CN102866148A - 钾离子浓度检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及钾离子浓度的检测方法。利用钾离子调控可形成G-四链体DNA结构转变的特性以及菁染料超分子聚集体识别G-四链体结构转变的特性，将待测样品加入可形成G-四链体的DNA与菁染料混合溶液，根据溶液的颜色半定量地判断样品中的钾离子浓度范围。该方法实现了钾离子浓度的可视化检测，可开发成检测试纸。试剂成分简单，反应过程简单、不需要特殊或额外仪器，检测成本低廉，便于行业内推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种钾离子浓度检测方法。
背景技术
人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重要指标。尿液、血清中钾离子的含量水平在临床上可用了诊断一些肾脏、心脏等方面的疾病。
正常情况下，人体的钾离子浓度有一个合理的参考范围，如血清中：3.5～5.5mmol/L；尿液中25～125mmol/24h。当钾离子高于参考值，表现出高钾症，其原因主要有：急性肾功能衰竭、严重溶血或组织损伤、急性酸中毒或组织缺氧、肾上腺皮质功能减退、醛固酮缺乏、长期应用利尿剂、家族性高血钾等。血清钾高还可引起严重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性应激紊乱，以及特异的心电图改变。血清钾高于7mmol/L时，就有这些现象出现，超过10mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而导致死亡。反之当钾的摄入量不足、钾丢失严重、肾脏疾病转入多尿期等情况时则会出现低钾症。
现有技术中测定钾离子浓度的方法主要有：中子活化法、同位素稀释质谱法、化学测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。
（1）火焰光度法：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。
通常采用的定量方法有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内标，测定的是锂／钾电流的比值，而不是单独钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。
（2）离子选择电极法（ISE法）：在专用仪器上进行血清和尿液的钾、钠离子测定。因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的 方法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是：离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分采用间接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。
目前主要的电极种类有：玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K+电极。这些电极都具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化，且价格昂贵。
（3）化学测定法：目前K+的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。
（4）酶法：酶法测定钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶Ⅰ的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。
（5）原子分光光度法也可用于检测血清中钾、钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
发明内容
本发明的目的：提供一种利用菁染料超分子与鸟嘌呤四链体（G-四链体）作用体系检测钾离子浓度的新方法，以及应用该方法配制而成的钾离子浓度检测试剂盒。利用该试剂盒中的试剂，可通过溶液的颜色判断样品中的钾离子浓度范围，现可视化检测。
本发明的总体技术路线为：通过加入钾离子来调控G-四链体结构的形成或构象转变，随之菁染料识别G-四链体结构的变化，从而反映出钾离子的浓度水平。具体为：在没有钠离子及其他金属阳离子存在的环境下，钾离子促使单链的DNA序列转变为G-四链体结构，随着G-四链体结构的生成，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上发生改变，达到肉眼观测；或者在钠离子存在的环境下，DNA序列形成反平行结构G-四链体，加入钾离子反平行G-四链体则发生构象转变，随着G-四链体构象转变，菁染料的聚集形态发生变化，从而在颜色上发生明显的变化，从而半定量地判断样品中钾离子浓度范围。
本发明的第一方面提供一种检测液体样品中钾离子浓度范围的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用pH6.2～8.2的缓冲溶液以一定的钾离子浓度梯度配制多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G-四链体的DNA分子、相同浓度的钠离子以及相同浓度的菁染料；将配制好的溶液样本作为标准比色样品备用；
（2）在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、菁染料以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、菁染料的浓度以及pH值与步骤（1）中的溶液样本一致，从而得到测试溶液，并记录待测液体样品被稀释的比例；
（3）将测试溶液与步骤（1）中获得的标准比色样品的颜色进行对比，颜色与测试溶液相同的标准比色样品的钾离子浓度与测试溶液的钾离子浓度一致，并通过待测样品的稀释比例计算待测样品的钾离子浓度。
本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钾离子浓度，例如，可以检测人或动物血液、尿液或其他体液中的钾离子浓度。
根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。在本发明的实施方案中，对缓冲液中缓冲剂的浓度并不做特别的限定，但是优选的浓度范围为10～50mmol/L。
根据本发明第一方面的方法，其中所述菁染料为下式I的化合物
式I
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构， 或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；X1，X2独立地选自碳（C）、氧（O）、硫（S）、硒（Se）或碲（Te）。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中C1-C6的烷基为碳原子数为1-6的直链或支链的烷基，包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基等。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R2和R3与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和环结构或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有氮（N）或硫（S）原子。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中R4和R5与它们所连接的碳原子可以形成5元至7元的饱和或不饱和环结构，所述环结构可以含或不含有N或S原子。
