CN1034543A - 制备抗体接合物的方法 - Google Patents

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CN1034543A CN89100559A CN89100559A CN1034543A CN 1034543 A CN1034543 A CN 1034543A CN 89100559 A CN89100559 A CN 89100559A CN 89100559 A CN89100559 A CN 89100559A CN 1034543 A CN1034543 A CN 1034543A
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Abstract

本发明公开了形成免疫球蛋白接合物的方法，该 方法包括：将含有连接在C-3或C-4的酰肼的抗肿 瘤吲垛-二氢吲垛长春生物碱与具有罕见高碳水化 合物含量的氧化IgG抗体反应。

Description

本发明属于免疫学与药物化学领域;本发明提供了抗体和长春花药的新结合物。
免疫学家和化学家近来已联合开发由免疫球蛋白（这种免疫球蛋白对限定的抗原具有特异性）和一种能连接到免疫球蛋白的理想位置上的药物或其它活性剂组成的结合物。文献中已描述了许多这一类的接合物。例如，英国专利申请2137202和2137210描述了长春花生物碱类抗癌药与对肿瘤抗原具有特异性的免疫球蛋白的接合物。
虽然对这类接合物作了科学研究，但这一研究领域仍处于早期发展阶段。仍未得到很好解答的问题之一是存在这样一种困难，即：在免疫球蛋白上携带大量活性物质而不影响其与抗原结合的能力。本发明提供了解决这一问题的答案，即，可以合成具有高比例的药物与免疫球蛋白的接合物。
本发明提供了具有下式的接合物：
式中R2为H、CH3或CHO;当R4和R5单独结合时，R5为H，R3和R4之一为乙基，另一个为H或OH;当R4和R5同时存在，它们形成环氧乙烷环，在此情况下，R3为乙基;R为NHN＝
Figure 891005595_IMG6
O（C1-3烷基），NH2，NH（C1-3烷基），NH-CH2CH2-Y，1-吡咯烷基或1-哌啶基，其中n为2-4，Y为Cl，OCH3或SCH3;R1为H（C1-3烷基）-CO，氯取代的（C1-3烷基）-CO或R6，其中R6为COXCONHN＝，其中X为C1-4直链亚烷基，C2-8支链亚烷基，C2-4亚链烯基，C3-4亚炔基，C3-6环亚烷基，亚苯基、羟基取代的C1-4亚烷基，或直接键，假定或者R为NHN＝，或者R1为R6，但当R1为R6时，R不能是NHN＝，而当R为NHN＝时，R1不能是R6;m为5至35的整数;Ab为IgG类抗体，含6%至18%的碳水化合物。
上式中可代表X的基团包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、乙烯基、亚丙基、亚丁烯基、亚丁炔基、亚丙炔基、羟基亚乙基、1，2-二羟基亚乙基、1，2-二甲基亚乙基、1，2，3，4-四羟基亚丁基、3，4-二甲基亚丁基、1，4-环亚己基、1，4-亚苯基、1，2-亚苯基等。
本发明还提供了制备式Ⅰ接合物的方法，即，将含有6%至18%碳水化合物的IgG类氧化抗体同下式（Ⅱ）的长春花酰肼反应，式（Ⅱ）为：
其中R7为NHNH，
O（C1-3烷基），NH2，NH（C1-3烷基），NH-CH2CH2-Y，1-吡咯烷基或1-哌啶基，其中n为2-4，Y为Cl，OCH3或SCH3;R8为H，（C1-3烷基）-CO，氯取代的（C1-3烷基）-CO或R0，其中，例定R7为NHNH2或者R8为R9，R9为COXCONHNH2，但当R8为R9时，R7不能是NHNH2，当R为NHNH2时，R8不能是R9。
本发明进一步提供了一种溶瘤细胞剂的式Ⅰ接合物的使用方法和含有式Ⅰ接合物及药用稀释剂的注射药物配方。
可用于制备酰肼（该酰肼组成本发明的接合物）的吲哚-二氢吲哚生物碱可由以下结构表示：
其中R2、R3、R4和R5的定义同前。
