CN102898523B - N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体cd14结合物及其制备方法和应用 - Google Patents

N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体cd14结合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物以及制备方法和应用，属于化学生物医药领域。这种结合物结构如式（Ⅱ）所示：在缩合剂DCC的作用下，CD14单抗分子中碳端的氨基酸残基与N-取代四氢吡啶连吲哚类化合物（Ⅰ）中吲哚环上的仲胺基结合，得到通式为（Ⅱ）的单克隆抗体CD14结合物。式（Ⅱ）结合物能高效抑制白血病K562细胞增殖，其抑制白血病K562细胞增殖的IC50值明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu），式（Ⅱ）结合物对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低，可用于制备治疗白血病的药物。

Description

N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一类N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物（简写为CD14-TPI），以及这种结合物的制备方法和作为治疗白血病药物的先导化合物的应用。属于化学生物药物领域， 
背景技术
白血病是当今世界上死亡率最高的疾病之一，它对人类的健康造成了极严重的危害。据中国发布的流行病学统计，我国各地区白血病发病率在各种肿瘤中占第六位，目前至少有400万白血病患者，每年新增约4万名。近年来，由于室内装修造成的污染，导致血液病患者人数急剧增加。白血病是一类造血细胞恶性疾患，好发于青少年，其发病率排在青少年肿瘤的第一位，所以对人类的危害更为明显和突出。 
目前，除了早幼粒细胞白血病以外，对于其它类型的白血病均缺乏特效的治疗手段，仍然采用化疗的方法来治疗这种恶性疾患。化疗仅能通过大量杀伤高度增殖的白血病细胞而使患者得到短期缓解，但无法根治这种恶性疾患。且由于目前所用的化疗药物多缺乏特异性，所以毒副作用很大。更棘手的是，大多数复发患者的白血病细胞常常对现有的化疗药物产生耐药。 
现在临床上常用的白血病化疗药物根据药物的来源和化学结构，分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类、激素类和杂类等。然而，这些药物的共同的缺点是选择性不强，对正常细胞和肿瘤细胞具有几乎相同的杀伤作用。所以，毒性较大,对骨髓、消化道细胞和生殖细胞也有很强的杀伤作用。 
据公开号为CN102276581A的专利报道，N-取代四氢吡啶连吲哚化合物（代号为TPI）（Ⅰ）具有高效抑制人白血病K562细胞系增殖的活性，但其选择性不 高，对正常细胞有一定的毒性。在一定程度上限制了该类化合物在治疗白血病药物中的应用。 
为了解决上述问题,近年来单克隆抗体(简称单抗)药物用于治疗肿瘤的研究已获得重要进展,研究表明,单抗药物对肿瘤相关靶点显示特异性结合,对肿瘤细胞有选择性杀伤作用并在动物实验有显著的疗效。因为单抗有高度特异性,所以单抗药物将在肿瘤治疗中发挥重要作用，研制单抗药物有巨大的潜力。 
据文献报道，编码为CD14的单克隆抗体（简称单抗CD14）对人白血病K562等细胞系具有高度特异性,将其与具有高效抑制人白血病K562细胞系增殖活性的N-取代四氢吡啶连吲哚化合物（Ⅰ）结合，制成TPI与单抗CD14结合的单抗药物先导化合物（简称为CD14-TPI）（Ⅱ），使CD14-TPI能靶向于特定的肿瘤细胞，大大降低其对正常组织细胞的毒性。为此，单抗药物先导化合物CD14-TPI（Ⅱ）有望成为极具临床应用潜力的抗癌新药。 
发明内容
本发明目的是为了提供一类N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物（简称为CD14-TPI），CD14-TPI是一类可作为治疗白血病的单抗药物的先导化合物。 
本发明的第二个目的是为了提供这种N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物的制备方法。 
本发明的第三个目的是将CD14-TPI用于制备治疗白血病的药物。该结合物具有高效抑制人白血病K562细胞系增殖的生物活性，IC50值均明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu）。CD14-TPI体内急性毒性低，对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低。 
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 
本发明提供的具有高效抑制人白血病K562细胞系增殖活性，对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低的抗白血病药物的先导化合物N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物（CD14-TPI）的结构式如式（Ⅱ）所示： 
Figure BDA00002277405000031
在式（Ⅱ）中： 
R1为：氟、氯、溴、氰基、硝基、羧基、酯基、羰基、磺酸基、烃基、烃氧基中的一种； 
R2为：苯基、4-取代苯基、2-取代苯基、3-取代苯基、2,4-二取代苯基、3,5-二取代苯基、2,3-二取代苯基；苄基、4-取代苄基、2-取代苄基、3-取代苄基、2,4-二取代苄基、3,5-二取代苄基、2,3-二取代苄基；2-吡啶基、3-取代-2-吡啶基、4-取代-2-吡啶基，3，4-二取代-2-吡啶基；3-吡啶基、2-取代-3-吡啶基、4-取代-3-吡啶基，2，4-二取代-2-吡啶基；2-四氢呋喃基、2-取代四氢呋喃基2-呋喃基、2-取代呋喃基等六元或五元取代杂环基中的一种。 
