CN102899320A

CN102899320A - 一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记及应用

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Publication number: CN102899320A
Application number: CN2011102189601A
Authority: CN
Inventors: 易建明; 周雄涛; 张淑君; 张军伟; 张琨
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-07-30
Filing date: 2011-07-30
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-07-30
Also published as: CN102899320B

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域。具体涉及一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记及应用。从牛NOS1基因中克隆得到一特异片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中在序列表SEQ ID NO：1的第121bp处有1个A121-G121的碱基突变，导致HaeⅢ-RFLP多态性；在序列表SEQ ID NO：1第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致Alu Ⅰ-RFLP多态性。本发明为奶牛分子标记辅助选择提供了一种新标记。

Description

一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记及应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域。具体涉及一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记的制备及应用。

背景技术

我国的奶牛业历史悠久，但规模化生产起步较晚，相对于发达国家来说，还是存在一定的差距。牛奶对提高国民身体素质的重要性是毋庸质疑的，由于饮食习惯的差异，牛奶被大众普遍接受经历了一个漫长的过程。在我国，居民的人均拥有牛奶是25kg/年，只相当于世界平均水平的1/13，同时奶牛业发展呈现南北不平衡，由于气候，饲料资源等一系列原因，北方占绝对优势。奶牛是喜寒怕热的动物，在我国的南方，每年的7-9月份的高温天气，会使奶牛产生热应激，往往造成产奶量的大幅下降和疾病的增加，使经济蒙受损失，这是一个不能避免的因素。弹丸之国以色列，位于亚洲西部，是亚、非、欧三大洲结合处，气候炎热干旱，缺乏水源和饲料资源，饲养奶牛条件比较差，但是他们结合本国的情况，依靠自主创新、科技投入和奶业协会的有效协调，使以色列成为世界著名的奶业强国，除了先进的生产管理，另一个重要因素是加强了抗热应激奶牛品种的选育。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧产生的一氧化氮(notricoxide，NO)是炎症反应和氧化应激中重要的相关气使分子之一。NO的生理效应有两面性，一方面可通过使cGMP升高激活蛋白激酶，发挥血管扩张作用，抑制血小板聚集与粘附；通过与谷氨酸琉基结合下调谷氨酸受体调控的离子通道，防止细胞内钙超载，防止NO⁺向NO^-转变，起到细胞保护作用。另一方面NO在高浓度状态下，又可与超氧阴离子(Superoxide anion radical，O^2-)反应，生成超氧亚硝酸根离子(peroxyntrite，ONOO^-)，也可引起细胞核酸亚硝酰化，破坏DNA结构及形成亚硝酞铁络合物，抑制细胞呼吸DNA复制相关的酶活性，发挥细胞毒性作用。(司良毅，1999)

NOS作为NO合成的关键酶，在NO的生成调节中起关键作用。迄今有多研究证实三种基因编码不同，但结构相似的一氧化氮亚型：诱导型NOS(inducibleNOS，iNOS)、神经型NOS(neuronal NOS，nNOS)和内皮型NOS endothelial NOS，eNOS)，(陈丹，2008)通过研究肢体缺血再灌注大鼠脑组织中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA的表达，通过检测脑组织中的MDA含量和SOD的活性，发现实验组与对照组相比，在缺血再灌注4h组，MDA的含量达到最高，SOD的活力下降到最低。与对照组差异显著(P＜0.05)，iNOS、nNOS、eNOS的表达量与SOD的活力呈负相关，相关系数分别为(r＝-0.340，-0.415，-0.310)，说明NOS的三种基因的超表达会对缺血再灌注后的脑组织构成氧化损伤。

发明内容

本发明的目的在于扩增奶牛NOS1基因的部分DNA序列，以寻找该基因突变位点多态性，筛选一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记。本发明还包括该分子标记在奶牛标记辅助选择上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种筛选奶牛氧化应激相关基因NOS1分子标记，按照以下步骤：

