背景技术
统计资料显示,近几年中老年人死亡病例中,有47%与器官组织纤维化有关,纤维化性疾病已成为导致中老年人死亡和残疾的首要因素。纤维化对许多人来说还比较陌生,其实纤维化通俗地说就是器官的硬化,它会直接导致肺、肝、肾、心血管、脑等重要脏器功能衰竭而致人死亡。专家认为,纤维化性疾病早期无明显症状,极易被疏忽,近年来发病率大幅上升,仅我国就有1.6亿人因高血压导致器官纤维化,中老年人特别是慢性病患者应引起高度警惕。常见的脏器纤维化有肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心肌纤维化。
肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是一种早期以肺泡炎症,后期以大量成纤维细胞(fibroblast,FB)异常增殖转型和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积为主要表现特点的肺间质疾病【GEISER T.Idiopathic pulmonary fibrosis-a disorder of alveola wound repair[J].Swiss Med Wkly,2003,133(29-30):405-11.】。
肺纤维化病理特征是肺泡上皮损伤、成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质的过度沉积,最终导致了肺组织结构的异常重塑。涉及到细胞、细胞因子、细胞外基质(ECM)等因素间的相互作用,是多种因素、多个环节参与的过程。近年来,随着分子生物学技术的发展和改进,人们发现许多细胞因子,炎症介质以及多种细胞都与肺纤维化的发生有关,如转化生长因子(TGF-β)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、白介素-1(IL-1)和白介素-8(IL-8)等。目前,细胞因子在介导炎症及其后的纤维化过程中所起的作用日益受到重视,这些细胞因子之间相互作用,相互协调,形成一个复杂而多变的细胞因子网络,在肺纤维化形成中起着重要的调控作用。
治疗肺纤维化的药物有:1)抑制炎症反应,如糖皮质激素类; 2)抑制ECM合成促进ECM降解,如γ干扰素(IFN-γ);3)细胞因子抑制剂,目前尚在动物实验阶段,未应用于临床;4)复方中药治疗,如复方鳖甲软肝片等。此外还有报道采用基因治疗与移植治疗。
各种原因导致的急、慢性肝损伤进程中由于肝内纤维生成与降解失衡,导致肝脏细胞外基质( ECM)中过多的胶原纤维在肝内沉积而诱发肝纤维化【漆德芳.肝硬化[M].北京:科学技术出版社,2007:107.】。
肝纤维化是各种疾病引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应,是肝硬化的早期可逆阶段,如不及时治疗则会进展成代偿期肝硬化并出现各种终末期肝病并发症,肝硬化及其并发症已经成为全球发病与死亡的主要因素之一,肝纤维化是许多肝病终末期复杂病症的发病基础,肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段。其发病机制从现代生物化学角度来看,肝纤维化是肝脏细胞外基质(ECM)合成增加和(或)降解减少所导致的ECM过度沉积;从细胞生物学角度来看,肝纤维化是产生胶原的肝脏间质细胞(主要是肝星状细胞,HSC)被激活从而发生增生并合成、分泌大量ECM的结果;从分子生物学角度来看,肝纤维化是各种细胞因子所导致的基因表达调节异常,即ECM基因表达增强,降解ECM的酶类基因表达下降。其中, HSC是肝纤维化形成过程中的关键细胞。HSC位于肝窦间隙,生理条件下处于静息状态,可分泌一些细胞因子如肝细胞生长因子(HGF)、内皮细胞生长因子(EGF),它们在维持肝脏结构及通过深入肝窦的伪足调节肝窦血流方面发挥重要作用。当肝窦受到各种病因刺激时,HSC表型和功能均可发生变化。研究发现HSC增殖抑制和凋亡增加会实现肝脏炎症反应减轻和肝纤维化消退。
治疗肝纤维化的药物有:1)抑制肝脏炎症,如糖皮质激素类、TNF-α抗体、内皮素受体A拮抗剂、前列腺素等; 2)抑制ECM合成促进ECM降解,如γ干扰素(IFN-γ);3)抑制HSC活化和增殖促进HSC凋亡,抗氧化剂如维生素E、多烯磷脂酰胆碱、水飞蓟素和S2腺苷蛋氨酸(SAM);4)中药治疗,如扶正化瘀胶囊(片)、复方鳖甲软肝片、安络化纤丸和强肝胶囊等。此外还有报道采用基因治疗与干细胞治疗。
肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应,是多种慢性肾病的共同病理基础与慢性肾病向终末期肾衰竭进展的重要过程【王海燕.肾脏病学.北京:人民卫生出版社,2001:597】。