上式Ⅲ中，若R2为甲基，R3为羟基，R4为乙基，R5为H，则代表VLB（长春花碱）;若R2为甲酰基，R3为羟基，R4为乙基，R5为H，则代表长春新碱（VCR）;若R6为甲基，R3为乙基，R4为羟基，R5为H，则代表白诺西丁;若R2为甲基或甲酰基，R3为乙基，R4和R5同与之连接的碳一起形成α环氧环时，则分别代表长春素和甲酰长春素（leuroformine）;若R2为甲基，R3为乙基，R4和R5为H，则代表脱氧VLB“B”（4′-脱氧长春西定或4′-表脱氧VLB）;若R2为甲基，R4为乙基，R3和R5为H，则代表脱氧VLB“A”或4′-脱氧VLB;若R2为CHO，R3为乙基，R4和R5为H，则代表4′-表脱氧长春新碱（1-甲酰基-1-去甲基-4′-脱氧长春新碱）。
有关原始长春生物碱（Ⅲ）的参考文献如下：白诺生（U.S.Patent    No3，370，057），VLB（U.S.Patent    No3，097，137），长春西定和长春新碱（均为U.S.Patent    No3，205，220），去甲基VLB（U.S.Patent    No3，354，163），4-表长春新碱（U.S.Patent    No4，143，041），甲酰长春素（Leurofor-mine）及环氧长春新碱（U.S.Patent    No4，279，816）和脱氧VLB“A”和“B”〔Tetrahedron    Letters，783（1958）〕。
根据酰肼连接在C-3还是C-4的不同情况，用于形成本发明接合物的式Ⅱ酰肼的制备方法也不同。采用U.S.Patent4，203，898，col 12，line65et seg和实例3，col.18的步骤制备C-3酰肼。在这个方法中，于大约60℃的密闭试管中，在乙醇的存在下，将无水酰肼与式Ⅲ的长春花生物碱反应。这一反应的产物为4-脱乙酰基-3-羧酰肼，因为在碱性反应条件下，C-4的乙酰氧基被水解。若需要制备位于C-4的酯〔式Ⅱ中的R8为（C1-3烷基）-CO或氯（C1-3烷基）-CO〕，可先通过与丙酮反应，形成N2-丙叉基衍生物，对其中R8为H的C-3羧酰肼进行保护。由于对酰肼的NH2基进行了有效的保护使之免遭酰化，于是可按惯用方式，用酰卤（例如氯乙酰氯）或酸酐（例如丙酸酐），酰化这一“被保护的”衍生物。接着，可用酸处理除去该保护基。按常规，如果C-3羟基被酰化，可用湿硅胶处理，先除去C-3酰基，参见Hargrove的 U.S.Patent    3，392，173号。
当酰肼基团为C-4链的一部分（即：上式Ⅱ中R9的一部分）时，根据C-3基团的性质，4-脱乙酰基起始原料的制备如下：若C-3是酯基，可采用Hargrove的美国专利3，392，173号中实施例1-5的步骤制备4-脱乙酰基衍生物;若C-3是酰胺基，可按Conrad等（见上）的方法或Cullinan的美国专利4，203，898的方法，制备4-脱乙酰基衍生物。这一方法包括C-3羧酰肼的制备，C-3羧酰肼由C-4的水解而制得。然后，将酰肼转化为叠氮化物，该叠氮化物再与氨或具有NH2-（C1-3烷基）结构的伯胺反应，或与NH2-CH2-CH2-S-CH3、NH2-CH2-CH2-O-CH3、吡咯烷、哌啶或NH2-CH2-CH2-CI反应。制备这一最后化合物（即，用于制备所需C-3羧酰胺C-4羟基衍生物的氯乙基酰胺）的优选方法是分解式Ⅲ的长春花生物碱的3″-（β-氯乙基）-3-螺-5″-恶唑烷-2″，4，-二酮。制备这些恶唑烷二酮衍生物的方法见Miller和Gutowski的U.S.Patent RE30，560由上述恶蛲槎票甫?氯乙基酰胺的过程见Miller和Gutowski的美国专利4，357，334号中的实施例1。（在同一专利的实施例2中，采用经典叠氮化物方法，制得相同的β-氯乙基酰胺）。通过直接氨解或用阮来镍将酰肼还原，还可制得伯胺（式Ⅰ中的R为NH2）。参见U.S.Patent 4，203，898。最后，当式Ⅱ中的R7为
其中n为2-4，即，分别为环琥珀酰亚胺、环戊二酰亚胺或环己二酰亚胺时，可通过Cullinan的U.S.Patent4，667，030的方法制得4-羟基衍生物。
可将某些长春花酰肼用于制备本发明的接合物。虽然式Ⅰ的所有接合物都是有用的，但特别理想的是以下类型的接合物。可以理解到，可将以下的类型组合起来，以获得类型更为限定的优选化合物。
1）R为NHN＝;
