CN102884046B - 分离色氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用模拟逆流色谱法或模拟移动床（SMB）色谱法从含水混合物、特别是已经被部分地处理的发酵液中分离色氨酸的方法，以及用于实施该方法的装置。

Description

分离色氨酸的方法
技术领域
本发明涉及使用模拟逆流色谱法或模拟移动床（SMB）色谱法从含水混合物（aqueousmixtureofmatter）、特别是已经被部分地处理的发酵液中分离色氨酸的方法，以及用于实施该方法的装置。
背景技术
色氨酸一般是通过发酵产生的，即使用微生物。这特别适用于其生物学可利用的L型。发酵后，生物质被破坏并分离出去，并对上清液进一步处理。在纯化链的终点通常包括结晶，其中通过从所述上清液（称作母液）分离而作为高纯固体获得色氨酸。上清液中含有饱和的色氨酸和其他盐、其他氨基酸和其他在发酵过程中生成的没有详细定义的有机成分。
如果在发酵后，以不可忽略的浓度存在相似的芳香族氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸），由于物理化学性质类似想要从母液中将其与色氨酸分离是困难的，所以必须频繁地废弃母液。
美国专利5300653描述了用阳离子交换色谱法从水溶液中分离芳香族氨基酸，而没有具体给出限定形式的方法。用其中所描述的方法不能分离两种芳族氨基酸：色氨酸和苯丙氨酸。
在Ribeiro等人的出版物BioprocessEngineering12(1995)95-102中描述了在pH8.0通过将色氨酸选择性吸附在各种活性炭和有机聚合物吸附剂上以将色氨酸从脂族氨基酸丝氨酸和吲哚的混合物分离。此外，其使用聚合物XAD-7（Rohm＆Haas公司，费城，美国）。起始原料是丝氨酸和吲哚的溶液，从该溶液使用固定化微生物生产色氨酸。该分离混合物，除了包含这三种物质，不包含任何其他氨基酸或类氨基酸的组分。此外，该混合物的组合物与产自发酵的起始介质不同，不受波动。分离间歇地进行。作为非有机的含水解吸介质，描述了NaOH溶液（0.05M）和盐酸溶液（0.1M）。其中没有提及使用纯水来解吸。色氨酸只能通过加入有机溶剂——例如甲醇或异丙醇——从另一种吸附剂（XAD-4，Rohm＆Haas公司，费城，美国）中解吸出来。
在Wu等人的出版物IndustrialandEngineeringChemistryResearch37(1998)4023-4035中，描述了芳族氨基酸色氨酸和苯丙氨酸于水中的限定的双组分混合物的分离，该分离中没有温度梯度。所使用的吸附剂是PVP树脂（聚-4-乙烯基吡啶，ReillexHP聚合物，VertellusSpecialtiesInc，印第安纳波利斯，美国）。所使用的解吸剂是水。分离使用一个封闭的内部液体环路以与已知的4区模拟移动床方法类似的方式进行。通过所述的限定的双组分混合物使得分离任务被显著简化，因为与通过发酵产生的起始溶液不同，其中不会发生与未限定的其他化合物的副反应。
Doulia等在JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology76(2001)83–89中另行描述了将氨基酸吸附到中性的聚合物吸附剂上。其中发现芳香族氨基酸色氨酸和苯丙氨酸最牢固地结合于两种吸附材料XAD-2和XAD-4（Rohm＆Haas公司，费城，美国）。在溶液中离子强度增加导致吸附增加。然而，没有给出解吸的细节。
EP1106602B1公开了使用模拟逆流色谱的方法从含有L-赖氨酸和其他杂质的溶液中分离碱性氨基酸（L-赖氨酸）。
串联连接的色谱柱填充有强阳离子交换剂。
但是，如果溶液还含有苯丙氨酸和/或酪氨酸则阳离子交换剂不适于分离色氨酸，因为这些物质以一种不相上下的方式与离子交换剂发生相互作用。
