAsekv(5’-TATCTG GTG GCG TAA CAC CTG CT-3’，SEQ IDNO：17)测定插入的序列。在Uppsala Genome Centre的3730xl DNA分析器(Applied Biosystems)上测序质粒DNA并用CLC Main Workbenchsoftware(CLC bio)分析。插入的分析揭示了分别来自3个不同基因中的9、9和8个重叠部分序列。
基因测序和序列分析
密螺旋体菌株V1的染色体DNA在瑞典斯德哥尔摩的KTH RoyalInstitute of Technology中的KTH Genome Center测序和组装，使用具有长读段GS FLX Titanium Chemistry和454从头组装仪(assembler)，Newbler(454 Life Sciences，Branford，CT，USA)的Genome Sequence FLXSystem。使用CLC Genomics Workbench 3(CLC bio)进行额外的De Novo组装读段并用CLC Main Workbench 5(CLC bio)进行进一步序列编辑。
基因组序列用于预测三种免疫原性蛋白质的完整的开放阅读框和相应的氨基酸序列。同源性搜索在国际生物技术信息中心使用BLAST算法而进行。含有革兰氏阳性数据的SignaIP 3.0服务器用于预测信号肽。一种蛋白预测为根据Setubal等.2006的脂蛋白。
用于蛋白表达和纯化的克隆构建
根据用于革兰氏阴性菌的说明书，使用DNeasy Blood&TissueKit(QIAGEN)制备用于PCR的密螺旋体菌株V1的基因组DNA。制备50μl的反应混合物，其含有带MgSO4的5μl 10X Pfu缓冲液(Fermentas)，0.2mM的各种脱氧核苷酸，0.2μM的在表2中所示的正向和反向引物，1.25U PfuDNA聚合酶(Fermentas)和50ng基因组DNA。热循环条件是95℃下1分钟，30个周期的95℃下30s、50℃30s和72℃3分钟，最后在72℃下延伸5分钟。使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，使用illustra GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE Healthcare)纯化。用BamHI和Xhol或Ndel和Sapl根据制造商的说明(Fast digest，Fermentas)消化纯化的扩增子并如前所述纯化。使用ReadyTOGO T4DNA连接酶(GE Healthcare)将消化的扩增子连接到各自的载体上-BamHI和XhoI消化的pGEX-6P-1(批量GST纯化模块，GEhealthcare)或NdeI和SapI消化的pTXB1(IMPACTTM试剂盒，New EnglandBioLabs)。连接的物质被电转化进感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)(GST)或ER2566(IMPACT)并涂布在补充有氨苄西林(最终浓度为50μg/ml)的LA上。使用载体测序引物通过PCR分析在大量的菌落上存在的插入。通过DNA测序进一步分析具有适合尺寸插入的克隆。
重组的免疫原性密螺旋体蛋白质的产生
用商业上可购的蛋白表达和纯化系统，如批量GST纯化模块(GEHealthcare)或IMPACTTM试剂盒(New England BioLabs)，根据制造商的说明产生重组的免疫原性密螺旋体蛋白质。在补充有氨苄西林(最终浓度为50μg/ml的LB培养基)上，在37℃下培养重组克隆。在光密度(OD600nm)～0.6，在生长培养基补充IPTG(最终浓度为0.3mM)，生长温度转至20℃。培养过夜之后，收获细胞并重悬于缓冲液中[20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，0.1mM EDTA，和0.05％(v/v)吐温20]，并且通过冷冻和融化使细胞裂解。在离心之后，将上清液无菌过滤并加至几丁质柱。使用相同的缓冲液充分冲洗柱，随后用裂解缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mMNaCl，0.1mM EDTA，和30mM二硫苏糖醇(DTT)]处理。含有抗原的洗脱样品针对磷酸盐缓冲盐水[PBS；137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4(pH 7.4)]透析。
在GST-谷胱甘肽亲和系统中，根据上面所描述的程序，在生长、诱导和收获之后，将大肠杆菌细胞悬浮在补充有最终浓度为0.1％(v/v)的吐温20的PBS(PBST)中，然后通过冷冻和融解使细胞裂解。在离心之后，将上清液无菌过滤并用谷胱甘肽-琼脂糖珠分批纯化。使用PBST充分冲洗之后，融合蛋白使用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱或用切割蛋白酶处理以释放产生的蛋白质。最终，使用分光光度法测定所获得的抗原的量和用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析其质量。蛋白质被最终存储于-20℃。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
