CN102858353A - 脊髓损伤、炎症和免疫性疾病:治疗剂的局部控释 - Google Patents

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Abstract

提供了一种治疗氧化应激的药物传递系统。该药物传递系统可以含有治疗剂和基质。所述治疗剂可以包括抗氧化剂或类固醇。所述基质可以包括水凝胶、颗粒、微米颗粒或纳米颗粒。还提供了一种治疗损伤的方法，所述损伤包括外周神经损伤或脊髓损伤。该方法包括在损伤处注射所述药物传递系统。

Description

脊髓损伤、炎症和免疫性疾病:治疗剂的局部控释
技术领域
本公开涉及一种传递至损伤处的治疗剂。
背景技术
一氧化氮(NO)是一种气态的化学信使，它参与了人体内的多种生理学过程。发现其在中枢神经系统(CNS)中的浓度最高。酶NO合成酶(NOS)催化NO的合成(Conti，A.，Miscusi，M.，Cardali，S.，Germano，A.，Suzuki，H.，、Cuzzocrea，S.和Tomasello，F.(2007)Nitric oxide in the injured spinal cord：Synthases cross-talk，oxidative stress and inflammation(受损脊髓中的一氧化氮：合成酶的窜扰、氧化应激以及炎症)。Brain Research Reviews 54，205-218)。CNS中的NOS具有四种亚型。其中两种为组成型表达：神经元型(nNOS)和内皮型(eNOS)。在线粒体中发现了一种功能活性的亚型(mtNOS)，而第四种亚型能在病理状态下诱导产生(iNOS)。
正常情况下，nNOS位于神经元、血管周神经中，在星形胶质细胞中也有非常低的含量。可以在脑血管内皮中发现eNOS。而iNOS在星形胶质细胞、小胶质细胞、血管平滑肌和内皮细胞中表达。
但NO除了在正常机能中的作用外还具有毒性。对于超氧阴离子自由基(O2 *-)，NO在与超氧化物歧化酶的竞争中胜出，生成过氧亚硝基阴离子。过氧亚硝基(peroxynitrite)本身就是具有毒性的。除此之外，过氧亚硝基在生理条件下分解成羟自由基、碳酸根自由基和二氧化氮，这些物质能使细胞受到毒性的氧化应激。
过氧亚硝基及其分解产物造成的氧化应激导致了多种疾病和损伤状态，包括脊髓损伤(SCI)、中风、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循环休克(circulatory shock)、慢性炎症性疾病、癌症和神经退行性疾病。
发生神经元损伤后，nNOS发生短时间的上调(1小时)。证据显示这会引起缺血性损伤(ischemic damage)。另一方面，eNOS产生的NO可以通过促进血管舒张并抑制微血管发生凝集和粘连来起到保护神经的作用。根据这一点，假设NO能清除由缺血产生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)而具有保护的功能。但在最初的nNOS发生上调之后，下调至组成水平以下的NO却会引起氧化应激和iNOS的超级诱导。
在病理状态下(如炎症、免疫应答和外伤)时，iNOS几乎在所有类型的细胞中都有表达。诱导需要炎性细胞因子，从而使转录因子STAT-1和(NF)-κB激活。iNOS一旦得到表达就能在时间和空间上产生高浓度的NO。虽然NO在噬菌细胞过程中非常重要，但如同对慢性炎症、自身免疫疾病和外伤的观察，以不受控的方式释放过量的NO可能对组织造成损害。
在SCI中，遭受损伤2小时后，iNOS的mRNA就在受损组织中得到了表达并持续数天。炎性细胞无法在损伤后3小时期间内侵入组织。因此，SCI后的早期iNOS表达很可能仅由固有脊髓细胞(resident spinal cord cells)(特别是小胶质细胞)产生。该时间点之后的iNOS表达主要由浸润的炎性细胞产生。虽然嗜中性粒细胞在损伤后1小时即可在脊髓中检测到，但是大多数在血管内。损伤后3-4小时发生外渗。嗜中性粒细胞感染率在损伤后1-3天达到最高值，并持续达10天。嗜中性粒细胞会释放出大量的物质，包括趋化因子、细胞因子、酶、ROS和活性氮自由基(reactive nitrogen radical)。
NO与CNS缺血性损伤和外伤损伤后的神经毒性有关(Xiong，Y、Rabchevsky，A.G.和Hall，E.D.(2007)Role of peroxynitrite in secondaryoxidative damage after spinal cord injury(过氧亚硝基在脊髓损伤后的二次氧化损害中的作用).J.Neurochem.100(1).639-649)。NO作为自由基能引起蛋白亚硝基化。它能通过多种机理而削弱氧化磷酸化并抑制糖基化，造成能量耗尽、缺氧和神经元死亡。NO能促进诱变DNA的脱氨基作用，并引起磷脂过氧化反应，从而破坏细胞膜的结构和功能完整性，导致细胞死亡。
SCI后，有研究指出过氧亚硝基形成的水平至少在损伤后一周内持续升高，这正好与蛋白质氧化以及脂质过氧化相吻合。参见Deng，Y.，Thompson，B.M.，Gao，X和Hall，E.D.(2007)Temporal relationship of peroxynitrite-inducedoxidative damage，calpain-mediated cytoskeletal degradation andneurodegeneration after traumatic brain injury(外伤性脑损伤后的过氧亚硝基诱导的氧化损害、钙蛋白酶介导的细胞骨架退化以及神经退行性变间的时间关系).Exp.Neurol.205.154-165。还有研究指出了多种试剂在减轻二次损伤中的效果，包括青霉氨、坦波尔(tempol)(Hillard，V.H.，Peng，H.，Zhang，Y.，Das，K.，Murali，R.和Etlinger，J.D.(2004)Tempol，a nitroxide antioxidant，improves locomotor and histological outcomes after spinal cord contusion in rats(坦波尔，一种硝基氧抗氧化物，能改善脊髓挫伤后大鼠的运动性和组织性结果)，J.Neurotrauma 21(10).1405-1414(“Hillard等人”))和尿酸(Scott，G.S.，Cuzzocrea，S.，Genovese，T.，Koprowski，H.和Hooper，D.C.(2005)Uricacid protects against secondary damage after spinal cord injury(尿酸能防止脊髓损伤后的二次损害)，Proc.Natl.Acad.Sci.102(9)，3483-3488(“Scott等人”))。此外，还有研究证实了临床上给药的糖皮质激素类固醇的神经保护效果很大程度是因为抑制了脂质过氧化而不是受体介导的抗炎性(Hall，E.D.和Springer，J.E.(2004)Neuroprotection and Acute Spinal Cord Injury：AReappraisal(神经保护与急性脊髓损伤：一次重新评价)，NeuroRx.1，80-100)。
1990年时，采用了高剂量甲基脱氢皮质醇(methylprednisolone)作为治疗急性SCI的标准。但是，对给药治疗急性SCI的类固醇的争议主要归结于其不利的副作用风险(如，感染、肺炎、感染性休克、糖尿病并发症和延误伤口愈合)和定量难度(如，尖锐的双相剂量反应曲线以及所需处理期间随着起始的时间点而变化)。已经在局部给药甲基脱氢皮质醇。参见Chvatal，S.A.，Kim，Y.-T.，Bratt-Leal，A.M.，Lee，H.和Bellamkonda，R.V.(2008)Spatialdistribution and anti-inflammatory effects of Methylprednisolone after sustainedlocal delivery to the contused spinal cord(甲基脱氢皮质醇在挫伤脊髓进行持续局部释药后的空间分布与抗炎性效果)，Biomaterials，1-9。Chvatal等人的给药法需要在椎板切除术中通过手术使脊髓暴露。然后将传递介质-温热的琼脂糖施覆在硬脊膜(dura)的外侧。
对SCI后的脊髓细胞和损伤后的的外周神经的氧化应激可能归因于在生理学条件下产生的由NO和ROS形成的过氧亚硝基和过氧亚硝基活性降解产物。由氧化应激造成的坏死过程或细胞凋亡级联反应由于过氧亚硝基的存在而以造成脊髓损伤或外周神经损伤后的病变扩散为特征。
发明内容
一方面，本发明涉及一种在患者损伤处对损伤进行治疗的方法。该方法包括在损伤处向患者给药含有基质和一种或多种治疗剂的药物传递系统(drug delivery system)。
另一方面，本发明涉及一种含有基质和一种或多种治疗剂的药物传递系统。
附图说明
下面结合附图将能更好地理解对本发明优选实施方式的具体说明。为了阐述本发明，附图中展示的为目前的优选实施方式。但应理解本发明并不限于所示的具体布置与手段。图中：
图1显示了PEG-400的1H-NMR(核磁共振)谱；
图2显示了比值为50∶50的PLGA与Lactel的1H-NMR谱；
图3显示了CP-PLGA-pPEG-PLGA-1的1H-NMR谱；
图4显示了用来检测链转移剂CP-PLGA-pPEG-PLGA-RAFT-功能的1H-NMR谱；
图5显示了S-(硫代苯甲酰)乙硫醇酰氯(S-(thiobenzoyl)thioglycolic acidchloride)DJS-CP-硫代苯甲酰-乙硫醇酰氯-1的1H-NMR谱；
图6显示了CP-PLGA-PEG-PLGA-CTA-Cl-rxn-1的1H-NMR谱；
图7显示了用S-硫代苯甲酰乙硫醇酸链转移剂官能化的CP-PGS-CTA聚(甘油-共-癸二酸)的1H-NMR谱；
图8显示了治疗剂在50μL的含5mg微米颗粒(microparticle)的水凝胶中，从水凝胶-微米颗粒上的释放曲线。
具体实施方式
权利要求书和说明书中对应部分中所用的词“一”和“一个”，在没有相反说明的情况下表示的是一个或多个所指代的物品。
本文使用的“基质”意指水凝胶、颗粒、纳米颗粒、微米颗粒或它们的组合。
本文使用的“治疗剂”和“药物”可互换使用。
本文使用的“损伤”指的是以任何方式造成的损伤，包括但不限于物理外伤、疾病、免疫性疾病或炎症。
本文使用的“患者”指的是人类或属于脊索动物门的非人类动物。
