CN102898860A - 一类以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一类以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构：其中：R₁选自-H、-CN、-OCH₃、-COOH、-OH、-NO₂、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-OCOCH₃和-SH；R₂选自-N-、-C-、-S-和-O-；R₃选自-NHCH₂OH、-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-NH(CH₂)₄OH、-N(CH₃)CH₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₃OH和-N(CH₃)(CH₂)₄OH。本发明的荧光染料具有高效的双光子吸收能力，低光致毒性、光漂白性；其对细胞RNA具有很强的专一性。可同时对活细胞、固定细胞的RNA进行特异性标记。

Description

一类以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料化合物在标记细胞RNA的应用。 

背景技术

核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发现了有支链的RNA分子。所以建立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的RNA标记技术是一项重要的工作。荧光染料，由于灵敏度高，操作方便，近年来逐渐取代了放射性同位素作为检测标记。 

现有特异性标记RNA荧光染料只有invitrogen公司出品的 RNASelectTM Green-Fluorescent Cell Stain的染料。但该染料在实际成像应用中存在以下缺陷：与RNA响应时间较长、光致毒性大、光稳定性差等，大大降低了该RNA染料在生物成像标记中的应用价值。随着双光子技术的发展，双光子荧光显微镜在生命科学的研究中已经成为最重要的成像工具。与传统的单光子荧光共聚焦显微镜相比，双光子荧光显微镜具有显著的优势，包括近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等（Helmchen F,Svoboda K,Denk W et al.Nature,1999,2:989-996.Maiti S,Shear J B,Williams R M et al.Science,1997,275:530.Ventelon L,Charier S,Moreaux L et al. Angewandte Chemie International Edition,2001,40:2098.）。由于双光子吸收过程与两倍光子能量有关，激发只局限在共焦平面内的极小的区域内。因此近红外的激发光源能透过组织，进行深层成像。用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针，是实现成像的关键。双光子显微技术及双光子荧光染料的出现为现存的问题提供了一种很好的解决方法，同时为细胞内RNA生物成像提供了一个崭新的平台。现有技术中对以异喹啉酮为母体的化合物的研究主要涉及到对金属离子的检测，如汞离子（Tetrahedron Letters,51(44)5784-5786）；制备水溶性好的荧光染料（CN101665493 (A)-Synthetic method for water-soluble fluorescent tracer）；检测脂肪胺（Collection of Czechoslovak Chemical Communications,48(8)2249-54）；及研究荧光化合物的低频半值组分与斯托克斯位移之间的关系（Dyes and Pigments，32（4）： 229-235）。现有技术中并未见异喹啉酮母体的化合 物作为双光子荧光染料应用于生物染色、尤其是RNA特异性染色的报道。因此设计开发一系列高效的双光子荧光探针并使其对细胞RNA具有良好选择行成像的工作变得越来越迫切需要。 

发明内容

本发明的目的即在于提供一类以异喹啉酮为母体的、具有高效的双光子吸收能力，并且具有降低的光致毒性和光漂白性的双光子荧光染料。本发明首先提供一类以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，所述荧光染料具有通式I的结构： 

其中： 

R₁选自-H、-CN、-OCH₃、-COOH、-OH、-NO₂、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-OCOCH₃和-SH； 

R₂选自-N-、-C-、-S-和-O-； 

R₃选自-NHCH₂OH、-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-NH(CH₂)₄OH、-N(CH₃)CH₂OH、 

-N(CH₃)(CH₂)₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₃OH和-N(CH₃)(CH₂)₄OH。 

本发明另一方面的目的在于提供上述以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤： 

1)4-溴-1,8-萘酐与式i的化合物按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物B： 

反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 

2)将步骤1)中制备得到的化合物B与H-R₃按照摩尔比1:1-1:2.5反应，制备化合物I： 

反应温度为100-200℃，反应时间为1-8小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物。 

再一方面，本发明旨在提供上述本发明以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料在生物样品标记中的应用。尤其是在细胞RNA标记领域中的应用。 

本发明在现有技术的基础上，通过在R₁和R₃引入合适的取代基团，有效地减弱异喹啉酮母核的吸电子能力，使其只起到传输电子的功能，从而增大分子的π电子共轭体系，大大提高了双光子吸收截面，同时也能满足D-π-A型的高效的双光子染料的要求。所以相对于已报道的类似的母体结构的染料，本发明的双光子荧光染料分子具有更高效的双光子吸收能力，并降低了光致毒性、光漂白性，提高了申请保护的分子在生物成像中的应用。此外，本发明所述及的燃料化合物在除细胞RNA的其他细胞区域内具有较低的荧光背景，在细胞RNA内具有较强的荧光信号，且对细胞RNA具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性，可同时对活细胞、固定细胞的RNA进行特异性标记。 

