CN102898522B

CN102898522B - 具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体cd14结合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102898522B
Application number: CN201210401778.4A
Authority: CN
Inventors: 孙传文; 肖笛; 李静; 薛思佳; 李兴玉
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2032-10-19
Also published as: CN102898522A

Abstract

本发明公开了一类具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14结合物及其制备方法和应用，这种结合物的结构如式（Ⅱ）所示：在缩合剂DCC的作用下，CD14单抗分子中碳端的氨基酸残基与四氢吡啶并吡喃衍生物中吡喃环上的氨基结合，得到通式为式（Ⅱ）的单克隆抗体结合物CD14-TPP。CD14-TPP能高效抑制人白血病K562细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖，其抑制上述三种癌细胞系增殖的IC₅₀值均明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu）。式（Ⅱ）结合物对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低，可用于制备治疗白血病、卵巢癌及肝癌的药物。

Description

具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14结合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14结合物及其制备方法和应用；具体为一类能高效抑制人白血病K562细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的四氢吡啶并吡喃与单克隆抗体CD14的结合物（代号为：CD14-TPP）的制备，及作为治疗白血病、卵巢癌和肝癌等单抗药物的先导化合物。属于化学生物药物领域。

背景技术

白血病、卵巢癌及肝癌是发病率很高的三大常见恶性肿瘤,然而现有技术没有理想的高效治疗上述癌症的药物。

白血病是一类造血干细胞克隆性疾病。好发于青少年，其发病率排在青少年肿瘤的第一位，所以对人类的危害更为明显和突出。慢性白血病中的K562细胞系，因其自身凋亡的抵抗力强于其他细胞系，为此，抑制K562细胞的增殖成为治疗白血病非常重要的手段。

卵巢癌是女性最常见的肿瘤之一，虽然其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，然而因卵巢癌致死者却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。。

肝癌是死亡率仅次于胃癌和食道癌的第三大常见恶性肿瘤。肝癌中的SMMC-7721细胞系，其抵抗凋亡的能力比其他肝癌细胞系强，为此，抑制SMMC-7721细胞系的增殖成为治疗肝癌的重要手段。

然而，现在临床上常用的化疗药物的共同的缺点是选择性不强，对正常细胞和肿瘤细胞几乎具有相同的杀伤作用，因此，毒性较大,对骨髓、消化道细胞和生殖细胞也有很强的杀伤作用。

据公开号为CN102285993A的专利报道，四氢吡啶并吡喃衍生物（Ⅰ）（简写为TPP）具有高效抑制人白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞的增殖的生物活性，其抑制上述三种癌细胞增殖的IC₅₀均值低于抗癌药5-氟尿嘧啶，具有潜在的实用性。然而，四氢吡啶并吡喃衍生物TPP的选择性不高，对正常细胞有一定的毒性，在一定程度上限制了它们在抗癌药物上的应用。

为了解决上述问题,近年来已有将抗癌药与单克隆抗体(简称单抗)结合，制成单克隆抗体药物（简称单抗药物）的相关报道,单抗药物能对肿瘤相关靶点显示特异性结合,对肿瘤细胞有选择性杀伤作用，并在动物实验中有显著的疗效。为此，研制单抗药物有巨大的潜力,单抗药物将在肿瘤治疗中发挥重要作用。

由于编码为CD14的单克隆抗体（简称单抗CD14）对人白血病K562、卵巢癌MDR-MB-231及肝癌SMMC-7721等细胞系具有高度特异性,将其与具有高效抑制人白血病K562细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖活性的四氢吡啶并吡喃衍生物（代号为TPP）（Ⅰ）结合，制成TPP与单抗CD14结合的单抗药物先导化合物（代号为CD14-TPP）（Ⅱ），使CD14-TPP能靶向于特定的肿瘤细胞，大大降低其对正常组织细胞的毒性。为此，单抗药物先导化合物CD14-TPP（Ⅱ）有望成为极具临床应用潜力的抗癌新药。

发明内容

本发明目的是为了提供一类具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14结合物（简写为CD14-TPP），该CD14-TPP结合物是一类可作为治疗白血病、卵巢癌和肝癌药物的单抗药物的先导化合物。