在ELISA中，使用纯化的在大肠杆菌中重组产生的蛋白质与完整细胞的裂解物相比的优点是大规模生产的可行性和测试的优化(不同的蛋白组合，由于高特异性而经常较少背景)。最初的ELISA使用来源于患有或未患有蹄炎(DD)的牛的血清和来自免疫的兔的血清(如上)进行。微孔板(PolySorpTM，Nalge Nunc Internatioanl)用重组TmpA同源性和/或重组尾卷尺蛋白片段以100μl pH9.5的50mM碳酸钠中的分别2.5μg和/或0.31μg的浓度包被，2℃下过夜。用pH 7.4的含有0.05％吐温20的400μl磷酸盐缓冲液(PBS-T)冲洗微孔两次。之后，这些孔在室温下用PBS-T封闭1小时。添加100μl的血清或PBS-T到每个孔中。使用每份血清的1∶25、1∶50、1∶100和1∶200的四种稀释液。这些微孔板在37℃下孵育1小时，然后用400μl的PBS-T洗涤三次。添加辣根过氧化物酶缀合的猪-抗兔(Dako)和兔-抗牛(Dako)抗体到相关的孔中，分别稀释至1∶4000和1∶500，平板在37℃下孵育1小时。用400μl PBS-T洗涤这些孔三次，随后添加100μl由20mM四甲基联苯胺(TMB)与pH 4.25的0.1M柠檬酸钾/H2O2(230μl/l)以1∶20混合组成的溶液。平板在室温下孵育10分钟。加入50μl 10％硫酸终止该反应。在450nm测量光密度(OD)，读数用空白缓冲液校正。
使用抗体的免疫磁性分离
密螺旋体是不易生长的生物，其需要复杂培养基和厌氧环境进行生长。此外，来源于牛蹄的样品有许多其它的细菌污染培养物。免疫磁性分离是浓缩和纯化密螺旋体用于培养和DNA分离的一个选择(Demirkan等.1999，Demirkan等.2001，Choi等.1996)。用例如与针对所述免疫原性蛋白质、其衍生物或活性片段产生的的兔抗体偶联的抗兔IgG共价包被的免疫磁性珠能用于特异性分离与溃蚀齿密螺旋体密切相关的DD密螺旋体属种系型。
疫苗
刺激免疫系统产生抗体的细菌蛋白也可用于开发疫苗。重组蛋白可以与免疫刺激复合物(ISCOM)和/或全细胞裂解物组合以增强动物的免疫应答，并因此增强针对致病因子的保护作用。
另外进行的实验
酶联免疫吸附测定(ELISA)
材料和方法：使用来源于分离出Tpl菌株V1的畜群的患有急性蹄炎的8只奶牛，来源于未知蹄炎病史的另一个畜群的2只奶牛，和6-7个月大的5只小牛的血清进行测定。通过肉眼检查进行蹄炎诊断。微孔板(PolySorpTM，Nalge Nunc International)用pH9.5的100μl 50mM碳酸钠中的重组蛋白(浓度为TmpA 1μg/ml，Ttm 0.8μg/ml或PrrA 0.02μg/ml)包被，在2℃下过夜。用PBS-T洗涤孔两次，用PBS-T在室温下封闭1小时。每个微孔中加入用PBS-T 1∶100稀释的171一百微升血清。微孔板在37℃下孵育1小时，然后用PBS-T洗涤。将1∶8000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG抗体(Sigma)或1∶4000稀释的单克隆22∶26抗牛IgG-HRP抗体(SvanovaBiotech AB)添加到微孔中，平板在37℃下孵育1小时。用PBS-T洗涤这些微孔三次，之后加入由1mM四甲基苯胺和pH 4.25的含0.006％H2O2的0.1M柠檬酸钾组成的100μl溶液。平板在室温下孵育10分钟。加入50μl 10％硫酸终止反应。在450nm处测定光密度，光密度读数减去空白样品缓冲液的光密度以获得校正的光密度(COD)。
结果：重组产生了在Tpl菌株V1中鉴定的三种免疫原性蛋白质；PrrA为全长成熟蛋白，从相对预测脂蛋白信号肽半胱氨酸残基的aa+1至终止密码子前的最后一个aa(aa：22-251)，TmpA相对预测脂蛋白信号肽半胱氨酸残基的aa+7至终止密码子前的最后一个aa(aa：s 29-344)和Ttm为覆盖aa：s 689-970的部分多肽，其是构成与筛选实验的Ttm序列重叠的共有序列的aa：s。这些蛋白质/多肽在间接ELISA中被用作抗原分析来源于患有和未患有DD的牛血清样品中针对所述抗原的抗体的存在。在预实验中测试不同浓度的抗原、血清和二抗(数据未显示)。实现患有和未患有DD的牛的最佳区分的条件用于最终的实验中。对于TmpA抗原，来源于患有DD的牛的三个样品的光密度比来源于临床健康的269牛的样品的最高值略低，在除了一种情况之外，用Ttm和PrrA的测试在所有情况下是有鉴别力的(图1A和B)。
Figure BPA00001609930500141
Figure BPA00001609930500151
表2：脱氧寡核糖核苷酸
参考文献
Berry，S.L.，Ertze，R.A.，Read，D.H.，Hird，D.W.，2004，Field evaluation ofprophylactic and therapeutic effects of a vaccine against(Papillomatous)Digital Dermatitis ofdairy cattle in two Californian dairies.In：Proceedings of the 13th International Symposiumand Conference on Lameness in Ruminants，Maribor，Slovenija，p.147.