附图说明

本发明附图11幅： 

图1是本发明的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料的结构通式I。 

图2是实施例2中表征本发明的荧光染料化合物A1的细胞内RNA双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为5μM的A₁-DMSO溶液分别加入到的Hela细胞，在37℃，5%CO₂下孵育30分钟，选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。激发波长800nm，收集波段520-570nm。图2中的为hela细胞。 

图3是实施例3中本发明的荧光染料化合物A₁与Hoechst 33258的细胞RNA复染试验结果。分别将浓度为5μM的A₁-DMSO溶液4μL，5μM的Hoechst 33258溶液2μL加入到的Hela细胞，在37℃，5%CO₂下于培养基中孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。图3(a)为加入染料Hoechst 33258后Hela细胞的聚焦图片,图3(b)为加入染料A₁后Hela细胞的聚焦图片,图3(c)为a,b图的叠加图。A₁的激发波长488nm，收集波段520-570nm；Hoechst 33258的激发波长405nm，收集波段430-490nm。 

图4是实施例5中本发明的荧光染料化合物A₂的不同溶剂中双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：二甲基亚砜。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的 NaOH溶液（pH 11）作为参比，所用A₁溶液浓度都为1×10^-4M，激光脉冲宽70 fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率3.0W(800nm)，可调波长范围700~980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。 

图5是实施例6中本发明的荧光染料化合物A₂的溶剂化效应表征结果。将化合物A₂分别加入到的丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等溶剂中。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)。 

图6是实施例8中表征本发明的荧光染料化合物A₃的固定细胞内RNA的双光子共聚焦成像图片。将4μL浓度为5μM的A₂-DMSO溶液加入到的Hela固定细胞，然后加入100μLRNA消化酶，在37℃，5%CO₂下于PBS中孵育24小时。然后于不同时间在双光子激光共聚焦选取代表性区域成像。用油镜(60×)观察，重复三次。图片收集波段520-570nm。图6为hela固定细胞。 

图7是实施例9中本发明的荧光染料化合物A₃加入不同量的RNA之后荧光增强试验。重复三次。 

图8是实施例11中本发明的荧光染料化合物A₄的水溶性表征结果。使用化合物A₄不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。 

图9是染料A₄双光子吸收截面与激光能量之间的关系表征结果。使用化合物A₄的DMSO溶液（10^-4M），测定其在相同激发波长下的荧光光谱，并计算获得其吸收截面。实验重复三次。 

图10是染料A₃和A₄的光漂白性试验结果。将荧光染料A₃和A₄分别加入Tris-HCl(100mM,pH=8.0)溶剂中，用碘钨灯连续照射数小时，并测定不同时间的荧光强度。实验重复三次。所用仪器是Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。 

图11是染料A₂与RNA作用的响应时间试验结果。染料化合物A₂加入Tris-HCl(100mM,pH=8.0)溶剂中，加入10倍当量的RNA，连续测试荧光强度的变化。实验重复三次。所用仪器是Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。 

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。 

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。 

本发明所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其通式结构I： 

R₁选自-H、-CN、-OCH₃、-COOH、-OH、-NO₂、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-OCOCH₃和-SH；优选-H、-OH、-NO₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂或-NH₂；更优选-H、-OH、-NO₂或-SH；最优选-NO₂。 

所述的R₂选自-N-、-C-、-S-和-O-；优选-N-、-S-或-O-；更优选-N-或-O-；最优选-N-。 

所述的R₃选自-NHCH₂OH、-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-NH(CH₂)₄OH、-N(CH₃)CH₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₃OH  和-N(CH₃)(CH₂)₄OH；优选-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-N(CH₃)(CH₂)₂OH或-N(CH₃)(CH₂)₃OH。 

具体的实施方式之一，所述的R₁是-NO₂，R₂是-N-，R₃是-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-N(CH₃)(CH₂)₂OH或-N(CH₃)(CH₂)₃OH。 

更为具体的实施方式中，所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料选自化合物A₁-A₄： 

8.权利要求1所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：1)4-溴-1,8-萘酐与式i的化合物按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物B： 

反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 

优选的实施方式中，反应温度为80-140℃，反应时间为2-10小时，反应溶剂选自乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1,8-萘酐与式i摩尔为1:1-1:4； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为90-120℃，反应时间为3-10小时，反应溶剂选自乙酸乙酯、醋酸或其混合物，4-溴-1,8-萘酐与式i摩尔为1:1-1:3； 