从Ensembl数据库(http://www.ensembl.org)中获得基因登录号为ENSBTAG00000002023的牛NOS1基因DNA序列，以该基因的DNA序列设计引物；从牛血液基因组中提取总DNA，PCR扩增，PCR产物纯化，获得如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，通过PCR-RFLP进行基因型检测和分型，在该序列表SEQID NO：1中的第121bp处有一个A121-G121的碱基突变，导致HaeⅢ-RFLP多态性；以及，在该序列的第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致AluⅠ-RFLP多态性。此处的第121bp处的碱基相当于牛NOS1基因DNA序列全序列的371bp处，第149bp处相当于牛NOS1基因DNA序列全序列的399bp处(在图3，4，5，6中所示的序列中碱基对应的位置是按照牛NOS1基因DNA序列全序列统计的，而图2和序列表SEQ ID NO：1是牛NOS1基因的片段及部分DNA序列)。

更详细技术细节如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明制备的分子标记的核苷酸序列(牛NOS1基因的部分DNA序列)，序列长度为300bp，在序列表SEQ ID NO：1的第121bp处有一个A121-G121的碱基突变，导致HaeⅢ-RFLP多态性；同时在该序列的第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致AluⅠ-RFLP多态性。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是本发明扩增的NOS1基因的部分DNA片段(其对应于上述序列表SEQ ID NO：1所示的序列，序列中的英文字母“R”，分别代表突变位置，括号内显示碱基替换)。

图3：是用于PCR直接测序的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。琼脂糖浓度为1.5％。其中1-5泳道为PCR产物，长度为345bp，M泳道：DNA分子量标记(100bp DNA ladder)。

图4，图5：是371bp处和399bp处PCR测序的彩峰图(此处的371bp处和399bp是NOS1基因的全序列中所处的位置，其中该371bp就是本发明扩增的如SEQ ID NO：1序列所示的121bp，399bp就是本发明扩增的如SEQ ID NO：1序列所示的149bp)。

图6：是奶牛NOS1基因序列A121-G121和C149-T149的多态性检测结果。

具体实施方式

实施例1：牛NOS1基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测

1、奶牛NOS1基因部分DNA序列的扩增

1.1 引物设计

根据Ensembl提供的牛NOS1基因(基因登录号：ENSBTAG00000002023)的序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-CACCACCAGCGTCTGCTCT-3’，

反向引物：5’-GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC-3’。

1.2 奶牛血液基因组DNA的提取与检测

(1)分离白细胞

(2)在含有白细胞的试管中加入1ml的1×SET，加入200ul蛋白酶K(10mg/ml)，10％十二烷基硫酸钠(SDS)100ul。置入恒温水浴锅55℃消化过夜。

(3)加入等体积的平衡酚，(pH＝8.0)，缓慢颠倒离心管10min，以使管内溶液混匀，4℃8000rmp，离心10min。

(4)小心吸取上层含有DNA的上清液，移至另一离心管，再加入苯酚重复步骤(3)

(5)同法，吸上清，加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，4℃8000rmp离心10min。

(6)吸上清后加入氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，缓慢颠倒离心管10MIN，与以上相同的离心条件。

(7)吸上清，加入1/10体积的NaAc(3M，PH＝5.2)及2倍体积预冷的无水乙醇，振荡离心管可见白色的絮状物，即DNA，于-20℃放置30min。

(8)取出冷冻后的样品，于12000rmp高速离心5-8min，弃掉上层乙醇。

(9)加入1mL70％的乙醇洗涤沉淀，同速离心5-8min。

(10)小心弃掉70％乙醇，在室温下挥发残留乙醇，加入适量的TE溶解DNA。

(11)充分溶解后的DNA样可在1.5％琼脂糖胶上电泳检验，同时在DNA浓度测定仪上测定浓度。

(12)或按照报道的常规方法稀释成一定浓度，存放于-20℃的冰箱内备用。

1.3 PCR扩增

PCR反应体系为20ul：10×Buffer(含Mg²⁺)2.0ul，10mM dNTP 1.6ul，4uM上引物、下引物各0.4ul，5U/ul Taq酶0.4ul，500ng/ul DNA 1.0ul，ddH₂O 14.2ul，混匀，瞬时离心。

扩增条件为：94℃预热5min→94℃变性30s→58.2℃(67.2℃、63.9℃、67.6℃)退火30s→72℃延伸30s(从第二步变性到第四步进行30个循环)，然后72℃延伸5min→16℃6min。4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

2、PCR-SSCP检测及测序寻找SNP位点

2.1 PCR-SSCP检测

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，取5ul扩增产物加入溴酚蓝变性剂混合物(0.25％溴酚蓝∶变性剂＝1∶4)10ul，99℃变性10min，变性结束后立即将PCR管置于冰水混合物上冰浴2min，防止DNA单链复性。然后在交联度为39∶1的10％的聚丙烯酰胺凝胶上点样进行电泳检测。