Blowey，R.W.，Sharp，M.W.，1988.Digital dermatitis in dairy cattle.Vet.Rec.122，505-508.
Choi，B.K.，Wyss，C.，Gobel，U.B.，1996，Phylogenetic analysis of pathogen-related oralspirochetes.J Clin Microbiol.34，1922-1925.
Choi，B.K.，Nattermann，H.，Grund，S.，Haider，W.，U.B.，1997.Spirochetes fromdigital dermatitis lesions in cattle are closely related to treponemes associated with humanperiodontitis.Int.1.Syst.Bacteriol.47，175-181.
Demirkan，I.，Carter，S.D.，Hart，C.A.，Woodward，MJ.，1999.Isolation and cultivation ofa spirochaete from bovine digital dermatitis.Vet.Rec.145，497-498.
Demirkan，I.，Walker，R.L.，Murray，R.D.，Blowey，R.W.，Carter，S.D.，1999，Serologicalevidence of spirochaetal infections associated with digital dermatitis in dairy cattle.Vet J.157，69-77.
Demirkan，I.，Carter，S.D.，Winstanley，C.，Bruce，K.D.，McNair，N.M.，Woodside，M.，Hart，c.A.，2001，Isolation and characteri-sation of a novel spirochaete from severe virulentovine foot rot.J Med Microbiol.50，1061-1068.
Erdile LF，Guy B.OspA lipoprotein of Borrelia burgdorferi is a mucosal immunogen andadjuvantVaccine.1997 Jun；15(9)：988-96.
Evans，N.J.，Brown，J.M.，Demirkan，I.，Murray，R.D.，Vink，W.D.，Blowey，R.W.，Hart，C.A.，Carter，S.D.，2008.Three unique groups of spirochetes isolated from digital dermatitislesions in UK cattle.Vet.Microbiol.30，141-50.
Gupta，R.B.，Fincher，M.G.，Bruner，D.W.，1964.A study ofthe etiology of foot-rot incattle.Cornell Vet.54，66-77.
Hillstrom，A.，Bergsten，c.，2005.Digital dermatitis-a new infectious foot disease inSwedish dairy cattle.Svensk Vet.Tidn.57，15-20.
Keil，DJ.，Liem，A.，Stine，D.L.，Anderson，G.A.，2002，Serological and clinical responseof cattle to farm specific digital dermatitis bacterins.In：Proceedings of the 12th InternationalSymposium on Lameness in Ruminants，Orlando，FL，USA，p.385.
Klitgaard，K.，Boye，M.，Capion，N.，Jensen，T.K.，2008，Evidence of multipleTreponema phylotypes involved in bovine digital dermatitis as shown by 16S rRNA geneanalysis and fluorescence in situ hybridization.J Clin Microbiol.46，3012-3020.Epub 2008Jun 3018.
Losinger W.e.，2006.Economic impacts of reduced milk production associated withpapillomatous digital dermatitis in dairy cows in the USA.J.Dairy Res.73，244-256.