最优选的实施方式中，反应温度为95-110℃，反应时间为4-8小时，反应溶剂为醋酸，4-溴-1,8-萘酐与式i摩尔为1:1-1:2； 

2)将步骤1)中制备得到的化合物B与H-R₃按照摩尔比1:1-1:2.5反应，制备化合物I： 

反应温度为100-200℃，反应时间为1-8小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物。 

优选的实施方式中，反应温度为100-165℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物，化合物B与H-R₃的摩尔为1:1-1:2.5； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为100-150℃，反应时间为1-5小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物，化合物B与H-R₃的摩尔为1:1-1:2； 

最优选的实施方式中，反应温度为100-130℃，反应时间为1-4小时，反应溶剂为乙二醇单甲醚，化合物B与H-R₃的摩尔为1:1-1:1.5； 

对本发明采用上述方法合成的双光子荧光染料化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构，并且辅以碳谱、熔点测试来辅助确认其结构。 

本发明还提供使用上述本发明的双光子荧光染料化合物标记细胞RNA的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。 

本发明所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料具备以下特点： 

所述化合物引入了专一性靶向点，提高了对活细胞及固定细胞内的RNA标记的专一性、特异性； 

所述化合物具有优异的双光子性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性； 

所述化合物分子的荧光发射波长大于500nm，可用于动物活体成像； 

所述化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化； 

鉴于此，本发明所述的双光子荧光染料化合物可用于细胞RNA的标记。除了以本文中所述的形式直接用于细胞RNA染色外，含有本发明的双光子荧光染料化合物的组合物也可以用于细胞RNA的染色。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的双光子荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。 

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

实施例1.制备染料化合物A₁

（1）中间体1的合成 

将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和35mmol 4-硝基邻苯二胺加入到含有20ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热105℃回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物1，收率84%。 

（2）染料A₁的合成 

将上步20mmol粗产品1和25mmol乙醇胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应4h后停止。混合物倒入冰水中，橙红色沉淀析出，抽滤得红色固体粉末粗产品，柱色谱分离得红色固体粉末产品A₁，收率84%。¹HNMR(400 MHz,DMSO-d6,Me₄Si)δ:9.00(d,1H,J=2.40Hz),8.62-8.65(m,1H),8.57-8.52(m,1H),8.44(d,1H,J=6.40Hz),8.40(d,1H,J=3.20Hz),8.13(br,s,1H),8.05(d,1H,J=8.00Hz),7.99(d,1H,J=7.20Hz),3.01-3.09(m,2H),2.70-2.79(m,2H)。 

实施例2.染料化合物A₁对细胞RNA的标记试验 

使用实施例1合成的化合物A₁，以浓度为5μM的A₁-DMSO溶液4μL加入到的Hela细胞，在37℃，5%CO₂下将加入染料A₁的Hela细胞于培养基中孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。实验结果如图2所示，成像显示Hela细胞的细胞RNA中的有强荧光信号，而细胞的其他区域无荧光信号。图2为加入染料A₁后Hela细胞的聚焦图片。激发波长800nm，收集波段520-570nm。图中标尺20μm。 

实施例3.染料化合物A₁与Hoechst 33258的细胞RNA复染试验 

使用实施例1合成的化合物A₁，分别将浓度为5μM的A₁-DMSO溶液4μL，5μM的Hoechst 33258溶液2μL加入到的Hela细胞，在37℃，5%CO₂下于培养基中孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。实验结果如图3所示，成像显示Hela细胞的细胞RNA中的有强荧光信号，而细胞的其他区域无荧光信号。图3(a)为加入染料Hoechst 33258后Hela细胞的聚焦图片,图3(b)为加入染料A₁后Hela细胞的聚焦图片,图3(c)为a,b图的叠加图。A₁的激发波长488nm，收集波段520-570nm；Hoechst 33258的激发波长405nm，收集波段430-490nm。图中标尺20μm。 

实施例4.制备染料化合物A₂： 

（1）中间体1的合成 

将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和35mmol 4-硝基邻苯二胺加入到含有20ml醋酸溶液的圆底烧CCC瓶中，氮气保护。反应加热105℃回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物1，收率84%。 

