CN102876795A - 高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法 - Google Patents

Abstract

高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法，涉及基因突变的检测，提供高选择性基因突变检测方法，所述高选择性基因突变检测方法包括：根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，用所述上游引物与下游引物进行PCR扩增并检测PCR扩增产物，从而获知目标基因突变位点。所述高选择性基因突变检测引物包括上游引物与下游引物，其中，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。本发明设计了高选择性基因突变检测引物，通过抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。

Description

高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法

技术领域

本发明涉及基因突变的检测，特别涉及高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法。

 

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。目前市面上针对基因检测的方法有许多。但是在较高的野生型模板的背景下，针对较低含量的基因突变的检测能力有限，因此针对基因稀有突变的检测还存在诸多的挑战。

基因稀有突变，顾名思义指的是存在大于量野生基因序列背景中的极为稀少突变基因序列。在临床案例中，癌症初期或是治疗后病人血液中含有少量的肿瘤突变DNA；孕妇外周血含有少量的胎儿DNA等，这些情况都属于稀有突变。许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所提的DNA也是带有大量野生型DNA，同样需要采用稀有突变的检测方法。因此，基因稀有突变检测在疾病防治医疗评价、无创产前筛查等具有十分重要的意义。

目前稀有突变检测方法中，主要有作为“金标准”的基因测序。但是测序灵敏度有限，在大量野生型基因的背景下，测序仅能检测到含有20%的突变，会导致假阴性结果，而且耗时较长。相较于测序，变性高效液相色谱的灵敏度有所提高，但是需要PCR后处理，容易造成实验室污染，容易导致假阳性结果，特异性也有所限制，并且操作步骤繁杂，周期长。基于核酸杂交原理的检测方法，比如Taqman探针，其选择性检测水平与测序法相当。扩增阻碍突变系统（ARMS）是常用的稀有突变检测方法，基于引物3’末端碱基对不同错配碱基的分辨能力特异性选择扩增突变型模板，但由于分辨能力有限导致选择性一般且不同类型的突变差异性较大。2011年Life technology公司开发出一种高选择性突变检测技术—cast PCR技术，该技术基于ARMS技术，采用MGB探针的高特异性进一步提高了反应的选择性。但是MGB探针合成难度较大，费用较高，不利于广泛应用。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的第一目的在于提供高选择性基因突变检测方法，所述高选择性基因突变检测方法可选择性扩增基因突变产物，通过抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。

本发明的第二目的在于提供高选择性基因突变检测引物。

本发明的第三目的在于提供高选择性基因突变检测引物设计方法。

所述高选择性基因突变检测方法包括：根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，用所述上游引物与下游引物进行PCR扩增并检测PCR扩增产物，从而检测目标基因突变位点。

所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。

所述上游引物更包括特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。

所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。

所述PCR扩增可采用实时荧光PCR扩增并通过探针实时检测PCR扩增产物。

所述高选择性基因突变检测引物包括上游引物与下游引物，其中，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。所述上游引物更包括一特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。

所述高选择性基因突变检测引物设计方法包括：根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，在上游引物设计标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。所述上游引物更包括一特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。

本发明设计了高选择性基因突变检测引物，通过抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。本发明中的高选择性基因突变检测方法具有高特异性，针对突变型模板设计的引物对可以耐受5000拷贝甚至更高拷贝数的野生型模板。同时，本发明可检测个位数拷贝的突变型模板，具有很高的灵敏度。本发明中检测方法选择性高，可有效检出突变含量为1/1000的模板。本发明成本低，仅需要一对引物即可实现选择性扩增。

附图说明

图1为本发明技术方案原理图。在图1中，1、2为区域1和区域2，分别为上游引物的标签序列与特异杂交序列所在区域，3为野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置，4、7为基因组模板序列，8为双链DNA，6为下游引物，1’为互补链3端序列，5为互补序列，GC为野生型基因位点，GA为突变的基因位点；

图2A为野生型模板梯度稀释检测结果图，在图2A中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，野生型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝；

图2B为突变型模板梯度稀释检测结果图，在图2B中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1、2、3、4分别为突变型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝时的检测曲线；

图3为梯度稀释突变型模板与野生型模板掺入实验结果图。在图3中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1、2、3、4分别为突变型与野生型比例分别为1:1、1:10、1:100、1:1000时的检测曲线；

图4A为突变型模板梯度稀释检测结果图，在图4A中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1、2、3、4分别为突变型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝时的检测曲线；

图4B为野生型模板梯度稀释检测结果图，在图2B中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，野生型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝；

图5为梯度稀释突变型模板与野生型模板掺入实验结果图。在图5中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1、2、3、4分别为突变型与野生型比例分别为1:1、1:10、1:100、1:1000时的检测曲线。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的技术方案。