R2中苯基、苄基、吡啶基和四氢呋喃基中的取代基为：甲基、乙基等C6以下的烃基、甲氧基、乙氧基等C6以下的烃氧基、氟、氯、溴、氰基、硝基、羧基、酯基、羰基、磺酸基等中的一种或两种。 
R3为：氢、甲基、乙基、丙基等C6以下的烃基中的一种。 
mCD14是指编码为CD14的单克隆抗体，简称单抗CD14。 
上述N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物的制备方法，具体步骤为： 
（1）制备式（Ⅰ）化合物：化合物（Ⅰa）~（Ⅰj）具体制备方法见公开号为CN102276581A的发明专利；化合物（Ⅰk）~（Ir）的制备方法见本专利说明书实施例2~实施例9。 
（2）制备式（Ⅱ）结合物：取10mg式（Ⅰ）化合物，溶于0.1mL DMSO中，向上述溶液中依次加入浓度为0.1mol/L的DCC溶液0.1mL和浓度为2μg/mL的CD140.05~0.2mL，然后用生理盐水将上述混合溶液稀释至1mL。37℃反应20~120min，得到式（Ⅱ）结合物。浓度为2μg/mL的CD14的用量优选为0.1mL； 37℃反应时间优选为30min。 
反应方程式为： 
Figure BDA00002277405000041
其中，式（Ⅱ）结合物中R1、R2、R3和mCD14的定义同前；式（Ⅰ）化合物中R1、R2、R3的定义同式（Ⅱ）结合物。 
以MTT法分别测定式（Ⅱ）结合物和式（Ⅰ）化合物对人白血病K562细胞的杀伤作用，同时设立多组对照组。对照组包括：空白组，CD14+DMSO+DCC，CD14，式（Ⅰ）化合物，CD14+式（Ⅰ）化合物。 
抗人白血病的N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体结合物CD14-TPI可用于制备治疗白血病的药物。该结合物具有高效抑制人白血病K562细胞系增殖的生物活性，其IC50值均明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu）。该CD14-TPI结合物体内急性毒性低，对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低，有可能成为特效的、毒副作用较小的新型抗白血病药物，具有潜在的实用性。 
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。 
本发明制备的具有抗人白血病活性的N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物（CD14-TPI）的实施例是： 
（Ⅱa）CD14-3-[N-(4-氟苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚； 
（Ⅱb）CD14-3-[N-(4-甲基苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚； 
（Ⅱc）CD14-3-[N-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚； 
（Ⅱd）CD14-3-[N-苄基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚； 
（Ⅱe）CD14-3-[N-(4-氟苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚； 
（Ⅱf）CD14-3-[N-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚； 
（Ⅱg）CD14-3-[N-苄基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚； 
（Ⅱh）CD14-3-[N-(4-甲基苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚； 
（Ⅱi）CD14-3-[N-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚； 
（Ⅱj）CD14-3-[N-(2-四氢呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-2-甲基吲哚； 
（Ⅱk）CD14-3-[N-(2-四氢呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚； 
（Ⅱl）CD14-3-(N-苯乙基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)吲哚； 
（Ⅱm）CD14-3-[N-(3,4-二甲氧苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚； 
（Ⅱn）CD14-3-[N-(3,5-二氟苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚； 
（Ⅱo）CD14-3-[N-(2-吡啶基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚； 
（Ⅱp）CD14-3-[N-(2-氯苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-氰基吲哚； 
（Ⅱq）CD14-3-[N-(3-吡啶基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚； 
（Ⅱr）CD14-3-[N-(2-呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚； 
