CN102844028A - Hcv大环抑制剂、非核苷和核苷的组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大环HCV蛋白酶抑制剂、大环非核苷HCV聚合酶抑制剂和核苷HCV聚合酶抑制剂的组合。

Description

HCV大环抑制剂、非核苷和核苷的组合

发明领域

本发明涉及HCV的大环NS3/4A蛋白酶抑制剂、抑制HCV NS5B聚合酶的非核苷和抑制HCV NS5B聚合酶的核苷的组合。

发明背景

丙型肝炎病毒(HCV)，属黄病毒科(Flaviviridae family)的肝病毒属的成员，是全世界慢性肝病的最主要原因。尽管诊断学和血液筛查的发展已经相当地降低新的感染率，HCV仍然是全球卫生负担，原因是其慢性性质和其长时期损害肝脏的潜在性。有六种主要的HCV基因型(1-6)和多种亚型(用字母表现)。基因型1b在欧洲占主导，而基因型1a在北美洲占主导。基因型在确定对疗法的潜在反应和这样的疗法所需的时程具有临床上的重要性。

HCV主要由血液接触传播。在最初的急性感染之后，多数感染的个体发展为慢性肝炎，因为HCV优先在肝细胞中复制但不直接引起细胞病变。经过数十年，相当数量的感染者发展为纤维化、硬化和肝细胞性肝癌，而慢性HCV感染为肝移植的最主要原因。这种情形和累及的患者数量已经使得HCV称为相当多的医学研究的焦点。

HCV基因组的复制由许多酶介导，在这些酶中有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶和其相关联的辅因子NS4A。在此过程中的另一个重要的酶是NS5B聚合酶。NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B聚合酶均被认为对病毒复制是重要的且这些酶的抑制剂被认为是HCV治疗的候选药物。

现行的保健标准由每周一次的聚乙二醇化的干扰素-α (IFN-α)和每天两次的利巴韦林的联合疗法构成，且能治愈~80%的基因型2或3感染的患者，但仅治愈40-50%的基因型1患者。除了基因型1型患者的低成功率外，该项治疗也与包括流感样症状、贫血和抑郁的一系列副作用相关联。因此对特别具克服现行的HCV疗法的缺点的更安全和更有效药物存在需求，所述缺点有诸如副作用、功效受限、耐受差、出现抗药性以及依从性失败。

HCV聚合酶的高度差错率加上高的病毒周转率(viral turnover)，产生各患者中的HCV基因组异种群，并依据这些变异体的频率和适合度(fitness)不同而异，提供高的病毒清除门槛(hurdle)。因而可能未来的疗法将包括多种抗病毒药物，如果需要与IFN-α和利巴韦林的组合，以增强抗病毒效应，以及也提高抗药性发生的界限，最终改善持续的病毒学反应(sustained virologic response) (SVR)率。

已经描述多种不同的抑制HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的药物。WO 05/073195公开了线性和大环NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中心为取代的脯氨酸部分和WO 05/073216，公开了具有中心环戊基部分的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在这些中，由于大环衍生物的效力和有趣的药代动力学特性，它们是具有吸引力的。WO 2007/014926公开了一系列大环NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂。在这些中，化合物(1R,4R,6S,15R,17R)-顺式-N-[17-[2-(4-异丙基-噻唑-2-基)-7-甲氧基-8-甲基-喹啉-4-基氧基]-13-甲基-2,14-二氧代-3,13-二氮杂三环[13.3.0.0^4,6]十八碳-7-烯-4-羰基](环丙基)磺胺，其也可被称为(1R,4R,6S,7Z,15R,17R)-N-[17-[2-(4-异丙基噻唑-2-基)-7-甲氧基-8-甲基-异喹啉-4-基氧基]-13-甲基-2,14-二氧代-3,13-二氮杂三环-[13.3.0.0^4,6]十八碳-7-烯-4-羰基](环丙基)磺胺，即具有下文描绘的化学结构的式I化合物，具有特别的重要性。该化合物显示显著的抗HCV活性，具有吸引人的药代动力学特性，并且具有良好的耐受性。可通过在WO 2007/014926的实施列5中描述的合成工艺制备该化合物。