2）R1为R6;
3）R为烷氧基或烷氨基;
4）R1为氢;
5）R2为甲基或CHO;
6）R3为OH或乙基;
7）R4为氢或乙基;
8）R5为氢;
9）X为亚烷基;
10）X为C1-4直链亚烷基。
下面例举了式Ⅱ的可用于本发明的某些优选长春花酰肼及其专业上熟知的常用名（俗名）：
4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰肼（R7＝NHNH2;R8＝R5＝氢;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基）;
4-脱乙酰基-VLB-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝OCH3R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VLB-羧酰肼-N2-琥珀酰亚胺-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝
Figure 891005595_IMG11
R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰胺-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝NH2;R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VLB-4-半戊二酸酯酰肼（R7＝OCH3;R8＝COCH2CH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VCR-4-半琥珀酸酰肼（R7＝OCH3;R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝CHO;R3＝羟基：R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-4′-表脱氧基-VLB-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝OCH3;R8＝COCH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝乙基;R4＝R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰肼-N2-戊二酰亚胺-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝
Figure 891005595_IMG12
;
R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）
4-脱乙酰基-VCR-3-羧酰肼（R7＝NHNH2;R8＝R5＝氢;R2＝CHO;R3＝羟基;R4＝乙基）;
4-脱乙酰基-4′-表脱氧基-VLB-3-羧酰肼（R7＝NHNH2;R8＝R4＝R5＝氢;R2＝甲基;R3＝乙基）;
4-脱乙酰基-VLB-3-乙基羧酰胺-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝NHCH2CH3;R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VLB-3-甲氧基乙羧酰胺-4-半琥珀酸酯酰肼（R7＝NHCH2CH2OCH3;R8＝COCH2CH2CONHNH2;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）;
4-脱乙酰基-VLB-4-丙酰-3-羧酰肼（R7＝NHNH2;R8＝COCH2CH3;R2＝甲基;R3＝羟基;R4＝乙基;R5＝氢）。
按英国专利申请2，137，202A或Cullinan的美国专利4，667，030号中概述的多步法，通过对式Ⅱ的化合物进行反应，可制得C-3具有各种取代（见式Ⅱ中的R7）的二聚吲哚-二氢吲哚生物碱的C-4衍生物。其中所述式Ⅱ化合物中的R8为H，R7和R2-R5具有一定的定义。