实施例1：结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）的制备方法 
化合物（Ⅰa）~（Ⅰj）的制备方法见相关专利：专利申请号：201110224878.x，公开号：CN102276581A。 
化合物（Ⅰk）~（Ir）的制备方法见本专利说明书实施例2~实施例9。 
取10mg化合物（Ⅰa）~(Ⅰr)，分别溶于0.1mL DMSO中，分别向上述溶液中依次加入浓度为0.1mol/L的DCC溶液0.1mL，浓度为2μg/mL的CD140.1mL，然后用生理盐水将上述混合溶液稀释至1mL。37℃反应30min，得到结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)。 
以MTT法分别测定结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)对白血病K562细胞的杀伤作用，同时设立多组对照组。对照组包括：空白组，CD14+DMSO+DCC，CD14，化合物（Ⅰa）~(Ⅰr)，CD14+化合物（Ⅰa）~(Ⅰr)。 
实施例2：3-[N-(2-四氢呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚（Ⅰk）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01molN-(2-四氢呋喃甲基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流5h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用 无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(2-四氢呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚（Ⅰk）。 
收率54%;黄色固体;mp162-164℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.08(s,1H),7.78(d,J=7.9Hz,1H),7.51-6.84(m,4H),6.08(d,J=3.4Hz,1H),4.13-3.86(m,1H),3.85-3.50(m,2H),3.15(m,2H),2.68(m,2H);2.56-2.38(m,4H),2.04-1.39(m,4H);IR(KBr):3052,2914,2866,1635,1605,1571,1485,1450,1436,1375,1320,1280,1200,1110,956,790,745cm-1;Anal.calcd.for C18H22N2O C%76.56,H%7.85,N%9.92;Found:C%76.54,H%7.66,N%9.99。 
实施例3：3-[N-苯乙基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]吲哚（Ⅰl）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01molN-苯乙基-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流6h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-(N-苯乙基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)吲哚（Ⅰl）。 
收率64%;黄色固体；mp172-174℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.18(s,1H),7.79(d,J=6.9Hz,1H),7.58-6.78(m,9H),6.13(d,J=2.4Hz,1H),3.53-3.46(m,4H),3.25(m,2H),2.63(t,J=6.0Hz,2H);2.49(s,2H);IR(KBr):3072,2918,2876,1640,1613,1570,1485,1452,1436,1370,1320,1288,1205,1112,956,794,748cm-1;Anal.calcd.for C21H22N2C%83.40,H%7.33,N%9.26;Found:C%83.44,H%7.36,N%9.08。 
实施例4：3-[N-(3,4-二甲氧苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚（Ⅰm）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol5-甲氧基吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01molN-(3,4-二甲氧苄基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流6h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(3,4-二甲氧苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚（Ⅰm）。 
收率52%;黄色固体;mp155-157℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),7.84(d,J=6.5Hz,1H),7.53-6.78(m,6H),5.98(d,J=5.4Hz,1H),3.63(d,J=15.4Hz,9H),3.48(s,2H),3.02(s,2H),2.58(t,J=6.4Hz,2H),2.49(s,2H);IR(KBr):3062,2911,2866,1645,1605,1592,1470,1452,1438,1375,1329,1280,1190,1102,956,786,750cm-1;Anal.calcd.for C23H26N2O3C%72.99,H%6.92,N%7.40;Found:C%72.84,H%6.36,N%7.69。 