（2）染料A₂的合成 

将上步20mmol粗产品1和25mmol正丙醇胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应4h后停止。混合物倒入冰水中，橙红色沉淀析出，抽滤得红色固体粉末粗产品，柱色谱分离得红色固体粉末产品A₂，收率84%。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,Me₄Si)δ:8.62-8.65(m,1H),8.57-8.52(m,1H),8.44(d,1H,J=6.40Hz),8.40(d,1H,J=3.20Hz),8.13(br,s,1H),8.05(d,1H,J=8.00Hz),7.99(d,1H,J=7.20Hz),3.01-3.09(m,2H),2.70-2.79(m,2H)。 

实施例5.染料A₂的双光子有效吸收截面检测试验： 

采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液（pH 11）作为参比，将实施例4合成的化合物A₂分别加入到的二甲基亚砜、N,N-甲基甲酰胺等溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10^-4M，用计算公式如下所示： 

${\mathrm{\δ}}_s={\mathrm{\δ}}_r\frac{C_r}{C_s}\frac{n_r}{n_s}\frac{F_s}{F_r}\frac{{\mathrm{\Φ}}_r}{{\mathrm{\Φ}}_s}$

公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。 

测定不同溶剂中、不同波长下双光子有效吸收截面（Φδ），实验结果如图4所示。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70 fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率3.0W（800nm），可调波长范围700~980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。 

实施例6.染料化合物A₂的溶剂化效应检测试验 

使用上述实施例4合成的化合物A₂分别加入到的丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等溶剂中，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果如图5所示，显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图5(a)为染料A₂在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图5(b)为染料A₂在不同溶剂中的荧光发射光谱。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计和 Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。 

实施例7.制备染料化合物A₃

（1）中间体1的合成 

将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和35mmol 4-硝基邻苯二胺加入到含有20ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热105℃回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物1，收率84%。 

（2）染料A₃的合成 

将上步20mmol粗产品1和25mmol N-甲基-乙醇胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应4h后停止。混合物倒入冰水中，橙红色沉淀析出，抽滤得红色固体粉末粗产品，柱色谱分离得红色固体粉末产品A₃，收率84%。 ¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,Me₄Si)δ:9.00(d,1H,J=2.40Hz),8.62-8.65(m,1H),8.57–8.52(m,1H),8.44(d,1H,J=6.40Hz),8.40(d,1H,J=3.20Hz),8.13(br,s,1H),8.05(d,1H,J=8.00Hz),7.99(d,1H,J=7.20Hz),3.01-3.09(m,2H),2.70-2.79(m,2H),2.32(m,3H)。 

实施例8.染料化合物A3对加入RNA消化酶之后的细胞RNA标记试验 

使用实施例7合成的化合物A₃，以浓度为5μM的A₁-DMSO溶液4μL加入到的Hela固定细胞，在37℃，5%CO₂下将加入染料A₃的Hela固定细胞中，然后加入100μL RNA消化酶，于PBS中孵育24小时。然后于不同时间在双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。实验结果如图6所示，成像显示Hela细胞的细胞RNA的有强荧光信号，而细胞的其他区域无荧光信号。图6（a）为加入100μL RNA消化酶0h后Hela固定细胞的聚焦图片，图6（b）为加入100μL RNA消化酶24h后Hela固定细胞的聚焦图片。激发波长800nm，收集波段520-570nm。图中标尺20μm。 

实施例9.染料化合物A₃加入RNA消化酶之后荧光增强试验 

使用实施例7合成的化合物A₃，以浓度为3μM的A₁的Tris-HCl（100mM，pH=8.0）溶液，然后加入不同量得RNA测定荧光发射光谱。重复三次，实验结果如图7所示。图7为加入不同量的RNA后的A₃荧光增强的光谱图。所用仪器是Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计 

实施例10.制备染料化合物A₄

（1）中间体1的合成 

将20mmol 4-溴-1，8-萘酐和35mmol 4-硝基邻苯二胺加入到含有20ml醋酸溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热 105℃回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，中间产物1，收率84%。 

（2）染料A₃的合成 

将上步20mmol粗产品1和25mmol N-甲基-丙醇胺加入到含有20ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应5h后停止。混合物倒入冰水中，黄 色沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，柱色谱分离得橙色固体粉末产品A₃，收率78%。 ¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,Me₄Si)δ:9.00(d,1H,J=2.40Hz),8.62-8.65(m,1H),8.57–8.52(m,1H),8.44(d,1H,J=6.40Hz),8.40(d,1H,J=3.20Hz),8.13(br,s,1H),8.05(d,1H,J=8.00Hz),7.99(d,1H,J=7.20Hz),3.01-3.09(m,2H),2.70-2.79(m,2H),2.32(m,3H),1.73-1.69(m,2H)。 