肾纤维化包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,而肾小管间质的纤维化与慢性肾脏病的预后更密切相关。防止和延缓肾纤维化也就成为防治慢性肾脏病进展的关键。肾纤维化的发生机制是一个非常复杂的慢性病理过程,很多细胞介质和生长因子都直接或间接参与了这一过程,主要有:1)细胞生长因子的作用,包括促纤维化的转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)和起保护作用的肝细胞生长因子(HGF);2)肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化过程的作用,包括表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞、细胞外基质成分如胶原(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)等;3)信号转导通路的作用,包括Smad 依赖性信号转导通路( 主要是Smad2、Smad3 和起负调节作用的Smad7)和非TGF-β依赖的Smad信号转导通路(如ERK/P38MAPK)。
肾纤维化的西药治疗有:1)吡非尼酮,是一种新型抗瘢痕药物,其可阻止甚至逆转细胞外基质(ECM)沉积,在肺间质纤维化、腹膜硬化、心脏纤维化及肾纤维化中已被证实;2)松弛素,是胰岛素生长因子家族的成员;3)肝细胞生长因子;4)骨形态发生蛋白;5)戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂;6)血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂。复方中药治疗有:1)血府逐瘀胶囊;2)肾炎康复片;3)肾炎康复片;4)肾炎康复片。
心肌纤维化是指在心肌的组织结构中胶原纤维过量积聚、其胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著增加【姜秀春,姜秀丽,李树青。心肌纤维化发病机制和防治的研究进展。医学综述,2006 年8 月第12 卷第15 期:931】。
近年来大量研究表明,心肌纤维化可发生于高血压、心肌梗死及心力衰竭等许多心血管疾病。它是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变,是心肌重构的主要表现之一,可致心肌僵硬度增加、心室舒张功能减退、冠状动脉储备下降,甚至引起猝死。心肌纤维化是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果,其形成机制非常复杂,主要有:1) 肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS):血管紧张素Ⅱ(Ang )和醛固酮(ALD) 是RAAS 的主要效应分子,通过不同作用机制参与心肌纤维化的发生;2)内皮素(ET):是一种作用极强的缩血管活性多肽,以自分泌、旁分泌方式调节局部血管紧张度,其作用和AngⅡ有多方面的相似性;3)一氧化氮(NO);4)转化生长因子-β1 (TGF2β1 ):TGF2β1 是一种多功能的蛋白肽,它能增加以胶原为主的间质蛋白质的合成,是诸多因素导致心肌纤维化最后的共同中介之一;5)结缔组织生长因子(CTGF);6)细胞内Ca2+。
治疗心肌纤维化的药物有:1)血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) :ACEI 是目前治疗心肌纤维化的药物中研究最多,结果也较为肯定的一类药物;2)AT1受体阻断剂;3) Ca通道阻滞剂;4)醛固酮拮抗剂;5)中药:强心冲剂、心衰颗粒、天麻钩藤饮、益气活血合剂、参附注射液。
本发明是在中国专利ZL 02146573.8的基础上进行的改进发明,在此全文引用该专利文件记载的内容。中国专利ZL 02146573.8未记载该中药组合物在制备治疗脏器纤维化的药物中的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种中药组合物在制备治疗脏器纤维化的药物中的应用。
本发明药物是运用络病理论研制而成的中成药,由黄芪、人参、丹参等11味中药组成,以益气温阳药为治络强心之本,辅以活血通络药,使气旺血行络通,阻断血瘀络阻,可以有效治疗脏器纤维化。
本发明中药组合物中,作为活性组分的原料药的拉丁名及其加工方法来自《中药大辞典》(1977年7月,第一版,上海科学技术出版社)和《中国药典》(2010年版,中国医药科技出版社)。
本发明中药组合物由如下重量份的原料药制成:
黄芪 150-450份、附子40-120份、人参或党参75-225份、 丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮或南五加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份;