本发明接合物的其它成份为IgG类的氧化抗体，最好是单克隆抗体（MoAb），该抗体含大约6%至18%的碳水化合物。因此，用于本发明的抗体是相当罕见的，因为一般的IgG免疫球蛋白仅含大约2-5%的碳水化合物。（权威们已估计了IgG中碳水化合物的含量，Goding在Monoclonal    Antibo-dies：Principles    and    Practice，Academic    Press，1983，P.9上报道为2-3%，Ghose等在J.Immunol.Methods    59，130（1983）上报道为3%。）
本文中所采用的术语“抗体”包括上一段中所述类型抗体的Fab、Fab′和F（ab′）2片断。
所述抗体可以是这样一种，即，其中轻链上连有罕见量的碳水化合物。然而，重链可含有罕见量的碳水化合物，或者作为一个整体的抗体的Fab部分可含罕见量的碳水化合物。另一方面，抗体Fc部分中可包含或部分包含罕见量的碳水化合物。
虽然本发明用的抗体含大约6%至18%碳水化合物，但优选类型的抗体的碳水化合物含量可在其它范围内，这些范围为：
1）约6%至15%;
2）约6%至12%;
3）约8%至15%;
4）约8%至12%;
5）约6%至10%;
6）约10%至15%。
从免疫动物的血清中或通过培养分泌单克隆产物的杂交瘤来制备抗体的技术是公知的。通过基团工程技术，可对杂交瘤进行修饰，以产生具有特定性质的抗体，例如本发明用的具有罕见碳水化合物含量的抗体。还可采用化学方法对纯化的抗体进行修饰，以增加其碳水化合物含量。用于本发明的代表性抗体包括同以下抗原接合的单克隆或多克隆抗体，所述抗原为：
（ⅰ）与人或动物肿瘤有关的抗原;
（ⅱ）人的B-和T-细胞抗原;
（ⅲ）人的Ia抗原;
（ⅳ）病毒、真菌和细菌抗原;和
（ⅴ）与人的炎性或变应性反应有关的细胞。
与人或动物肿瘤有关的抗原连接的优选抗体可例举如下：
（ⅰ）取自经癌胚抗原免疫的小羊或羊的IgG;
（ⅱ）取自免子的抗急性成淋巴细胞性白血病血清的IgG;
（ⅲ）取自各种灵长类动物的抗血清的IgG，该抗血清是由抗急性成淋巴细胞白血病，急性成骨髓细胞白血病，慢性成淋巴细胞白血病和慢性粒细胞白血病产生的。
（ⅳ）取自经肺癌细胞或细胞成份免疫的山羊或羊的IgG;
（ⅴ）取自能分泌抗人体结肠直肠癌抗体的小鼠杂交瘤的单克隆IgG;
（ⅵ）取自能分泌抗人体黑素瘤抗体的小鼠杂交瘤的单克隆IgG;
（ⅶ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述小鼠杂交瘤能分泌可与人体白血病细胞进行反应的抗体。
（ⅷ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述杂交瘤能分泌那些与人体成神经细胞瘤细胞反应的抗体;
（ⅸ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述杂交瘤能分泌那些与人乳腺癌抗原反应的抗体：
（ⅹ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述杂交瘤能分泌那些与人卵巢癌细胞反应的抗体;
（ⅹⅰ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述杂交瘤能分泌那些能与下述细胞进行反应的抗体，所述细胞是人骨瘤细胞、人胰腺癌细胞、人前列胰癌细胞等;
（ⅹⅱ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述杂交瘤能分泌那些能与腺癌（包括肺、肾、乳腺、胰腺癌）接合的抗体;
（ⅹⅲ）取自小鼠杂交瘤的单克隆IgG，所述杂交瘤能分泌那些与人鳞状癌细胞反应的抗体;
（ⅹⅳ）取自人杂交瘤的单克隆IgG（所述杂交瘤能分泌那些与人肿瘤有关抗原的抗体，这些抗体包括但不限于上述那些单克隆）。
优选的接合物是那些由单克隆抗体制备的接合物，尤其是从那些能识别人类癌细胞的抗体制备的接合物。所述的人类癌细胞包括腺癌、鳞状细胞癌、过渡性单核白细胞癌、黑素瘤、成神经细胞癌、小细胞癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤。