Manske，T.，Hultgren，J.，Bergsten，C.，2002.Topical treatment of digital dermatitisassociated with severe heel-hom erosion in a Swedish dairy herd.Prev.Vet.Med.53，215-231.
Moter，A.，Leist，G.，Rudolph，R.，Schrank，K.，Choi，B.K.，Wagner，M.，Gobel，U.B.，1998.Fluorescence in situ hybridization shows spatial distribution of as yet unculturedtreponemes in biopsies from digital dermatitis lesions.Microbiology 144，2459-2467.
Nordhoff，M.，Moter，A.，Schrank，K.，Wieler，L.H.，2008，High prevalence oftreponemes in bovine digital dermatitis-a molecular epidemiology.Vet Microbiol.131，293-300.Epub 2008 Apr 2022.
Read，D.，Walker，R.，1996.Experimental transmission of papillomatous digitaldermatitis(footwarts)in cattle.Vet.pathol.33，607.
Read，D.，Nordhausen，R.，Walker，R.L.，1998.Pathogenesis of experimentalpapillomatous digital dermatitis(footwarts)in cattle：Bacterial morphotypes associated withearly lesion development.In：Lischer C.and assent P.(Eds.)，Proceedings 10th internationalsymposium on lameness i ruminants，Lucerne，Switzerland，p.271.
Rodriguez-Lainz，A.，Hird，D.W.，Carpenter，T.E.，Read，D.H.，1996.Case-control studyof papillomatous digital dermatitis in Southern California dairy farms.Prev.Vet.Med.28，117-131.
Setubal，J.C.，Reis，M.，Matsunaga，J.，Haake，D.A.，2006，Lipoprotein computationalprediction in spirochaetal genomes.Microbiol.152，113-121.
Trott，D.J.，Moeller，M.R.，Zuerner，R.L.，Goff，J.P.，Waters，W.R.，Alt，D.P.，Walker，R.L.，Wannemuehler，M.J.，2003，Characterization of Treponema phagedenis-like spirochetesisolated from papillomatous digital dermatitis lesions in dairy cattle.J Clin Microbiol.41，2522-2529.
Vink，W.O.，Jones，G.，Johnson，W.O.，Brown，J.，Demirkan，1.，Carter，S.D.，French，N.P.，2009，Diagnostic assessment without cut-offs：application of serology for the modelling ofbovine digital dermatitis infection.Prev Vet Med.92，235-248.
Walker，R.L.，Read，D.H.，Loretz，K.J.，Nordhausen，R.W.，1995.Spirochetes isolatedfrom dairy cattle with papillomatous digital dermatitis and interdigital dermatitis.Vet.Microbiol.47，343-355.
Walker，R.L.，Read，D.H.，Loretz，K.J.，Hird，D.W.，Berry，S.L.，1997，Humoral responseof dairy cattle to spirochetes isolated from papillomatous digital dermatitis lesions.Am J VetRes.58，744-748.
Yano，T.，Moe，K.K.，Yamazaki，K.，Ooka，T.，Hayashi，T.，Misawa，N.，2009，Identification of candidate pathogens of papillomatous digital dermatitis in dairy cattle fromquantitive 16S rRNA clonal analysis.Vet Microbiol.23，23.