RNA-依赖RNA聚合酶NS5B对于RNA基因组复制是重要的。该酶的核苷和非核苷抑制剂均是已知的。

例如，WO 2008/043704描述了许多核苷抑制剂，其中之一是4-氨基-1-((2R,3S,4S,5R)-5-叠氮基-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮，即具有下文描绘的化学结构的式II化合物。可通过在WO 2008/043704的实施列1中描述的合成工艺制备该化合物。

WO2010/003658描述许多非核苷抑制剂，其中之一是具有下文描绘的化学结构的式III化合物。可通过在WO2010/003658的实施列1中描述的合成工艺制备该化合物。

发明描述

本发明涉及包括以下化合物的组合：

式I化合物

或其药学上可接受的盐，

式II化合物：

或其药学上可接受的盐，

和式III化合物：

 (III)

或其药学上可接受的盐。

已经发现，这些活性成分的组合增强抗-HCV活性和抑制抗药性集落的出现，因此与单独使用的每一个单一抑制剂的抗药性比较，提高其遗传屏障。也已经发现，这些活性成分的组合改善了复制子HCV RNA的清除，即使是在低剂量的三个直接的式I、II和III抗病毒剂情况下也如此。

可将式I、式II或式III化合物可以以其药学上可接受的盐形式或以游离(即非盐)形式使用。可通过用酸或碱处理游离形式获得盐形式。药学上可接受的酸和碱加成盐具有重要性，其意味着包含式I和II化合物可形成的治疗上有效的无毒性的酸和碱加成盐形式。可通过用这样适当的酸处理游离形式便利获得式I和II化合物的药学上可接受的酸加成盐。适当的酸包括，例如，无机酸，诸如氢卤酸，诸如氢溴酸，或特别是盐酸；或硫酸、硝酸、磷酸等酸；或有机酸，例如、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、苹果酸(即羟基丁二酸)、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对-氨基水杨酸、扑酸等酸。也可通过用适当有机碱或无机碱处理将式I化合物转化为药学上可接受的金属或胺加成盐形式。适当碱盐形式包括，例如铵盐、碱金属和碱土金属盐，如锂盐、钠盐或钾盐；或镁盐或钙盐；有机碱的盐，如苄星、N-甲基-D-葡糖胺、海巴明盐，和与氨基酸，例如，精氨酸、赖氨酸等所成的盐。术语加成盐形式意欲还包括可形成的式I或式II化合物的任何溶剂化物以及其盐。这样的溶剂化物为，例如，水合物、醇化物，如乙醇化物等。式II化合物的游离(即非盐)形式，或式I化合物的药学上可接受的盐形式具有重要性。

在本发明组合中的式I、II和III活性成分之间的EC₅₀比率可有变化。如在本文使用的，术语“EC₅₀比率”是指式I化合物的EC₅₀值与式II化合物的EC₅₀值之间的比率，以及式I化合物的EC₅₀值与式III化合物的EC₅₀值之间的比率，所述EC₅₀值在HCV复制子试验中获得。后者特别是下文描述的试验方法。在该试验中，发现化合物I的平均EC₅₀值为8 nM而化合物II的平均EC₅₀值为5 μM，而在WO2010/003658中报告的化合物III的EC₅₀值为0.07 μM。

基于以上的EC₅₀值，可通过用表达血浆蛋白结合的因子和表示安全边界的因子与EC₅₀值相乘，以确定有效血浆水平。可将表示安全边界的因子设定为约10。可通过检测结合至血液蛋白，诸如人血清白蛋白、脂蛋白、糖蛋白、α、β和γ球蛋白的量确定蛋白结合。有效血浆水平，也可指病毒活性剂量，表示提供有效抗-病毒活性的必需的剂量，即有效降低病毒负荷的剂量。有效降低病毒负荷，此时降低约两个或更多个数量级，优选低于病毒检测限。从病毒活性剂量，可用分布容积(V_D)，也已知为表观分布容积计算将要给予的剂量(或药物的量)。此为药物学术语，用于经口服或胃肠外给药后量化药物在血浆和身体其余组织之间的分布。其被定义为容积，药物的量将需要均匀地分布其中，以产生观察到的血液浓度。可在给予预定量的活性物质和检测血浆水平的动物模型中测定V_D。