(1)10％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配置(总体积35ml)

将以上溶液于小烧杯中混合摇匀。

(2)上样、电泳

凝胶聚合后拔出梳子，用注射器吸取1×TBE缓冲液(先制成5×TBE储备液，配方为：称取54gTris碱和27.5g硼酸溶于750ml双蒸水中，加入20ml 0.5MEDTA(PH＝8.0)，加水定容至1L；然后稀释成1×TBE)冲洗梳孔，以除去未聚合的胶液，使样品容易沉降。组装好电泳设备，用1.5％琼脂糖胶液封闭好玻璃板与电泳槽之间的缝隙，防止电泳缓冲液渗漏。在上下缓冲槽中倒入足量1×TBE缓冲液，用50ul移液器将PCR变性产物缓缓注入梳孔。上样完毕后开启电泳仪，开始用高压250V电泳30min，后改用115V电压电泳12个小时，直至二甲苯氰电泳指示条带迁移到凝胶底部。

(3)凝胶染色

电泳完毕，取下玻板，小心地将凝胶从玻板上剥离下来，放入双蒸水中漂洗一次，然后500ml固定液(无水乙醇45mL+冰醋酸2.5mL加至500mL)放入摇床5-10min；用双蒸水漂洗后，加入500ml染色液(硝酸银0.75g+500mL水+37％甲醛0.75mL)，加入甲醛，用黑色塑料袋包裹避光，脱色6-8min；用双蒸水冲洗后，加入500ml显色液(无水NaOH 7.5g+双蒸水500mL+37％甲醛1mL)，并加入甲醛，直至黄色背景和条带出现为止；用水停显，用白光板观察染色效果。

(4)凝胶成像与电泳条带分析

讲目标条带清晰的凝胶在凝胶成像系统中进行扫描并保存电泳图谱。根据电泳条带判断基因型。

2.2 PCR产物的纯化与测序

在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)纯化PCR产物。纯化方法：在1.5ml离心管中加入400ul吸附液，在凝胶完全溶解之前将其放置在室温中，且不时进行搅拌，如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或者凝胶难以溶解时，放入55℃水浴锅温浴5min，加入30ul磁珠，经常用漩涡搅拌器搅拌，并放置2min(室温)，然后放入离心机(6000rpm，5sec)，加入600ul洗净液，搅拌10sec，离心(6000rmp，5sec)，加入1ml 75％无水乙醇，搅拌10sec，瞬时高速离心，彻底去除上清部分(打开微型试管的盖子，55℃下放置5min，干燥)，加入25-200ul蒸馏水，搅拌10sec，放置2min后离心(6000rmp，5sec)，回收上清液。上清液中含有回收的目的片段。

从两个样品的品种中分别挑选几个DNA样品送到上海生工生物工程技术有限公司进行测序。

2.3 DNA序列比对及突变位点的鉴定

用测序获得的基因序列进行序列同源性比较，用DNASTAR5.01软件和PRIMER5.软件对测序峰图进行了分析，以鉴定和获得该DNA序列的突变信息。

3、PCR-RFLP诊断方法的建立

3.1 PCR产物的扩增

PCR产物的扩增如前面所述(见1.3)

3.2 PCR产物酶切

正向引物：CACCACCAGCGTCTGCTCT，

反向引物：GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC；

引物酶切反应体系为10ul：限制性内切酶AluⅠ0.5ul，10×缓冲液1ul，PCR产物4ul，加ddH₂O至10ul，55℃条件下水浴酶切3-4个小时。

3.3 PCR-RFLP检测

酶切产物检测：由于酶切后各片段之间的长度差异性较小，琼脂糖凝胶电泳的灵敏度较差，所以选用聚丙烯酰胺凝胶来检测，所用的丙烯酰胺交联度为29∶1浓度为8％的凝胶。

每板胶35ml，配制方法：

酶切产物用8％丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液为1×TBE，110V恒压4小时，用银染法染色，拍照，并由带型来判断基因型，记录基因型。

