CN102899309B - 一种纳米介质材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米介质材料的制备方法，由此方法制备的纳米介质材料，以及以该纳米介质材料为载体的固定化酶。本发明所述纳米介质材料的制备方法操作简单、成本低、反应条件温和、环境友好；所制备的纳米介质材料生物相容性好、可产生各向同性的纳米孔道；以该纳米介质材料为载体的原位固定化酶酶活力较高，目前重复使用7次后，酶活力保留率达80%或者更高。
Description
技术领域
本发明涉及酶固定化载体领域，特别涉及一种纳米介质材料的制备方法，由此方法制备的纳米介质材料，以及以该纳米介质材料为载体的固定化酶。
背景技术
酶作为催化剂具有高效性、专一性、温和性等特点，可广泛应用于食品、医药、化工等领域。但酶催化反应也有如下缺点，如酶价格较高、回收困难，因此导致生产成本较高；另外，不易回收的酶污染产物，使得产物的纯化费用增加；最后，酶对环境如热、酸、碱等敏感，易失活。酶的固定化技术则部分地解决了酶催化的上述缺点：固定化酶可重复回收使用，大大降低了酶催化反应的成本；固定化酶易从反应系统中分离，解决了残留酶污染反应产物的问题；固定化酶稳定性好，使酶的使用寿命更长。
固定化酶载体作为固定化酶的一部分，其结构和性能对固定化酶的性能有很大的影响。无机多孔材料，尤其是硅基多孔材料，因其比表面积大（>800m2/g）、孔隙率高（>0.5cm3/g）、孔径分布窄（2～10nm）等特点已被广泛用于固定化酶载体。
溶胶-凝胶法是用含高化学活性组分的化合物作前驱体，在液相下将这些原料均匀混合，并进行水解、缩合化学反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，溶胶经陈化胶粒间缓慢聚合，形成三维空间网络结构的凝胶，凝胶网络间充满了失去流动性的溶剂，形成凝胶。凝胶经过干燥、烧结固化制备出纳米材料。
在溶胶-凝胶法中引入模板，可以使得纳米材料的生长按照人们的意愿来进行，产物基本涵盖了目前可制备的一维纳米材料。模板包含有一维方向上的重复结构，利用这个重复结构可以实现一维纳米结构的可控生长。表面活性剂为传统的模板材料，自1992年首次报道以来，采用传统表面活性剂作模板合成介孔材料的研究就引起了人们极大的关注，并且发展非常迅速。然而，传统表面活性剂能起到模板作用的仅限于少数几种，且其后处理复杂，有毒，环境污染严重。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非表面活性剂为模板制备该纳米介质材料的方法，由该方法制备的纳米介质材料，以及以该纳米介质材料为载体的固定化酶。本发明纳米介质材料的制备方法简单、环保，以该纳米介质材料为载体的固定化酶酶活力较高，多次重复使用后的酶活力保留率高。
具体地，本发明提供了一种纳米介质材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以任意一种可进行溶胶-凝胶反应的金属氧化物前驱体为原料，常温下，所述原料与盐酸、水发生缩聚反应，得预水解凝胶；所述原料与水的重量比为1:0.4～1.6；
（2）向上述预水解凝胶中加入碱以调节pH值至4～8，然后加入模板剂进行反应；所述模板剂为重量体积百分比（g/ml）为20～70%的果糖或葡萄糖水溶液；所述原料与果糖或葡萄糖的重量比为2.5～6:1；
（3）室温下干燥至恒重，获得纳米介质材料。
优选地，所述可进行溶胶-凝胶反应的金属氧化物前驱体为正硅酸酯。
优选地，步骤（2）所述碱为氢氧化钠或氢氧化铵。
本发明的另一个目的是提供一种纳米介质材料，由上述制备方法制备而得。