根据本发明第一方面或第二方面的方法，其中Y优选为氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
根据本发明第一方面所述的方法，其中可以通过使用可溶性钾盐如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等来配制所述多个溶液样本，各溶液样本中钾离子浓度的范围优选在0至300mmol/L的范围，进一步优选在0至200mmol/L的范围，更进一步优选在0至150mmol/L的范围，最优选在20至100mmol/L的范围，其中所述可溶性钾盐的非限定性实例包括，氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾或硝酸钾等。
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述多个溶液样本中钠离子浓度优选控制在人体或动物体中生理浓度范围内，例如0至300mmol/L的范围，优选在40至160mmol/L的范围，钠离子的浓度可以通添加可溶性钠盐或者使用含有钠离子的缓冲液来调节，所述可溶性钠盐的非限定性实例包括，氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠等。
根据本发明第一方面的方法，其中所述菁染料在溶液样本中的浓度在3至30mol/L的范围，优选在3至20μmol/L，所述能够形成G-四链体的DNA分子在溶液样本中的浓度在3至50μmol/L的范围，优选在5至30μmol/L的范围，进一步优选在10至20μmol/L的范围。
根据本发明第一方面或第二方面所述的方法，其中所述能够形成G-四链体的DNA分子为分子序列中富含鸟嘌呤的DNA分子，并且优选分子序列中具有“GG”结构的DNA分子。此类DNA分子中，四个鸟嘌呤通过氢键连接可以形成平面四集体，两个以上的平面四集体可以相互堆叠形成立体四链结构，即鸟嘌呤四链体（G-四链体）。这类DNA分子的非限定性实例包括，如TTAGGG、TTAGGGTTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、GGTTGGTGTGGTTGG、TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、TTGGGGTTGGGG、GGGGTTGGGG、GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG，但可形成G-四链体的DNA序列范围不受这些列举所限制。另外，对于本发明中所使用的能够形成G-四链体的DNA分子的长度并没有特殊限制，但是优选6~300个碱基的长度，更优选10~100个碱基的长度，最优选10~30个碱基的长度。
根据本发明第一方面的方法，也可以在步骤（1）中制备的各个标准溶液的颜色中选取若干个有明显差异的颜色制作标准比色卡，由于随着钾离子浓度的升高标准溶液的颜色是逐渐变化的，因此即使测试溶液的颜色与标准比色卡中的颜色不完全相同也可以通过对比颜色的相近程度来判断测试溶液中钾离子浓度的大致范围，从而判断待测样品中钾离子浓度的大致范围。
本发明的第二方面提供一种用于检测溶液中钾离子浓度的试剂盒，所述试剂盒包括：标准比色卡、pH6.2~8.2的缓冲液、可溶性钠盐、能够形成G四链体的DNA分子和菁染料，其中所述标准比色卡中不同的颜色对应不同的钾离子浓度。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中可以通过以下方式来确定所述标准比色卡上的颜色：（i）用pH6.2～8.2的缓冲溶液配制钾离子浓度不同的多个溶液样本，使每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G四链体的DNA分子、相同浓度的钠离子以及相同浓度的菁染料；（ii）按照溶液样本钾离子浓度由低到高的顺序排列，并通过例如数码相机等图像采集手段采集溶液样本的颜色并制作成标准比色卡，比色卡上不同的颜色对应不同的钾离子浓度。
在使用本发明第二方面的试剂盒检测待测样品中钾离子浓度时，在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、菁染料、可溶性钠盐以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、菁染料的浓度、钠离子浓度以及pH值与在确定标准比色卡的颜色时所配制的溶液样本一致，从而得到测试溶液，通过将测试溶液的颜色与标准比色卡上的颜色进行比较来确定测试溶液的钾离子浓度范围，并通过待测样品的稀释倍数获得待测样品的浓度范围。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述缓冲溶液、菁染料和能够形成G四链体的DNA分子如前文所定义。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中在确定标准比色卡上的颜色时，所述菁染料在各溶液样本中的浓度优选在3至30μmol/L的范围，优选在5至20μmol/L的范围；所述DNA在各溶液样本中的浓度在3至50μmol/L的范围，优选在5至30μmol/L的范围，进一步优选在10至20μmol/L的范围。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中可以通过使用可溶性钾盐如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等来配制所述多个溶液样本，各溶液样本中钾离子浓度的范围优选在0至300mmol/L的范围，其中所述可溶性钾盐的非限定性实例包括，氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾或硝酸钾等。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述多个溶液样本中钠离子浓度优选控制在人体或动物体中生理浓度范围内，例如0至300mmol/L的范围，优选在40至160mmol/L的范围，钠离子的浓度可以通添加可溶性钠盐或者使用含有钠离子的缓冲液来调节，所述可溶性钠盐的非限定性实例包括，氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠等。
在本发明的方法和试剂盒中，也可以先将菁染料、DNA等配制成一定浓度的母液，以便在配制标准溶液样本和测试溶液时使用。
本发明的方法和试剂盒的主要优点在于：
1）本发明利用菁染料超分子聚集体特异识别钾离子调控的G-四链体结构，可在生理钠离子浓度下操作而不受影响，对钾离子特异性高；
2）本发明使用菁染料超分子探针，对钾离子调控的G-四链体结构变化十分敏感，伴有聚集形态的改变，同时在紫外吸收光谱中展现出吸收带高达近百纳米的位移，因而产生颜色上的变化，可实现可视检测；
3）本发明所使用的菁染料超分子探针，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉， 便于行业内推广应用；
4）本发明所用试剂成分只有3～4种，只需按比例混合就可检测，操作简单、快捷且成本低廉，该体系在缓冲液环境中操作，不会污染环境。
5）本发明所用试剂成分简单、种类少，相互之间不会产生影响，且稳定性好，可长时间储存，能很好保证应用测试效果；
6）应用本发明提供的检测方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，可用来测定人体和其它动物体内钾离子的含量，也可用来检测水质或土壤等其他样本中的钾离子水平。
7）应用本发明提供的检测方法，根据菁染料聚集体颜色变化的特性，可以开发成试纸的形式，使检测更为简单、便利。
具体实施方式
下面将以具体实施例的方式来更详细地描述本发明，但是应当理解，本发明可以以不同的方式实施，提供这些实施例仅是为了使本说明书充分和完整，以使本领域技术人员能够实施本发明，本发明的范围不应当限定为本文所列的具体实施例。
实施例1
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为5.84mmol/L、尿样2为22.25mmol/L、尿样3为38.17mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有20mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液 （pH8.0）中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入9.1ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液600μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、2、4、8、10、15、20mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~10mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，10~20mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1mL并用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的50%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1的颜色为蓝色，测试溶液2为紫红色，测试溶液3的颜色为粉红色。因此测试溶液1的钾离子浓度在0~10的范围，测试溶液2和测试溶液3的钾离子浓度在10~20的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1的钾离子浓度在0~20的范围，尿样2和尿样3的钾离子浓度在20~40的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例2
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为9.18mmol/L、尿样2为32.43mmol/L、尿样3为49.57mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有40mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH6.2）中，制备浓度为500μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入9.14ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液360μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为0.98mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、5、10、15、20、30、40mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~15mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，15~40mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为粉红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1mL并用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的50%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1的颜色为蓝色，测试溶液2为紫红色、测试溶液3为粉红色。因此测试溶液1的钾离子浓度在0~15的范围，测试溶液2和测试溶液3的钾离子浓度在15~40的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1的钾离子浓度在0~30的范围，尿样2和尿样3的钾离子浓度在30~80的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例3
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为9.82mmol/L、尿样2为20.35mmol/L、尿样3为78.26mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有100mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH7.5）中，制备浓度为500μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液0.4mL，加入4.2ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液0.4mL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为0.5mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、10、20、40、60、80、100mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~60mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，60~100mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1.5mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的75%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1和2的颜色为蓝色，测试溶液3的颜色为紫红色。因此测试溶液1、2、3的钾离子浓度在0~60的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1、2、3的钾离子浓度在0~80的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例4
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为42.58mmol/L、尿样2为70.65mmol/L、尿样3为98.34mmol/L。在本实施 例中使用的能够形成G-四链体的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，所使用的菁染料为下式的化合物