优选地,所述中药组合物由如下重量份的原料药制成:黄芪450份、附子112.5份、人参或党参225份、丹参225份、葶苈子150份、香加皮或南五加皮180份、泽泻225份、玉竹75份、 桂枝90份、 红花90份、 陈皮75份;
或:
黄芪250份、附子112.5份、人参或党参200份、丹参120份、葶苈子135份、香加皮或南五加皮150份、泽泻200份、玉竹60份、桂枝75份、红花75份、陈皮60份。
本发明还提供了所述中药组合物的活性成分由下列步骤制成:
(1)将黄芪、葶苈子、泽泻、人参或党参、香加皮或南五加皮用70%乙醇提取,滤过,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏;
(2)提取桂枝、陈皮的挥发油;提油后的水溶液滤过,收集水溶液滤液,再加水煎煮残渣1小时,滤过,合并水溶液,得提油后水提液;
(3)附子、丹参、玉竹、红花加水煎煮2次,合并提取液,滤过;与步骤(2)所得水提液合并,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30清膏,放冷,搅拌中加入乙醇,至醇浓度70%,静置,滤过,滤液浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏;
(4)将步骤(1)所得清膏与将步骤(3)所得清膏混合,烘干,粉碎,加入步骤(2)所得挥发油,即得。
本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺,例如,范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺,制成药剂学可接受的任意常规剂型,例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂等。
为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,如范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)中各剂型记载的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。
本发明还提供了该中药组合物胶囊剂的制备方法:
(1)按比例称取黄芪、葶苈子、泽泻、人参或党参、香加皮或南五加皮,加入8倍量70%乙醇回流提取2次,第一次3小时,第二次2小时,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏,备用;
(2)按比例称取桂枝、陈皮,提取挥发油;提油后的水溶液滤过,备用,残渣再加8倍量水煎煮1小时,滤过,合并水溶液,得提油后水提液,备用;
(3)按比例称取附子、丹参、玉竹、红花,加水9倍量,煎煮2次,每次2小时,合并提取液,滤过,与步骤(2)所得水提液合并,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30 的清膏,放冷,搅拌中加入乙醇,至醇浓度70%,4℃以下静置24小时,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏,备用;
(4)将步骤(1)所得清膏与将步骤(3)所得清膏混合,65-70℃烘干,粉碎成100目粉,加70%乙醇适量制粒,加入步骤(2)所得挥发油,混匀,装胶囊,即得。
本发明中药组合物的用量,按活性组分原料药总重量计,为4-20克/日,可每日服用一次,优选为分2-4次服用;还优选为6-12克/日,分2-4次服用;更优选为7.59克/日,分3次服用。
本发明中药组合物治疗的脏器纤维化优选为肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化或者心肌纤维化。
实验例1:
为阐明本发明中药组合物治疗肺纤维化的疗效,用按实施例1方法所制得的药物(以下称本发明药物)进行了下列试验。
材料与方法
1.1 造模:SD大鼠,雄,200-220g,48只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。45 mg/kg无巴比妥钠麻醉后气管内注射博来霉素(5mg/kg)进行造模。
1.2 分组:大鼠随机分为:模型组、本发明药物组、阳性药组,每组12只,另设假手术组。本发明药物由石家庄以岭药业股份有限公司提供,按本发明药物临床用量的10倍,即0.6g/kg/d溶于蒸馏水,于造模后次日灌胃给药连续4周。阳性药组给醋酸泼尼松,江苏徐州平光制药有限责任公司生产,给药剂量为6mg/kg,为临床剂量的10倍。模型组和假手术组大鼠在相同时间点给予等量蒸馏水灌胃。
1.3 指标检测:
1.3.1 4周后,将大鼠用10%水合氯醛麻醉,分离血清,检测血清中白介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)。
1.3.2 肺脏组织羟脯氨酸(Hyp)、转化生长因子β1(TGF-β1)、透明质酸(HA)测定:分别称取取肺组织100 mg 在冰浴下制成5% 组织匀浆,4 ℃ 4 000 r /min 离心15 min,取上清液按试剂盒说明书操作。
1.3.3 病理形态学检测:肺组织,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,进行HE染色,光镜下观察肺脏形态学变化。
1.4 统计方法
所有数据用均数±标准差(
±
s)表示。采用SPSS统计软件包,进行T检验。
2 结果
2.1 血清及肺组织指标的变化:与假手术组比较,模型组血清IL-4、及肺组织Hyp、TGF-β1、HA含量明显升高(P<0.01);阳性药组与模型组比较,上述指标均明显降低(P<0.01或P<0.05);本发明药物组与模型组比较上述指标均明显降低(P<0.01或P<0.05);模型组血清IFN-γ含量明显降低(P<0.01),本发明药物、阳性药组与模型组比较IFN-γ含量明显升高(P<0.05);且本发明药物组与阳性药组比较未见明显差异。见表1。
表1 各实验组血清及肺组织指标的比较
组别 |
IL-4(pg/ml) |
IFN-γ(pg/ml) |
Hyp(μg/g) |
TGF-β1(ng/L) |
HA(μg/L) |
假手术 |
19.8±4.7 |
86.5±22.4 |
357.9±68.2 |
134.5±28.9 |
308.6±45.5 |
模型 |
40.0±9.2** |
43.7±13.8** |
658.7±92.3** |
255.3±31.6** |
550.7±67.3** |
阳性药 |
32.5±5.5△ |
66.7±17.3△△ |
591.1±53.6△ |
195.6±32.7△△ |
496.2±33.8△ |
本发明药物 |
29.1±6.1△△ |
60.6±21.1△ |
589.4±62.3△ |
189.9±25.6△△ |
497.6±43.1△ |
注:与正常对照组比较: **P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01
2.2 病理变化:假手术组肺组织结构清晰,未出现明显病变;模型组肺泡结构破坏,成纤维细胞大量增生,纤维组织呈条索样瘢痕改变,胶原纤维成弥漫性增多,毛细血管腔闭塞。
阳性药组和本发明药物组均有不同的改善,且阳性药组和本发明药物组比较形态无显著差异。
3 结论
采用气管内注射博来霉素所致的大鼠肺纤维化模型,可见血清中IL-4明显升高,IFN-γ明显降低;肺脏组织匀浆Hyp、TGF-β1、HA含量显著增高,形态学显示肺泡结构破坏,成纤维细胞大量增生,纤维组织呈条索样瘢痕改变,胶原纤维成弥漫性增多,给予本发明药物治疗后可见血清及组织中相关指标明显改善,肺脏组织病理形态学亦有明显改善,表明本发明药物可有效治疗肺纤维化,且与阳性药效果相当。
实验例2:
为阐明本发明中药组合物治疗肝纤维化的疗效,用按实施例2方法所制得的药物(以下称本发明药物)进行了下列试验。
材料与方法
1.1 造模:SD大鼠,雄,200-220g,48只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。腹腔注射40%的四氯化碳橄榄油溶液进行造模,用量为2ml/kg(正常对照组腹腔注射橄榄油,2ml/kg),一周2次,连续6周。
1.2 分组:大鼠随机分为:模型组、本发明药物组、阳性药组,每组12只,另设正常对照组。本发明药物由石家庄以岭药业股份有限公司提供,按本发明药物临床用量的10倍,即0.6g/kg/d溶于蒸馏水,于造模当日开始灌胃给药,连续6周。阳性药组给联苯双酯滴丸,北京协和药厂生产,给药剂量为100mg/kg,为临床剂量的10倍。模型组和正常对照组大鼠在相同时间点给予等量蒸馏水灌胃。
1.3 指标检测:
1.3.1 6周后,将大鼠用10%水合氯醛麻醉,分离血清,检测血清中转化生子因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)
1.3.2 肝脏组织羟脯氨酸(Hyp)测定:取肝组织100 mg 在冰浴下制成5% 组织匀浆,4 ℃ 4 000 r /min 离心15 min,取上清液比色法按试剂盒说明书操作。
1.3.3 病理形态学检测:肝脏组织,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,进行HE染色,光镜下观察肝脏形态学变化。
1.4 统计方法
所有数据用均数±标准差(±s)表示。采用SPSS统计软件包,进行T检验。
2 结果