实施例5：3-[N-(3,5-二氟苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚（Ⅰn）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol5-溴吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01mol N-(3,5-二氟苄基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流5h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(3,5-二氟苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚（Ⅰn）。 
收率50%;黄色固体;mp192-194℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.21(s,1H),7.80(d,J=4.3Hz,1H),7.43-6.98(m,6H),6.13(d,J=6.2Hz,1H),3.58(s,2H),3.12(s,2H),2.55(t,J=5.2Hz,2H),2.47(s,2H);IR(KBr):3082,2901,2875,1640,1611,1590,1475,1450,1438,1375,1325,1270,1190,1101,949,779,755cm-1;Anal.calcd.for C20H17BrF2N2C%59.57,H%4.25,N%6.95;Found:C%59.44,H%4.36,N%6.89。 
实施例6：3-[N-(2-吡啶基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚（Ⅰo）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol5-甲氧基吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01molN-(2-吡啶基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流5h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(2-吡啶基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚（Ⅰo）。 
收率62%;黄色固体;mp165-167℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.98(s, 1H),7.96(d,J=5.5Hz,1H),7.83-6.98(m,7H),6.13(d,J=6.4Hz,1H),3.77(d,J=16.5Hz,3H),3.45(s,2H),3.12(s,2H),2.55(t,J=7.2Hz,2H),2.48(s,2H);IR(KBr):3082,2921,2874,1648,1600,1590,1475,1450,1439,1375,1320,1285,1189,1109,950,786,758cm-1;Anal.calcd.for C20H21N3O C%75.21,H%6.63,N%13.16;Found:C%75.54,H%6.46,N%13.04。 
实施例7：3-[N-(2-氯苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-氰基吲哚（Ⅰp）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol5-氰基吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01molN-(2-氯苄基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流5h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(2-氯苄基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-氰基吲哚（Ⅰp）。 
收率48%;黄色固体;mp175-177℃;1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.12(s,1H),7.98(d,J=5.5Hz,1H),7.73-7.02(m,7H),6.15(d,J=4.3Hz,1H),3.42(s,2H),3.01(s,2H),2.55(t,J=5.8Hz,2H),2.49(s,2H);IR(KBr):3077,2911,2864,1655,1610,1587,1479,1450,1379,1321,1285,1199,1104,955,792,753cm-1;Anal.calcd.for C21H18ClN3C%72.51,H%5.22,N%12.08;Found:C%72.54,H%5.36,N%11.99。 