以每日为基础给予的本发明的组合中的式I化合物的量可从约1 mg-约2500 mg、约5 mg-约1000 mg，或从约10 mg-约500 mg，或从约25 mg-约250 mg，或从约25 mg-约200 mg之间变化。式I化合物的每日量的实例为25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、200 mg和400 mg。以每日为基础给予的式II化合物的量可从约250 mg-约20,000 mg，或从约500 mg-约16,000 mg，或从约1000 mg-约12,000 mg，或从约3000 mg-约12,000 mg，或从约3000 mg-约6000 mg之间变化。式II化合物的每日量的实例为3000 mg、4500 mg、6000 mg、12,000 mg。以每日为基础给予的式III化合物的量可从约10 mg-约2500 mg，或从约20 mg-约1000 mg，或从约50 mg-约750 mg，或从约100 mg-约500 mg，或从约125 mg-约250 mg之间变化。式III化合物的每日量的实例为100 mg、150 mg、200 mg、500 mg和1000 mg。在本段和以下诸段提及的所有量指的是游离形式(即非盐形式)。以上的值表示游离-形式的当量等值，即如同将给予的游离形式的量。如果给予盐，则必需在盐和游离形式之间的分子量比率的函数式中计算该量。

计算以上提及的平均体重约70 kg的每日剂量并应该重新计算在儿科应用情况下的每日剂量，或当用于具有实际变化(diverting)的体重的患者时重新计算。

剂量可呈现为在一整天中以适当间隔给予的一个、两个、三个或四个或更多个亚剂量。使用的剂量优选相当于以上提及的式I化合物或式II化合物的每日量，或其亚剂量，诸如其1/2、1/3或1/4。剂型可含等于前面段落中提及的范围或数量的量的化合物I、化合物II，或化合物III，或含所有三个，例如，剂型可或者在分开制剂中，或者在合并的制剂中含25 mg、50 mg、100 mg、200 mg的化合物I，250 mg、500 mg、1000 mg、1500 mg，或2000 mg的化合物II，100 mg、150 mg、200 mg、500 mg或1000 mg的化合物III。在一个实施方案中，每天一次(q.d.)给予式I化合物，特别是作为每天一个剂量给药，和每天一次或两次(q.d.或b.i.d.)给予式II化合物，特别是作为每天一个或作为两个剂量给药，以及每天一次或两次(q.d.或b.i.d.)给予式III化合物，特别是作为每天一个或作为两个剂量给药。在每天一次给予式I和式II以及式III所有三个化合物的情况下，可通过给予三个分开的剂量，一个是化合物I，另一个是化合物II而第三个是化合物III来实现，或通过给予含化合物I和化合物II和化合物III的合并的剂量实现。

可每天一次、两次、三次、四次，或如果需要，更多次给予本发明的组合。在一个实施方案中，每天一次给予所述组合。在另一个实施方案中，每天两次或三次给予所述组合。可通过分开的剂型，即仅含化合物I或仅含化合物II或仅含化合物III的剂型，给予剂量；或通过含活性成分I、II和III的合并的剂型给予剂量。也可采用使用合并的剂型和分开的剂型的混合形式。在下文描述了可给予的剂型，优选口服剂型，特别是片剂或胶囊剂。

可或者分开或者作为合并的药用组合物将活性成分配制在药用组合物中。在合并的药用组合物的情况下，提供包含本文指定的前述有效治疗量的式I化合物或其药学上可接受的盐，和式II化合物或其药学上可接受的盐，以及式III化合物或其药学上可接受的盐的药用组合物，和药学上可接受的载体。在上下文中，有效治疗量是在感染患者或处于感染风险的患者中，在以预防方式中抗击，或稳定或减少HCV感染足以起作用的量。有效治疗量可特别相当于以上提及的、基于每日给药的量或其亚剂量以方便每天多次给药。