实施例2：牛NOS1基因变异对生产性状的遗传效应分析

NOS1 exon1-HaeⅢ多态性位点基因型和基因频率的初步分析结果显示：在测试的331头奶牛中，基因型AA型的牛为52头、AG型的牛为152头、GG型的牛为112头，由统计结果可以看出，基因型AG与GG为优势基因型，基因型AA的基因型频率比较小，等位基因G的频率明显高于等位基因A的频率。群体中多态信息含量为0.361，达到中度多态性，遗传变异较大。X²适合性检验结果显示，该基因座处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。

表1分别将NOS1 exon1-HaeⅢ突变位点的不同基因型与生产性状指标之间进行相关性分析，可以得出exon1-HaeⅢ不同基因型在第一胎次的水平上，对各观测值没有显著影响。

表1第一胎次水平上NOS1 exon1-HaeⅢ基因酶切多态性与生产性状统计分析

由表2，在第二个胎次的水平上，三种基因性的关联分析可知，在平均泌乳量这一观测值上，AA型比A G，GG型具有更高的日平均泌乳量(P＜0.05)，AG型和GG型差异不显著；在SCS这一观测值上，AA＜AG(P＜0.05)，AA型与AG型之间差异不显著，AG型与GG型之间差异不显著；在305DM这一观测值上AA＞AG，AA＞GG且差异性显著(P＜0.05)。

表2 第二胎次水平上NOS1 exon1-HaeⅢ基因酶切多态性与生产性状统计分析

由表3可知，在第三个胎次的水平上，三种基因性的关联分析可知，在体细胞评分这一观测值上AA＜GG，AA＜AG，且差异性显著(P＜0.05)，AG与GG型之间没有差异；在乳蛋白率这一观测值上，三种基因型之间没有显著性差异，但是AG和GG有大于AA的趋势。

表3 第三胎次水平上NOS1 exon1-HaeⅢ基因酶切多态性与生产性状统计分析

NOS1 exon1 AluⅠ多态性位点基因型和基因频率的初步分析结果显示：在检测的242头奶牛中，CC型有37头，CT型为155头，TT型为50头。由统计结果可以看出，基因型CT与TT为优势基因型，基因型CC的基因型频率比较小，等位基因T的频率明显高于等位基因C的频率。群体中多态信息含量为0.350，达到中度多态性，遗传变异较大。X2适合性检验结果显示，该基因座不处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表4分别将NOS1 exon1-AluⅠ突变位点的三种基因型与生产性状指标之间进行相关性分析，结果表明三种基因型对不同的胎次各观测值没有显著影响，但是在第一胎次水平上，CT和TT型的乳蛋白率有高于CC的趋势。

表4 各胎次NOS1 exon1-AluⅠ基因酶切多态性与生产性状统计分析

表5、表6分析了NOS1 exon1-AluⅠ不同基因型与季节性气温差异导致的SCS变化之间的联系性

奶牛在第三胎的时候，其生产性能处于最佳状态，稳定性也比较强，通过对原始数据的整理，发现扬子江的2009年产犊高峰月是9月-12月间，这样能选更多样本用于实验。实验牛群选取扬子江奶牛场产犊月份在9月-12月第三胎次的奶牛，一共59头奶牛，其中CC型6头，CT型43头，TT型10头

表5 NOS1 exon1 AluⅠ三种基因型春、夏季组内SCS的最小二乘分析

表6 NOS1 exon1 AluⅠ三种基因型春、夏季组间SCS的最小二乘分析

从组内比较的结果可以得出，春季NOS1 exon1 AluⅠ三种基因型的SCS的差异不显著，说明在无热应激的情况下三种基因型的奶牛的乳房健康状况相当；当温度升高，且造成机体的氧化还原状态失衡的时候，夏季SCS的整体趋势要高于春季；通过组内比较夏季的三种基因型的SCS发现三种基因型之间差异性不显著；通过组间比较夏季的三种基因型的SCS发现三种基因型之间差异不显著，说明NOS1 exon1 AluⅠ三种基因型与春夏两季体细胞的变化没有相关性。

Claims

1.一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列表SEQ ID NO：1中的第121bp处有一个A121-G121的碱基突变，导致HaeⅢ-RFLP多态性；以及，在该序列的第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致Alu Ⅰ-RFLP多态性。

2.一种检测如权利要求1所述的分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-CACCACCAGCGTCTGCTCT-3’

反向引物：5’-GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC-3’。

3.权利要求1所述的分子标记在奶牛标记辅助选择中的应用。

4.权利要求2所述引物对在奶牛标记辅助选择中的应用。