2.1 血清及肝组织指标的变化:与正常对照组比较,模型组血清TGF-β1、TNF-α、HA、LN含量及肝组织Hyp含量明显升高(P<0.01);阳性药组与模型组比较,上述指标均明显降低(P<0.01或P<0.05);本发明药物组与模型组比较上述指标均明显降低(P<0.01或P<0.05);且本发明药物组与阳性药组比较未见明显差异。见表2。
表2 各实验组血清及肝组织指标的比较
组别 |
TGF-β1(pg/ml) |
TNF-α(pg/ml) |
HA(ng/ml) |
LN(ng/ml) |
Hyp(μg/g) |
正常对照 |
183.5±22.7 |
92.7±30.1 |
105.4±22.6 |
72.2±17.4 |
219.7±23.6 |
模型 |
875.4±133.7** |
306.4±70.8** |
230.8±31.7** |
122.3±28.6** |
433.5±52.3** |
阳性药 |
435.6±93.2△△ |
236.9±53.7△ |
200.6±19.7△ |
90.4±22.5△△ |
394.4±31.6△ |
本发明药物 |
416.9±95.1△△ |
226.5±47.7△△ |
197.9±20.4△ |
98.3±24.1△ |
389.7±26.3△ |
注:与正常对照组比较: **P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01
2.2 病理变化:正常对照组肝组织结构清晰,干细胞大小均匀,无变性、坏死,小叶内肝细胞索排列整齐;模型组肝细胞可见明显脂肪变性,汇管区纤维组织明显增生;阳性药组和本发明药物组均有不同的改善,且阳性药组和本发明药物组比较形态无显著差异。
3 结论
采用腹腔注射CCl4所致的大鼠肝纤维化模型,可见血清中TGF-β1、TNF-α、HA、LN含量及肝脏组织匀浆Hyp含量显著增高,形态学显示明显脂肪变性,汇管区纤维组织明显增生,给予本发明药物治疗后可见血清中GF-β、TNF-α、HA、LN含量明显降低,肝组织中Hyp含量明显降低,肝脏组织病理形态学改善,表明本发明药物可有效治疗肝纤维化,且与阳性药效果相当。
实验例3:
为阐明本发明中药组合物治疗肾纤维化的疗效,用按实施例3方法所制得的药物(以下称本发明药物)进行了下列试验。
材料与方法
1.1 造模:大鼠,雄,130-160g,48只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠,用10%的水合氯醛按3.5ml/kg行腹腔麻醉,碘伏消毒,行大鼠左侧腹肾区切口,逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层,暴露左侧肾脏,沿肾脏下极向下仔细寻找辨认肾动脉及输尿管(肾动脉为淡红色管状并伴有轻微搏动,输尿管为沿脊柱两侧下行的灰白色细线状物),用眼科镊分离左侧输尿管,用五号手术线,在肾盏处和肾下极处以适当松紧度分别结扎输尿管,间距约3mm,以便结扎后能造成输尿管完全梗阻,不离断输尿管,手术时注意不碰伤肾包膜并保护好周围组织,手术后把肾置于原位,以少量生理盐水冲洗腹腔后,逐层缝合切口。术中严格遵守无菌操作。假手术组除不结扎输尿管外,其余步骤与模型大鼠相同。
1.2 分组:造模后的大鼠随机分为:模型组、本发明药物组、阳性药组,每组12只,另设假手术组。本发明药物由石家庄以岭药业股份有限公司提供,按本发明药物临床用量的10倍,即0.6g/kg/d溶于蒸馏水,于术后次日灌胃给药。阳性药组给予苯那普利,商品名:洛汀新,又名盐酸贝那普利,由北京诺华制药有限公司生产,给药剂量为3.33mg/kg,为临床剂量的10倍。模型组和假手术组大鼠在相同时间点给予等量蒸馏水灌胃。连续灌胃7天。
1.3 指标检测:
1.3.1 血生化检测:大鼠,腹主动脉取血,置塑料试管中室温放置至上层有血清析出,3000rpm离心10分钟,吸取上清置于-20℃保存待检。采用日立7080全自动生化分析仪测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的含量。
1.3.2 尿液指标检测:于各阶段取材前一天将各组大鼠放入洁净的代谢笼中,正常饮水禁食下留取24h尿液,测量24h尿量,进行尿蛋白的测定,并计算尿蛋白的排泄率。采用日立7080全自动生化分析仪检测尿素氮、尿肌酐、尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的含量,计算肌酐清除率。
1.3.3 病理形态学检测:麻醉后处死动物,留取左右肾组织,去掉包膜,按冠状位纵行剖开,置于4%甲醛液中固定,石蜡包埋,进行HE、染色,光镜下观察肾小管和肾间质的结构及变化。
1.4 统计方法
所有数据用均数±标准差(
±
s)表示。采用SPSS统计软件包,进行T检验。
2 结果