如图1所示，针对待检测的目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物。上游引物包括区域1和区域2，区域1为标签序列，与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置（简称为延伸产物序列）3反向互补，区域2为特异杂交序列，与基因组模板序列4互补杂交引导扩增，下游引物6与基因组模板序列7互补杂交引导扩增。基因组模板序列4基因组模板序列7均来自解链的双链DNA 8。上游引物在扩增的前两个循环无差别的扩增野生型模板及突变型模板，第三个循环开始，上游引物区域1的标签序列在退火阶段与其延伸产物序列3形成内部颈环结构，野生型模板中，其互补链3端序列1’与序列5完全互补杂交形成颈环结构，该3端以自身序列为模板延伸下去形成非常稳定的二级结构，该产物在之后的循环中不能被扩增，其中颈部（区域1）长度为6-18nt，形成二级结构的Tm值为60℃-75℃，环部长度为：25-60nt；突变型模板中，其互补链3端序列1’与序列5仍可杂交形成颈环 ，但3端第一个碱基与突变位点碱基不匹配(如图1中，GC突变为GA)，不能延伸形成稳定的二级结构。因此，突变型模板扩增产物可持续被有效扩增，从而达到抑制野生型扩增，富集突变产物的目的。

实施例1

选择SNP(rs13182883)为研究对象，其基因型A为野生型，基因型G为突变型，设计相应的引物和探针如下：

引物F：TGAGGATTTGCTGGCCTGCAGTGAGCATT

引物R：CTGACAATCCTTGGTCTGCT

检测探针：FAM-GAAGAAAGTAACGGAGAGCCTG-BHQ

为了考察该方法的特异性，10倍梯度稀释纯合野生的模板1，得到浓度分别为1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的野生型模板；为了考察该方法灵敏度，10倍梯度稀释纯合突变的模板2，得到浓度分别为1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的突变型模板。

25μL PCR反应体系内含5μL人基因组模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH4）2SO₄，0.01% Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U 热启动Taq酶，3.5 mmol/L Mg2+，0.2 μmol/L检测探针，0.04μmol/L 上游引物，0.4 μmol/下游引物。PCR反应程序为：95℃ 3分钟；95℃ 15秒，52℃ 25秒，72℃ 20秒，50个循环；52℃退火阶段采集荧光信号。

图2A显示结果为：梯度稀释的野生型模板均未出现扩增曲线，而同一次实验的梯度稀释的突变型模板出现梯度扩增曲线，其Ct值（每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）随着模板量的减少而变大，无模板的阴性质控未出现扩增曲线。该体系中的引物理论上应选择性扩增突变型模板，抑制野生型模板的扩增，实验结果与理论推测较一致，说明该技术具有较高的特异性，即野生型模板的扩增被有效抑制，突变型的模板扩增良好；图2B显示该技术可以最低检测到个位数拷贝的突变型模板，体现较高的灵敏度。  

实施例2

模拟稀有突变型模板检测的掺入实验如下：稀释一组浓度分别为2000拷贝/μL、200拷贝/μL、20拷贝/μL、2拷贝/μL的突变型模板，该组突变型模板分别掺入等体积的浓度为2000拷贝/μL野生型模板中，得到突变型与野生型比例分别为1:1、1:10、1:100、1:1000的模板。

25μL PCR反应体系内含5μL人基因组模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH4）2SO₄，0.01% Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U 热启动Taq酶，3.5 mmol/L Mg2+，0.2 μmol/L检测探针，0.04μmol/L 上游引物，0.4 μmol/下游引物。PCR反应程序为：95℃ 3分钟；95℃ 15秒，52℃ 25秒，72℃ 20秒，50个循环；52℃退火阶段采集荧光信号。

图3显示四组掺入的模板扩增曲线良好，呈现一定的梯度，其线性关系良好，无模板的阴性质控未出现扩增曲线，该模拟实验说明本技术方案可以检测到突变型与野生型比例为1:1000的模板，且仍有潜力实现更高的选择性。

实施例3

选择K-ras基因第12密码子基因突变为研究对象，该密码子野生型为GGT，突变型为CGT，根据实验需要合成基因序列如下：

野生型模板：

TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTTATAATAAAAATAATGAAAATGTGACTATATTAGAACATGTCACACATAAGGTTAATACACTATCAAATACTCCACCAGTACCTTTTAATA

突变型模板：

TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACGAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTTATAATAAAAATAATGAAAATGTGACTATATTAGAACATGTCACACATAAGGTTAATACACTATCAAATACTCCACCAGTACCTTTTAATA

设计引物、探针序列如下：

上游引物：GGTGGCGTAGGTATCGTCAAGGCACTCTTGC

下游引物：GGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGT

检测探针：FAM-CTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTC-BHQ

10倍梯度稀释纯合野生型模板3，得到浓度分别为1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的野生型模板；10倍梯度稀释纯合突变的模板4，得到浓度分别为1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的突变型模板，以此进一步验证该技术的特异性和灵敏度。

25μL PCR反应体系内含5μL人基因组模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH4）2SO₄，0.01% Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U 热启动Taq酶，3mmol/L Mg2+，0.25 μmol/L检测探针，0.04μmol/L 上游引物，0.4 μmol/下游引物。PCR反应程序为：95℃ 3分钟；95℃ 15秒，55℃ 25秒，72℃ 20秒，50个循环；55℃退火阶段采集荧光信号。

图4A显示结果为：梯度稀释的野生型模板均未出现扩增曲线，而同一次实验的梯度稀释的突变型模板出现梯度扩增曲线，其Ct值随着模板量的减少而变大，无模板的阴性质控未出现扩增曲线。该体系中的引物理论上应选择性扩增突变型模板，抑制野生型模板的扩增，实验结果与理论推测较一致，再次体现该技术具有较高的特异性；图4B显示该技术可以最低检测到个位数拷贝的突变型模板，体现较高的灵敏度。  

实施例4

模拟稀有突变模板检测的掺入实验如下：稀释一组浓度分别为2000拷贝/μL、200拷贝/μL、20拷贝/μL、2拷贝/μL的K-ras突变型模板，该组突变型模板分别掺入等体积的浓度为2000拷贝/μL的K-ras野生型模板中，得到突变型与野生型比例分别为1:1、1:10、1:100、1:1000的模板。

25μL PCR反应体系内含5μL人基因组模板，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20 mmol/L（NH4）2SO₄，0.01% Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U 热启动Taq酶，3mmol/L Mg2+，0.25 μmol/L检测探针，0.04μmol/L 上游引物，0.4 μmol/下游引物。PCR反应程序为：95℃ 3分钟；95℃ 15秒，55℃ 25秒，72℃ 20秒，50个循环；55℃退火阶段采集荧光信号。

图5显示四组掺入的模板扩增曲线良好，呈现一定的梯度，无模板的阴性质控未出现扩增曲线，该模拟实验再次说明本技术方案可以检测到突变型与野生型比例为1:1000的模板，且仍有潜力实现更高的选择性。

本发明的关键在于：野生型模板的上游引物中的标签序列与上游引物扩增产物的部分序列形成内部颈环结构，该颈环结构在扩增过程中形成非常稳定的二级结构，阻止野生型模板的扩增，并实现对模板中稀有突变的富集，从而高选择性地检测稀有突变。以上只是本发明技术方案的具体举例，只要引物符合上述结构，本发明同样适应于除实施例外的其它基因突变的检测，因此，本发明实施例不用于限制本发明的保护范围。

序列表

<110>  厦门基科生物科技有限公司

<120>  高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法

<130>  2012

<160>  8    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tgaggatttg ctggcctgca gtgagcatt                                       29

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctgacaatcc ttggtctgct                                                 20

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gaagaaagta acggagagcc tg                                             22

 

 

<210>  4

<211>  180

<212>  DNA

<213>  K-ras

 

<400>  4

tctgaattag ctgtatcgtc aaggcactct tgcctacgcc accagctcca actaccacaa             60

gtttatattc agtcattttc agcaggcctt ataataaaaa taatgaaaat gtgactatat               120

tagaacatgt cacacataag gttaatacac tatcaaatac tccaccagta ccttttaata              180

 

<210>  5

<211>  180

<212>  DNA

<213>  K-ras

 

<400>  5

tctgaattag ctgtatcgtc aaggcactct tgcctacgcc acgagctcca actaccacaa            60

gtttatattc agtcattttc agcaggcctt ataataaaaa taatgaaaat gtgactatat               120

tagaacatgt cacacataag gttaatacac tatcaaatac tccaccagta ccttttaata              180

 

 

<210>  6

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ggtggcgtag gtatcgtcaa ggcactcttg c                                    31

 

<210>  7

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ggtggcgtag gtatcgtcaa ggcactcttg c                                    31

 

<210>  8

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

ctccaactac cacaagttta tattcagtc                                       29

Claims (10)

1.高选择性基因突变检测方法，其特征在于，所述高选择性基因突变检测方法包括：根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补；用所述上游引物与下游引物进行PCR扩增并检测PCR扩增产物，从而检测目标基因突变位点。

2.如权利要求1所述的高选择性基因突变检测方法，其特征在于，所述上游引物更包括特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。

3.如权利要求1所述的高选择性基因突变检测方法，其特征在于，所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。

4.如权利要求1所述的高选择性基因突变检测方法，其特征在于，所述PCR扩增采用实时荧光PCR扩增并通过探针实时检测PCR扩增产物。

5.高选择性基因突变检测引物，包括上游引物与下游引物，其特征在于，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。

6.如权利要求5所述的高选择性基因突变检测引物，其特征在于，所述上游引物更包括一特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。

7.如权利要求5所述的高选择性基因突变检测引物，其特征在于，所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。

8.高选择性基因突变检测引物设计方法，其特征在于，包括根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，在上游引物设计标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。

9.如权利要求8所述的高选择性基因突变检测引物设计方法，其特征在于，所述上游引物更包括一特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。

10.如权利要求8所述的高选择性基因突变检测引物设计方法，其特征在于，所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。

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