在又一方面，本发明涉及制备如本文指定的药用组合物的方法，该方法包括使药学上可接受的载体与有效治疗量的式I化合物或其药学上可接受的盐，和有效治疗量的式II化合物或其药学上可接受的盐，以及有效治疗量的式III化合物或其药学上可接受的盐紧密混合。

也可将本文提供的组合配制成联合的制剂，供同时、分开或序贯用于HCV疗法中。在这样的情况下，将式I化合物配制在含其他药学上可接受的赋形剂的药用组合物中，和将式II化合物分开配制在含其他药学上可接受的赋形剂的药用组合物中，以及将式III化合物分开配制在含其他药学上可接受的赋形剂的药用组合物中。便利地，这些分开的药用组合物可为药盒的一部分，供同时、分开或序贯使用。

本发明的组合的各单个成分可在疗程中同时或在不同时间分开给予，或同时以分开的或单一组合形式给予。

因此，可分开或联合将式I、II和III化合物配制成多种适合给药目的的药用组合物。在这些药用组合物当中，有效治疗量的特别的化合物，或所有三个化合物与药学上可接受的载体组合，所述载体依据想要给药的制剂形式的不同可采取宽泛的形式。可将药用组合物制备为要经口服、胃肠外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、直肠、透皮、口颊，或经鼻给予的药物。用于口服给药的适合的组合物包括散剂、颗粒剂、聚集体(aggregates)、片剂、压制或包衣丸剂、糖衣丸剂、袋装散剂(sachets)、硬或明胶胶囊剂、糖浆剂和混悬剂。用于胃肠外给药的适宜组合物包括水性或非水性溶液剂或乳剂，而适宜直肠给药的组合物包括具有亲水或疏水媒介的栓剂。局部给药可适宜在透皮递送系统应用，而经鼻传递给药可适宜在气溶胶系统应用。

例如，在制备口服给药的组合物中，可使用任何通常的药用介质，例如，在口服液体组合物，诸如混悬剂、糖浆剂、酏剂、乳剂和溶液剂的情况下的水、二醇、油、醇等；或固体载体，诸如在固体组合物的情况下的淀粉、糖、高岭土、滑润剂、粘合剂、崩解剂等。对于胃肠外组合物，载体将通常包括灭菌水，至少是大部分，尽管可向其中加入其他成分，诸如增溶剂、乳化剂或另外的辅助剂。可制备注射用溶液剂，其中的载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或两者的混合物。也可制备注射用混悬剂，在这样的情况下可使用适当液体载体、助悬剂等。还包括意欲在临用前即刻转变为液体形式制剂的固体形式制剂，诸如供再组配的粉末。在适用于经皮给药的组合物中，所述载体任选地包括皮肤渗透促进剂和/或湿润剂，任选与少部分的适宜的皮肤兼容的添加剂组合。式I或II化合物，或其组合，也可通过适合的制剂，经由口吸入或喷入给药，所述制剂与这样的给药类型相适应，诸如溶液剂、混悬剂或干粉剂。以气溶胶或喷雾剂形式给药的适宜的药用组合物为，例如，式I或II化合物或两者在药学上可接受的液体载体，诸如乙醇或水或其混合物中的混悬剂。如果需要，制剂中也可另外包含其他的药用辅助剂，诸如表面活性剂、乳化剂和稳定剂以及抛射剂。这样的制备物通常包含浓度为以重量计从大约0.1至50%，特别是从大约0.3至3%的活性化合物。

药用组合物可含式I，或式II，或式III，或所有三个化合物的组合的活性成分，其浓度为约0.1%-约50%，或约1%-约30%，或约3%-约20%，或约5%-约20%，所有百分比均以重量百分比计。在包含式I和式II以及式III所有三个化合物的组合物中，式I化合物以约0.1%-约50%，或约1%-约30%，或约3%-约20%，或约5%-约20%的浓度存在；而式II化合物以约3%-约50%，或约5%-约50%，或约10%-约50%，或约10%-约50%，或约10%-约30%的浓度存在；以及式III化合物以约0.1%-约50%，或约1%-约30%，或约3%-约20%，或约5%-约20%的浓度存在。