在US5071560中描述了将苯丙氨酸选择性吸附于中性聚合物XAD-7上并描述了使用水、醇、酮或酯将其解吸。在该方法中，待吸附的苯丙氨酸被从不与所述吸附剂发生相互作用的其他组分中分离，并通过从吸附剂中解吸而再度分离。使用发酵液，其中除了苯丙氨酸，大体上还含有盐、乳酸、及其它没有更详细限定的氨基酸。
在美国专利2985589（1961）中首次描述了SMB法的基本原理。近年来试验了多种不同的方法变型。概述可见于，例如，Guiochon等人的“FundamentalsofPreparativeandNonlinearChromatography”(AcademicPress2006,NewYork,USA)或Seidel-Morgenstern等人的ChemicalEngineeringandTechnology31(2008)826–837中。
例如，L.C.Keβler等在JournalofChromatographyA1176(2007)69–78中结合抗体和蛋白质的纯化而描述了一种基于通过三个活性区和一个置换区对溶剂组合物（溶剂梯度）进行改变的SMB方法。该方法的一个决定性特征在于通过使用不同的盐浓度来实现不同的相互作用强度。所使用的解吸介质是不同浓度的氯化钠溶液。
发明内容
本发明的目的是提供一种从含水混合物、尤其是从发酵液中结晶色氨酸所形成的母液中分离色氨酸的方法，由此增加色氨酸发酵的产率。
本发明涉及一种从含水混合物、特别是含有其他芳香氨基酸的含水混合物中分离溶解的色氨酸的方法，该方法借助于模拟逆流色谱法或SMB色谱法的变型，其中，在分离部具有色谱柱排列，该色谱柱排列由多于一个串联连接的填充有适于作为吸附剂的有机聚合物的色谱柱构成，该色谱柱排列被细分为多个、优选为3个功能区域，所述方法包括以下步骤：
a)将所述含有溶解的色氨酸的混合物和作为解吸剂的水在不同点连续加料到所述色谱柱排列中，
b)在位于这些加料点之间的点，将所述富含色氨酸的萃取物流，并在位于含有色氨酸的混合物的所述加料点的上游的另外的点，将含有所用的所述混合物中的其他化合物的残液流，分别去除，任选地进一步进行处理，且优选地，
c)对载有来自所述混合物的非解吸的化合物的色谱柱通过萃取所述化合物来进行清洗。
富含意味着，相比于添加的所述混合物而言该萃取物流含有更高纯度的色氨酸。
在一个实施方案中，所述混合物特别为发酵液，所述发酵液在产生色氨酸的微生物的发酵之后产生，所述发酵液除了其他杂质之外，还含有苯丙氨酸和/或酪氨酸，且从所述发酵液优选提前分离所述生物质。
优选地，根据本发明的方法被随后用于结晶，在所述结晶中以高纯度固体形式得到色氨酸，从其分离出上清液（称为母液）。该上清液含有饱和的色氨酸且此外还含有盐、其他的氨基酸（如苯丙氨酸和/或酪氨酸）、以及在发酵过程中产生的且没有更清楚地定义的作为杂质而存在的其他化合物。这种母液，在一个优选的变型中，被通过所要求保护的方法分离成
a)产品流（萃取物），其中主要量的色氨酸存在于母液中，且其同时大大减少了干扰物质，以及
b)废物流（残液），其中存在其他的不期望的母液成分。
图1中示意性地再现了该方法方案。
得到的产品流然后被再度引入到位于结晶步骤上游的发酵液整理（work-up）过程的主要物流中，任选地在此前通过蒸发浓缩而进一步处理。如果使用的流是无细胞发酵溶液，产品流可进一步直接如此处理。从而增加通过发酵生产色氨酸的收率。这是本发明的一部分。
本发明的方法也可以代替所述结晶。
所述的分离使用表征为具有中等极性的有机聚合物来进行。如在本发明中所示，这种材料能够从芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸中几乎完全地分离色氨酸，同时极大地耗尽其他杂质。这些物质也包括，特别地，UV活性的副产品（“紫外光副产品”），其在一个如欧洲药典6.3（EuropeanPharmacopoeia6.3）中明确说明的杂质标准分析方法中无论是色氨酸之前（“UV-BP前”）或色氨酸之后（“UV-BP后”）洗脱。
合适的吸附剂特别是非离子聚合物吸附剂，其以如下的方式可逆吸附色氨酸，即其与色氨酸之间的相互作用强于与杂质的相互作用。相对强地被保留的色氨酸在优选的温度范围20至约80℃下可以用水再次解吸色氨酸，其中较高的温度导致较快的解吸从而导致较低的色氨酸保留。根据本发明进行的分离步骤中，大多数同样包含在所使用的发酵液中的有机杂质——例如，源自微生物的蛋白片段或副产物（如苯丙氨酸或酪氨酸）——以如下方式不与吸附剂发生相互作用或相比于色氨酸而言与吸附剂发生弱得多的相互作用，即可以在流经液或残液中发现它们。少部分杂质同样被吸附且在用水解吸时仍然附着在吸附剂上。其在接下来的使用碱性或酸性溶液的清洗步骤中被解吸。随后，将由此清洗的色谱柱再度连接到分离过程中。合适的吸附剂包括选自含有丙烯酸/甲基丙烯酸基团的材料的聚合物和聚苯乙烯基聚合物。
优选的吸附剂是丙烯酸类聚合物，例如，XAD7、（Rohm＆Haas公司）或（Diaion）。
特别合适的吸附剂包括如下特点：
a)后述物质的主链：丙烯酸酯（优选甲基丙烯酸酯）、丙烯酸和它们的衍生物
b)脂族交联，优选由多官能单体产生的脂族交联
c)由上述2个特性所产生的偶极矩，该偶极矩高于ST-DVB基材料的偶极矩
d)大网状孔结构
e)适当的高表面积
f)不存在通过离子交换的相互作用。
所述分离系统没有负载有机溶剂，因为根据本发明仅有水（特别是去离子水）是分离所需的，所述水在优选为60至70°C的温度下加入。这使得处理程序简单且避免引入额外的异物。使用如图1中所示的“模拟移动床”方法的变型来利用装置进行实施。
使用市场上可以买到的阀门构件将所述色谱柱彼此连接，并在一个实施方式中，在满足一定时间（“切换时间”）后通过使用该环路而同时进行流通。在本发明的情况下，通过一个来自Knauer（KnauerWissenschaftlicheGmbH，柏林，德国）的中央换向阀来实现。然而，该方法也可以使用其他的阀构件来实现，例如，使用适当连接的双向阀。在此方法中的固体逆流通过在加料和出口处的位置变化来模拟。在这种情况下，根据美国专利6136198还可能有加料和出口之间的非同步的其他连接。其他可能性是顺序进行在下文中描述的步骤，比如根据顺序式SMB原理（S.Baudouin和X.Lancrenon,IndustriesAlimentairesetAgricoles,120,2003,第42-48页）。原则上，本发明方法的基本原理可以适用于已知的所有连续和不连续色谱法的变型，从而赋予这些色谱法以新功能。
在SMB操作期间，所述液体流通过填充有吸附剂的多个固定床色谱柱。根据本发明的装置经由连续加入或除去加料、解吸剂、萃取物和残液流而被细分为三个功能区域，如在图1中示出。在这种情况下，这些区域中的每个单独的区域采用特定的分离或整理功能。当采用待分离且没有准确定义的混合物时，使用开放式的液体环路（“开环”）对于本发明的目的是有利的。在每种情况下，每个功能区域含有一个至多个色谱柱。
此外，优选地通过添加第四区域（其是残液排出点的上游），也可以实施封闭的液体环路。
在优选开放的根据本发明的SMB法操作中，通常存在通过如下平衡方程而相互关联的三个内部（QI、QII和QIII）和四个外部（(QFeed、QDes、QEx和QRa）物质流速
QI=QDes
QII=QI–QEx
QIII=QII+QFeed=QRa。
为了设立工作点，质量流速或体积流速以及还有循环时间ts必须通过如下方式进行限定，即分离任务得以解决，从而实现与预设的产品单元相符的经济上的最佳操作。在这种情况下，循环时间ts确定表观固体逆流的“速度”，从而决定性地确定分离的成功。物流的建立可以根据现有技术通过不同方法来实施，例如Guiochon等在“FundamentalsofPreparativeandNonlinearChromatography”(AcademicPress2006,NewYork,USA)中所描述的。
为了从污染物的混合部分分离色氨酸而利用SMB过程中产生的逆流。其基本原则在于分别使得用于将色氨酸和所述污染物的混合部分（“中性废物”）导向两个不同出口（如图1）的化合物具有不同的迁移率。从标示为“萃取物”的出口在整个过程中可以取出含色氨酸的产品流，并除去干扰物质和标示为“残液”的物流。此外，通过“解吸剂”入口进行控温水的连续加入。分离的成功取决于加料和出口的流速和切换时间的适当选择。
根据本发明，在由三个区域组成的分离部维持温度梯度。控温水的加料在通常高于待分离溶液（分离混合物）10至40°C的温度下进行并通过加料入口被添加。证明了至少60°C的解吸剂加料温度以及45°C的分离混合物的温度是有利的。
用作解吸剂的水优选为完全脱盐的。然而，也可以使用具有盐含量优选为0.01至10重量％、特别是0.01至3重量％的水。在这些条件下也分离出色氨酸。然而，在这种情况下，必须接受该萃取物流载有该盐。
使用的含水混合物（尤其是溶液）中含有0.1至39g/l、优选0.5至38g/l、特别优选为10至18g/l的色氨酸。
含量特别取决于母液或其他非纯化色氨酸溶液是否被整理和这些物质所存在时的pH值。
所使用的混合物或溶液的pH值的范围从2至9，尤其为2.5至7，特别为5.8。
在根据本发明的方法中，与所述分离方法相平行地，那些在分离的常规通路中所不需要的色谱柱在清洗部（“清洗部件”）用各种试剂进行处理，以从吸附剂去除强烈吸附于其上且也不易溶解的杂质。
用于该目的的色谱柱首先用合适的碱性含水清洗剂进行处理。合适的清洗剂，不限于此，特别为浓度0.05至1M的氢氧化钠溶液。此外，还可以使用其他溶液，该其他溶液根据现有技术能够使吸附剂从强烈附着的杂质中释放。作为例示，不限制于此，此处可以列举出可与水混溶的有机溶剂，例如，乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇。
在一个另外的平行步骤中，将已经用第一清洗剂处理的色谱柱通过适当的介质进行冲洗。其特别为脱盐水，但也可以使用其他具有缓冲作用的含水溶液。在合适的清洗剂的情况下，第二清洗之前的冲洗步骤也可以被省去。
在一个另外的平行步骤中，使经过所述第一清洗剂处理并任选地被冲洗的色谱柱与第二清洗介质接触。此处，特别合适的清洗介质是酸性水溶液，例如0.01至0.1、特别为0.05M的硫酸。此外，也可以使用其他的清洗介质，该清洗介质根据现有技术在中性或碱性环境中能够更好地溶解微溶物质。
在一个另外的平行步骤中，将已经用所述两种清洗剂处理的色谱柱被再次或首次用适当的含水介质冲洗。其特别为脱盐水，但也可用其他的水溶液。
在本发明的一个优选方式中，所有的清洗步骤连续进行且与所述正在进行的分离平行进行。
在另外的实施方式中，个别的部分步骤可以省略。
在另外的实施方式中，所有或仅选择的清洗步骤也可以以与所述分离相独立的方式进行。因此，例如可以如下方式进行清洗，即仅以每天一次的节奏，或以与限定的分离的运行时间相关联的节奏来进行。
本发明还涉及一种用于借助于模拟逆流色谱法或SMB色谱法从含水混合物中分离所需有机化合物的装置，其具有一个由多于一个串联连接的填充有吸附剂的色谱柱构成的色谱柱环路，该色谱柱环路被细分为执行如下任务的三个功能区域：
添加原料流，
取出洗脱液流，
取出残液流，
添加解吸剂，
并且其中，在区域I和III之间通过解吸剂和加料的添加温度的不同而建立一个10至40°C、特别为15至25°C的根据图1的温度梯度。温度梯度促进了分离并降低了解吸剂的消耗。但这并不是分离成功的必要条件。
此结构与已知装置的不同之处在于，在分离部色谱柱通过开放的液体环路和温度梯度被排列成三区排列，且该系统部件与清洗部（“清洗部件”）相连，所述清洗部含有填充有相同的吸附剂的色谱柱，该色谱柱与那些来自分离部的色谱柱交替地通过除去附着的杂质来清洗。
所述区域中的色谱柱数通常在多于1个至32个之间，特别为16个。每个区域包含至少一个色谱柱。其总数和在整个区域中的分布可，对应于温度、色氨酸浓度、所需的迁移率和产品纯度，通过标准实验来确定。色谱柱的数目另外还受方法步骤的类型以及SMB法的实施影响。
使用根据本发明的方法，在实验室的实验中能够以色氨酸浓度为9至22g/kg母液且纯度为7至15%（基于总干质量）的母液为原料，实现产物流平均纯度大于85％、平均色氨酸产率优于85％且在萃取物中色氨酸的浓度为4至5g/kg。
因此如下是可能的，即以纯化的形式以高的百分比分离出存在于母液中的量的色氨酸，并将其以经济的方式再循环到发酵液整理过程中来提高总收率。
附图说明
图1示意性给出了根据本发明使用的SMB方法的示意性结构和色谱柱的排列。
该排列被分为分离部和清洗部。
在分离部中，例如，在60°C下添加解吸剂流QDes并在45°C下添加待分离的含水混合物QFeed，并排出所述残液QRa和所述萃取物QEx，在该萃取物QEx中色氨酸以分离的形式存在。
在清洗部中，例如在位置A和B，加入水，且在位置B加入0.05M的硫酸，并在位置D添加0.5M的NaOH。
在通过所述待清洗的色谱柱之后，在位置E处排出经使用的硫酸，并且在位置F处排出更轻微附着的水溶性的杂质的溶液，在位置G处排出经使用的NaOH，并在位置H排出强烈附着的杂质的溶液（CIP=CleaningInPlace，原位清洗）。
具体实施方式
实施例
1.方法参数
所使用的吸附剂:AmberliteXAD-7HP(Rohm&Haas)
色谱柱尺寸(dxL):1.5×15cm
SMB系统:KnauerCSEP916(KnauerWissenschaftliche
GmbH,Berlin,Germany)
泵:Watson-MarlowU101(Wilmington,MA,USA)
待分离混合物:结晶母液：
材料 浓度范围[g/kg]
色氨酸 12–22
酪氨酸 1.2–2.1
苯丙氨酸 1.1–4.8
其他副产物 220-260
其他参数与所述参数是相互独立的，例如，所述切换时间为8分钟和14分钟之间。但是，没有任何理由限于此。在实验室系统中由所使用的蠕动泵限制的所采用的流速在0.07和0.33公斤/小时之间，但不限于此。此外，还可以使用任何类型的泵，只要该泵能够提供待实现的吞吐量所需流速以保证分离。
所使用的温度为室温（25℃）至60℃，解吸剂的温度为至少60℃但不高于80℃，以及残液流和色谱柱的温度为45℃被证明是有利的。
2.使用例:
2.1吸附行为的测定
在一系列测量中，使用1节中所描述的色谱柱之一对色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的吸附和解吸行为进行了研究。出于该目的，使其中注有100μL的样品的水流流过色谱柱，在出口处检测所述氨基酸的流出时间。发现了在所述芳族氨基酸中色氨酸在中性、微酸性、以及酸性环境中最强烈地保留。在色氨酸的情况下温度升高导致保留时间的缩短。
色氨酸在pH5.9的保留时间（以分钟计）
45°C 60°C
5g/kg 37.3 31.9
10g/kg 37.1 31.1
17g/kg - 33.5
苯丙氨酸在pH5.9的保留时间
45°C 60°C
5g/kg 15.6 15.3
10g/kg 15.2 15.1
酪氨酸的保留时间与苯丙氨酸的保留时间处于相同水平。在pH2.5、45°C以及浓度10g/kg时,色氨酸的保留时间是39.1分钟，而苯丙氨酸在相同条件下的保留时间是15.8分钟。因此即使在酸性pH值下也可以进行分离。
2.2第一SMB实验活动
此处，实验性检测了三个工作点。所使用的进料是不同批次的含色氨酸的工艺母液以及1节中描述的溶液。条件是：
QDes QFeed QEx QRa tS
工作点1 5.49g/min 1.18g/min 3.21g/min 3.47g/min 14.0min
工作点2 5.74g/min 1.26g/min 3.30g/min 3.69g/min 12.9min
工作点3 5.59g/min 1.27g/min 3.26g/min 3.60g/min 12.75min
解吸剂的温度为60℃，所述色谱柱和其他溶液的温度为45℃。实验的结果是：
2.312天实验
在进一步的活动中，对长期稳定性进行了评价。在12天的整个实验时间期内，方法以如下参数进行：
所使用的进料是来自色氨酸结晶的母液。在工艺过程中，可以达到平均纯度89.3％（基于总的干质量）和90.4％的产率（基于所使用色氨酸质量）。苯丙氨酸和酪氨酸的浓度可以分别降低为平均0.002和0.001g/l。能够成功地再循环至色氨酸结晶，且没有表现出不利影响。

Claims (10)

1.使用模拟逆流色谱法或SMB色谱法从含水混合物中分离色氨酸的方法，其中，在分离部具有色谱柱排列，所述色谱柱排列由多于一个串联连接的填充有适用作吸附剂的非离子型有机聚合物的色谱柱构成，其中所述色谱柱排列被细分成多个功能区域，所述方法包括以下步骤：
a)将所述含有色氨酸的混合物和作为解吸剂的水在不同点连续加料到所述色谱柱排列中，
b)在位于这些加料点之间的点将所述富含色氨酸的萃取物流，并在位于含有色氨酸的混合物的所述加料点的上游的另外的点将含有所用的所述混合物中的其他化合物的残液流，分别去除，所述萃取物流任选地进行进一步处理，
其中，所述含有色氨酸的混合物除了含有色氨酸还含有苯丙氨酸和/或酪氨酸，并且
所使用的含有色氨酸的混合物是从发酵液中结晶色氨酸所形成的母液，
所述含有色氨酸的混合物含有浓度为10至39g/l的色氨酸，
所述含有色氨酸的混合物的pH为2.5至9，
在温度20至98℃将水加料至所述色谱柱排列，
在解吸剂引入区与残液去除区之间建立了温度梯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对载有来自所述混合物的非解吸的化合物的色谱柱通过萃取所述化合物来进行清洗。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，使用选自含有丙烯酸/甲基丙烯酸基团的材料的聚合物和聚苯乙烯基聚合物的非离子型有机聚合物作为吸附剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述分离连续进行。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述分离半连续进行。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，与分离色氨酸平行地，在清洗部对从所述分离部更换下来的所述色谱柱，根据循环时间，随后通过解吸化合物进行处理。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在清洗部，所述吸附剂通过包含以下步骤的方法进行处理：
a)用于该目的的色谱柱首先通过合适的碱性含水清洗剂进行处理，任选结合
b)在另外的平行步骤中，任选将经根据a)处理的色谱柱用选自脱盐的水的含水介质或具有缓冲作用的水溶液进行冲洗，
c)在另外的平行步骤中，使经根据a)和b)处理的色谱柱与第二含水清洗介质接触，其中所述第二含水清洗介质是酸性水溶液，和
d)在另外的平行步骤中，将所述经处理的色谱柱任选地用选自脱盐的水的含水介质进行冲洗，或者用可以用作缓冲剂的水溶液进行冲洗。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，含有所述色氨酸的所述萃取物流在所述色氨酸从其中结晶之前被加入到由发酵获得的含有色氨酸的含水混合物中。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，权利要求7所述的所有或一部分清洗步骤以与所述分离相独立的既定节奏进行。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤a)中，所述清洗剂是浓度0.05至1M的氢氧化钠溶液；并且在步骤c)中，所述第二含水清洗介质是0.01至0.05M的硫酸。
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