CN102914577B - 用于无标记h-IGg阻抗型免疫传感器的氧化还原探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于无标记h-IGg阻抗型免疫传感器的氧化还原探针的制备方法。向溶有3,5-二溴水杨醛的无水乙醇溶液中，滴加含β-巯基乙胺的无水乙醇溶液，水浴加热，重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱；将无水乙醇和N,N′-二甲基甲酰胺按体积比为2:1制成混合溶剂，向溶有β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱的混合溶剂中滴加含乙酸镍的N,N′-二甲基甲酰胺溶液，水浴加热，重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物；取β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物，溶于无水乙醇中，再加入到纳米金溶胶中。本发明制备简单，用于无标记h-IGg阻抗型免疫传感器检测h-IGg含量，具有检测限低、稳定性好和重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于无标记h-IgG阻抗型免疫传感器的氧化还原探针的制备方法。
背景技术
免疫球蛋白 G(h-IgG)是人体血清中含量最高的抗体 ,占血清中免疫球蛋白的70～80 % ,是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白,具有抗菌、抗病毒、抗毒素的特性,在机体免疫防护中起着重要作用。同时，IgG还是保持人体健康的重要物质，市场上出现了许多富含IgG的保健食品如牛初乳片等。在临床检测中，IgG含量的变化也是判定病变的重要指标。因此，建立一种新型、快速免疫球蛋白 G(h-IgG)的检测方法，对食品安全、生物分析检测具有积极的作用。无标记电化学免疫传感器通过直接测定抗原抗体复合物形成时的物理、化学变化，极大地简化制备和操作过程，适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析，已经广泛应用于临床医学、环境、制药、食品等分析领域中。氧化还原探针的选择对无标记电化学免疫传感器的应用效果具有重要的影响，这是因为其分析原理是基于测定抗原/抗体结合前后，氧化还原探针分子同电极之间的电子转移速率或电子转移阻抗的变化，来实现抗原/抗体高灵敏检测的目的。常见的氧化还原探针K4Fe(CN)6常常无法作为电化学免疫传感器的探针。因此，不断开发适合各种抗原/抗体的检测的无标记电化学免疫传感器的氧化还原探针具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是为无标记h-IgG阻抗型免疫传感器提供一种氧化还原探针，以提高无标记h-IgG阻抗型免疫传感器的检测性能。
本发明的目的是通过如下步骤来实现的：
1. 一种用于无标记h-IGg阻抗型免疫传感器的氧化还原探针，由β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物无水乙醇溶液、纳米金溶胶组成。
上述β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱结构式为：
。
2.所述的氧化还原探针的制备步骤为：
（1）合成β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱：
在搅拌的条件下，向10mL溶有4-8mmol3,5-二溴水杨醛的无水乙醇溶液中,缓慢滴加10mL含4-8mmolβ-巯基乙胺的无水乙醇溶液，60℃水浴加热4小时,得浅黄色沉淀，用无水乙醇重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱粉末。
（2）合成β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物：
将无水乙醇和N,N′—二甲基甲酰胺(DMF)按体积比为2:1制成混合溶剂，在搅拌的条件下，向5mL溶有0.5-1.5mmol步骤（1）制得的β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱的上述混合溶剂中缓慢滴加8mL含1-3mmol乙酸镍的N,N′—二甲基甲酰胺溶液,75℃水浴加热4小时,得深棕色沉淀，用无水乙醇重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物粉末。
（3）制备氧化还原探针：
取0.01g-0.05g步骤（2）制得的β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物粉末，在室温下搅拌溶于50mL无水乙醇中,取此溶液15-25μL缓慢加入到7mL-12mL纳米金溶胶中，在36℃下混合均匀后的溶液即为本发明的氧化还原探针。
本发明的氧化还原探针制备简单，用于无标记h-IGg阻抗型免疫传感器检测h-IGg含量，具有检测限低、稳定性好和重现性好等优点。