本发明所述纳米介质材料为在除去模板剂后具有2-25纳米可调孔径的中孔分子筛，孔径大小可通过调节制备方法中所用模板的浓度进行调节；纳米材料比表面积大（可达1000m2/g），孔体积大（可达0.5cm3/g），纳米孔道各向同性。
本发明的再一个目的是提供一种固定化酶，该固定化酶以本发明的纳米介质材料为固定化酶载体，原位与酶固载而得。
优选地，以本发明纳米介质材料为载体的上述固定化酶的固载量为200～800mg酶/g载体。
在具体的实施方式中，上述酶为纤维素酶；固定化纤维素酶的固载量为400mg酶/g载体。
纤维素酶是一种复合酶，由C 1酶、Cx酶和β葡糖苷酶三种酶组成。在具体的实施例中，1kg上述纳米介质材料能够固定化0.4kg纤维素酶，获得相当于0.2kg自由纤维素酶的酶活性。
本发明所述纳米介质材料的制备方法非表面活性剂为模板，其生产方法简单、成本低、反应条件温和（在pH4-8、室温条件即可制备）、环境友好；所制备的纳米介质材料为具有2-25纳米可调孔径的中孔分子筛，孔径大小可通过调节制备方法中所述模板的浓度进行调节；纳米材料比表面积大（可达1000m2/g），孔体积大（可达0.5cm3/g），纳米孔道各向同性；以上述纳米介质材料为载体的固定化酶具有酶稳定性好、催化效力高、可多次重复回收使用等特点，大大降低了酶催化反应的成本。
附图说明
图1为不同温度下固定化纤维素酶的相对酶活力曲线；纵坐标为各实验组不同温度点的酶活力与37℃时的酶活力比值；
图2为固定化纤维素酶重复回收使用后的酶活力曲线。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例中，所用正硅酸酯为纯度≥99%的市售商品；所用盐酸为质量百分浓度≥35%的市售商品；所用葡萄糖为纯度≥98%的市售商品。
实施例2-4所说的酶活性是指纤维素酶中β葡糖苷酶的酶活性；酶活力单位（IU）的定义：将1分钟水解对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)产生1μmol的对硝基苯酚（PNP）所需的酶量，定义为1个酶活力单位，即1IU。
β葡糖苷酶活性测定方法:0.5g酶制剂加入1ml的pH5.0柠檬酸缓冲液，恒温水浴到实验温度，10min后，再加入预热的1ml的pNPG（8mmol/L）,反应10min后加入1ml的1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，在405nm处测定吸光值OD，从对硝基苯酚的标准曲线获得PNP的量。
实施例1本发明纳米介质材料的制备
（1）预水解凝胶的制备：常温下，将2.5kg正硅酸酯、2.5g市售盐酸、2.5kg水混合反应约15min，混合反应液变成均相溶液，且伴随热量的产生；然后，在氮气保护下，将所得均相溶液加热，保持2h，冷却到室温，形成预水解凝胶；
（2）预水解凝胶与模板的反应：向预水解凝胶中加入氢氧化钠调节pH值到6，搅拌下加入质量体积百分比为50%的葡萄糖水溶液，反应40min；
（3）石蜡油膜部分封闭（2）所得反应产物，在相对封闭的环境中，使可挥发性溶剂和反应副产物挥发形成凝胶；再于室温下干燥至恒重，得1kg的纳米介质材料。
经鉴定，所制备纳米介质材料具有2-25纳米孔径的中孔分子筛，纳米材料比表面积大（约1000m2/g），孔体积大（约0.5cm3/g），纳米孔道各向同性。
实施例2以50%果糖为模板的固定化纤维素酶的制备
本发明固定化纤维素酶的制备过程如下：
（1）预水解凝胶的制备：同实施例1；
（2）向预水解凝胶中加入氢氧化钠调节pH值到6-8，搅拌下加入质量体积百分比为50%的果糖水溶液，再加入0.4kg纤维素酶，反应10小时后，混合物冷却到0℃；
（3）步骤（2）所得混合物在相对密封容器中于室温下搅拌，使得可挥发性溶剂和反应副产物挥发形成凝胶；待混合物接近凝胶状态时，于室温下真空干燥直至恒重，获得本发明纳米介质材料为载体的原位固定化纤维素酶。