为了使抗体能与长春酰肼反应，可用高碘酸盐或另一种适宜的氧化剂氧化抗体，使表面碳水化合物的连位二醇之间的键断裂，产生两个醛基。化学工作者或可以理解到，在其它官能试剂存在在下，在溶液中的醛基实际上可以呈缩醛、半缩醛、醛缩胺（aminal）、半醛缩胺（aminal）等形式。
专业人员可以理解到，被氧化的碳水化合物单位的比例和产生的二醛单位的数量取决于以下因素，即，高碘酸盐的用量，总的氧化反应条件（例如，时间、温度、溶剂、浓度等），存在于抗体上的连位二醇碳水化合物单位的数量，以及其与氟化剂的可接近程度。
另外，可结合上述高碘酸盐氧化法，也可单独采用半乳糖氧化酶进行酶氧化。半乳糖氧化酶是一种更具选择性和限制性的试剂，它能催化碳水化合物单位上半乳糖残基的6-CH2OH转化成醛基。该6-CH2OH必须是未取代的，以便成功地进行氧化，用酶唾液酸苷酶除去保护基，如唾液酸残基上所连接的保护基。如上所述，由此产生的醛基的数量随多种因素而变。然后，用亲核反应（其中酰肼基端氮上的孤电子对攻击氧化抗体的醛基），将氧化抗体与式Ⅰ的长春酰肼接合。
一般而言，将每摩尔抗体与若干摩尔长春酰肼接合。实际上，本发明的优点之一在于每个抗体分子上可携带大量药物。“接合率”是指每摩尔抗体携带长春酰肼的摩尔平均数。就本发明而言，接合率通常约为5至35，而优选的接合率约为5至25，更为优选的接合率约为10至20，15至25和5至15。
可采用专业上公知的标准方法，将长春酰肼与氧化抗体接合。一般情况下，先将式Ⅱ的长春酰肼溶于水溶性溶剂（如二甲基甲酰胺）中形成溶液，然后加到含氧化抗体的冷冻缓冲水溶液中，该长春酰肼也可制成硫酸盐，在此情况下，不需使用有机溶液。最好采用0-8℃的温度;通常使用0.1N乙酸钠缓冲液。最好在暗处和惰性气体中进行反应。反应通常于10-24小时内完成;可通过标准方法，例如利用Sephadex（交联葡聚糖凝胶）进行层析，将所得的接合物纯化。
以下实施例中采用的MoAb为ZCE-025，一种IgG1亚类的鼠类抗体，它可与癌胚胎抗原反应。这是由Hybritech Incorporated公司正在开发的项目，见Abdel-Nabi等，Radiology 164，617-21（1987）。J-P.Mach和助手们已对该抗体（名称为单克隆抗体35）特别是作为癌的诊断剂的用途已进行了一定时间的研究。见Delaloye et al.，J.Clin.Invest.77，301-11（1986）Haskell et al.，Cancer Res.43，3857-64（1983）;Sutherland et al.Cancer Res.47，1627-33（1987）。
在还原条件下，通过用SDS-PAGE进行分析，发现ZCE-025具有罕见高分子量（28，000）的轻链。该方法见Laemmli在U.K.Nature（London）227，680-85（1970）上的介绍。用Endoglycosidase    F处理ZCE-025〔Elder    et    al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA    70，4540-44（1982）〕导致大量轻链在SDS-PAGE上的色移同对照物的相同，这表明轻链的高分子量是由碳水化合物造成的。
实施例1
将10mgZCE-025溶解于PH为5.6的0.1M乙酸钠缓冲液（29.3g乙酸钠、2.44ml乙酸加上足量无菌水制成4L的缓冲液）中，制得一种溶液。将2.1mg偏过碘酸钠于快速搅拌下加到0-2℃的上述溶液中。
于暗处、0-2℃下，将该混合物搅拌10分钟，然后加入0.004ml12.5M的乙二醇无菌水溶液使反应终止。于暗处、0-2℃下继续搅拌5分钟，然后离心得到一澄清的上清液和白色沉淀。将上清液置于交联葡聚糖凝胶（中目）柱上，用同样的乙酸钠缓冲液对产物进行洗脱。用280nm的紫外光监测洗脱液。测定在280nm处收集的各洗脱液中氧化产物的浓度。
上述氧化产物洗脱液中的最终蛋白质浓度为2.5mg/ml，总体积为3.1ml。将溶液冷却至大约4℃。