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有160mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH8.2）中，制备浓度为500μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液0.5mL，加入3.5ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液1mL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为0.5mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、20、50、75、100、125、160mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~100mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，100~125mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为粉红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1.5mL并用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的75%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1的颜色为蓝色，测试溶液2和测试溶液3的颜色为紫红色。因此测试溶液1、2、3的钾离子浓度在0~100的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1、2、3的钾离子浓度在0~133的范围，尿样2、3钾离子浓度高于尿样1钾离子浓度。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例5
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如 下：尿样1为5.57mmol/L、尿样2为23.24mmol/L、尿样3为39.16mmol/L，使用的DNA为GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有20mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH7.0）中，制备浓度为200μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液300μL，加入8.5ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液600μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、2、4、8、10、15、20mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~10mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，10~20mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1mL并用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的50%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1的颜色为蓝色，测试溶液2为紫红色，测试溶液3的颜色为粉红色。因此测试溶液1的钾离子浓度在0~10的范围，测试溶液2和测试溶液3的钾离子浓度在10~20的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1的钾离子浓度在0~20的范围，尿样2和尿样3的钾离子浓度在20~40的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例6
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为85.32mmol/L、尿样2为100.54mmol/L、尿样3为126.32mmol/L，使用的DNA为GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有300mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH6.2）中，制备浓度为200μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液1mL，加入7ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液2mL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为600mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到钾离子的浓度分别为0、50、100、150、200、250、300mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~150mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，150~300mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为粉红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1mL并用Tris-Na缓冲液定容至2mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的50%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1、2、3的颜色为蓝色。因此测试溶液1、2、3的钾离子浓度在0~150的范围，通过稀释比例换算可以得出3个尿样的钾离子浓度在0~300的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例7
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为23.52mmol/L、尿样2为45.28mmol/L、尿样3为64.83mmol/L，使用的DNA为GGGGTTGGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有10mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH8.0）中，制备浓度为200μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液0.5mL，加入8.5ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液1mL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为1mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至1.2mL，得到钾离子的浓度分别为0、1、2、4、6、8、10mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~6mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，6~8mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本200μL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的17%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1的颜色为蓝色，测试溶液2和测试溶液3的颜色为粉红色。因此测试溶液1的钾离子浓度在0~6的范围，测试溶液2和测试溶液3的钾离子浓度在6~10的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1的钾离子浓度在0~35的范围，尿样2和尿样3的钾离子浓度在35~59的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
实施例8
本实施例对三个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为22.36mmol/L、尿样2为48.72mmol/L、尿样3为52.38mmol/L，使用的 DNA为GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG，使用的菁染料为下式的化合物：
1）配制标准溶液样本
将一定量的DNA样品溶解于含有50mmol/L NaCl的Tris-HCl（Tris-Na）缓冲液（pH6.2）中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，备用。
取浓度为200μmol/L菁染料的甲醇溶液200μL，加入4.5ml Tris-Na缓冲液,然后再加入DNA溶液300μL混匀。把上述样本平均分成10份，每份样本溶液为0.5mL。
取其中的7个样本，分别加入一定量的浓度为200mmol/L KCl的Tris-Na溶液，然后用Tris-Na缓冲液定容至1.5mL，得到钾离子的浓度分别为0、10、20、30、40、50、60mmol/L的标准样本溶液。标准溶液样本的颜色如下：0~30mmol/L的标准溶液样本的颜色从蓝色逐渐转变为紫红色，30~60mmol/L的标准溶液样本的颜色从紫红色逐渐转变为粉红色。
2）配制测试溶液
另外3个样本中加入待测尿液样本1mL，得到3个测试溶液，每个测试溶液中尿液样本占测试溶液体积的66%。
3）对比分析
将测试溶液的颜色与标准溶液样本的颜色进行比较，结果发现测试溶液1的颜色为蓝色，测试溶液2和测试溶液3的颜色为紫红色。因此测试溶液1的钾离子浓度在0~30的范围，测试溶液2和测试溶液3的钾离子浓度在30~60的范围，通过稀释比例换算可以得出尿样1的钾离子浓度在0~45的范围，尿样2和尿样3的钾离子浓度在45~91的范围。该结果与尿样的实际浓度吻合。
本发明的显著特色之一是：基于钾离子调控DNA构像的变化实现检测，钾离子引起DNA构像变化，DNA构像变化又引起菁染料聚集形态的改变，从而使得溶液颜色或吸收、荧光光谱上发生改变。体系成分简单，反应也简单，钾离子是整个反应的“引发剂”，保证了检测的精确度。
本发明的显著特色之二是：体系本身可带有大量的钠离子，这种情况可保证样本中钠离子所能引起的环境的变化忽略不计。
本发明的显著特色之三是：使用菁染料超分子探针，反应灵敏度高，有颜色变化，可实现肉眼观测。
总之，实验证明本发明的测定方法，可通过溶液颜色的变化，用肉眼判断钾离子浓度水平的高低。此外，本发明提供的钾离子检测试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中钾离子的含量。
虽然已经以具体实施例的方式描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改，这些变化和修改同样包括在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种检测液体样品中钾离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用pH6.2～8.2的缓冲溶液以一定的钾离子浓度梯度配制多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的能够形成G-四链体的DNA分子、相同浓度的钠离子以及相同浓度的菁染料；
（2）在待测液体样品中加入能够形成G-四链体的DNA分子、菁染料以及缓冲液，以使待测液体样品中的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度、菁染料的浓度以及pH值与步骤（1）中的溶液样本一致，从而得到测试溶液，并记录待测液体样品被稀释的比例；
（3）将测试溶液与步骤（1）中获得的标准比色样品的颜色进行对比，颜色与测试溶液相同的标准比色样品的钾离子浓度与测试溶液的钾离子浓度一致，并通过待测样品的稀释比例计算待测样品的钾离子浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述菁染料为式I的化合物，
式I
其中：R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构；R6和R7为C1-C6烷基或者磺酸基取代的C1-C6烷基；Y为反离子，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若R6和R7为烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则无需Y作为反离子；若R6和R7均带有磺酸根，则Y为三乙胺阳离子；X1，X2独立地选自C、O、S、Se或Te。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述C1-C6的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
4.如权利要求2所述的方法，其中R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构。
6.如权利要求2所述的方法，其中Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或磷酸钠缓冲液。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述溶液样本中钾离子浓度在0至300mmol/L的范围，优选在0~100mmol/L的范围，进一步优选在0~10mmol/L的范围，最优选在0~2mmol/L的范围；钠离子浓度在0至200mmol/L的范围，优选在40~160mmol/L的范围；所述菁染料在所述溶液样本中的浓度在5至30μmol/L的范围，优选在5~20μmol/L的范围，所述能够形成G-四链体的DNA分子在溶液样本中的浓度在5~50μmol/L的范围，优选在5至30μmol/L。
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