本发明的第二个目的是为了提供该单抗药物的先导化合物CD14-TPP的制备方法。

本发明的第三个目的是将该单抗药物的先导化合物CD14-TPP用于制备治疗白血病、卵巢癌和肝癌的抗肿瘤药物。CD14-TPP能高效抑制人白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞的增殖，其抑制上述三种癌细胞增殖的IC₅₀均值低于抗癌药5-氟尿嘧啶。该CD14-TPP体内急性毒性低，对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低，具有潜在的实用性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

本发明提供的单抗药物的先导化合物CD14-TPP，具有高效抑制人白血病K562细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的活性，且对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低，该抗白血病、卵巢癌和肝癌的单抗药物的先导化合物CD14-TPP的结构式如式（Ⅱ）所示：

在式（Ⅱ）中：

R₁为：氟、氯、溴、氰基、硝基、羧基、酯基、羰基、磺酸基、烃基和烃氧基中的一种；

R₂为：苯基、4-取代苯基、2-取代苯基、3-取代苯基、2,4-二取代苯基、3,5-二取代苯基、2,3-二取代苯基；苄基、4-取代苄基、2-取代苄基、3-取代苄基、2,4-二取代苄基、3,5-二取代苄基、2,3-二取代苄基；2-吡啶基、3-取代-2-吡啶基、4-取代-2-吡啶基，3，4-二取代-2-吡啶基；3-吡啶基、2-取代-3-吡啶基、4-取代-3-吡啶基，2，4-二取代-2-吡啶基；2-四氢呋喃基、2-取代四氢呋喃基2-呋喃基、2-取代呋喃基等六元或五元取代杂环基中的一种。

R₂中苯基、苄基、吡啶基和四氢呋喃基中的取代基为：甲基、乙基等C₆以下的烃基；甲氧基、乙氧基等C₆以下的烃氧基；氟，氯，溴，氰基，硝基，羧基，酯基，羰基和磺酸基等中的一种或两种。

mCD14是指编码为CD14的单克隆抗体，简称单抗CD14。

本发明提供式（Ⅱ）化合物的制备方法，具体步骤如下：

（1）制备式（Ⅰ）化合物：化合物（Ⅰa）~（Ⅰh）的制备方法见公开号为CN102285993A的专利。化合物（Ⅰa）~（Ⅰh）的制备方法见该专利说明书实施例1~实施例8。

（2）制备式（Ⅱ）结合物：取10mg式（Ⅰ）化合物，溶于0.1mL DMSO中，向上述溶液中依次加入浓度为0.1mol/L的DCC溶液0.1mL和浓度为2μg/mL 的CD140.05~0.2mL，然后用生理盐水将上述混合溶液稀释至1mL。37℃反应20~120min，得到式（Ⅱ）化合物。浓度为2μg/mL的CD14的用量优选为0.1mL；37℃反应时间优选为30min。

反应方程式为：

在式（Ⅱ）结合物中，R₁、R₂和mCD14的定义同前；式（Ⅰ）化合物中R₁、R₂的定义同式（Ⅱ）结合物。

以MTT法分别测定式（Ⅰ）化合物和式（Ⅱ）结合物对人白血病K562细胞系的杀伤作用；式（Ⅱ）结合物对卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系的杀伤作用，同时设立多组对照组。对照组包括：空白组，CD14+DMSO+DCC，CD14，式（Ⅰ）化合物，CD14+式（Ⅰ）化合物。

通式为（Ⅱ）的单克隆抗体结合物CD14-TPP具有高效抑制人白血病K562细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的活性，其抑制上述三种癌细胞系增殖的IC₅₀值均明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu），且该CD14-TPP结合物体内急性毒性低，对小鼠正常骨髓细胞的毒性较低。CD14-TPP（Ⅱ）可用于制备治疗白血病、卵巢癌和肝癌的药物。有可能成为特效的、毒副作用较小的新型抗癌药物，具有潜在的实用性。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。