本文使用的“一种药学可接受盐”或“多种药学可接受盐”指的是能安全有效地用于患者并获得期望的生物学活性的化合物的盐。所述多种药学可接受盐包括具有酸性或碱性基团的盐。药学可接受酸性添加盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐(isonicotinate)、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、琥珀酸钠、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐(glucaronate)、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和巴莫酸盐(即，1，1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))这些盐。所述多种药学可接受盐包括多种氨基酸的盐。药物可接受碱性盐包括但不限于铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐和二乙醇胺盐。
本文的实施方式提供了一种调整外伤后二次损伤后的方法，该方法通过局部给药治疗剂来清除损伤处或炎症处的自由基。鉴于用药物(如糖皮质激素类固醇)进行全身给药还伴随着不期望的副作用，因此通过局部给药治疗剂(包括消炎药(如二甲胺四环素或甲基脱氢皮质醇)、或自由基清除剂(如尿酸或坦波尔))来减轻二次损伤可能是有意义的。提供了对损伤后的神经损害做出应答的药物传递系统靶向过程(targeting processes)来影响治疗剂的局部给药。所述靶向过程包括由损伤引起的伤害造成的氧化应激。药物传递系统的实施方式能适应于SCI后的脊髓治疗。但是，所述药物传递系统的实施方式可以用在任何损伤或炎症处。所述损伤或炎症处可以是脊髓或外周神经。用药物传递系统进行治疗的方法可以在细胞内区域、细胞外区域、血管内区域和/或细胞膜处进行。药物传递系统的实施方式及其方法能解决炎症带来的有害影响，且这些实施方式可用于治疗慢性炎症、自身免疫性疾病、脊髓损伤(SCI)、中风、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循环休克、慢性炎症性疾病、癌症、神经退行性疾病、创伤性脑损伤、外周神经切断、神经根压迫(nerve root impingment)和其他疾病或外伤性损伤。所述药物传递系统是这样的装置，它含有基质和一种或多种治疗剂。所述治疗的方法包括给药该药物传递系统。
所述药物传递系统包括但不限于以下基质和治疗剂的组合：1)水凝胶+治疗剂；2)水凝胶+多种治疗剂的组合；3)颗粒+治疗剂；4)颗粒+多种治疗剂；5)水凝胶+颗粒+治疗剂，其中，治疗剂分布在水凝胶中、颗粒中或二者中均有；6)水凝胶+颗粒+多种治疗剂，其中，所述治疗剂分布在水凝胶中、水凝胶内的颗粒(可能是一组截然不同的颗粒)中，或二者中均有；以及7)水凝胶+颗粒+多种治疗剂，其中，具体的多种治疗剂分布在水凝胶中、水凝胶内的颗粒(可能是一组截然不同的颗粒)中或二者中均有。所述颗粒既可以是微米颗粒也可以是纳米颗粒。所述治疗剂或多种治疗剂能溶解或分散在水凝胶中、颗粒中、或水凝胶与颗粒中均有，从而通过扩散和/或溶解来实现控释动力学。优选基质是可注射的，且所述药物传递系统可以通过注射被传递到损伤处。但也可以通过其他的方法来给药所述药物传递系统，包括但不限于手术植入药物传递装置。
所述水凝胶可以是热敏性生物可降解组合物。本文使用的“热敏性”指的是水凝胶在低于患者体温的温度和患者体温之间会表现出溶胶-凝胶相变，或者聚合物的混合物在接近患者体温的温度下比在更低的温度下更容易发生反应形成水凝胶。优选所述患者为人类，体温为37℃，所述更低的温度可以是室温(如22℃)。热敏性水凝胶的临界温度可以接近患者的体温，优选为接近37℃。
药物传递系统中生物可降解的热敏性水凝胶可以包括多嵌段共聚物。一个或多个聚合物嵌段可以是生物可降解的、生物相容的、或生物可降解且生物相容的。其中一些聚合物嵌段可以是生物可降解的，而其余的聚合物嵌段为生物相容的。优选地，所述水凝胶的成分(如聚合物、单体或分解产物)为生物可降解的、生物相容的、或生物相容且可排出的。所述水凝胶可以含有能从体内排泄出来的生物相容的聚合物嵌段。
单体嵌段之间酯键是可水解的，并能在体内发生降解以释放出聚合物单体嵌段。含有酯键的聚合物是生物可降解的。酰胺键、酐键和醚键也可以是可水解的。这些键以及其他的在酶的作用、还原性条件(如，硫代酸酯键、硫醚键或二硫键)或者患者体内目前条件下能发生降解的键都可以作为预计在水凝胶或颗粒中使用的聚合物。水凝胶可以含有带醚键的乙二醇的聚合物嵌段、低聚乙二醇或聚乙二醇，他们都是生物相容且可排出的。乙醇酸、乳酸、甘油和癸二酸的聚合物是包括了上述聚合物的生物可降解的水凝胶。丙交酯、乙交酯、聚(甘油-共-癸二酸)(poly(glycerol-co-sebacic acid))共聚物是生物可降解的，并且这些聚合物中的一种或多种可以包括在水凝胶中。预计作为部分水凝胶的聚合物包括但不限于聚(甘油-共-癸二酸)丙烯酸酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)与聚(乙二醇)或低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯的多嵌段共聚物；和聚(甘油-共-癸二酸)与聚(乙二醇)，低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯或聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝共聚物，乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯(ethoxylated trimethylolpropane tri-3-mercaptopropionate)或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)diacrylate)。这些聚合物具有热敏性。
水凝胶可以在物理条件发生改变时发生膨胀或收缩，这具有生理学上的重要性。例如，温度、pH或离子强度的改变能引起水凝胶发生膨胀或收缩。优选地，注射到脊髓或其他损伤处的水凝胶平衡到损伤处的环境时不会发生显著的膨胀。但是，药物传递系统中也可以含有膨胀的水凝胶。
可以将含有具有活性端基的乙二醇单体单元的亲水性聚合物用作水凝胶或颗粒中的聚合物，所述活性端基包括但不限于丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、乙烯基、二酰肼基(dihydrazide)或硫醇基。可以使用丙烯酰氯(acrylochloride)、甲基丙烯酰氯(methacrylochloride)、氯乙烯来形成丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的端基。可以用巯基丙酸、半胱氨酸和胱胺来提供硫醇端基。可通过多种合成法(如开环聚合和活性自由基聚合)来生成用于基质的聚合物。水凝胶可由共价和物理交联的网络组成。所述物理交联指的是疏水嵌段的聚集。
具有丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯、二酰肼或硫醇官能化的化合物的聚合物能够与其他具有相容的活性端基的聚合物发生反应，从而形成水凝胶。丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和乙烯活性端基彼此相容并均与硫醇相容。硫醇和丙烯酸酯官能化的聚合物或聚合物嵌段能在温和条件下(热或光)发生反应以形成硫醇-醚。因此，硫醇和丙烯酸酯官能化的水溶性聚合物是用作药物传递系统中水凝胶的合适候选者。某些水凝胶能在凝胶化后的平衡过程中发生膨胀或收缩，这可能是转化不完全或由于要进行充分迅速的反应所需的反应剂的浓度比随后在生理学条件下(如温度、pH、离子强度)凝胶中的平衡浓度要高而造成的。鉴于其快速反应速率以及高水凝胶转化度(extentsof conversion to hydrogel)，硫醇-丙烯酸酯官能化的聚合物是有吸引力的用作传递装置的聚合物。药物传递系统中使用的水凝胶可以通过混合具有相容的活性端基的聚合物来形成。优选地，混合物包括含硫醇的聚合物和含丙烯酸酯的聚合物。混合后，将混合物暴露在足够的温度或光照下，生成的硫醇-酯形成了水凝胶。优选地，在患者体温下比在低于患者体温的温度下更快地进行硫醇-酯的生成。举例来说，硫醇-酯的生成在37℃处或附近比在22℃处或附近进行得更快。可以在给药前或给药过程中混合具有相容的活性端基的聚合物，优选含有硫醇和含有丙烯酸酯的聚合物。在给药过程中进行混合时，可以在注入的同时将所述聚合物进行混合，或通过连续或同时注射不同的聚合物来进行混合。所述混合物的一种非限制性实例包括乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的组合。
药物传递系统中的水凝胶的压缩模量优选与损伤处周围组织的接近。例如，设计成向脊髓进行传递的药物传递系统的压缩模量可以与脊髓的压缩模量接近。药物传递系统中的水凝胶的孔隙率能与待释放的治疗剂的大小相匹配。若药物传递系统中含500道尔顿的治疗剂部分，水凝胶的筛孔就应该能允许500道尔顿的治疗剂移动穿过凝胶。
基质可以包括含有颗粒的药物，且所述颗粒是为了药物的控释动力学而被提供的。在一种优选的实施方式中，可以将颗粒作为悬浮液注射到受损区域处，该区域可以是外周神经或脊髓处。所述颗粒可以是微米颗粒，其大小约为1-1000微米。颗粒可以是纳米颗粒，其大小约为1-1000纳米。但可以根据具体应用来改变颗粒的尺寸。治疗剂可以在颗粒上或颗粒内，其浓度能有效地实现清除自由基、防止自由基形成或其他抵抗由一氧化碳相关的氧化应激产生的的毒性的作用。在优选的实施方式中，颗粒中含有0.1-30％重量/重量(药物重量/颗粒与药物重量之和)的治疗剂，进一步优选为1-30％重量/重量。所述治疗剂可以通过扩散、溶解和颗粒降解的机制得到释放。
颗粒可以是固体聚合物或凝胶。在一种优选实施方式中，颗粒由生物可降解的、生物相容的聚合物制成，所述聚合物例如可以是聚酯。一种能作为颗粒的合适的聚酯为聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，它能通过酯水解而发生降解。其他合适的材料包括聚丙交酯、聚乙交酯以及聚(羧基苯氧基丙烷)-共-癸二酸)(poly(carboxyphenoxy propane)-co-sebacic acid)(如，购自MGI医药品公司的gliadel waferTM)。优选地，颗粒的成分(如聚合物、单体或分解产物)是生物可降解、生物相容或生物相容且可排出的。
可以向上述组合中提供水凝胶或颗粒，从而能削弱在原位凝胶化过程中的释放动力学。通过对释放动力学的削弱，治疗剂从颗粒和从水凝胶中释放出来的速率可能有所不同。在一种优选的实施方式中，不同的治疗剂可以被包含在水凝胶或颗粒中，或不同类型的颗粒中，从而能使各种特定的治疗剂以不同的速率得到释放。
在一种实施方式中，用治疗剂对水凝胶或颗粒物质进行功能化。可以通过任意类型的键来附着治疗剂从而功能化颗粒。优选地，使聚合物重复单元中的羧基或羟基通过酯键、酰胺键、醚键或缩醛键实现附着。在一种优选实施方式中，功能性水凝胶含有附着在聚(甘油-共-癸二酸酯)丙烯酸酯(PGSA)上的治疗剂。
任何治疗剂都能用来对水凝胶或颗粒进行功能化，但在一种优选实施方式中，治疗剂附着在水凝胶上且该治疗剂为抗氧化剂。更优选地，使抗氧化剂-抗坏血酸(维生素C)与α-生育酚(维生素E)附着到水凝胶上。当抗氧化剂维生素C和维生素E组合存在时，能使这两种物质得到循环利用以及增强抗氧化性能。可以使用其他治疗剂的组合以实现在药物传递系统中的循环利用。