将13.4mg4-脱乙酰基VLB3-羧酰肼硫酸酯加到上述冷冻的缓冲MoAb溶液中。充入氮气，然后密封。在低温、于暗处，将反应混合物用磁性搅拌器搅拌16小时。然后，将反应容器开启。用PH＝7.4的磷酸盐缓冲盐水（0.01M磷酸盐，0.15M    NaCl）（也用作洗脱液）预平衡交联萄聚糖凝胶G25，然后将清的浅黄色反应混合物于该凝胶柱上进行层析。先洗脱接合物，再洗脱未反应的4-脱乙酰基VLB-3-羧酰基VLB-3-羧酰肼。所得接合物为5.7mg（于4.8ml液体中）。用280和270nm处的双波长紫外光谱测定，接合比率为每摩尔MoAb约带有5.2摩尔4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰肼。
实施例2
用34mg偏过碘酸钠将含有10mg上述MoAb的1ml乙酸盐缓冲液于0℃氧化21分钟。然后加0.064ml12.5M乙二醇，使反应骤停，按实例1的方法将产物纯化，得到9.7mg氧化MoAb（于4ml溶液中）。将17mg4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰肼硫酸酯于0℃加到该溶液中，将混合物于暗处放置16小时，然后离心20分钟，按例1所述方法加工上清液，得到0.6mg产物，接合率为27.2。
实施例3
实施类似于实施例1的过程。偏过碘酸钠的量为2.1mg;氧化反应进行21分钟。获得的氧化MoAb为8.8mg，将其与19mg长春酰肼反应，按实施例2所述方法加工，得到6.9mg接合率为8.6的接合物。
实施例4
重复实施例3的过程，只是偏过碘酸钠的量为8.6mg，乙二醇的量为0.016ml。得氧化MoAb8.6mg。将所得产物与18mg长春酰肼反应，得到5mg所需的接合物，其接合率为13.8。
实施例5
再次重复实施例3的过程，只是偏过碘酸钠的量为8.6mg，乙二醇的量为0.016ml，氧化时间为10分钟。得到的氧化MoAb为8.1mg。将所得产物与19mg长春酰肼反应，产生6.5mg接合率为10.3的接合物。
通过放射免疫测定法和免疫荧光法确定以上实施例中制备的接合物与抗原-阳性的LS174T克隆腺癌细胞的结合至少同没有接合药物的ZCE-025与上述癌细胞的结合一样好。免疫荧光法分析表明，该接合物不同抗原-阳性的M14人黑素瘤细胞结合。
实施例6
将374mg抗体ZCE-025透析入28.8mlPH为5.6的乙酸钠缓冲液中再加入8.1ml缓冲液，然后将其与0.53ml过碘酸钠水溶液（150mg/ml）混合。于暗处将该混合物搅拌10分钟，然后加入乙二醇使反应骤停。将反应混合物离心，上清液于交联葡聚糖凝胶柱上进行层析，用乙酸钠缓冲液洗脱，将含有抗体的部分合并，用280nm的紫外光谱进行分析，结果显示得到355mg氧化抗体。用乙酸钠缓冲液将其稀释至浓度为2.8mg/ml，并将554mg4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰肼加入其中。使反应混合物于4℃下静置过夜，经交联葡聚糖凝胶层析提纯该混合物，用PH7.4的生理盐水缓冲液洗脱，将含有产品的洗脱液合并，并通过0.2μ的滤膜。得到总共为304mg的接合物，其浓度为13.5mg/ml，接合率为每摩尔抗体带5.0摩尔药物。
实施例7
基本上重复实施例6的过程，只是稍有变动，以制备具有更高接合率的产品。当过碘化钠溶液的浓度为150mg/ml时，其用量为6.4ml。氧化反应进行21分钟。投入相同量的长春酰肼，得到187mg接合物，其浓度为8.9mg/ml，接合率为每摩尔蛋白质带有9.7摩尔药物。
用生长于雌性查尔斯（Charles    River）裸体小鼠体内的LS174T肿瘤的异种移植物试验实施例6和7的接合物的抗癌效果。LS174T是一种能产生癌胚抗原的人结肠直肠肿瘤。实验开始给每只小鼠皮下移植107个肿瘤细胞。分别于移植后的第7天、10天、14天和17天，给每只小鼠注射一次接合物，注射剂量为每公斤体重3mg长春药。于移植后的不同时间（最长为42天），测定移植诱发的肿瘤的大小。治疗组用五只小鼠，对照组十只小鼠。所述试验还包括给予未接合的4-脱乙酰基-VLB-3-羧酰肼的一组。