Figure IPA00001609930100011
Figure IPA00001609930100021
Figure IPA00001609930100041
Figure IPA00001609930100051
Figure IPA00001609930100061
Figure IPA00001609930100071
Figure IPA00001609930100081
Figure IPA00001609930100091
Figure IPA00001609930100111
Figure IPA00001609930100121
Figure IPA00001609930100131
Figure IPA00001609930100151
Figure IPA00001609930100161

Claims (19)

1.具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质，或其能够诱导针对所述蛋白质的免疫应答的片段或衍生物，或其能够结合由对象在针对所述蛋白质的免疫应答中产生的抗体的片段或衍生物。
2.权利要求1的蛋白质、片段或衍生物，其用于兽药中。
3.权利要求1的蛋白质、片段或衍生物，其用于预防由密螺旋体(Treponema spp.)引起的疾病，例如蹄炎。
4.用于治疗或预防由密螺旋体引起的疾病的方法，包括给对象施用具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白或其能够诱导针对所述蛋白质的免疫应答的片段或衍生物。
5.权利要求4的方法，其中所述由密螺旋体引起的疾病是蹄炎。
6.药物组合物，其包含具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够诱导针对所述蛋白质的免疫应答的片段或衍生物，和任选存在的药学上可接受的佐剂、载体和/或稀释剂。
7.检测样品中针对来自密螺旋体的蛋白质的抗体存在的方法，包括以下步骤：
-使所述样品接触具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够结合由对象在针对所述蛋白质的免疫应答中产生的抗体的片段或衍生物；和
-检测结合所述蛋白质、片段或衍生物的抗体。
8.体外诊断由密螺旋体引起的疾病的方法，包括以下步骤：
-从对象获取体液或组织样品；
-使所述样品接触具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质或其能够结合由对象在针对所述蛋白质的免疫应答中产生的抗体的片段或衍生物；和
-检测结合所述蛋白质、片段或衍生物的抗体；
其中结合所述蛋白质、片段或衍生物的抗体的存在表示是由密螺旋体引起的疾病。
9.权利要求8的方法，其中所述疾病是蹄炎。
10.抗体或其结合片段，其特异性结合具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的蛋白质。
11.治疗或预防由密螺旋体引起的疾病的方法，其包括给对象施用权利要求10的抗体。
12.权利要求11的方法，其中所述由密螺旋体引起的疾病是蹄炎。
13.从样品中分离密螺旋体属细菌的方法，包括以下步骤：
-使所述样品与结合至固相的权利要求10的抗体接触；
-使所述抗体结合所述密螺旋体属细菌中的密螺旋体蛋白质；和
-从所述样品中分离所述固相，
由此从所述样品中分离所述密螺旋体属细菌。
14.权利要求13的方法，其中所述分离是免疫磁性分离。
15.编码权利要求1的蛋白质、片段或衍生物的核酸分子。
16.权利要求15的核酸分子，其具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
17.载体，其包含权利要求15或16的核酸分子以及任选存在的用于在宿主细胞中表达的调控序列。
18.转基因宿主细胞，其包含权利要求17的载体。
19.用于产生权利要求1的蛋白质、片段或衍生物的方法，包括以下步骤：
-在合适的培养基中培养权利要求18的宿主细胞；和
-从所述培养基中分离所述蛋白质、片段或衍生物。
CN2011800077474A 2010-01-28 2011-01-28 用于疫苗的重组蛋白质、针对所述蛋白质的抗体及包括所述蛋白质和抗体的诊断和治疗方法 Pending CN102918053A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29896010P 2010-01-28 2010-01-28
US61/298,960 2010-01-28
US36098610P 2010-07-02 2010-07-02
US61/360,986 2010-07-02
PCT/SE2011/050090 WO2011093783A1 (en) 2010-01-28 2011-01-28 Recombinant proteins for use in vaccine, antibodies against said proteins, and diagnostic and therapeutic methods including the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102918053A true CN102918053A (zh) 2013-02-06

Family

ID=44319584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800077474A Pending CN102918053A (zh) 2010-01-28 2011-01-28 用于疫苗的重组蛋白质、针对所述蛋白质的抗体及包括所述蛋白质和抗体的诊断和治疗方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8703432B2 (zh)
EP (1) EP2528939B1 (zh)
JP (1) JP2013518563A (zh)
CN (1) CN102918053A (zh)
AU (1) AU2011209988A1 (zh)
BR (1) BR112012018840A2 (zh)
CA (1) CA2825282A1 (zh)
NZ (1) NZ601980A (zh)
RU (1) RU2012137304A (zh)
WO (1) WO2011093783A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10010423B2 (en) 2013-03-15 2018-07-03 Avinash Kumar Anatomical humeral fixation system and method
JP5740062B1 (ja) * 2013-07-03 2015-06-24 三菱化学フーズ株式会社 毛状疣贅病の予防および／または治療方法
US10022458B2 (en) 2015-03-05 2018-07-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Animal model protocol, diagnostic, therapeutic and vaccine against digital dermatitis
JP7399865B2 (ja) * 2017-11-17 2023-12-18 ヒプラ サイエンティフィック， エセ． エレ． ウ． 哺乳動物における趾皮膚炎に使用されるワクチン組成物
KR102177180B1 (ko) * 2020-05-13 2020-11-10 순천대학교 산학협력단 신규 트레포네마 파지데니스 균주 및 이의 분리 방법
KR102177181B1 (ko) * 2020-05-14 2020-11-10 순천대학교 산학협력단 트레포네마 파지데니스 균주의 배양 조성물 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096323A (en) * 1997-10-03 2000-08-01 The Regents Of The University Of California Vaccine against papillomatous digital dermatitis (PDD)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0534526A1 (en) * 1991-09-25 1993-03-31 Duphar International Research B.V Treponema hyodysenteriae vaccine