PGSA在温和条件下能形成弹性网络(自由基聚合反应)，其能防止抗氧化剂在处理中变性。此外，对PGSA采用熔融塑模(melt molding)或无固体形式的快速成型法(rapid prototyping techniques)可以形成任意几何构型的框架。这能用来定制药物传递系统以满足特定的受损腔(lesion cavity)(或脊髓肿瘤腔)，从而改善治疗损伤(可以是SCI或外周神经损伤)的手术干预。
下表1列举了以下示例性的7种药物传递系统的组合制剂：1)水凝胶+治疗剂；2)水凝胶+多种治疗剂的组合；3)颗粒+治疗剂；4)颗粒+多种治疗剂；5)水凝胶+颗粒+治疗剂，其中，治疗剂分布在水凝胶中、颗粒中、或二者中均有；6)水凝胶+颗粒+多种治疗剂，其中，所述多种治疗剂分布在水凝胶中、水凝胶内的颗粒(可能是一组截然不同的颗粒)中、或二者中均有；以及7)水凝胶+颗粒+多种治疗剂，其中，具体的多种治疗剂分布在水凝胶中、水凝胶内的颗粒(可能是一组截然不同的颗粒)中、或二者中均有。
表1
Figure BPA00001368840400121
表1所示实施例中，重量％按成分的重量除以组合(包括其他成分)的总重进行计算。PBS，pH 7.4指的是pH等于7.4的磷酸盐缓冲盐水，它含有144mg/L(1.06mM)的磷酸二氢钾(KH2PO4，136g/mol)，9000mg/L(155.17mM)的氯化钠(NaCl，58g/mol)和795mg/L(2.97mM)的磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)。
任何能起到自由基清除剂或消炎剂作用的分子都是药物传递系统的候选治疗剂。该分子优选为小分子。优选地，所述治疗剂能减少体内位置的自由基的数目和/或减少自由基的生成。所述药物传递系统可以含有一种以上的治疗剂的组合。所述治疗剂可以为抗氧化剂、类固醇(steroid)或它们的组合。在一种优选实施方式中，所述治疗剂包括一种或多种选自由一种抗氧化剂或多种抗氧化剂、坦波尔(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基)、尿酸、二甲胺四环素、甲基脱氢皮质醇、MnTBAP(锰(III)四(4-苯甲酸)卟啉)和地塞米松所组成的组中的物质。所述抗氧化剂可以是但不限于抗坏血酸或α-生育酚。药物传递系统中还可以提供能互相重复利用彼此的治疗剂组合。例如，抗坏血酸(维生素C)和α-生育酚(维生素E)可以组合使用以重复利用彼此并增强抗氧化性能。
所述治疗剂并不限于上述物质。药物传递系统中可以含有的治疗剂的非限制性实例包括NOS或NO产物的抑制剂、抗氧化剂、自旋捕获剂(spin trap)和过氧亚硝基清除剂。
可以提供在药物传递系统中的NOS或NO产物的抑制剂的非限制性列表包括1400W(N-(3-(氨甲基)苄基)乙脒)；放线菌素D(actinomycin D)；AET(C3H11Br2N3S)；ALLM(N-乙酰基-亮氨酸-亮氨酸-蛋氨酸(N-acetyl-Leu-Leu-Met))；ALLN(N-乙酰基-亮氨酸-亮氨酸-正亮氨醛(N-acetyl-Leu-Leu-Norleucinal))；NG-烯丙基-左旋精氨酸；氨基胍、半硫酸盐(hemisulfate)；1-氨基-2-羟胍；对甲苯磺酸盐；2-氨基-4-甲基吡啶；AMITU(1-氨基-S-甲基异硫脲(1-amino-S-methylisothiourea))；AMT(2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4H-1，3-噻嗪(2-Amino-5，6-dihydro-6-methyl-4H-1，3-thiazine))；S-苄基异硫脲；甲磺酸溴隐亭(bromocriptine mesylate)；L-刀豆氨酸硫酸盐；洋刀豆(canavalia ensiformis)；氯丙嗪、盐酸盐；姜黄素；姜黄(curcuma longaL)；环己酰亚胺；高纯度环己酰亚胺；环孢菌素；地塞米松、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶；NG，NG-二甲基-左旋精氨酸；NG，NG1-二甲基-左旋精氨酸；二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium)；DMHP(二甲庚基吡喃(dimethylheptylpyran))、S(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯；S-乙基-N-苯基异硫脲；2-乙基-2-硫代假脲(2-ethyl-2-thiopseudourea)；ETPI(S-乙基-N-[4-(三氟甲基)苯基]异硫脲(S-Ethyl N-[4-Triflurormethyl)phenyl]isothiourea))；碱性成纤维细胞生长因子；牛碱性成纤维细胞生长因子；重组人碱性成纤维细胞生长因子、GED(双(2-胍乙基二硫化物(bis-(2-guanidoethyl)-disulfide))；氟哌啶醇(haloperidol)；L-N6-(1-二乙酰氧乙基)赖氨酸(L-N6-(1-lminoethyl)lysine)、二盐酸盐；L-N5-(1-二乙酰氧乙基)鸟氨酸(L-N5-(1-lminoethyl)ornithine)；LY83583；LY231617；MEG(乙二醇)；褪黑激素；S-甲基异硫脲硫酸盐；S-甲基-L-硫瓜氨酸(S-methyl-L-thiodtrulline)、二盐酸盐；NG-单乙基-左旋精氨酸；NG-单甲基右旋精氨酸一醋酸盐；NG-单甲基左旋精氨酸的DiHABS(二-羟基偶氮苯-p′磺酸酯)盐；NG-单甲基左旋精氨酸；NG-单甲基左旋精氨酸的一水合HABS盐；NG-单甲基左旋高精氨酸；菌酚酸(mycophenolic acid)、L-NIL；可诱导的一氧化氮合成酶抑制剂套装(Calbiochem
Figure BPA00001368840400141
)；神经元一氧化氮合成酶抑制剂套装(set)(Calbiochem)；NG-硝基右旋精氨酸；NG-硝基左旋精氨酸；NG-硝基右旋精氨酸甲酯；NG-硝基左旋精氨酸甲酯；对氯化硝基四氮唑兰(p-nitrolue tetrazolium chloride)；7-硝基吲唑；7-硝基吲唑的钠盐；3-溴-7-硝基吲唑；3-溴-7-硝基吲唑的钠盐；NOS抑制剂套装(Calbiochem
Figure BPA00001368840400143
)、1，3-PBITU；羟乙磺酸戊氧苯脒；PPM-18；NG-丙基-左旋精氨酸；1-吡咯烷二硫代羧酸(1-pyrrolidinecarbodithioic acid)；SKF-525A；SKF-96365；水杨酸钠；亚精胺；三盐酸亚精胺；精胺；四盐酸精胺；L-硫瓜氨酸；Nα-甲苯磺酰基赖氨酸氯甲酮(Nα-tosyl-Lys chloromethylketone)；Nα-甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲酮(Nα-tosyl-Phe chloromethyl ketone)；TRIM(tripartite motif，三结构域蛋白)；以及原卟啉IX锌(II)。药物传递系统中可以含有NOS或NO产物的一种抑制剂或多种抑制剂的药学可接受盐。
可以提供在药物传递系统中的抗氧化物的非限制性列表包括N-乙酰基-L-半胱氨酸；N-乙酰基-S-法尼基-L-半胱氨酸；AG 1714；盐酸氨溴索；抗氧化剂套装(Calbiochem
Figure BPA00001368840400144
)；L-抗坏血酸；胆红素、胆红素游离酸、咖啡酸、CAPE；卡诺醇(carnsol)；(+)-儿茶酚；血浆铜蓝蛋白；人血浆铜蓝蛋白；腔肠素；二异丙基水杨酸铜；甲磺酸去铁胺；R-(-)-盐酸苄甲炔胺；DMNQ；DTPA；双酐；依布硒啉(ebselen)；鞣花酸；脱水鞣花酸；(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯；L-麦角硫因；二水EUK-8；去铁铁蛋白(apo-ferritin)、马脾去铁铁蛋白；无镉铁蛋白；马脾无镉铁蛋白；人肝铁蛋白；重组人铁蛋白H-链；重组人铁蛋白L-链；芒柄花黄素；还原型谷胱甘肽；还原型谷胱甘肽游离酸；谷胱甘肽单乙酯；α-硫辛酸；二氢-DL-α-硫辛酸(dihydro-DL-α-lipoicacid))；毛地黄黄酮(luteolin)、LY 231617；青霉胺；MCI-186；MnTMPyP、桑色素水合物；NCO-700；NDGA；对氯化硝基四氮唑兰；O-淳索克斯(O-trensox)；丙基没食子酸；白藜芦醇；迷迭香酸；(+)-芸香苷水合物；水飞蓟素类(silymarin group)；L-光千金藤定碱(L-stepholidine)；河谷地不容(stephania intermedica)；(±)-紫杉叶素；粉防己碱；DL-硫辛酸；硫氧还蛋白；重组人低内毒素硫氧还蛋白(human recombinant low endotoxinthioredoxon)；硫氧还蛋白II；酵母硫氧还蛋白II；重组酵母硫氧还蛋白II；DL-α-生育酚；生育酚套装(Calbiochem
Figure BPA00001368840400151
)；DL-α-生育酚醋酸酯、生育三烯酸套装(Calbiochem
Figure BPA00001368840400152
)、Trolox
Figure BPA00001368840400153
U-74389G；U-83836E；尿酸；和维生素E琥珀酸酯。药物传递系统中可以含有一种抗氧化剂或多种抗氧化剂的药学可接受盐。
可用于药物传递系统的自旋捕获剂试剂包括但不限于N-叔丁基-α苯基硝酸灵、坦波尔和DTCS(铁(II)N-(二硫代羧酸)肌氨酸Fe2+)。药物传递系统中可以含有一种自旋捕获剂或多种自旋捕获剂的药学可接受盐。
可用于药物传递系统的过氧亚硝基清除剂包括但不限于依布硒啉；FeTMPyP；FeTPPS；还原型谷胱甘肽；还原型谷胱甘肽游离酸；褪黑激素；MnTBAP；MnTMPyP；L-硒代蛋氨酸；和Trolox
Figure BPA00001368840400154
药物传递系统中可以含有一种或多种过氧亚硝基清除剂的药学可接受盐。
可以提供任意浓度的能有效清除自由基、防止自由基形成或能缓解一氧化氮相关应激的毒性的治疗剂。优选地，所述治疗剂在药物传递系统中的浓度为0.1-30％W/V(药物的质量/药物传递系统的体积)。所选择的治疗剂在药物传递装置中的浓度列于下表2中。
表2
Figure BPA00001368840400161
药物传递系统可以含有例如载体等的药物添加剂。本文使用的术语“载体”包括可接受的佐剂和载剂(vehicles)。药用可接受载体可以选自下列清单中的那些但不仅限于此：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、人血清清蛋白、缓冲物质、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素系物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、蜡、和聚乙二醇。
可以将治疗剂提供在小量的作为载体的稀释剂中。例如，1ml的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠(即孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮，21-(3-羧基-1-氧代丙氧基)-11，17-二羟基-6-甲基一钠盐，(6α，11β)(分子量496.53))治疗剂溶液可以含有40mg的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠；1.6mg的无水磷酸二氢钠；17.46mg的干燥的磷酸氢二钠；25mg的含水乳糖(lactose hydrous)；和8.8mg的苯甲醇作为防腐剂。可以在需要时调整各配方的pH值。例如，可以加入氢氧化钠从而使添加后的溶液pH在7-8范围内，并对于40mg/mL的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠溶液来说，张力(tonicity)为0.50容积渗克分子(osmolar)。可以将基质内的环境设计成与稀释剂或与向基质中加入治疗剂之前治疗剂存在的溶液相同、接近或者不同。例如，可以将1ml体积的含甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠的基质设计成含有与上述作为稀释剂的含量相同的的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、含水乳糖、苯甲醇、pH和稀释剂水。也可以使用其他的稀释剂。可以将治疗剂提供在任何药用可接受载体中。例如，可以将治疗剂提供在缓冲稀释剂中，如磷酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐水。
可以通过使聚合物溶解或浸泡在治疗剂溶液中来组装药物传递系统。当使用不同颗粒的组合或颗粒和水凝胶的组合时，基质成分能以混合或独立的形式与治疗剂接触。若针对各种颗粒、不同子集的颗粒或水凝胶使用不同的治疗剂，这些成分可以在使所有的聚合物成分组合在一起之前分别接触治疗剂。
已经开发了降解、药物释放以及体内分布的计算模型，来预测药物传递系统的时空药物曲线上不同的设计参数的效果。所述参数包括聚合物组成、分子量、多分散性、药物类型、药物大小、药物-聚合物相互作用和药物传递系统的几何结构。
如下文实施例7中所述地，混合了作为水凝胶的MW为400g/mol的聚(乙二醇)二丙烯酸酯和MW为11,600g/mol的PLGA聚合物的MW＝1300g/mol的乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯是一个非限制性实施例，该实施例中的水凝胶与颗粒的参数适合作为药物传递系统的一种实施方式。药物传递系统中也可以使用其他参数的水凝胶和颗粒。
可以将药物传递系统从损伤或炎症处区域注射到患者体内，或者使其沉积到通过手术而暴露的区域的位置内或该位置上。通过注射(而非手术介入)，药物传递系统可以以侵害性最小的方式进行给药。在一种优选实施方式中，仅需要进行一次给药来维持持续剂量。因此，可以直接使药物传递到损伤或炎症位点上，从而最小化因全身给药造成的副作用。优选但非排除性地，可以在该方法中采用乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的组合制成的水凝胶。所述药物传递装置的非限制性实例已在表1中列出。
一种治疗的方法为将药物传递系统注射到脊髓挫伤损伤内。该方法可以通过硬膜内髓内注射来实现。药物传递系统通过注射或植入的方式进入脊髓，药物或药物传递系统成分都不能穿过硬脊膜，且药物不能穿过血脑屏障。优选地，将药物传递系统设计成能与病理生理性升高同步地在持续时间段内释放治疗剂，从而能暂时地保持损伤处的自由基和自由基产物(部分由于小胶质细胞的活化以及嗜中性粒细胞浸润)的水平。优选但非排除性的是，可以在该方法中采用乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的组合制成的水凝胶。所述药物传递装置的非限制性实例已在表1中列出。
在一种优选实施方式中，将药物传递系统设计成能在治疗过程中通过水解发生降解，并能在不借助进一步手术介入的前提下，自体通过正常途径排出。优选但非排除性的是，可以在该方法中采用乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的组合制成的水凝胶。所述药物释放装置的非限制性实例已在表1中列出。
潜在药物传递系统测试
可以用本领域公知方法对治疗剂、基质及其组合进行测试。可以在体外使用一系列的一氧化氮供体(如SIN-1盐酸盐)来产生稳定水平的过氧亚硝基以及由于过氧亚硝基产生的自由基。继而，可以采用多种方法(如改良的格里斯试剂(Griess Reagent))通过测量亚硝酸盐来测定抗氧化剂的活性。典型商购的格里斯试剂为其中含0.2％的萘二胺二盐酸盐(naphthylenediamine dihydrochloride)和2％的对氨基苯磺酰胺的5％的磷酸。可以使用测量细胞膜完整性的乳酸脱氢酶(LDH)的线粒体活性的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)或MTS(单溶液细胞增殖分析)分析来测定细胞的体外完整性。参见Mosmann，T.(1983)RapidColorimetric Assay for Cellular Growth and Survival：Application toProliferation and Cytotoxicity Assays(细胞生长和存活的快速比色分析：对增殖和细胞毒性分析的应用).J.Immunol.Meth.65，55-63；和Wilson，A.P.(2000)Cytotoxicity and Viability Assays in Animal Cell Culture：A PracticalApproach(对动物细胞培养物的细胞毒性与生存能力的分析：一种实践的方法)，第三版.(Masters，J.R.W.编辑)牛津大学出版社：牛津大学2000，第一卷，通过引用将上述文献的全部引入本文。还可以测试药物传递系统减少细胞死亡或体外细胞膜损害，以及消除由供体(如SIN-1)产生的亚硝酸盐的能力。可以在体内研究后，通过免疫染色或使用针对过氧亚硝基氧化应激的标记物来测定治疗剂、基质或药物传递系统的效力。所述标记物包括但不限于3-硝基酪氨酸和4-羟基壬烯醛。
大鼠遭受中等挫伤损伤后由过氧亚硝基带来的氧化损伤在空间和时间上的特征已在Xiong，Y、Rabchevsky，A.G.和Hall，E.D.(2007)Role ofperoxynitrite in secondary oxidative damage after spinal cord injury(过氧亚硝基在脊髓损伤后的二次氧化损害中的作用).J.Neurochem.100(1)，639-649(“Xiong等人”)中进行了描述，将该文献的全部引入本文。Xiong等人提出了3-硝基酪氨酸-过氧亚硝基的特异性标记物在较早时间点上(1-3小时)迅速聚集，并与假手术大鼠相比，3-硝基酪氨酸的显著增加持续到损伤后1周。此外，Xiong等人还指出了与之一致并持续增长的与蛋白氧化有关的蛋白羰基的水平与脂质过氧化产生的4-羟基壬烯醛的水平。在损伤后24小时时观察到3-硝基酪氨酸和4-羟基壬烯醛的峰值增强。在免疫组化结果中，Xiong等人指出3-硝基酪氨酸和4-羟基壬烯醛的同位性(co-localization)说明了过氧亚硝基参与了脂质过氧化和蛋白硝化损害。氧化损害的另一结果是使细胞内钙超载增剧，这会激活半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶从而导致多个细胞内的目标，包括细胞骨架蛋白(α-血影蛋白)，发生降解。Xiong等人通过对α-血影蛋白分解产物的分析还发现，特异地由钙蛋白酶产生的α-血影蛋白的145千道尔顿的碎片在损伤后1小时后马上显著增加，尽管峰值增强在损伤后72小时候才出现。Xiong等人由此推断钙蛋白酶的后期活化作用很可能与过氧亚硝基介导的钙稳态的二次氧化损害有关。Xiong等人记载了可以用作标记物测试的候选治疗剂、基质及其组合。可用各种方法对标记物进行测定，包括Xiong等人描述的方法。在Xiong等人描述的方法中包括的外伤性脊髓挫伤大鼠模型，对3-硝基酪氨酸和4-羟基壬烯醛的免疫印迹法分析、对α-血影蛋白分解产物的蛋白质印迹(western blotting)、以及统计分析如下。
外伤性脊髓挫伤大鼠模型：根据Xiong等人，其中记载的所有研究均使用体重为200-225g的年轻雌性成年Sprague-Dawley大鼠(Charles River，Portage，MI，美国)。这些动物处于随机的生理周期，但在发情期阶段不对其进行测试。随意地对它们进行喂食和喂水。对T10椎骨进行椎板切除术前，用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)对大鼠进行麻醉。用InfiniteHorizon装置来造成脊髓损伤(Scheff，S.W.、Rabchevsky，A.G.、Fugaccia，I、Main，J.A.和Lumpp，J.E.Jr.(2003)Experimental modeling of spinal cord injury：characterization of a force-defined injury device(脊髓损伤实验建模：对规定力损伤装置的描述).J.Neurotrauma 20，179-193)，通过引用将该文献的全部引入本文)，该装置用不锈钢头的蓄力器(impounder)迅速施加规定力的冲击，从而对暴露的脊髓造成实质性的挫伤损伤。小心地进行椎板切除术，稍大于2.5mm的冲击器末端。用钳状骨针夹紧有喙的T9和尾侧T11椎体来固定脊柱。将脊柱与暴露的脊髓小心的排列在同一水平面上。在冲击过程中，步进电机推动成对的齿条向暴露的脊髓造成挫伤损伤。施加到脊髓上的力量为200千达因，造成了中等严重程度的损伤。冲击装置与PC相连，由PC记录蓄力器的速度、实际力量以及脊髓的位移。
在手术后不同时间点(1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、72小时和1周)，将第一组的动物(每个时间点6只大鼠)用过量戊巴比妥钠(150mg/kg)杀死。通过椎板切除术迅速地移除包括冲击中心的20mm的脊髓部分。将得到的组织在冷冻台上解剖并迅速转移到含有800μL的Triton裂解缓冲液[20mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷HCl(Tris-HCl)、150mmol/L的NaCl、1％的Triton X-100、5mmol/L的EGTA、10mmol/L的EDTA、20mmol/L的HEPES、10％的甘油溶液和蛋白酶抑制混合剂(Roche有限公司，Nutley，NJ，美国)]的离心管中，并进行短时的超声处理。去膜(dismembranation)后，将脊髓组织样品在4℃下以15000转/分钟的速度离心1小时，收集上清液，用蛋白测定试剂盒(Pierce Biotechnology有限公司，Rockford，IL，美国)测定蛋白质水平，然后将样品归一化至1μg/μL并在测定前储存在-80℃。用窄缝免疫印迹法(slot immunoblotting)对氧化损害进行评价。将2μg的蛋白样品加样到窄缝-印迹设备上测量最佳抗体结合灵敏度。用兔的多克隆抗HNE抗体(1∶5000；Alpha Diagnostics国际有限公司，San Antonio，TX，美国)来实现脂质过氧化。用兔的多克隆抗硝基酪氨酸抗体(1∶2000；Upstate USA有限公司，Charlottesville，VA，美国)来获得过氧亚硝基产生的3-硝基酪氨酸。使用氧化印迹技术(Oxy-Blot蛋白氧化检测试剂盒；Chemicon International，Temecula，CA，美国)来检测蛋白氧化。用Li-Cor奥德赛(Odyssey)红外成像系统(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA)来分析窄缝印迹分析，它使用了IRDye800-共轭的山羊-抗-兔IgG(1∶5000；Rockland，Gilbertsville，PA，美国)作为第二抗体。先进行初步研究来确定每组氧化标记密度计量学(densitometry)曲线的线性范围，由此证实得到的密度计量学读数没有超出精确量化的范围。
3-硝基酪氨酸与4-羟基壬烯醛的免疫组化：根据Xiong等人，在手术后不同时间点(1小时、3小时、6小时和24小时)，将第二组的动物过量给用戊巴比妥钠(150mg/kg)，并依次用150mL的0.1mol/L的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和其中含有4％的多聚甲醛的200mL的PBS(pH＝7.4)进行灌注。在不同的时间点切下以损伤中心为圆心的5mm脊髓片断，形成横截面图。损伤24小时候切下包括受冲击处的15mm的脊髓片断，形成纵截面图。采集完毕后，将脊髓浸入含4％多聚甲醛的PBS中4小时。然后将该组织转移到PBS中整夜，并在磷酸盐缓冲的20％蔗糖溶液中冷藏2天。从横向平面或纵向平面将脊髓制成20μm切片，并且将每第五个切片直接放在Superfrostplus载玻片(Fisher Scientific国际有限公司，汉普顿，NH，美国)上。收集完所有的脊髓切片后，将载玻片置于托盘上，并在4℃下储存以整夜脱水，然后将其储存在-20℃下直到染色。染色当天，将冷冻的载玻片从-20℃中取出并在20℃下解冻30分钟。用0.2mol/L的PBS进行漂洗后，将切片含3％过氧化氢的0.2mol/L的PBS中孵育30分钟，然后在封闭缓冲液(含5％的山羊血清，0.25％的Triton-X，1％奶粉的0.2mol/L的PBS)中孵育1小时，接着与兔多克隆抗-4-羟基壬烯醛(1∶5000)或抗-3-硝基酪氨酸抗体(1∶2000)接触整夜。第二天将切片在20℃下与生物素化的山羊-抗-兔第二抗体(1∶200，Vector ABC-AP试剂盒；Vector Labs，Burlingame，CA，USA)孵育2小时。漂洗后，将切片与VECTASTAIN ABC试剂(抗生物素蛋白DH和生物素化辣根过氧化物酶，Vector Labs)孵育1小时，接着用维克多布鲁法(Vector blue method)在黑暗处进行10-30分钟的染色(Vector BlueAlkaline Phosphatase Substrate试剂盒；Vector Labs)。反应后，用核快红(nuclear fast red)对脊髓切片进行复染色(Vector Labs)，脱水后用OlympusMagnafire数码相机(Olympus America有限公司，Melville，NY，USA)拍下其在Olympus Provis A70显微镜下的照片。
对α-血影蛋白分解产物的蛋白印迹法：Xiong等人指出将15微克的样品在含三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐电泳缓冲系统(running buffer system)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶[3-8％(w/v)丙烯酰胺，Bio-rad Criterion XT预制胶]上跑电泳，然后通过半干电转移单元(Bio-Rad实验室，Hercules，CA，美国)在20mA，15分钟下将其转移到硝酸纤维素膜上。用小鼠单克隆抗α-血影蛋白抗体对印迹进行探测(1∶5000，Affiniti有限公司，Ft.Lauderdale，FL，美国；现为Biomol International，LP Plymouth，PA，USA的部分)，该探针能识别针对280千道尔顿的母α-血影蛋白以及每一个150千道尔顿和145千道尔顿的蛋白水解片断上的抗原决定部位。与第一抗体接触后，在黑暗中使用IRDye800-共轭的山羊-抗-小鼠IgG(1∶5000；Rockland)第二抗体处理1小时。使用Li-Cor奥德赛红外成像系统进行蛋白印迹的成像分析，以定量分析145千道尔顿和150千道尔顿的α-血影蛋白分解产物(SBDP 145与SBDP 150)的量。每一个蛋白印迹包括标准化蛋白上样对照，以允许参考印迹和印迹之间的强度差进行校准。在其他研究中也使用了这种定量的方法((Kupina，N.C，Nath R，Bernath E.E.，Inoue J.，Mitsuyoshi A.，Yuen，P.W.，Wang，K.K.和Hall E.D.(2002)Neuroimmunophilin ligand V-10，367 isneuroprotective after 24-hour delayed administration in a mouse model of diffusetraumatic brain injury(在弥散性外伤性脑损伤小鼠模型中进行24小时延迟给药后，神经免疫亲和素配体V-10，367具有神经保护性).J.Cereb.BloodFlow Metab.22，1212-1221；Hall E.D.，Sullivan，P.G.，Gibson，T.R.，Pavel，K.M.，Thompson，B.M.和Scheff，S.W.，(2005)Spatial and temporal characteristics ofneurodegenerations after controlled cortical impact in mice：more than a focalbrain injury(对小鼠进行受控脑皮层冲击后的神经退行性变的时空特性：不仅是中心脑损伤).J.Neruotrauma 22，252-265，将上述两篇文献的全部内容引入本文。
统计分析：Xiong等人采用了定量密度计量学分析来读出窄缝印迹和蛋白免疫印迹分析。使用STATVIEW软件包(JMP Software，Cary，NC，美国)来进行统计分析。所有的数值被表示为平均数±SEM。先进行双因素方差分析法(two-way analysis ofvariance)。如果对变量的分析反映了显著性(p＜0.05)效果，则进行事后测试(post hoc testing)，利用F测验保护最小显著差数法(Fisher′s protected least significant difference(PLSD))，比较个体外伤后的时间点和假手术、未受伤组的时间点。在所有情况下，p＜0.05被认为是显著的。
采用Xiong等人列举的以及上文描述的测试，能对任何治疗剂、基质或药物传递系统进行测试。治疗剂、基质或药物传递系统可以通过手术植入或者在SCI后通过注射植入，然后可以继续进行标记物测试(如Xiong等人中记载的)。同样地，可以对免疫应答标记物(如Glial Fibrilary酸性蛋白(GFAP))进行监测以追踪炎症应答。可以对整个损伤范围用苏木精或曙红进行染色以监测治疗的效果。
本文描述的基质可以单独使用、接种细胞使用、与药物结合使用或与其他聚合物共混使用以得到最优化的功能。可以最优化的功能包括降解速率、机械性能以及小尺寸特征。最优化的方法包括将颗粒、水凝胶或颗粒与水凝胶配置成可注射支架(scaffold)的至少一部分，该可注射支架可作为假体或组织工程学位点。水凝胶和/或颗粒能携带细胞、药物或其他有利于组织工程学的聚合物。颗粒和/或水凝胶可以含有多肽序列来促进细胞粘着(如RGB或IKVAV)，该多肽序列可以通过交联作用而引入聚合物网络成为聚合物单体的一部分，或被物理约束在网络中。美国专利号NO.5,759,830；NO.5,770,417；NO.5,770,193；NO.5,514,378；NO.6,689,608；NO.6,281,015；NO.6,095,148；NO.6,309,635；和NO.5,654,381中涉及了聚合物的合成、使聚合物最优化、将聚合物接种细胞、以及组织支架的制备，在此，通过引用将这些专利中记载的全部内容引入本文。
虽然对脊髓损伤进行治疗代表了一种优选实施方式，本药物传递系统还可以用来治疗外周神经损伤、中风、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循环休克、慢性炎症性疾病、癌症和神经退行性疾病。本药物传递系统还可以用来治疗的其他疾病包括但不限于在Pacher，P.，Beckman，J.S.，Liaudet，L.(2007)Nitric oxide and peroxy nitrite in health and disease(健康与患病人群中的一氧化氮和过氧亚硝酸盐).Physiol.Rev.87，315-424中进行了记载的那些，通过引用将该文献记载的全部内容引入本文。为了对这些病况(包括脊髓损伤)中的任何一种进行治疗，将所述药物传递系统给药在由疾病引起的损伤部位处。给药可以通过各种方式，包括但不限于手术植入或注射。
本领域技术人员可以理解的是，两种或多种的上述实施方式可以是彼此相容的并且可以互相组合实施。
在另一种替代实施方式中，可以按上文描述将自由基清除剂(如抗坏血酸)加入基质中，且该组合能作为食品和包装工业中的防腐剂加以利用。比如说，能将可食用的抗氧化剂提供在可食用的基质中，优选将维生素C提供在聚乳酸系聚合物基质中。
实施例
实施例1-多嵌段共聚物的合成：PGA-PEG-PGA(聚(乙交酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乙交酯))
该聚合物为热敏性嵌段共聚物的实例，它含有共聚在亲水性聚合物两端的疏水性端基。它是一种用作热敏性水凝胶的两亲性三嵌段共聚物。该例中，通过开环聚合来构建疏水性的端链。
材料
1克的聚乙二醇，MW 4000＝0.00025mol；
0.05mol的乙交酯＝5.805克的乙交酯；以及
辛酸亚锡作为催化剂，0.025重量％＝1.7mg的辛酸亚锡，密度＝1.251g/mL，1.36微升
方法
1、将干燥的PEG与乙交酯置于烘干的schlenk烧瓶内，在真空下用搅拌棒搅拌40分钟。
2、使PEG与乙交酯在150℃下熔融，逐滴加入15微升含催化剂的丙酮。
3、将该反应进行到熔融物变成琥珀色且具有粘性为止。
实施例2-多嵌段共聚物的合成：PLGA-PEG-PLGA(聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(丙交酯-共-乙交酯))
这是另一个用于热敏性水凝胶的两亲性三嵌段共聚物的实例。
材料
PEG-4000：0.000125mol，0.5g；
乙交酯：0.00625mol，0.725625g；
D，L-丙交酯：0.00625mol，0.9008125g；以及
辛酸亚锡作为催化剂：总进料的0.05％＝0.85mg的辛酸亚锡，密度＝1.251g/mL，0.68微升。
方法
1、将PEG、乙交酯与丙交酯加入烧瓶中。将该烧瓶置于真空下后向其中充满氩气。
2、使PEG、乙交酯与丙交酯在150℃下熔融，并逐滴加入15微升含催化剂的丙酮。
3、使该反应进行1小时45分钟。
图1、图2和图3证实成功合成了CP-PLGA-pPEG-PLGA-1三嵌段共聚物。3.5-3.7ppm处(4个氢)的位移显示了PEG中的亚甲基，4.6-4.9ppm处(2个氢)的位移显示了PGA中的亚甲基，以及5.2ppm处(1个氢)的位移显示了PLA中的次甲基。
这些峰值具有下列面积：PEG＝15.57/4＝3.8925；PGA＝3.6/2＝1.8；以及PGA＝1。PEG(Fluka)的聚合物分子量＝4000g/mol，其中单体MW＝44，因此聚合度＝91。PLA单体的MW＝72，聚合度＝91/3.8925＝23.38，且聚合物MW＝1683.24。PGA单体MW＝58，聚合度＝91/(3.8925/1.8)＝42.08，且聚合物MW＝2440.69。PLGA-PEG-PLGA总分子量：8881.38g/mol。PEG嵌段的分子量约为4000g/mol。每个PLGA嵌段约为4881.38g/mol，其中PLGA中乳酸与乙醇酸单体的比值约等于36∶64。
实施例3-多嵌段共聚物的合成：CTA-CP-PLGA-pPEG-PLGA-CTA
该聚合物用作多嵌段共聚物的可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合的巨链转移剂(macro-chain-transfer-agent)的实例。本例中，所述巨链转移剂为三嵌段的，并且能用来制备具有5个或更多个嵌段的两亲性多嵌段共聚物。
材料
上述CP-PLGA-pPEG-PLGA，或任何其他具有双功能性羟基端基的聚合物；
S-(硫代苯甲酰)-硫代乙醇酸(CTA)或其他的酸性链转移剂(acid chaintransfer agent)；以及
活化链转移剂的二环己基碳二亚胺(DCC)。
方法
1、将100mg的CP-PLGA-pPEG-PLGA-1(1.126×10-5mol，8881.38g/mol)溶解在1mL的无水二氯甲烷中。
2、将两倍于CP-PLGA-pPEG-PLGA-1摩尔数的DCC(4.65mg)与五倍于CP-PLGA-pPEG-PLGA-1摩尔数的CTA(11.95mg)在搅拌下加入圆底烧瓶内。
3、将烧瓶在真空下放置1小时。
4、用氩气替代真空。
5、向烧瓶中加入1mL的无水二氯甲烷。
6、将溶解的聚合物逐滴加入到烧瓶中，然后在室温下搅拌过夜(300rpm)。
7、使获得的溶液在100mL乙醚中进行沉淀。
8、通过真空过滤器用滤纸对混合物进行过滤，并将沉淀干燥。
参见图4，链转移剂的存在在1H-NMR分析中并不明显。但实施例4的的精炼过程增强了将链转移剂耦合到具有羟基端基的聚合物上的效果。
实施例4-多嵌段共聚物的合成：DJS-CP-CTA-Cl
使用酰氯形式的RAFT链转移剂来增加与具有羟基端基的聚合物的反应活性。如前文描述，这能在不希望使用碱性催化剂(如4-二甲基氨基吡啶(DMAP))的时候有效地促进酸性链转移剂(CTA)的耦合，原因在于碱性催化剂会增加大分子单体中α-羟基-酸聚合物嵌段(alpha-hydroxy-acidpolymer block)或其他可能的酯嵌段在碱催化下发生酯水解的风险。
材料
S-(硫代苯甲酰)-硫代乙醇酸或其他的CTA
草酰氯
方法
1、在50mL的干燥的圆底烧瓶中，使0.5g的S-(硫代苯甲酰)-硫代乙醇酸在搅拌下溶解于无水二氯甲烷中，并将其浸没在冰水浴中冷却至0℃。
2、在氮气下缓慢加入1.2mol当量的草酰氯，然后使溶液至室温，搅拌3小时。
3、对溶液进行减压浓缩以生成酰氯，或使其残留在二氯甲烷中。
图5阐述了得到的S-(硫代苯甲酰)硫代乙醇酰氯DJS-CP-硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-1的1H-NMR谱。
实施例5-多嵌段共聚物的合成：使CTA-Cl耦合到CP-PLGA-pPEG-PLGA-1上
该方法证实了能成功地利用酰氯形式的链转移剂(用于耦合聚合物)来产生用于对形成热敏性共聚物的嵌段进行RAFT共聚反应的巨链转移剂。
方法
1、将1mL的含100mg干燥CP-PLGA-pPEG-PLGA-1的无水二氯甲烷置于Schlenk烧瓶中，然后加入7.84微升的三乙胺。
2、然后在惰性气体下将混合物冷却至0℃。
3、缓慢地加入DJS-CP-硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-1(5倍于聚合物摩尔数的酰氯，在0.346mL的二氯甲烷中)。
4、反应温度至室温，并反应24小时。
5、对溶液进行过滤以除去三乙胺盐。
6、使过滤后的溶液在乙醚中进行沉淀以除去未反应的酰氯和三乙胺。
7、过滤后，对沉淀进行真空干燥。
图6显示了CP-PLGA-pPEG-PLGA-1共聚物能成功地被RAFT链转移剂端基(7.6，8.0ppm)官能化，从而产生用于RAFT共聚反应的巨链转移剂来加成更多的聚合物嵌段。RAFT共聚反应过程可以向所述三嵌段中加成低聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，生成能用于可注射的水凝胶药物传递装置或可注射的组织工程学支架的、具有热敏性的生物相容且生物可降解的五嵌段共聚物。
实施例6-多嵌段共聚物的合成：PGS-CTA
聚(甘油-共-癸二)酸中的羟基基团可以被RAFT链转移剂官能化，如前文所述地，利用酸或酰氯形式的链转移剂使CP-PLGA-pPEG-PLGA-1官能化。例如，聚(甘油-共-癸二)酸的羟基能通过与低聚(乙二醇甲基丙烯酸甲酯)进行RAFT从而被官能化，进而生成能形成热敏性弹性网络的接枝共聚物。
材料1
聚(甘油-共-癸二酸)；
S-(硫代苯甲酰)-硫代乙醇酸链转移剂(CTA)或其它的酸性CTA；
活化CTA的二环己基碳二亚胺(DCC)；以及
作为碱性催化剂的DMAP。
方法1
1、使0.5g的PGS(约1.95mmol的羟基基团)溶解于5mL的无水二氯甲烷中。
2、将与PGS中的羟基基团等摩尔的DCC(0.402g)和大于PGS的量的CTA(0.414g)在搅拌下加入到圆底烧瓶中。然后加入0.1mol的DMAP(相较于PGS中羟基基团)。
3、将烧瓶在真空下放置1小时。
4、用氩气替代真空。
5、向烧瓶中加入无水二氯甲烷以使DCC、CTA和DMAP溶解。
6、将步骤1中已溶解的PGS聚合物逐滴地加入到烧瓶中，并在室温下搅拌过夜(300rmp)。
7、使得到的溶液在250mL的乙醚中进行沉淀。
8、用滤纸对产物进行真空过滤，并干燥沉淀。
材料2
聚(甘油-共-癸二酸)
DJS-CP硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-1或其他的酰氯链转移剂；以及
作为碱性催化剂的三乙胺。
方法2
1、将1mL的含100mg干燥PGS的无水二氯甲烷置于Schlenk烧瓶中。然后加入三乙胺(与酰氯的摩尔数相等)。
2、在惰性气体下，将混合物冷却至0℃。
3、缓慢加入DJS-CP-硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-1(相对于期望的聚合物羟基基团的官能度的摩尔数2倍摩尔数的酰氯)。
4、反应温度至室温，并反应24小时。
5、对溶液进行过滤以除去三乙胺盐。
6、使过滤后的溶液在乙醚中进行沉淀以除去未反应的酰氯和三乙胺。
7、过滤沉淀并真空干燥。
如图7所示地，该方法能产生被S-硫代苯甲酰-硫代乙醇酸链转移剂官能化的CP-PGS-CTA聚(甘油-共-癸二酸)。
实施例7-在体外和体内测试的可注射水凝胶
在体外测试的可注射水凝胶
水溶性聚合物化合物的定义是，它能在生理学病况下迅速胶凝，并展现了可调的膨胀特性。这些聚合物包括以下：
1、乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯(ETTMP1300)，CAS345352-19-4。MW 1300g/mol。Bruno Bock GmbH，Marschacht，德国。
2、乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯(ETTMP700)，CAS345352-19-4。MW 700g/mol，Bruno Bock GmbH，Marschacht，德国。
3、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA400)，CAS 26570-48-9。MW 400g/mol，Polysciences，Warrington，PA，美国。
4、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA400)，CAS 26570-48-9。MW 4000g/mol，Polysciences，Warrington，PA，美国。
配制
ETTMP1300与ETTMP700含有3个硫醇官能团。PEGDA400 andPEGDA4000含有两个丙烯酸酯官能团。可以使这些化合物结合起来使硫醇与丙烯酸酯官能团的比例等摩尔。然后将上述化合物以20质量/体积/％、25质量/体积/％、30质量/体积/％(溶液中全部的聚合物)溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco，Carlsbad，CA)中。可以使用任何含丙烯酸酯和硫醇的聚合物组合。但是越高分子量的丙烯酸酯会造成越大的膨胀。故为了降低膨胀，可以利用较低分子量的丙烯酸酯(如具有与PEGDA400的分子量接近的分子量)。
溶胶向凝胶的转化速率
将200微升的不同浓度的聚合物与盐水溶液(ETTMP1300/PEGDA400)置于1.5mL的微量离心管(Eppendorf tubes)内，并在37℃下孵育或者置于22℃的室温中，无光。下表1示出了从溶胶转化为凝胶的时间，当溶液不再流动时，认为已经发生了，这通过上下翻转管子并用手摇动进行监测(每组3个样品)。
表1转化率作为硫醇-丙烯酸酯在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水中的浓度的函数
Figure BPA00001368840400321
膨胀测试
1.5mL的凝胶(n＝6)在37℃下固化，确定质量和体积，然后加入到300mL的pH为7.4的37℃的磷酸盐缓冲盐水中，并平衡7天。
膨胀比(swelling ratio)定义为水凝胶在达到平衡时的体积与固化后水凝胶的初始体积的比值。另一个信息指示性的度量为初始水凝胶聚合物的重量百分数与平衡时水凝胶聚合物的重量百分数的比值。初始聚合物的重量百分数由配方决定。平衡聚合物的重量百分数通过测量水凝胶达到平衡后的湿重而确定。然后，将水凝胶冷冻干燥后测量干重。通过干重与湿重的比值来确定平衡聚合物的重量百分数。将平衡聚合物的重量百分数与初始聚合物的重量百分数相比也能表明膨胀。可以通过比较平衡后的干重与最初加入到水凝胶的聚合物重量来监测水凝胶转化与降解的程度。
在体内测试的可注射水凝胶
通过混合两种原液来制备25重量/体积％的ETTMP1300与PEGDA400的溶液：1号瓶，3.28mL的含1720mg的ETTMP1300的PBS；以及2号瓶，4.21mL的含794mg的PEGDA400的PBS。原液经过无菌过滤(0.2μm的Supor membrane Acrodisc注射器式过滤器，PALL生命科学)，并在无菌条件下用移液管分离成200μL的等份。
通过椎板切除术使T8脊髓暴露后，用Infinite Horizon蓄力器(250千达因)对250g的麻醉(异氟醚)的大鼠造成挫伤损伤。
在损伤后6小时(4只大鼠)或3天(4只大鼠)，再次对大鼠进行麻醉并使挫伤处的脊髓再次暴露。使用立体定位架的情况下，将装有5μL的盐水和15μL的硫醇-丙烯酸酯凝胶溶液(将两等份的200μL的含有ETTMP1300和PEGDA400的PBS混合得到)的25μL的注射器(Hamilton1802RN，26号锤头缝合针)插入脊髓内1.1mm以达到损伤的中心(从硬脊膜背侧中间表面开始测量)。以3μL/min的速度注射凝胶超过5分钟。注射器内额外的盐水用来防止凝胶粘附在注射器上，从而凝胶不会在移开注射器时被带走。余下的水凝胶在进行等量混合后，在室温下约20分钟内发生固化。在脊髓内，假定凝胶在少于7分钟的时间内完全固化。移开注射器后，能在进行注射后5-7分钟观察到少量残留的凝胶。
用Basso Beattie Bresnahan(BBB)对受到损伤但不进行注射的对照组进性评估，从而来监测大鼠在14天内的机能。两周后，对大鼠实施安乐死并采集脊髓进行组织分析以评价损伤(苏木精与曙红染色)和炎症标记物(GFAP，Iba1免疫组化)的大小和特征。
实施例8-甲基脱氢皮质醇微米颗粒
制备
制备一批单面(single emulsion)乳剂微米颗粒(约250mg)的方法说明如下。
溶液的配制
用乙醇和丙酮对所有的烧杯进行清洗以简单地防止污染。用蒸馏去离子水与0.25重量％的聚(乙烯醇)(PVA)和0.5M的氯化钠(NaCl)来制备800mL的水溶液。用加热板来使固体溶解以加速过程，并允许溶液达到室温(否则均质过程会产生泡沫)。制备1升的0.5M氯化钠溶液。称取450mg的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)(前Boehringer Ingelheim RG502H，MW 11,600g/mol)并将其溶解在1.1mL的二氯甲烷(DCM)中。称取50mg的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠(MPss)并将其溶解于400μl的甲醇中。混合二氯甲烷溶液与甲醇溶液。
均质化作用(Homogenization)
准备具有中等尺寸头部的均质器，用水和丙酮对其进行洗涤，然后再用水洗涤。将均质器头部降低伸入800mL的PVA/NaCl的溶液中并将速度设定至6500rpm。用玻璃离移液管注入混合的PLGA/DCM/MPss/甲醇混合物，并进行20秒的均质化作用。升高头部并用水漂洗。将均质后的溶液(约为800mL)倒入1升的0.5M的NaCl溶液中。以400rpm用磁性搅拌器在搅拌板上搅拌1小时。
过滤、清洗和冻干
在真空下通过乙酸乙酯过滤器搅拌过滤1.8升的溶液以除去PVA和DCM。用蒸馏水漂洗并收集过滤器上的微米颗粒。将悬浮的微米颗粒倒入50mL的离心管内。以1500rcf下离心3分钟。除去上清液并用蒸馏去离子水重悬颗粒。重复三次。进行最后一次离心步骤后，除去上清液并用5mL的蒸馏去离子水重悬。用液氮冷冻离心管中的悬浮液，并置于冻干机内数百毫托的真空下进行冻干。将等量的干燥微米颗粒置于微量离心管内，并将其包装进行电子束灭菌(3mRad)。
甲基脱氢皮质醇在体外从悬浮在硫醇-丙烯酸酯水凝胶的微米颗粒中释放
建立释放研究
通过使16mg的甲基脱氢皮质醇PLGA微米颗粒(按上述进行制备)与160μL的25重量/体积％的硫醇-丙烯酸酯水凝胶溶液一起振荡，来使微米颗粒悬浮在水凝胶中。将50μL的悬浮液用移液管移至15mL的离心管内三次，凝胶在管底部固化。向管内水凝胶顶部加入10mL的PBS，将管密封后置于37℃的定轨摇床上。每隔14天的时间间隔，从上清液中获取等量300μL的溶液。
HPLC对药物释放的分析
用高压液相色谱(HPLC)通过对各个时间点获取的样品的分析来测量甲基脱氢皮质醇从水凝胶-微米颗粒储存物中的释放速率。
采用了Agilent 1100 HPLC系统，使用238nm的紫外(UV)检测器。使用了Atlantis dC18 5μm 4.6mm×250mm的柱(Waters，Ireland)。流动相中含有乙腈、水和甲酸(体积比为60∶40∶1)，流动速率为1mL/min。注射体积为5μL。甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠在上述条件下的保留时间为8.4分钟。通过6个进行几何稀释(从85μg/mL至2.66μg/mL)的样品绘出基于峰面积的标准曲线，线性回归R平方值为0.9997。
图8示出了基于三种50μL含5mg的微米颗粒的水凝胶中水凝胶-微米颗粒的释放曲线。
实施例9-对外伤性脊髓损伤进行治疗的剂量
在大鼠脊髓中，将15μL的水凝胶注射到硬膜内(intradural)髓内(intramedullary)挫伤损伤中心是可行的。根据实施例8的配方(25重量/体积％的硫醇-丙烯酸酯水凝胶溶液与含有微米颗粒的1.5mg的甲基脱氢皮质醇)，这是与15μg的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠以受控的方式在1-2周时间内释放的剂量相对应的。在临床设定中，基于人脊髓在T8处的直径约为10mm，而大鼠中为2.8mm的事实，可以向人脊髓损伤内注入150μL的水凝胶以获得相同的作用。这与在二次损伤的过程中直接从损伤位置处释放的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠的150μg的剂量相对应。
实施例10-外周神经治疗
对因外伤或慢性退行性变(如神经根压迫)造成的对外周神经损伤而引起的炎症来说，可以在靠近损伤位置处注射水凝胶。在这些病例中，剂量可以根据炎症处周围可利用的空间而改变。例如，如果可以在神经周围注射1mL的水凝胶，则可以给药1mg剂量的能在1-2周内进行释放的甲基脱氢皮质醇琥珀酸钠。
因此，应该理解的是，本发明不限于所公开的具体实施方式，而旨在覆盖所有由随附权利要求书；以上的说明书和/或附图中界定的本发明实质和范围内的改变。

Claims (65)

1.一种在患者损伤处对损伤进行治疗的方法，其特征在于，该方法包括在损伤处向患者给药含有基质和一种或多种治疗剂的药物传递系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给药的步骤包括在损伤处将药物传递系统注射到患者体内。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述基质包括热敏性水凝胶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶包括多嵌段共聚物，其中所述共聚物选自由含乙二醇聚合物、含低聚乙二醇聚合物、含聚乙二醇聚合物、丙交酯聚合物、乙交酯聚合物和聚(甘油-共-癸二酸)所组成的组中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶包括具有相容的活性端基的聚合物的组合。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶包括含硫醇聚合物与含丙烯酸酯聚合物的硫羟酸酯。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶包括选自由聚(甘油-共-癸二酸)丙烯酸酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)与聚(乙二醇)或低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯的多嵌段共聚物；聚(甘油-共-癸二酸)与聚(乙二醇)、低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯或聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝共聚物；和乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羟酸酯所组成的组中的一种或多种聚合物。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶包括乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羟酸酯。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶为生物可降解的且该水凝胶的成分为生物可降解的或生物相容的且可排出，或者该水凝胶含有生物可降解成分与生物相容且可排出成分的混合物。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，所述基质包括颗粒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述颗粒为微米颗粒、纳米颗粒或微米颗粒与纳米颗粒的组合。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述颗粒包括生物可降解聚合物，可排出的生物相容聚合物，或含有生物相容且可排出成分的生物可降解聚合物。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述颗粒包括聚酯。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述颗粒包括选自由聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚丙交酯、聚乙交酯；和聚(羧基苯氧基丙烷)-共-癸二酸)所组成的组中的一种或多种聚合物。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述颗粒为包括聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米颗粒。