2.1 血液学指标的变化:与假手术组比较,模型组血清BUN、CRE明显升高(P<0.01),肌酐清除率明显下降(P<0.01),阳性药组与模型组比较,BUN、CRE明显下降(P<0.01),肌酐清除率明显上升(P<0.05),本发明药物组与模型组比较,BUN、CRE明显下降(P<0.01),肌酐清除率明显上升(P<0.01),本发明药组与阳性药组比较无明显差异(P>0.05)。见表3。
表3 各实验组血液指标的比较
组别 |
血清BUN |
血清CRE |
内生肌酐清除率 |
假手术 |
6.03±1.21 |
43.52±6.38 |
6.97±1.55 |
模型 |
10.69±3.18** |
59.92±7.99** |
3.98±0.65** |
阳性药 |
7.28±2.37△△ |
48.27±6.21△△ |
4.94±1.26△ |
本发明药物 |
7.17±2.23△△ |
50.44±7.27△△ |
5.13±1.37△△ |
注:与假手术组比较:*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01
2.2 尿量及尿液指标的变化:与假手术组比较,模型组尿液中BUN、CRE、NAG明显升高(P<0.01),尿量、尿蛋白清除率明显下降(P<0.01),阳性药组与模型组比较,尿液中BUN、CRE、NAG明显下降(P<0.01),尿量、尿蛋白清除率明显上升(P<0.01),本发明药物组与模型组比较,尿液中BUN、CRE、NAG明显下降(P<0.01),尿量、尿蛋白清除率明显上升(P<0.05,P<0.01),本发明药物组与阳性药组比较上述指标无明显差异(P>0.05)。见表4。
表4 各实验组尿量及尿液指标的比较
组别 |
尿BUN |
尿CRE |
尿NAG |
尿量 |
尿蛋白清除率 |
假手术 |
190.11±35.07 |
3651.66±382.44 |
10.94±2.45 |
29.11±6.27 |
6.69±1.34 |
模型组 |
331.08±47.26** |
5289.08±563.92** |
20.38±5.68** |
15.85±3.29** |
4.27±1.62** |
阳性药 |
251.48±38.28△△ |
4481.57±525.17△△ |
14.97±3.13△△ |
22.20±5.08△△ |
7.41±1.76△△ |
本发明药药 |
252.17±37.89△△ |
4589.22±491.51△△ |
15.27±3.28△ |
24.95±5.57△△ |
6.19±1.41△△ |
注:与假手术组比较:*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01;
2.3 病理变化:假手术组左肾及右肾表现为正常形态。模型组肾小管为扁平上皮细胞,甚或丢失,部分上皮细胞空泡化;部分肾小管扩张,可见上皮细胞已经完全丢失的巨大小管,蛋白管型及颗粒管型反而减少,间质可见成群炎细胞及成纤维细胞,间质胶原成分增多,肾小球未见明显异常。与模型组相比,阳性药组和本发明药物组在肾脏结构与形态学上均见较轻的病理变化。阳性药组和本发明药物组比较形态无显著差异。
3 结论
采用单侧输尿管梗阻所致的大鼠肾间质纤维化模型,可见血清BUN、CRE明显升高,肌酐清除率明显下降,尿量减少,尿液中BUN、CRE明显升高,尿蛋白清除率明显下降,并且可反映肾小管损害的NAG酶活性也明显升高,病理结果显示间质炎性细胞浸润,肾小管扩张、坏死以及间质的纤维化,表明模型成功。经本发明药药物治疗后可见血清及尿液中BUN、CRE明显降低,内生肌酐清除率、尿蛋白清除率上升,NAG酶活性降低,改善病理形态学的变化,表明本发明药物可有效治疗肾纤维化,且与阳性药效果相当。
实验例4:
为阐明本发明中药组合物治疗心肌纤维化的疗效,用按实施例4方法所制得的药物(以下称本发明药物)进行了下列试验。
材料与方法
1.1 造模:大鼠,雄,180-200g,48只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠,背部皮下注射5 mg/kg异丙肾上腺素,连续8 d,正常对照组注射等量生理盐水。
1.2 分组:造模后的大鼠随机分为:模型组、本发明药物组、阳性药组,每组12只,另设正常对照组。本发明药物由石家庄以岭药业股份有限公司提供,按本发明药物临床用量的10倍,即0.6g/kg/d溶于蒸馏水,于造模后次日灌胃给药连续4周。阳性药组给予苯那普利,商品名:洛汀新,又名盐酸贝那普利,由北京诺华制药有限公司生产,给药剂量为3.33mg/kg,为临床剂量的10倍。模型组和正常对照组大鼠在相同时间点给予等量蒸馏水灌胃。
1.3 指标检测:
1.3.1 心功能:4周后,大鼠,10%乌拉坦腹腔注射麻醉,行右颈总动脉插管,接四道生理记录仪,将插管沿颈总动脉逆行插入左心室。平稳5 min后记录左心室内舒张压(LVEDP)、最大上升速率(+dp/dtmax)和最大下降速率(-dp/dtmin)。