药用组合物可便利地以易于给药且均一剂量的单位剂型呈现。实例包括片剂(包括刻痕片剂或包衣片剂)、胶囊剂、丸剂、栓剂、粉末袋装剂(powder packets)、薄片剂(wafers)、注射用溶液剂或混悬剂等，和其隔离的多重单位。令人感兴趣的是口服给药的固体剂型，诸如片剂或胶囊剂。

可将呈现单位剂量形式的固体剂型装入任何已知的包装中，优选罩泡眼包装(blister packs)，特别对于片剂和胶囊剂而言更是如此。当分开配制式I、式II和式III化合物时，可将它们包装在分开的罩泡眼中，但一个罩泡眼可最好包括化合物I的，或化合物II的，或化合物III的单位剂量形式，例如一排为化合物I的诸单位，而另一排为化合物II的诸单位以及另一排为化合物III的诸单位。还可能存在其他的可能性。

可将本发明的组合用于治疗HCV感染以及与HCV相关联的疾病。与HCV相关联的疾病包括导致硬化、末期肝病和HCC (肝细胞性肝癌)的进行性肝纤维化、炎症和坏死。

可在细胞HCV复制子系统中试验式I或式II或式III化合物抗HCV的体外抗病毒活性，所述系统基于Lohmann等(1999) Science 285:110-113，由Krieger等(2001) Journal of Virology 75: 4614-4624 (通过参考结合于本文)描述进一步修订，其在实施例章节被进一步举例说明。该模型，虽然不是HCV的完全感染模型，为广泛接受为现行可用到的自主HCV RNA复制的最具活力且最有效率的模型。也可通过酶促试验，试验抗HCV的体外抗病毒活性。

如在本文指定的，式I、式II化合物和式III化合物的组合用于治疗感染HCV的温血动物，特别是人，且用于预防HCV感染。

因此，本发明还涉及治疗感染HCV，或处于被HCV感染风险的温血动物，特别是人的方法，所述方法包括给予抗-HCV有效量的、如在本文指定的式I、式II化合物和式III化合物的组合。本发明还提供在动物中治疗HCV-相关病症或预防HCV-相关病症的方法，该方法包括给予抗-病毒有效量的、如在本文指定的式I、式II化合物和式III化合物的组合。

可将本发明的组合用作药物。本发明也涉及如本文描述的组合在制备用于治疗或预防HCV感染或HCV相关病症的药物中的应用。

在又一方面，本发明涉及含式I、式II化合物和式III化合物和任选的另一个抗-HCV化合物产品，其作为组合制剂供同时、分开或序贯用于治疗HCV感染。

可将本发明的组合依次与一个或多个其他的抗-HCV化合物组合。令人感兴趣的是与IFN-α (聚乙二醇化的或不是聚乙二醇化的)和/或利巴韦林的组合。

可与本发明的组合共同给予的其他药物，可作为分开的制剂给予，或可与式I、式II或式III活性成分中的一个或多个共同配制。

本发明的组合，包括那些与其他抗-HCV剂的组合，也可与改善生物利用度的、对药物代谢和/或药代动力学具有正效应的药物，如利托那韦或其药学上可接受的盐组合。可将利托那韦作为分开的制剂使用，或可与本发明的组合中的一个或多个活性剂共同配制。式I化合物或式II化合物或式III化合物与利托那韦的重量/重量比的范围可从约10:1至约1:10，或从约6:1至约1:6，或从约1:1至约10:1，或从约1:1至约6:1，或从约1:1至约4:1，或从约1:1至约3:1，或从约1:1至约2:1。

在本发明的再一方面，提供式(I)化合物、式III化合物和式II化合物的酯前药的组合。这些包括在WO 2008/043704中描述的式II化合物，特别是4'和5'羟基酯，其可用式IIa表达：

或其药学上可接受的盐，其中R¹是氢和R²是C_1-18烷基-CO-；或R²是氢和R¹是C_1-18烷基-CO-；或R¹和R²均是C_1-18烷基-CO-；其中各个C_1-18烷基独立地为具有一个至18个碳原子的非支链或支链饱和烃基；而其中各个C_1-18烷基特别是C_1-6烷基和更特别是C_3-4烷基。这样的酯前药的实例是式IIa化合物，其中R¹是氢而R²是异丙基；或其中R²是氢和R¹是异丙基-CO-；或其中R¹和R²均是异丙基-CO-。术语异丙基-CO-指的是异丁酸的酯，其也可称为异丁酰基。如之上描述式II化合物的盐那样描述式IIa前药的药学上可接受的盐。

在这一方面，用等量的、以上描述的组合、制剂、应用或方法中的酯前药替代式(II)化合物。

如在本文使用的，术语“约”具有其常规含义。在特别的实施方案中，当与数值相关时，其可被解释为意味着该数值± 10%，或± 5%，或± 2%，或± 1%，或± 0.5%，或± 0.1%。在其他实施方案中，精确的值，即通过省去单词“约”表示其含意。

图

图1．(A)化合物I和化合物II、(B)化合物I和化合物III，以及(C)化合物II和化合物III组合对抗病毒活性的效应。以下显示如用于典型实验的由MacSynergy? II软件生产的，在95%置信区间(CI)的三维协同绘图。

图2．单独存在化合物I、II和III (A)，或存在组合(B和C)下的细胞集落形成。在右下角指出各细胞培养皿存活的细胞集落数量。EC₅₀，意指50%有效浓度。

图3．单独存在化合物I、II和III，和存在组合下从含复制子细胞清除HCV RNA。反弹期(rebound phase)为灰色阴影，而RT-PCR阳性判断值(cut off)如红线显示。指出存活复制子细胞集落的数量。HCV，丙型肝炎病毒；RNA，核糖核酸；RT-PCR，逆转录聚合酶链反应。

实施例

以下的实施例意欲阐述而不是限制本发明。

实施例1：式I、II和III化合物的活性

复制子试验

在细胞试验中检验式I、II和III化合物抑制HCV RNA复制的活性。在多目标筛查策略中，细胞试验基于双顺反子表达构建物，如由Lohmann等(1999) Science vol. 285 pp. 110-113所描述，由Krieger等(2001) Journal of Virology 75: 4614-4624描述对其的修订。大体上，该方法如下。

该试验基于稳定转染的细胞系Huh-7 luc/neo (下文指Huh-Luc)。该细胞系含有编码双顺反子表达构造的RNA，该构建物包括从脑心肌炎病毒(EMCV)的、自内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site) (IRES)翻译的1b型HCV的野生型NS3-NS5B区域，其由受体部分(FfL-荧光素酶)作先导，和可选择的标记物部分(neo^R，新霉素磷酸转移酶)。该构建物与自1b型HCV的5’和3’ NTRs (非翻译的区域)邻接。复制子细胞在G418 (neo^R)的存在下的连续培养取决于HCV RNA的复制。表达HCV RNA的稳定转染的复制子细胞，用于筛查抗病毒化合物，所述HCV RNA自主复制并至高水平，尤其是编码荧光素酶。

将复制子细胞铺陈于存在加入多种浓度的受试和对照化合物的384孔板中。培养三天后，通过分析荧光素酶活性(采用标准荧光素酶分析底物和试剂和Perkin Elmer ViewLux^Tm ultraHTS微滴定板成像仪(microplate imager))检测HCV复制。在对照培养物中的复制子细胞在不存在任何抑制剂下具有高的荧光素酶表达。在Huh-Luc细胞上监测化合物的抑制活性，建立各受试化合物的剂量-反应曲线。然后计算EC₅₀值，该值表示使探测的荧光素酶活性水平降低50%所需的化合物的量，或更特别地，表示使HCV复制子RNA遗传关联至复制的能力。

合并化合物I、II和III对抗-HCV活性的作用示于图1和表1中。

表1 ．TMC435、Tib-NNI和Tib-NI的不同组合的抗病毒活性。

于95%置信区间(CI)下的协同和拮抗体积，如由MacSynergy? II软件产生的那样。协同体积<25、25–50、50–100和>100分别指无显著性协同、轻度协同、中度协同和强大协同。所显示的结果是来自两个或更多个实验的平均值。

用与化合物III或化合物II组合的化合物I处理细胞，分别导致相加或协同性抗-HCV活性。

用与化合物II组合的化合物III处理导致相加的抗-HCV活性。

用受试的任何组合没有观察到细胞毒性。

实施例2：集落形成。

采用含HCV-基因型-1b-复制子的细胞，在式I、II和III化合物的存在下，测定集落形成。将Huh7-Luc复制子细胞(20,000)接种在含添加10% FCS的DMEM的10 cm培养皿中，并在1,000 μg/mL G418的存在下，用不同浓度的单一抑制剂或两个组合的抑制剂处理。培养细胞，并每周两次更换抑制剂和培养介质。当出现显著细胞死亡(大约2–3周)时，用中性红染色剩余的的集落并计数。

单独存在化合物I、II和III下和存在这些化合物的组合下的细胞集落形成示于图2中。

增加单独的各抑制剂的浓度导致剂量-依赖性集落形成减少，但并不完全防止耐药复制子集落形成。用与化合物III或化合物II组合的化合物I处理，防止耐药复制子集落的形成。在最低试验浓度下，用与化合物II组合的化合物III处理防止耐药复制子集落的形成。

实施例3：复制子清除-反弹试验

采用含HCV-基因型-1b-复制子的细胞评估清除-反弹期间HCV-复制子核糖核酸(RNA)水平。将Huh7-Luc复制子细胞(300,000)接种在含添加10% FCS的DMEM的10 cm培养皿中，并在一个或多个抑制剂的存在下，在G418 (清除期)的不存在下培养。必要时使细胞传代(典型地每周两次)和提取HCV RNA。14天后，去除抑制剂并在250 μg/mL G418的存在下培养细胞21天(反弹期)。采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)量化HCV复制子RNA和细胞RPL13A转录水平，并使HCV复制子RNA水平归一化至RPL13A转录水平。计数实验结束时观察到的细胞集落的数量。

在单独存在化合物I、II或III和组合的存在(清除期)以及不存在(反弹期)下，从含复制子的细胞清除HCV RNA，示于图3中。

所有三个抑制剂在2-周的清除期期间降低复制子HCV RNA水平，但不导致从细胞全部清除复制子HCV RNA。用与化合物III或化合物II组合的化合物I处理增强最初的HCV RNA减少，尽管在反弹期观察到少许复制子集落，提示对于一些组合而言不完全的复制子HCV RNA清除。用最低试验浓度的所有三个抑制剂的组合处理导致明显的复制子HCV RNA减少和最为有效的复制子清除。

Claims (8)

1.一种组合，其包含(i)式I化合物：

或其药学上可接受的盐，

和(ii)式II化合物：

或其药学上可接受的盐；或其酯前药，其可用式IIa表达：

其中R¹是氢和R²是C_1-18烷基-CO-；或R²是氢和R¹是C_1-18烷基-CO-；或R¹和R²均是C_1-18烷基-CO-；或其药学上可接受的盐，

和(iii)式III化合物：

 (III)

或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的组合，其中式I和III化合物与式II化合物组合。

3. 权利要求1的组合，其中式I和III化合物与式IIa化合物组合。

4. 权利要求3的组合，其中R¹和R²均为异丙基-CO-。

5. 权利要求1-4的任一项的组合，其与选自利巴韦林和干扰素的另外的药物组合。

6. 一种药用组合物，其包含如在权利要求1-4的任一项要求的组合和药学上可接受的载体。

7. 一种包含式I化合物和式II或式IIa化合物以及式III化合物的产品，所有化合物如在权利要求1中定义，所述产品作为一种联合制剂供同时、分开或序贯用于HCV疗法中。

8. 如在权利要求1-5中任一项定义的组合在HCV感染或与其相关的疾病的预防和治疗中的应用。

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