实施例11.染料化合物A₄的水溶解性检测试验 

使用上述实施例10合成的化合物A₄加入到水中，测定在不同浓度A₄水溶液的最大吸收波长下吸光度。实验结果如图8所示，显示当化合物A₄浓度为8.0μM时，吸光度值未发生偏移，即化合物A₂在水中的溶解度为8.0μM。图8为不同染料A₄浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。 

实施例12.染料化合物A4的光物理数据测试试验 

使用上述实施例10合成的化合物A₄分别加入不同的溶剂中，测定不同溶剂中的光物理数据。测试结果显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。荧光量子产率可以达到0.239（DMSO）所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计和Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。具体数据见表1 

表1A₄的光物理数据 

施例13.染料化合物A₄的双光子吸收能力试验 

采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液（pH 11）作为参比，A₄加入到的二甲基亚砜溶剂中测试其双光子吸收截面，所用溶液浓度都为1×10^-4M，测定相同波长、不同激发能量下的发射峰，并用如下公式计算得出双光子有效吸收截面（Φδ）： 

${\mathrm{\δ}}_s={\mathrm{\δ}}_r\frac{C_r}{C_s}\frac{n_r}{n_s}\frac{F_s}{F_r}\frac{{\mathrm{\Φ}}_r}{{\mathrm{\Φ}}_s}$

公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70 fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率3.0W（800nm），可调波长范围700~980nm。 

不同激发能量与吸收截面的实验结果如附图9所示，可见双光子吸收截面与激光能量之间的关系：log(双光子吸收截面)=2.023log(激光能量)+0.37。log(双光子吸收截面)与log(激光能量)之间存在着良好的线性关系，且线性斜率接近2，即表明申请保护的分子具有良好的双光吸收性能。 

实施例14.染料化合物A₃和A₄的光漂白性试验 

分别测试实施例7和实施例10制得的荧光染料A₃和A₄：将荧光染料分别加入Tris-HCl(100mM,pH=8.0)溶剂中，用碘钨灯连续照射数小时，并测定不同时间的荧光强度。所用仪器是Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。 

实验结果如附图10所示，可见：在连续照射7个小时后，染料化合物A₃和A₄仍具有很好的光稳定，说明光漂白小。因此，由于R₁和R₃的引入，增大了分子的刚性结构，使得分子与RNA具有很好的特异性识别，并且与RNA的响应时间较短。 

实施例15.染料化合物A₂与RNA作用的响应时间试验 

将实施例4所制备的染料化合物A₂加入Tris-HCl(100mM,pH=8.0)溶剂中，加入10倍当量的RNA，连续测试荧光强度的变化。所用仪器是Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。 

测试结果如附图11所示，可见：染料化合物A₂与RNA响应时间很短，当作用时间为3分钟时，荧光强度基本不变，即申请保护的分子与RNA响应时间约为3分钟。与SYTO RNASelect商业化染料相比（Chemistry and Biology 13,615-623,），与RNA作用时间减少很多，有利于对RNA的检测。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。 

Claims (9)

1.一类以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，所述荧光染料具有通式I的结构：

其中：

R₁选自-H、-CN、-OCH₃、-COOH、-OH、-NO₂、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-OCOCH₃和-SH；

R₂选自-N-、-C-、-S-和-O-；

R₃选自-NHCH₂OH、-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-NH(CH₂)₄OH、-N(CH₃)CH₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₂OH、-N(CH₃)(CH₂)₃OH和-N(CH₃)(CH₂)₄OH。

2.权利要求1所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R₁为-H、-OH、-NO₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂或-NH₂。

3.权利要求2所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R₁为-NO₂。

4.权利要求1所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R₂为-N-、-S-或-O-。

5.权利要求4所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R₂为-N-。

6.权利要求1~5中任一权利要求所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R₃为-NH(CH₂)₂OH、-NH(CH₂)₃OH、-N(CH₃)(CH₂)₂OH或-N(CH₃)(CH₂)₃OH。

7.权利要求6所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R₁是-NO₂，并且R₂是-N-。

8.权利要求1所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

1)4-溴-1,8-萘酐与式i的化合物按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物B：

反应温度为70-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；

2)将步骤1)中制备得到的化合物B与H-R₃按照摩尔比1:1-1:2.5反应，制备化合物I：

反应温度为100-200℃，反应时间为1-8小时，反应溶剂为乙醇、乙二醇单甲醚或其混合物。

9.权利要求1所述的以异喹啉酮为母体的双光子荧光染料在生物样品标记中的应用。

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