1.3.2血浆AngⅡ检测:取血,离心,放免法按试剂盒说明书操作。
1.3.3 血浆转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量测定:采用双抗体夹心ABC-ELISA测定,方法按说明书进行。
1.3.4 心肌组织羟脯氨酸(Hyp)测定:取左心室心肌组织100 mg 在冰浴下制成5% 组织匀浆,4 ℃ 4 000 r /min 离心15 min,取上清液比色法按试剂盒说明书操作。
1.3.5 病理形态学检测:心肌组织,置于4%甲醛液中固定,石蜡包埋,进行HE染色,光镜下观察心肌形态学变化。
1.4 统计方法
所有数据用均数±标准差(±s)表示。采用SPSS统计软件包,进行T检验。
2 结果
2.1 心功能指标的变化:与正常对照组比较,模型组LVEDP和-dp/dtmin明显上升,+dp/dtmax明显下降(P<0.01),阳性药组与模型组比较,LVEDP和-dp/dtmin明显下降,+dp/dtmax明显上升(P<0.01),本发明药物组与模型组比较,LVEDP和-dp/dtmin明显下降,+dp/dtmax明显上升(P<0.05,P<0.01),本发明药组与阳性药组比较无明显差异(P>0.05)。见表5。
表5各实验组心功能指标的比较
组别 |
LVEDP(mmHg) |
+dp/dtmax(mmHg/s) |
-dp/dtmin(mmHg/s) |
正常对照 |
2.09±0.38 |
3.59±0.58 |
-2.22±0.45 |
模型 |
11.62±3.37** |
1.27±0.39** |
-1.09±0.37** |
阳性药 |
7.27±2.39△△ |
2.48±0.52△△ |
-2.01±0.26△ |
本发明药物 |
8.17±2.23△ |
2.76±0.48△△ |
-1.93±0.21△△ |
注:与正常对照组比较:*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01
2.2 血液AngⅡ、TGF-β1和心肌组织Hyp含量的变化:与正常对照组比较,模型组血液AngⅡ、TGF-β1和心肌组织Hyp含量明显升高(P<0.01),阳性药组与模型组比较,AngⅡ、TGF-β1、Hyp含量明显下降(P<0.01),本发明药物组与模型组比较,AngⅡ、TGF-β1、Hyp含量明显下降(P<0.01),本发明药物组与阳性药组比较上述指标无明显差异(P>0.05)。见表6。
表6 各实验组指标的比较
组别 |
AngⅡ( ng/L) |
TGF-β1(
ng/L) |
Hyp(μg/g) |
正常对照 |
351.6±82.8 |
1194.1±335.5 |
410.2±52.4 |
模型组 |
689.0±93.6** |
3231.6±546.4** |
728.1±85.5** |
阳性药 |
481.5±65.3△△ |
1551.9±358.9△△ |
514.3±63.3△△ |
本发明药物 |
512.2±69.5△△ |
1965.4±397.3△△ |
591.9±73.8△△ |
注:与正常对照组比较:*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01;
2.3 病理变化:正常对照组心肌组织形态正常。模型组肌纤维及间质发生凋亡或坏死,心肌纤维增粗,拉长,胞核着色深,细胞排列疏松,局部组织纤维化,间质内有炎性细胞浸润。阳性药组和发明药组均有不同的改善,且阳性药组和发明药组比较形态无显著差异。
3 结论
采用皮下注射所致的大鼠心肌纤维化模型,可见心功能异常,血液中AngⅡ、TGF-β1及心肌组织Hyp含量增高,形态学显示心肌纤维及间质发生凋亡或坏死,心肌纤维增粗,拉长,胞核着色深,细胞排列疏松,局部组织纤维化,间质内有炎性细胞浸润,给予本发明药物治疗后可见心功能恢复,血液中AngⅡ、TGF-β1及心肌组织Hyp含量降低,心肌组织病理形态学改善,表明本发明药物可有效治疗心肌纤维化,且与阳性药效果相当。
由以上实验结果可以证实,本发明中药组合物可以有效治疗各种脏器纤维化,并且与临床常用阳性药物疗效相当,疗效确切,在实验中未发现明显不良反应,可以证实其安全性。
具体实施方式
实施例1:本发明药物胶囊剂的制备
处方:
黄芪450g 附子112.5g 人参225g 丹参225g 葶苈子150g 香加皮180g 泽泻225g 红花90g 玉竹75g 陈皮75g 桂枝90g
制备方法:
(1)按照处方比例称取黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮,加8倍量70%乙醇回流提取2次,第一次3小时,第二次2小时,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30 的清膏,备用;
(2)按照处方比例称取桂枝、陈皮,蒸馏提取挥发油;提油后的水溶液滤过,备用,残渣再加8倍量水煎煮1小时,滤过,合并水煎液,备用;
(3)按照处方比例称取附子、丹参、玉竹、红花,加水9倍量,煎煮2次,每次2小时,合并提取液,滤过,与步骤(2)中桂枝、陈皮水溶液合并,浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30清膏,放冷,搅拌中加入乙醇,至醇浓度70%,4℃以下静置24小时,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至60℃测定相对密度为1.25-1.30清膏,与步骤(1)的醇提清膏混合,70℃烘干;
(4)干膏混合粉碎成100目粉,加70%乙醇适量制粒,喷入桂枝、陈皮挥发油,混匀,装胶囊,制成1000粒,即得。
用法用量:每次4粒,每日3次。
实施例2:活性成分的制备
处方:
黄芪450g 附子112.5g 人参225g 丹参225g 葶苈子150g 香加皮180g 泽泻225g 红花90g 玉竹75g 陈皮75g 桂枝90g
制备方法:
(1)按照比例称取黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮,用70%乙醇提取,滤过,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏;
(2)按照比例称取桂枝、陈皮,提取挥发油;提油后的水溶液滤过,收集水溶液滤液,再加水煎煮残渣1小时,滤过,合并水煎液,得提油后水提液;
(3)按照比例称取附子、丹参、玉竹、红花,加水煎煮2次,合并提取液,滤过;与步骤(2)所得水提液合并,浓缩至相对密度为1.25-1.30清膏,放冷,搅拌中加入乙醇,至醇浓度70%,静置,滤过,滤液浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏;
(4)将步骤(1)所得清膏与将步骤(3)所得清膏混合,烘干,粉碎,加入步骤(2)所得挥发油,即得。
实施例3:本发明药物片剂的制备
处方:
黄芪150g 附子40g 人参225g 丹参225g 葶苈子50g 香加皮180g 泽泻75g 玉竹75g 桂枝30g 红花90g 陈皮25g
制备方法:
(1)按照处方比例称取黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮,加8倍量70%乙醇回流提取2次,第一次3小时,第二次2小时,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏,备用;
(2)按照处方比例称取桂枝、陈皮,蒸馏提取挥发油,提油后的水溶液滤过,备用,残渣再加8倍量水煎煮1小时,滤过,合并水煎液,备用;
(3)按照处方比例称取附子、丹参、玉竹、红花,加水9倍量煎煮2次,每次2小时,合并提取液,滤过,与步骤(2)中桂枝、陈皮水煎液合并,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30 的清膏,放冷,搅拌中加入乙醇,至醇浓度70%,4℃以下静置24小时,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏,与步骤(1)的醇提清膏混合,65℃烘干;
(4)干膏混合粉碎成100目粉,加70%乙醇适量制粒,喷入桂枝、陈皮挥发油,混匀,按常规制剂方法制成片剂。
实施例4:本发明药物颗粒剂的制备
处方:
黄芪250g 附子112.5g 党参200g 丹参120g 葶苈子135g
南五加皮150g 泽泻200g 玉竹60g 桂枝75g 红花75g 陈皮60g
制备方法:
(1)按照处方比例称取黄芪、葶苈子、泽泻、人参、香加皮,加8倍量70%乙醇回流提取2次,第一次3小时,第二次2小时,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏,备用;
(2)按照处方比例称取桂枝、陈皮,蒸馏提取挥发油,提油后的水溶液滤过,备用,残渣再加8倍量水煎煮1小时,滤过,合并水煎液,备用;
(3)按照处方比例称取附子、丹参、玉竹、红花,加水9倍量煎煮2次,每次2小时,合并提取液,滤过,与步骤(2)中桂枝、陈皮水煎液合并,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30 的清膏,放冷,搅拌中加入乙醇,至醇浓度70%,4℃以下静置24小时,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至在60℃热测时相对密度为1.25-1.30的清膏,与步骤(1)的醇提清膏混合,70℃烘干;
(4)干膏混合粉碎成100目粉,加70%乙醇适量制粒,喷入桂枝、陈皮挥发油,混匀,按常规制剂方法制成颗粒剂。