IL103530A0 (en) * 1991-10-25 1993-03-15 Duphar Int Res Treponema hyodysenteriae vaccine
US6287575B1 (en) 1997-10-03 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Vaccine against papillomatous digital dermatitis (PDD)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096323A (en) * 1997-10-03 2000-08-01 The Regents Of The University Of California Vaccine against papillomatous digital dermatitis (PDD)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D.J TROTT ET AL: "Characterization of Treponema phagedenis like Spirochetes isolated from papillomatous digital dermatitis lesions in dairy cattle", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
YELTON DB ET AL: "Genbank：M58475.1", 《GENBANK》 *
YELTON DB ET AL: "Genbank：P29721.1", 《GENBANK》 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ601980A (en) 2014-08-29
RU2012137304A (ru) 2014-03-10
EP2528939A4 (en) 2013-07-03
BR112012018840A2 (pt) 2017-06-20
CA2825282A1 (en) 2011-08-04
JP2013518563A (ja) 2013-05-23
AU2011209988A1 (en) 2012-09-13
EP2528939B1 (en) 2015-04-08
EP2528939A1 (en) 2012-12-05
WO2011093783A1 (en) 2011-08-04
US20130034560A1 (en) 2013-02-07
US8703432B2 (en) 2014-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Atzingen et al. Lsa21, a novel leptospiral protein binding adhesive matrix molecules and present during human infection
Cheng et al. Identification and immunoprotective analysis of a Streptococcus iniae subunit vaccine candidate
Olvera et al. Virulence-associated trimeric autotransporters of Haemophilus parasuis are antigenic proteins expressed in vivo
CN103483431B (zh) 猪链球菌多肽和编码其的多核苷酸以及它们在疫苗和诊断中的应用
Garibaldi et al. Immunoprotective activities of a Streptococcus suis pilus subunit in murine models of infection
CN102918053A (zh) 用于疫苗的重组蛋白质、针对所述蛋白质的抗体及包括所述蛋白质和抗体的诊断和治疗方法
KR102460165B1 (ko) Ospa의 돌연변이 단편 및 이와 관련된 방법 및 용도
CZ280743B6 (cs) Imunogen proti lymské boreliose savců
Rosander et al. Identification of immunogenic proteins in Treponema phagedenis-like strain V1 from digital dermatitis lesions by phage display
Godlewska et al. Evaluation of a protective effect of in ovo delivered Campylobacter jejuni OMVs
Bulashev et al. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins.
US10022458B2 (en) Animal model protocol, diagnostic, therapeutic and vaccine against digital dermatitis
Lo et al. Characterization of two lipoproteins in Pasteurella multocida
CA2719041A1 (en) A method for identifying polypeptides which comprise a cross-reactive antigenic determinant
Lin et al. Identification of a 35-kilodalton serovar-cross-reactive flagellar protein, FlaB, from Leptospira interrogans by N-terminal sequencing, gene cloning, and sequence analysis
RU2514230C1 (ru) Рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза
CN116284274A (zh) 一种重组猪丹毒杆菌表面抗原SpaA蛋白及其应用
US6162429A (en) Detection prevention and treatment of Papillomatous Digital Dermatitis
CN113754782A (zh) 一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用
MX2010009516A (es) Secuencias novedosas de brachyspira, composiciones inmunogenicas, metodos para la preparacion y usos de las mismas.
Yu et al. InlA and InlC2 of Listeria monocytogenes serotype 4b are two internalin proteins eliciting humoral immune responses common to listerial infection of various host species
RU2102081C1 (ru) Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi
Phoka et al. Identification of in vivo expressed proteins in live attenuated lipopolysaccharide mutant that mediates heterologous protection against Leptospira spp
Redchuk et al. Expression of Mycobacterium tuberculosis proteins MPT63 and MPT83 as a fusion: purification, refolding and immunological characterization
EP4046652A1 (en) Compositions and methods for diagnosing, treating and preventing carrion's disease

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20161116

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned