CN102834383A - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 - Google Patents

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CN102834383A CN2010800635616A CN201080063561A CN102834383A CN 102834383 A CN102834383 A CN 102834383A CN 2010800635616 A CN2010800635616 A CN 2010800635616A CN 201080063561 A CN201080063561 A CN 201080063561A CN 102834383 A CN102834383 A CN 102834383A
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K.埃斯马克
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D.约恩森
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B.克拉森
P.林德
S.伦德格伦
L.奥登
K.帕克斯
D.维克特柳斯
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Abstract

式(II)化合物，其中R1a是H；和R1b是C1-C6烷基、碳环基或Het；或R1a和R1b共同限定具有3-6个环原子的饱和环胺；R2a和R2b独立为H、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基，或R2a和R2b与它们连接的碳原子一起共同形成C3-C6环烷基；R3是支链C5-C10烷基链、C2-C4卤代烷基或-CH2C3-C7环烷基；R4'是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或氧杂环丁烷-3-基，用于预防或治疗以组织蛋白酶S的不适当表达或激活为特征的紊乱。

Description

半胱氨酸蛋白酶抑制剂
技术领域
本发明涉及组织蛋白酶S的抑制剂和它们在治疗涉及组织蛋白酶S的紊乱，诸如自身免疫紊乱、过敏反应和慢性疼痛病症的方法中的应用。
发明背景
半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族广泛分布于不同物种，包括哺乳动物、无脊椎动物、原生动物、植物和细菌中。大量的哺乳动物组织蛋白酶类，包括组织蛋白酶B、F、H、K、L、O、S和W已经归属于该超家族，且它们的活性的不适当的调节已经涉及许多代谢紊乱，包括关节炎、肌肉萎缩症、炎症、肾小球肾炎和肿瘤侵入。病原性组织蛋白酶样酶类，包括细菌性半胱氨酸蛋白酶(bacterial gingipains)、疟疾性半胱氨酸蛋白酶(malarial falcipains) I、II、III等和来自卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzei)、短膜虫(Crithidia fusiculata)、血吸虫亚种(Schistosoma spp)的半胱氨酸蛋白酶。
在WO 97/40066中，描述了对抗组织蛋白酶S的抑制剂的应用。提示对该酶的抑制作用可预防或治疗由蛋白酶活性引起的疾病。组织蛋白酶S是高度活性的半胱氨酸蛋白酶，属于木瓜蛋白酶超家族。其一级结构与人组织蛋白酶L和H以及植物半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶的相似度分别为57 %、41 %和45 %，虽然仅有31 %与组织蛋白酶B相似。已发现主要在B细胞、树突状细胞和巨噬细胞，且此有限的存在提示在退变性疾病的发病机理中可能涉及该酶。此外，已经发现，通过蛋白水解破坏Ii对于MHC II类分子结合抗原肽和将得到的复合物转移至细胞表面是必需的。此外，已经发现，组织蛋白酶S在B细胞中对于必需呈递II类分子胜任结合肽的有效的Ii蛋白水解是重要的。因此，抑制该酶可用于调制II类限制的免疫反应(WO 97/40066)。其他涉及组织蛋白酶S的紊乱为哮喘、慢性阻塞性肺病、子宫内膜异位和慢性疼痛。
发明简述
依据本发明的第一方面，本文提供式II化合物：
Figure 929302DEST_PATH_IMAGE001
其中
R1a是H；和
R1b是C1-C6烷基，其任选被独立选自以下的1-3个取代基取代：卤代、羟基、氰基、叠氮基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、C1-C4二烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、碳环基和Het；或
R1b是碳环基或Het；或
R1a和R1b与它们连接的N原子一起共同限定具有3-6个环原子的饱和环胺；
其中的碳环基、Het或环胺任选被独立选自以下的1-3个取代基取代：卤代、羟基、氰基、叠氮基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、C1-C4二烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、RxOOC-C0-C2亚烷基(此处Rx是H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基)、苯基、苄基或C3-C6环烷基C0-C2亚烷基；
其中的苯基、苄基或环烷基部分任选被独立选自卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基的1-3个取代基取代)；
R2a和R2b独立选自H、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基，或R2a和R2b与它们连接的碳原子一起共同形成C3-C6环烷基；
R3是C5-C10烷基，其任选被独立选自卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代；或
R3是具有至少2个氯代或3个氟代取代基的C2-C4烷基链；或
R3是C3-C7环烷基甲基，其任选被独立选自C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代；
R4'是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或氧杂环丁烷-3-基。
Het是含1-4个独立选自O、S和N的杂原子的、稳定的、单环或双环、饱和的、部分饱和的或芳环系统，各环具有5或6个环原子；
碳环基是C3-C6环烷基、C5-C6环烯基或苯基；
或其药学上可接受的盐、水合物或N-氧化物。
在一些实施方案中，R1a是H和R1b是C1-C4烷基，诸如甲基、乙基、异丙基、叔-丁基或优选甲基，任选被如上定义的一个或多个取代基，优选1-3个卤代(如F)或C1-C4烷氧基(如甲氧基)取代。
在其他的实施方案中，R1a是H和R1b是甲基、环丙基、1-苯基乙基，或含1-3个氮原子和0或1个硫原子的5或6元杂环，所述环丙基、苯基或杂环任选被独立选自以下的至多三个取代基取代：
C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、C1-C4-二烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、RxOOC-C0-C2亚烷基(此处Rx是H或C1-C4烷基)或C3-C6环烷基C0-C2亚烷基或苄基(环烷基，或苄基的苯基环任选被选自C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代)。
对于R1b的5或6元芳族杂环的实例包括吡啶基或嘧啶基，且尤其是吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噻二唑基、三唑基或四唑基，任选被下列任一取代基取代：C1-C4烷基(如Me)、卤代(如F)、C1-C4卤代烷基(如CF3)、C1-C4烷氧基(如MeO)、C3-C6环烷基C0-C1亚烷基(如环丙基或环丙基甲基、苄基或C0-C2亚烷基COOH和其C1-C4烷基酯。例证性种类是1-甲基-吡唑-5-基。
典型地依据该实施方案，杂环是吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噻唑基或噻二唑基，它们中的任一个任选被C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C3-C6环烷基或C3-C6环烷基甲基取代。
典型地，依据该实施方案，所述杂环是吡唑-1-基，其任选被C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基或环丙基，优选C1-C4烷基，诸如乙基或优选甲基取代。
对于R1b优选的值是吡唑-1-基，其被C1-C4烷基，诸如乙基或甲基N-取代。
依据该实施方案，对于R1b更典型的值是甲基或环丙基。
在其他的实施方案中，R1a是H而R1b是甲基或乙基，其在1-位上被环基团，诸如苯基取代，或R1b是单环杂环，诸如吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、吲哚啉基、吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、噻喃基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、四唑基、吡唑基、吲哚基等。所述苯基或杂环任选被，例如独立选自羟基、氨基、C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、氨基、C1-C4烷基胺、C1-C4二烷基胺等的1-3个取代基取代。例证性种类是1-苯基乙基。
在其他的实施方案中，R1a是H和R1b是C3-C6环烷基，优选环丁基或环丙基，任选如上定义被取代。优选地，环烷基是未取代的或被选自以下的1-3个取代基取代：卤代(如1个或2个氟代)、羟基、C1-C4烷基(如1个或2个甲基)、C1-C4卤代烷基(如CF3基团)、C1-C4烷氧基(如MeO基团)、C1-C4烷基胺(如MeNH-基团)、C1-C4二烷基胺(如(Me)2N-基团)等。例证性种类是环丙基，或单氟代-或偕二氟代环丙基。
在一些实施方案中，R1a是H和R1b是含1-3个氮原子和0或1个硫原子的、6元或优选5元芳族杂环，任选如上定义被取代。优选，杂环通过杂环的碳原子连接至α酮酰胺基团的邻近的氮原子。例证性取代基包括C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、二C1-C4烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、RxOC(=O)C0-C2亚烷基(此处Rx是H或C1-C4烷基)或C3-C6环烷基C0-C2亚烷基或苄基(环烷基或苄基的苯基环)，其任选被选自C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代)。
在一些实施方案中，R1a、R1b和它们连接的N-原子形成3-6元环胺，诸如氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷，且优选吗啉、哌嗪或哌啶。这些环胺可为未取代的或如上描述被取代，优选被选自以下的1-3个取代基取代：卤代(如1个或2个氟代)、羟基、C1-C4烷基(如1个或2个甲基)、C1-C4卤代烷基(如CF3基团)、C1-C4烷氧基(如MeO-基团)、C1-C4烷基胺(如MeNH-基团)、C1-C4二烷基胺(如(Me)2N-基团)等。
在一些实施方案中，R3是环烷基烷基，任选被，例如卤代(诸如F)或烷氧基(诸如MeO)取代。例证性种类包括1-甲基环戊基甲基、1-甲基环己基甲基、1-甲基环丁基甲基、1-甲基-3,3-二氟代环丁基甲基、1-甲基-4,4-二氟代环己基甲基、环丙基甲基或1-甲基-3,3-二氟代环戊基甲基。
优选的R3种类包括叔-丁基甲基、环丁基甲基、1-甲基环丁基甲基和1-甲基环戊基甲基，它们中的任一个任选被一个或两个F或MeO取代。代表性种类是1-氟代环丁基甲基和1-氟代环戊基甲基。
进一步的代表性R3种类包括1-甲基环戊基甲基和1-氟代环戊基甲基，
其他的实施方案具有R3作为5-10个C-原子的直链或支链烷基链，任选被1-3个卤代(如CI或F)，或C1-C4烷氧基(如MeO)取代。例证性种类包括2,2-二甲基丙基、3,3-二甲基戊基、2,2,3,3-四甲基丁基。卤代化的烷基的例证性种类包括2,2-二氯代乙基、3,3,3-三氟丙基、2,2-三氟甲基乙基或2,2,2-三氟乙基。
典型地，R4'是C1-C4烷基，诸如甲基或乙基。
或者，依据R4'是C1-C6卤代烷基，诸如C1-C6氯代烷基或C1-C6氟代烷基。
本发明的一个实施方案包括式II化合物，其中R2a和R2b至少之一是卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基。典型地，依据该实施方案，R2a和R2b之一是H，而另一个是氯代、氟代、三氟甲基或甲氧基；特别是氟代或甲氧基。
本发明优选的实施方案包括式II化合物，其中R2a和R2b之一是H，而另一个是F。依据该实施方案特别优选的是具有在式IIa中显示的立体化学的化合物：
Figure 555366DEST_PATH_IMAGE002
本发明的另一个实施方案包括式II化合物，其中R2a和R2b均为F，由此提供式IIb化合物：
Figure 272786DEST_PATH_IMAGE003
本发明的又一个实施方案包括化合物，其中R2a和R2b均为H，由此提供式IIc化合物：
Figure 854946DEST_PATH_IMAGE004
在其他的实施方案中，R2a和R2b与它们连接的碳原子一起共同形成C3-C6环烷基。
本发明的再一个实施方案包括式II化合物，其中R1a是H，R1b是N-甲基吡唑-2-基，R2a和R2b均为H和R3是被甲基或氟代取代的环戊基甲基，由此提供式IId化合物：
Figure 607002DEST_PATH_IMAGE005
其中R3'是甲基或氟代。
本发明的一个实施方案包括式IId化合物，前提条件是R4'不是甲氧基或乙氧基。
本发明备选的实施方案包括式IId化合物，其中R4'是甲氧基或乙氧基，由此提供式III化合物：
Figure 117880DEST_PATH_IMAGE006
其中n是0或1。
本发明的一个实施方案包括式III化合物，前提条件是该化合物不是3-(1-氟代环戊基)-1-(1-(2-(1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代乙酰基)环丁基氨基)-1-氧代丙-2-基氨基甲酸乙酯.
本发明备选的实施方案包括化合物3-(1-氟代环戊基)-1-(1-(2-(1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代乙酰基)环丁基氨基)-1-氧代丙-2-基氨基甲酸乙酯，即式IV化合物：
Figure 588175DEST_PATH_IMAGE007
式II化合物以多个有利的药学性质为特征并且显示出鉴于在先技术的化合物的至少一个改良的性质。具体是，本发明的抑制剂在一个或多个下列药学相关性质方面是有优势的：即效能、减轻的细胞毒性、改善的药代动力学、可接受的剂量和药物负担。
不希望以任何方式受限于理论或对于特别变量试验性结合模式的归属，仅为了方便起见提供如在本文使用的P1、P2和P3，并且具有它们的常规含义，和指示抑制剂的那些部分相信分别填充酶的S1、S2和S3亚位点(subsite)，此处S1邻近裂解位点而S3远离裂解位点。
本发明的又一方面包括使用式II化合物预防或治疗由组织蛋白酶异常表达或激活所致疾病的方法，所述疾病为通过抑制组织蛋白酶S缓解或改善的疾病或病症，优选基本上不伴随抑制木瓜蛋白酶超家族的其他成员。
本发明的又一方面提供式II化合物在预防或治疗由组织蛋白酶异常表达或激活所致疾病中的应用，所述疾病为通过抑制组织蛋白酶S缓解或改善的疾病或病症，优选基本上不伴随抑制木瓜蛋白酶超家族的其他成员。
本发明的又一方面提供式II化合物在制备用于预防或治疗由组织蛋白酶S的异常表达或激活所致疾病的药物中的应用，所述疾病为通过抑制组织蛋白酶S缓解或改善的疾病或病症，优选基本上不伴随抑制木瓜蛋白酶超家族的其他成员。
还提供用作药物，诸如在预防或治疗以组织蛋白酶S的不适当表达或激活为特征的紊乱中的药物的式II化合物，所述疾病为通过抑制组织蛋白酶S缓解或改善的疾病或病症，优选基本上不伴随抑制木瓜蛋白酶超家族的其他成员。
在前文刚刚描述的四段中定义的这样的疾病或病症的实例，包括那些在WO 97/40066中列举的疾病或病症，诸如自身免疫性疾病、过敏症，诸如哮喘和枯草热、多发性硬化症、类风湿性关节炎等。又一个实例是如在WO03/20287中公开的、子宫内膜异位症和特别是慢性疼痛的治疗。本发明还提供式II化合物或式II的任何亚组，在疗法和在制备治疗通过抑制组织蛋白酶S缓解或改善的疾病或病症的药物中的应用。
在一个系列的实施方案中，使用该方法治疗处于自身免疫性疾病风险或罹患自身免疫性疾病的哺乳动物，特别是人。自身免疫意指其中宿主免疫反应变成对抗其自身组成部分导致病理变化的现象。许多人自身免疫性疾病与某些II类MHC-复合物相关联。此关联发生是因为由引起自身免疫的细胞的T细胞识别的结构为由II类MHC分子和抗原性肽组成的复合物。当T细胞与宿主的与源于宿主自身的基因产物的肽复合的II类MHC分子反应时，可产生自身免疫性疾病。如果抑制这些II类MHC/抗原性肽复合物的形成，则减少或压抑自身免疫反应。可依据本发明的方法治疗其中II类MHC/抗原性复合物起作用的任何自身免疫性疾病。
这样的自身免疫性疾病包括，如幼年发生型糖尿病(胰岛素依赖)、多发性硬化症、寻常性天疱疮、Grave's疾病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和慢性淋巴细胞性甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)。
在另一个系列的实施方案中，使用该方法治疗处于过敏反应风险或罹患过敏反应的哺乳动物，特别是人。“过敏反应”意指其中宿主对特定抗原的免疫反应不必要或不成比例地导致病理变化的现象。过敏症为本领域所熟悉，且本文所采用的术语“过敏反应”与医学领域的标准用法相一致。
过敏症的实例包括，但不限于对花粉、“豚草”、甲壳类动物、家养动物(如猫和狗)、蜂毒、屋尘螨过敏原等的过敏症。
另一个特别预期的过敏反应是引起哮喘的过敏反应。过敏反应可发生在男人中，因为T细胞识别特定的II类MHC/抗原性肽复合物。如果抑制这些II类MHC/抗原性肽复合物的形成，则减少或压抑过敏反应。可依据本发明的方法治疗其中II类MHC/抗原性肽复合物起作用的任何过敏反应。通过本发明方法的免疫抑制将典型地为严重的或威胁生命的过敏反应的预防性或治疗性的治疗，因为其可在哮喘发作或过敏性休克过程中发生。
在另一个系列的实施方案中，使用该方法治疗接受或即将接受器官移植或组织移植的哺乳动物，特别是人。在组织移植(如肾、肺、肝、心)或皮肤移植中，此时如有供体与受体之间的II类MHC基因型(HLA型)的错配，则可对供体组织产生严重的“异源性”免疫反应，原因是在供体细胞的表面存在非自己的或异源性II类MHC分子呈递抗原性肽。就该反应依赖于形成II类MHC/抗原性肽复合物的意义上说，抑制组织蛋白酶S可压抑该项反应和减轻组织排斥反应。可单独或与其他治疗剂一起使用组织蛋白酶S抑制剂，所述治疗剂作为辅助环孢菌素A和/或抗淋巴细胞γ球蛋白，以实现免疫压抑和促进移植物生存。优选地，在手术之前和/或之后通过全身应用给予宿主。备选或其它地，灌注供体器官或组织，或者在移植或移植之前，或者在其之后，可为有效。