实施例8：3-[N-(3-吡啶基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚（Ⅰq）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol5-溴吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01mol N-(3-吡啶基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流5h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(3-吡啶基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-溴吲哚（Ⅰq）。 
收率58%;黄色固体;mp171-173℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),8.13(d,J=3.5Hz,1H),7.86-7.12(m,7H),6.09(d,J=5.2Hz,1H),3.60(s,2H), 3.11(s,2H),2.65(t,J=4.7Hz,2H),2.51(s,2H);IR(KBr):3087,2910,2868,1655,1620,1597,1475,1450,1370,1321,1275,1190,1108,957,792,756cm-1;Anal.calcd.for C19H18BrN3C%61.97,H%4.93,N%11.41;Found:C%61.89,H%4.99,N%11.51。 
实施例9：3-[N-(2-呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚（Ⅰr）的制备方法： 
向50mL干燥的三颈瓶中加入0.005mol5-甲氧基吲哚、5mL甲醇及5mL甲醇钠溶液（30wt%CH3OH溶液），冰水浴条件下搅拌加入0.01mol N-(2-呋喃甲基)-4-哌啶酮和5mL甲醇的混合液。滴加完毕后室温搅拌20min，然后在63℃条件下加热回流5h，有黄色固体析出,薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体，用乙酸乙酯重结晶，得到3-[N-(2-呋喃甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-5-甲氧基吲哚（Ⅰr）。 
收率48%;黄色固体;mp141-143℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.44(s,1H),8.03(d,J=3.5Hz,1H),7.46(m,1H),7.28-6.77(m,5H),6.08(d,J=7.2Hz,1H),3.87(d,J=12.5Hz,3H),3.57(s,2H),3.21(s,2H),2.68(t,J=5.5Hz,2H),2.49(s,2H);IR(KBr):3077,2910,2878,1650,1620,1590,1465,1450,1379,1325,1278,1195,1109,954,792,753cm-1;Anal.calcd.for C19H20N2O2C%74.00,H%6.54,N%9.08;Found:C%74.10,H%6.50,N%9.11。 
实施例10结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）和化合物（Ⅰa）~（Ir）抑制人白血病K562细胞系增殖的IC50的测试 
1.测试药剂及设备 
实验药品与试剂：自制结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）和化合物（Ⅰa）~（Ir），用DMSO溶解，加蒸馏水配至所需浓度(DMSO浓度≤1‰)，灭菌4℃保存。MTT(四甲基偶氮唑蓝)试剂购自Sigma公司。人白血病细胞K562细胞系购于上海中科院细胞库。10%SDS试剂（Sino-American Biotechnology产品），用含20%小牛血清(FBS)的RPMI-1640(美国GiBCo公司)培养液，其它试剂都是市售分析纯。在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。 
仪器设备：超净工作台，洁净<3.5粒/L(>0.5μm尘粒)，上海上净净化设备有 限公司；CO2细胞培养箱，Thermo公司Forma Scientific,Inc；倒置显微镜，日本奥林巴斯(OLYMPUS)公司，型号CKX41；酶联免疫检测仪，Bio-RAD Model680；96孔平板，美国Costar公司；SK2200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。 
2.试验方法 
实验在96孔板中进行，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板中，1×104/孔，每孔总体积100μL，每组8个复孔，设置药物颜色对照孔(不含细胞)和含细胞与不同浓度药物的培养孔，分别培养44h后，在各孔中加入MTT(5mg/mL,10μL)，继续培养4h，再加入10%SDS100μL终止反应，37℃过夜，用酶联免疫检测各孔在570nm的吸光度A值。用EXCEL做趋势线计算出IC50值。 
3.结果调查 
用MTT法测定了结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）化合物（Ⅰa）~（Ⅰr）抑制人白血病K562IC50值，IC50值见表1。 
表1（Ⅰa）~（Ir）和（Ⅱa）~（Ⅱr）抑制人白血病k562细胞系增殖的IC50值 
结合物Ⅱ IC50（μM） 化合物Ⅰ IC50（μM）
Ⅱa 4.87 Ⅰa 4.99
Ⅱb 4.70 Ⅰb 4.85
Ⅱc 4.43 Ⅰc 4.63
Ⅱd 4.32 Ⅰd 4.59
Ⅱe 3.71 Ⅰe 4.09
Ⅱf 5.08 Ⅰf 5.81
Ⅱg 4.51 Ⅰg 4.82
Ⅱh 4.65 Ⅰh 5.02
Ⅱi 4.39 Ⅰi 4.70
Ⅱj 4.09 Ⅰj 4.28