42天后，对照组小鼠长出了平均约为23.5g的大肿瘤。接受了实施例6接合物的所有小鼠均已死亡。接受了实施例7接合物的其中一只小鼠已死亡，而其余四只小鼠的肿瘤平均为4.5g。接受了未接合的药物的小鼠其中三只已死亡，另外两只的肿瘤同样平均为4.5g。
在按相同方式进行的另一个试验中，肿瘤生长速度缓慢得多。在移植后的第34天，对照小鼠肿瘤重约3.7g。所有接受了未接合的药物的小鼠均已死亡。接受了实施例6和7接合物的小鼠的肿瘤平均约重0.1g;然而，接受了实施例6接合物的小鼠四只已死亡，而接受了实施例7接合物的小鼠无一只死亡。
在类似的试验中，以每公斤体重仅给2mg长春药的比例施用接合物。在此试验中，对照小鼠的肿瘤重量平均约为23.5g，与第一个试验中的结果相同。到试验的第42天，接受了实施例7的接合物或游离长春药的无一死亡;接受了实施例6接合物的小鼠中仅有一只死亡。接受了长春药的小鼠的肿瘤于第42天时的平均重量约8g，接受了实施例6和7接合物的小鼠肿瘤平均约为5g。
已发现，本发明的接合物相当安全，最令人意想不到的是，接合率高的接合物比长春药含量较低的接合物更为安全。因此，该接合物保证了一种最有益的用药方式，即，可以较大剂量地施用抗肿瘤的长春药，而对病人具有意料不到的安全性。
本发明的新颖接合物可用来治疗癌症，就此而论，最好将其制成适于注射的剂形使用。因此，本发明包括一种药剂，例如一种可注射用的制剂，它包含本发明的接合物和专业上公知的药用载体或稀释剂。所述剂形最好呈单位剂量形式，每一单位剂量含（例如）0.01至10mg活性成份（就长春药部分而言）。
本发明的新颖接合物在很宽的剂量范围和周剂量内都是有效的，例如对于治疗成年癌症患者而言，该剂量范围一般为0.01至10mg/kg（长春药部分），更常用的为0.03至9mg/kg。然而，应该意识到，接合物的实际施用量将由医生根据有关情况（包括所治疗的疾状和所选择的给药途径）确定。

Claims (5)

1、一种制备下式(Ⅰ)的接合物的方法，该方法包括：将含有6%至18%碳水化合物的IgG类氧化抗体同下式(Ⅱ)的长春酰肼反应，式Ⅰ为：
Figure 891005595_IMG1
式中R2为H、CH3或CHO；当R4和R5单独结合时，R5为H，R3和R4之一为乙基，另一个为H或OH；当R4和R5同时与连接它们的碳结合时，它们形成环氧乙烷环，在此情况下，R3为乙基；R为NHN=，
Figure 891005595_IMG2
O(C1-3烷基)，NH2，NH(C1-3烷基)，NH-CH2CH2-Y，1-吡咯烷基或1-哌啶基，其中n为2-4，Y为Cl，OCH3或SCH3；R1为H，(C1-3烷基)-CO，氯取代的(C1-3烷基)-CO或R6，其中R6为COXCONHN=，其中X为C1-4直链亚烷基，C2-8支链亚烷基，C2-4亚链烯基，C3-4亚炔基，C3-6环亚烷基，亚苯基、羟基取代的C1-4亚烷基，或直接键，假定或者R为NHN=，或者R1为R6，但当R1为R6时，R不能是NHN=，而当R为NHN=时，R1不能是R6；m为5至35的整数；AD为IgG类的抗体，含6%至18%的碳水化合物；式Ⅱ为：
Figure 891005595_IMG3
其中R7为NHNH，
Figure 891005595_IMG4
O(C1-3烷基)，NH2，NH(C1-3烷基)，NH-CH2CH2-Y，1-吡咯烷基或1-哌啶基，其中n为2-4，Y为Cl，OCH3或SCH3；R8为H，(C1-3烷基)-CO，氯取代的(C1-3烷基)-CO或R9，其中假定R7为NHNH2，或者R8为R9，R9为COXCONHNH2，但当R8为R9时，R7不能是NHNH2，当R为NHNH2时，R8不能是R9。
2、按权利要求1的方法，其中于冷冻缓冲水溶液中实施该方法。
3、按权利要求1或2的方法，其中抗体为单克隆抗体。
4、按权利要求3的方法，其中抗体被用于识别哺乳动物的有害的细胞表面上的抗原。
5、按权利要求4的方法，其中抗体被用于识别人的癌细胞，这些癌细胞包括腺癌、鳞状细胞癌、过渡性单核白细胞癌、黑素癌、成神经细胞瘤、小细胞癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤。
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