16.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括选自由NOS或NO产物的抑制剂、抗氧化剂、自旋捕获剂和过氧亚硝基清除剂，或它们的药学可接受盐所组成的组中的一种或多种物质。
17.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括选自由一种抗氧化剂或多种抗氧化剂、坦波尔(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基)、尿酸、二甲胺四环素、甲基脱氢皮质醇、MnTBAP和地塞米松，或它们的药学可接受盐所组成的组中的物质。
18.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇或其药学可接受盐。
19.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括二甲胺四环素或其药学可接受盐。
20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇和二甲胺四环素，或它们的药学可接受盐。
21.根据权利要求2所述的方法，其中，所述基质被一种或多种治疗剂或它们的药学可接受盐官能化。
22.根据权利要求2所述的方法，其中，所述损伤处位于脊髓内，且所述注射的步骤包括硬膜内髓内注射。
23.根据权利要求2所述的方法，其中，所述损伤处为外周神经。
24.根据权利要求2所述的方法，其中，所述基质包括热敏性水凝胶和颗粒。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂溶解或分散于热敏性水凝胶中、颗粒中或热敏性水凝胶与颗粒中均有。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂为多种治疗剂，且该多种治疗剂中的一种或多种溶解或分散在水凝胶中，而该多种治疗剂中其它的一种或多种溶解或分散在颗粒中。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，所述热敏性水凝胶包括乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羟酸酯，且所述颗粒包括含有聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米颗粒；且
所述一种或多种治疗剂包括选自由NOS或NO产物的抑制剂、抗氧化剂、自旋捕获剂和过氧亚硝基清除剂或它们的药学可接受盐所组成的组中的一种或多种物质。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇或其药学可接受盐。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括二甲胺四环素或其药学可接受盐。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇和二甲胺四环素，或它们的药学可接受盐。
31.根据权利要求27所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂溶解或分散于微米颗粒中。
32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述损伤处位于脊髓内，且所述注射的步骤包括硬膜内髓内注射。
33.根据权利要求27所述的方法，其中，所述损伤处为外周神经。
34.根据权利要求27所述的方法，其中，水凝胶和微米颗粒之一或二者被一种或多种治疗剂官能化。
35.根据权利要求2所述的方法，其中，所述一种或多种治疗剂包括维生素C和维生素E。
36.一种药物传递系统，其特征在于，该药物传递系统含有基质和一种或多种治疗剂。
37.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述基质包括热敏性水凝胶。
38.根据权利要求37所述的药物传递系统，其中，所述热敏性水凝胶包括多嵌段共聚物，其中该聚合物选自由含乙二醇聚合物、含低聚乙二醇聚合物、聚乙二醇聚合物、丙交酯聚合物、乙交酯聚合物和聚(甘油-共-癸二酸)所组成的组中的一种或多种。
39.根据权利要求37所述的药物传递系统，其中，所述热敏性水凝胶包括具有相容的活性端基的聚合物的组合。
40.根据权利要求37所述的药物传递系统，其中，所述热敏性水凝胶包括含硫醇聚合物与含丙烯酸酯聚合物的硫羟酸酯。
41.根据权利要求37所述的药物传递系统，其中，所述热敏性水凝胶包括选自由聚(甘油-共-癸二酸)丙烯酸酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)与聚(乙二醇)或低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯的多嵌段共聚物；聚(甘油-共-癸二酸)与聚(乙二醇)、低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯或聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝共聚物；和乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羟酸酯所组成的组中的一种或多种聚合物。
42.根据权利要求37所述的药物传递系统，其中，所述热敏性水凝胶包括乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羟酸酯。
43.根据权利要求37所述的药物传递系统，其中，所述热敏性水凝胶为生物可降解的且该水凝胶的成分为生物可降解的或生物相容且可排出的，或者该水凝胶含有生物可降解成分与生物相容且可排出成分的混合物。
44.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述基质包括颗粒。
45.根据权利要求44所述的药物传递系统，其中，所述颗粒为微米颗粒、纳米颗粒或微米颗粒与纳米颗粒的组合。
46.根据权利要求44所述的药物传递系统，其中，所述颗粒包括生物可降解聚合物，可排出的生物相容聚合物，或含有生物相容且可排出成分的生物可降解聚合物。
47.根据权利要求44所述的药物传递系统，其中，所述颗粒包括聚酯。
48.根据权利要求44所述的药物传递系统，其中，所述颗粒包括选自由聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚丙交酯、聚乙交酯；和聚(羧基苯氧基丙烷)-共-癸二酸)所组成的组中的一种或多种聚合物。
49.根据权利要求44所述的药物传递系统，其中，所述颗粒为包括聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米颗粒。
50.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括选自由NOS或NO产物的抑制剂、抗氧化剂、自旋捕获剂和过氧亚硝基清除剂，或它们的药学可接受盐所组成的组中的一种或多种物质。
51.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括选自由一种抗氧化剂或多种抗氧化剂、坦波尔(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基)、尿酸、二甲胺四环素、甲基脱氢皮质醇、MnTBAP和地塞米松，或它们的药学可接受盐所组成的组中的物质。
52.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇或其药学可接受盐。
53.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括二甲胺四环素或其药学可接受盐。
54.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇和二甲胺四环素，或它们的药学可接受盐。
55.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述基质被一种或多种治疗剂或它们的药学可接受盐官能化。
56.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述基质包括热敏性水凝胶和颗粒。
57.根据权利要求56所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂溶解或分散于热敏性水凝胶中、颗粒中或热敏性水凝胶与颗粒中均有。
58.根据权利要求57所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂为多种治疗剂，且该多种治疗剂中的一种或多种溶解或分散在水凝胶中，而该多种治疗剂中其它的一种或多种溶解或分散在颗粒中。
59.根据权利要求56所述的药物传递系统，其中，
所述水凝胶包括乙氧基化三羟甲基丙烷三-3-巯基丙酸酯与聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羟酸酯，且所述颗粒包括含有聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米颗粒；且
所述一种或多种治疗剂包括选自由NOS或NO产物的抑制剂、抗氧化剂、自旋捕获剂和过氧亚硝基清除剂或它们的药学可接受盐所组成的组中的一种或多种物质。
60.根据权利要求59所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇或其药学可接受盐。
61.根据权利要求59所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括二甲胺四环素或其药学可接受盐。
62.根据权利要求59所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括甲基脱氢皮质醇和二甲胺四环素，或它们的药学可接受盐。
63.根据权利要求59所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂溶解或分散于微米颗粒中。
64.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，水凝胶和微米颗粒之一或二者被一种或多种治疗剂官能化。
65.根据权利要求36所述的药物传递系统，其中，所述一种或多种治疗剂包括维生素C和维生素E。
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