Ⅱk 4.15 Ⅰk 4.32
Ⅱl 4.53 Ⅰl 4.88
Ⅱm 4.79 Ⅰm 4.91
Ⅱn 4.69 Ⅰn 4.89
Ⅱo 5.81 Ⅰo 5.96
Ⅱp 4.62 Ⅰp 4.85
Ⅱq 6.02 Ⅰq 6.23
Ⅱr 4.70 Ⅰr 5.10
K562(5-Fu) 126    
 4.结论：表1所示为化合物(Ⅰa）~（Ⅰr）和结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)在体外细胞水平抑制人白血病K562细胞系增殖的IC50。由表1数据可知，结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)抑制白血病K562细胞系增殖的IC50值均明显低于化合物(Ⅰa）~（Ⅰr），且化合物(Ⅰa）~（Ⅰr）和结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)在体外细胞水平抑制人白血病K562细胞系增殖的IC50均明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu）。 
实例11化合物(Ⅰa）~（Ir）和结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC50的测试 
1.试验方法(集落计数法) 
用劲椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用TMEM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取106个小鼠骨髓细胞种于2ml含有20%胎牛血清的Endo M培养体系中，置于6孔板中，设立药物处理组化合物(Ⅰa）~（Ir）、结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）和阴性对照组(DMSO)，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养3天后计数，以≥50个细胞的聚合为1个集落，分别记录各孔的集落数目，用EXCEL做趋势线计算出IC50值。 
2.结果调查 
用上述集落计数法测定了化合物(Ⅰa）~（Ir）和结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC50值，IC50值见表2。 
表2（Ⅰa）~（Ir）和（Ⅱa）~（Ⅱr）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC50值 
与CD14结合前 IC50（μM） 与CD14结合物 IC50（μM）
Ⅰa 18.93 Ⅱa 20.85
Ⅰb 20.67 Ⅱb 22.37
Ⅰc 20.16 Ⅱc 21.19
Ⅰd 17.70 Ⅱd 19.24
Ⅰe 16.44 Ⅱe 19.22
Ⅰf 23.29 Ⅱf 23.15
Ⅰg 17.91 Ⅱg 18.14
Ⅰh 16.52 Ⅱh 17.96
Ⅰi 17.46 Ⅱi 18.34
Ⅰj 18.32 IIj 19.82
Ⅰk 15.29 Ⅱk 17.26
Ⅰl 15.37 Ⅱl 16.58
Ⅰm 14.54 Ⅱm 16.59
Ⅰn 14.21 Ⅱn 17.68
Ⅰo 24.65 Ⅱo 26.72
Ⅰp 14.79 Ⅱp 15.60
 
Ⅰq 27.87 Ⅱq 30.86
Ⅰr 14.49 Ⅱr 17.06
3.结论： 
表2所示为化合物(Ⅰa）~（Ⅰr）和结合物（Ⅱa）~（Ⅱr）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC50值，由表2数据可知，结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC50值，均明显低于化合物(Ⅰa）~（Ir），说明结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)的体外毒性明显小于化合物(Ⅰa）~（Ir）。 

Claims (4)

1.N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物，其特征在于，其结构如式（Ⅱ）所示：
在式（Ⅱ）中：
R1为：氢、溴、氰基、和甲氧基中的一种；
R2为：苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、2-氯苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,5-二氟苯基、苄基、2-吡啶基、3-吡啶基、2-四氢呋喃基和2-呋喃基中的一种；
R3为：氢和甲基中的一种；
mCD14是指CD14的单克隆抗体。
2.权利要求1所述N-取代四氢吡啶连吲哚-单克隆抗体CD14结合物的制备方法，其特征在于：取10mg式（Ⅰ）化合物，溶于0.1mL DMSO中；向该溶液中依次加入浓度为0.1mol/L的DCC溶液0.1mL和浓度为2μg/mL的mCD140.05～0.2mL；然后用生理盐水将上述混合溶液稀释至1mL；37℃反应20～120min，得到式（Ⅱ）结合物；反应方程式为：
Figure FDA0000473004430000012
其中，式（Ⅰ）化合物中R1、R2、R3的定义同式（Ⅱ）结合物；所述的mCD14是指CD14的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：浓度为2μg/mL的mCD14的用量为0.1mL；37℃反应30min。
4.根据权利要求1所述N-取代四氢吡啶链吲哚-单克隆抗体CD14结合物，其特征在于：N-取代四氢吡啶链吲哚-单克隆抗体结合物应用于制备治疗白血病药物。
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