具体实施方式
实施例：
（1）合成β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱：
在搅拌的条件下，向10mL溶有6mmol3,5-二溴水杨醛的无水乙醇溶液中,缓慢滴加10mL含6mmolβ-巯基乙胺的无水乙醇溶液，60℃水浴加热4小时,得浅黄色沉淀，用乙醇重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱粉末。
（2）合成β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物：
将无水乙醇和N,N′—二甲基甲酰胺(DMF)按体积比为2:1制成混合溶剂，在搅拌的条件下，向5mL溶有1mmol步骤（1）制得的β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱的上述混合溶剂中缓慢滴加8mL含2mmol乙酸镍的N,N′—二甲基甲酰胺溶液,75℃水浴加热4小时,得深棕色沉淀，用无水乙醇重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物粉末。
（3）制备氧化还原探针：
取0.03g步骤（2）制得的β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物粉末，在室温下搅拌溶于50mL无水乙醇中,取此溶液20μL缓慢加入到10mL纳米金溶胶中，在36℃下混合均匀后的溶液即为本发明的氧化还原探针。
无标记h-IGg免疫传感器的制作：
用氧化铝粉末在麂皮表面将裸金电极抛光至呈镜面，分别依次用超纯水、无水乙醇和超纯水清洗电极表面各5分钟，干燥后置于阴凉处待用。将前期预处理好的裸金电极置于含有L-半胱氨酸的PBS(pH 6.0）缓冲溶液中，自组装反应12小时后取出，置于含有重量百分比浓度为5% 的戊二醛的PBS(pH 7.0）缓冲溶液中，自组装反应6小时后取出，置于含有Anti-IgG的PBS(pH 7.0）缓冲溶液中，自组装固定1.5小时后取出，在含有5%牛血清白蛋白的PBS(pH 7.0）缓冲溶液中进行表面非活性位点的封闭，封闭1小时后取出，置于不同浓度的含有h-IgG的PBS(pH 7.0）缓冲溶液中，进行特异性结合。超纯水洗涤晾干,即得无标记h-IGg免疫传感器，置于4℃的冰箱中保存待用；传感器的制备过程中温度控制在37℃左右。
将上述制备好的无标记h-IGg免疫传感器中放入待测的h-IgG抗原溶液，进行抗体—抗原的特异性结合12小时，然后置于前述制备好的氧化还原探针溶液中，利用交流阻抗法检测h-IgG抗原浓度。采用三电极体系，修饰金电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞为参比电极。选择振幅值为5mV，开路电位为-0.20 V，在100 kHz～10 mHz之间检测样品溶液的电阻值，进而计算出h-IgG浓度值。实验测试温度控制在37℃。
计算公式如下：
ΔRP=-60.23+11.47×Ch-IgG，
式中：ΔRP-检测样品的电阻（Ω）；Ch-IgG-抗原的不同浓度值（ng.mL-1）。
测定的实验结果如下：检测样品的电阻为400Ω时，h-IgG的浓度为40.12ng.mL-1。
Claims (1)
1.一种用于无标记h-IGg阻抗型免疫传感器的氧化还原探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）合成β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱：
在搅拌的条件下，向10mL溶有4-8mmol 3,5-二溴水杨醛的无水乙醇溶液中,缓慢滴加10mL含4-8mmolβ-巯基乙胺的无水乙醇溶液，60℃水浴加热4小时,得浅黄色沉淀，用无水乙醇重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱粉末；
（2）合成β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物：
将无水乙醇和N,N′—二甲基甲酰胺按体积比为2:1制成混合溶剂，在搅拌的条件下，向5mL溶有0.5-1.5mmol步骤（1）制得的β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱的上述混合溶剂中缓慢滴加8mL含1-3mmol乙酸镍的N,N′—二甲基甲酰胺溶液,75℃水浴加热4小时,得深棕色沉淀，用无水乙醇重结晶，真空干燥即得β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物粉末；
（3）制备氧化还原探针：
取0.01g-0.05g步骤（2）制得的β-巯基乙胺缩3,5-二溴水杨醛席夫碱镍配合物粉末，在室温下搅拌溶于50mL无水乙醇中,取此溶液15-25μL缓慢加入到7mL-12mL纳米金溶胶中，在36℃下混合均匀后的溶液即为氧化还原探针。
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