对所得固定化纤维素酶进行β葡糖苷酶活性检测，结果显示：所得固定化纤维素酶的β葡糖苷酶活性相当于0.2kg自由纤维素酶的β葡糖苷酶活性。
实施例3本发明固定化纤维素酶的酶活力及对温度的敏感性实验
采用上述β葡糖苷酶活性的测定方法，分别于37℃、42℃、47℃、52℃、57℃、67℃对实施例2所制备的固定化纤维素酶的β葡糖苷酶活性进行检测，以自由纤维素酶、无模板固定化纤维素酶（以水代替50%果糖水溶液，其余步骤同实施例2）为对照；37℃时测得的各组酶活性如表1所示。
表1各实验组37℃时的β葡糖苷酶的比活力
| 组别 | β葡糖苷酶比活力（IU/g） |
| 无模板组 | 80±5 |
| 50%果糖模板组 | 125±8 |
| 自由纤维素酶组 | 400±5 |
由表1可得，37℃时，50%果糖模板组的β葡糖苷酶活力明显高于无模板组，二者均低于自由纤维素酶组。
归一化处理：
将各实验组于37℃时的β葡糖苷酶活力定为1，计算各实验组上述温度点下相对于本实验组37℃时β葡糖苷酶活力的相对值，其结果就表2所示，相对酶活力曲线如图1所示。
表2各实验组各温度点的相对酶活力
| 组别 | 37℃ | 42℃ | 47℃ | 52℃ | 57℃ | 67℃ |
| 无模板组 | 1.00 | 1.17 | 2.07 | 1.55 | 1.64 | 1.44 |
| 50%果糖模板组 | 1.00 | 1.28 | 1.94 | 1.67 | 2.00 | 1.96 |
| 自由纤维素酶组 | 1.00 | 1.09 | 1.13 | 1.24 | 1.24 | 1.06 |
由表2可得，50%果糖模板组随着温度的增高，其增幅最大，明显高于无模板组合自由纤维素酶组。
以上结果说明：本发明固定化纤维素酶具有较高的酶活力，且随着催化反应温度的增高，其酶活力增幅高于没有固定化的自由纤维素酶。
实施例4本发明固定化纤维素酶多次重复使用后的酶活力保留试验
将实施例2所制备固定化纤维素酶或无模板固定化纤维素酶（以水代替50%果糖水溶液，其余步骤同实施例2），分别用于从商业途径获得预处理后的液化的生物质纤维素多糖原料（木屑、秸秆、蔗渣等）制备纤维素乙醇，并在多次重复回收使用该酶后，检测其β葡糖苷酶的酶活力。
固定化纤维素酶的回收与重复使用：用过滤法或吸铁石(如在纳米介质材料中已加入了磁性氧化铁颗粒)方法从反应液中回收本发明固定化纤维素酶或无模板固定化纤维素酶，并重复应用于上述纤维素乙醇的制备过程，测定每次回收后的β葡糖苷酶活性，其结果如图2所示。
由图2可得：本发明固定化纤维素酶的β葡糖苷酶的酶活力明显高于无模板固定化纤维素酶，且其在7次重复使用后的酶活力保留率为80%或更高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种纳米介质材料的制备方法，其特征在于，由如下步骤组成：
(1)以任意一种可进行溶胶-凝胶反应的金属氧化物前驱体为原料，常温下，所述原料与盐酸、水发生缩聚反应，得预水解凝胶；所述原料与水的重量比为1:0.4～1.6；所述可进行溶胶-凝胶反应的金属氧化物前驱体为正硅酸酯；
(2)向上述预水解凝胶中加入碱以调节pH值至4～8，然后加入模板剂进行反应；所述模板剂为重量体积百分比为20～70％的果糖或葡萄糖水溶液；所述原料与果糖或葡萄糖的重量比为2.5～6:1；
(3)室温下干燥至恒重，获得纳米介质材料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述碱为氢氧化钠或氢氧化铵。
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