本发明制备的具有抗白血病、卵巢癌和肝癌活性的单抗药物先导化合物CD14-TPP（Ⅱ）的实施例是：

（Ⅱa）CD14-6-（4-甲苄基）-4-（4-氟苯基）-8-（4-氟苄叉基）-3-氰基-2- 氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱb）CD14-6-（4-甲苄基）-4-（2-氯苯基）-8-（2-氯苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱc）CD14-6-（4-氟苄基）-4-（4-氟苯基）-8-（4-氟苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱd）CD14-6-（4-氟苄基）-4-（4-甲苯基）-8-（4-甲苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱe）CD14-6-（4-甲氧苄基）-4-（4-氟苯基）-8-（4-氟苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱf）CD14-6-（4-甲氧苄基）-4-（4-甲苯基）-8-（4-甲苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱg）CD14-6-（4-溴苄基）-4-（4-氟苯基）-8-（4-氟苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

（Ⅱh）CD14-6-（4-溴苄基）-4-（4-甲苯基）-8-（4-甲苄叉基）-3-氰基-2-氨基-1,2,5,6-四氢吡啶并[4,3-b]吡喃

实施例1：结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）的制备

化合物（Ⅰa）~（Ⅰh）的制备方法见公开号：CN102285993A的专利。

取10mg化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)，分别溶于0.1mL DMSO中，分别向上述溶液中依次加入浓度为0.1mol/L的DCC溶液0.1mL，浓度为2μg/mL的CD140.1mL，然后用生理盐水将上述混合溶液稀释至1mL。37℃反应30min，得到结合物（Ⅱa）~(Ⅱh)。

以MTT法分别测定式（Ⅰ）化合物和式（Ⅱ）结合物对人白血病K562细胞系的杀伤作用；式（Ⅱ）结合物对卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系的杀伤作用，同时设立多组对照组。对照组包括：空白组，CD14+DMSO+DCC，CD14，化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)，CD14+化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)。

实施例2：结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）和化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)抑制人白血病K562细胞系，结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的IC₅₀的测试

1.测试药剂及设备

实验药品与试剂：自制化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)和结合物（Ⅱa）~（Ⅱh），用DMSO溶解，加蒸馏水配至所需浓度(DMSO浓度≤1‰)，灭菌4℃保存。MTT(四甲基偶氮唑蓝)试剂购自Sigma公司。人白血病细胞K562卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系均购于上海中科院细胞库。10%SDS试剂（Sino-American Biotechnology产品），用含20%小牛血清(FBS)的RPMI-1640(美国GiBCo公司)培养液，其它试剂都是市售分析纯。在37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

仪器设备：超净工作台，洁净<3.5粒/L(>0.5μm尘粒)，上海上净净化设备有限公司；CO₂细胞培养箱，Thermo公司Forma Scientific,Inc；倒置显微镜，日本奥林巴斯(OLYMPUS)公司，型号CKX41；酶联免疫检测仪，Bio-RAD Model 680；96孔平板，美国Costar公司；SK2200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。

2.试验方法

实验在96孔板中进行，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板中，1×10⁴/孔，每孔总体积100μL，每组8个复孔，设置药物颜色对照孔(不含细胞)和含细胞与不同浓度药物的培养孔，分别培养44h后，在各孔中加入MTT(5mg/mL,10μL)，继续培养4h，再加入10%SDS 100μL终止反应，37℃过夜，用酶联免疫检测各孔在570nm的吸光度A值。用EXCEL做趋势线计算出IC50值。

3.结果调查

用MTT法测定了结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）和化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)抑制人白血病K562细胞系增殖的IC₅₀值，IC₅₀值见表1。测定了结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制卵巢癌MDR-MB-231、及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的IC₅₀值，IC₅₀值见表2。

表1（Ⅰa）~（Ⅰh）和（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制人白血病k562细胞系增殖的IC₅₀值

结合物Ⅱ	IC₅₀（μM）	化合物Ⅰ	IC₅₀（μM）
				Ⅱa	12.09	Ⅰa	13.15
Ⅱb	17.42	Ⅰb	18.76
				Ⅱc	14.95	Ⅰc	15.89
Ⅱd	20.31	Ⅰd	22.13

Ⅱe	17.06	Ⅰe	20.12
				Ⅱf	18.27	Ⅰf	20.23
Ⅱg	15.10	Ⅰg	16.23
				Ⅱh	16.54	Ⅰh	18.12
K562(5-Fu)	126

表2结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制卵巢癌MDR-MB-231和肝癌SMMC-7721细胞系增殖的IC₅₀值

4.结论：表1所示为结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）和化合物（Ⅰa）~(Ⅰh)在体外细胞水平抑制人白血病K562细胞系增殖的IC₅₀值,由表1数据可知，结合物（Ⅱa）~(Ⅱh)抑制白血病K562细胞系增殖的IC₅₀值均明显低于化合物(Ⅰa）~（Ⅰh），且化合物(Ⅰa）~（Ⅰh）和结合物（Ⅱa）~(Ⅱh)在体外细胞水平抑制人白血病K562细胞系增殖的IC₅₀均明显低于常规化疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu）。

表2所示为结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）在体外细胞水平抑制卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的IC₅₀。由表2数据可知，结合物（Ⅱa）~(Ⅱh)具有高效抑制卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的生物活性。

实例3化合物(Ⅰa）~（Ⅰh）和结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC₅₀的测试

1.试验方法(集落计数法)

用劲椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用TMEM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取10⁶个小鼠骨髓细胞种于2ml含有20%胎牛血清的Endo M培养体系中，置于6孔板中，设立药物处理组化合物(Ⅰa）~（Ⅰh）、结合物（Ⅱa） ~（Ⅱh）和阴性对照组(DMSO)，于37℃、5%CO₂、饱和湿度下培养3天后计数，以≥50个细胞的聚合为1个集落，分别记录各孔的集落数目，用EXCEL做趋势线计算出IC₅₀值。

2.结果调查

用上述集落计数法测定了化合物(Ⅰa）~（Ⅰh）和结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC₅₀值，IC₅₀值见表3。

表3（Ⅰa）~（Ⅰh）和（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC₅₀值

化合物Ⅰ	IC₅₀（μM）	结合物Ⅱ	IC₅₀（μM）
				Ⅰa	36.75	Ⅱa	38.98
Ⅰb	36.40	Ⅱb	37.46
				Ⅰc	35.90	Ⅱc	37.52
Ⅰd	36.29	Ⅱd	39.66
				Ⅰe	32.51	Ⅱe	33.57
Ⅰf	38.82	Ⅱf	41.28
				Ⅰg	32.35	Ⅱg	35.33
Ⅰh	33.07	Ⅱh	37.68

3.结论：

表3所示为化合物(Ⅰa）~（Ⅰh）和结合物（Ⅱa）~（Ⅱh）抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC₅₀值，由表2数据可知，结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)抑制小鼠正常骨髓细胞增殖的IC₅₀值，均明显低于化合物(Ⅰa）~（Ⅰh），说明结合物（Ⅱa）~(Ⅱr)的体外毒性明显小于化合物(Ⅰa）~（Ⅰh）。

Claims

1.具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14结合物，其特征在于：结构式如式(Ⅱ)所示：

在式(Ⅱ)中：

R₁为：甲基、氟、溴和甲氧基中的一种；

R₂为：苯基、4-氟苯基和2-氯苯基中的一种；

mCD14是抗CD14的单克隆抗体。

2.权利要求1所述具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14结合物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

取10mg式(Ⅰ)化合物，溶于0.1mL DMSO中，向上述溶液中依次加入浓度为0.1mol/L的DCC溶液0.1mL和浓度为2μg/mL的mCD14 0.05～0.2mL，然后用生理盐水将上述混合溶液稀释至1mL，37℃反应20～120min，得到式(Ⅱ)结合物；反应方程式为：

其中，式(Ⅰ)化合物中R₁、R₂的定义同式(Ⅱ)结合物；mCD14是抗CD14的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：浓度为2μg/mL的mCD14的用量为0.1mL；37℃反应时间为30min；所述的mCD14是抗CD14的单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的四氢吡啶并吡喃-单克隆抗体CD14 结合物，其特征在于：应用于制备治疗白血病、卵巢癌和肝癌的药物。