已经用MHC II类机制阐述以上的实施方案，但是本发明并不局限于该作用机制。组织蛋白酶S的抑制作为COPD或慢性疼痛的治疗可完全不，例如涉及MHC II类。
本发明的相关方面涉及在患者中治疗正在经历疗法的患者的方法，其中的疗法引起免疫反应，优选有害的免疫反应，包括给予患者式II化合物或其药学上可接受的盐、氮-氧化物或水合物。典型地，该免疫反应由MHC II类分子介导。可在所述疗法之前、同时或之后给予本发明化合物。典型地，该疗法包括用生物学产物(the biologic)，诸如蛋白质，优选抗体，更优选单克隆抗体治疗。更优选地，生物学产物是Remicade®、Refacto®、ReferonA®、VIII因子、VII因子、Betaseron®、Epogen®、Enbrel®、β干扰素、Botox®、Fabrazyme®、Elspar®、Cerezyme®、Myobloc®、Aldurazyrne®、Verluma®、α干扰素、Humira®、Aranesp®、Zevalin®或OKT3。或者，该治疗包括使用肝素、低分子量肝素、普鲁卡因胺或肼屈嗪。
对组织蛋白酶S抑制剂在治疗慢性疼痛，包括神经性或炎性疼痛中的评估的分析如在WO 03/20287中描述的那样。
依据本发明可治疗的目前优选的适应症包括：
银屑病；
自身免疫适应症，包括特发性血小板减少性紫癜(ITP)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、干燥性综合征、Grave’s病和系统性红斑狼疮(SLE)；
非自身免疫适应症包括过敏性鼻炎、哮喘、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)和慢性疼痛。
本发明的化合物可形成盐，所述盐形成本发明的另外方面。适当的本发明化合物的药学上可接受的盐包括有机酸的盐，特别是羧酸的盐，包括，但不限于乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、顺丁烯二酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、羟乙磺酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、二葡糖酸盐、环戊酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、草酸盐、庚酸盐、己酸盐、反丁烯二酸盐、烟酸盐、棕榈酸盐、果胶脂酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、特戊酸盐(pivolate)、樟脑酸盐、十一酸盐和琥珀酸盐，有机硫酸的盐，诸如甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、对-氯代苯磺酸盐和对-甲苯磺酸盐；和无机酸的盐，诸如氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、半硫酸盐、硫代氰酸盐、过硫酸盐，磷酸和磺酸的盐。
在某些情况下可分离本发明的化合物为水合物。典型地，通过用有机溶剂，诸如二噁英(dioxin)、四氢呋喃或甲醇，从水性/有机溶剂中再结晶制备水合物。也可通过给予患者相应的酮而在原位生成水合物。
可通过本领域普通技术人员已知的方法制备本发明化合物的N-氧化物。例如，可通过于大约0℃，在适宜的惰性有机溶剂(如卤代烃，诸如二氯甲烷)中，用氧化剂(如三氟过乙酸、过顺丁烯二酸、过苯甲酸、过乙酸、间-氯代过氧苯甲酸等)处理未氧化形式的本发明的化合物制备N-氧化物。或者，可从适当的起始原料的N-氧化物制备本发明化合物的N-氧化物。
可通过于0-80 ℃在适宜的惰性有机溶剂(如乙腈、乙醇、水性二氧杂环已烷等)中，用还原剂(如硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、二氯化磷、三溴化物等)处理，从相应的本发明化合物的N-氧化物制备呈现未氧化形式的本发明化合物。
本发明也包括同位素标记的式II或任何式II亚组的化合物，其中一个或多个原子被该原子的同位素，即具有与典型地天然发现的原子具相同原子数而不同原子质量的原子替代。可掺入式II或任何式II亚组的化合物中的同位素的实例包括，但不限于氢同位素，诸如2H和3H (也分别用D表示氘，而用T表示氚)、碳同位素，诸如11C、13C和14C、氮同位素，诸如13N和15N、氧同位素，诸如15O、17O和18O、磷同位素，诸如31P和32P、硫同位素，诸如35S、氟同位素，诸如18F、氯同位素，诸如36Cl、溴同位素，诸如75Br、76Br、77Br和82Br以及碘同位素，诸如123I、124I、125I和131I。
包含在同位素标记的化合物中的同位素的选择将依赖于该化合物的具体应用。例如，对于药物或底物组织分布分析而言，其中掺入放射性同位素，诸如3H或14C的化合物将通常是最有用的。对于放射成像应用而言，例如正电子放射X线断层摄影术(PET)，正电子放射同位素，诸如11C、18F、13N或15O将是有用的。掺入较重的同位素，诸如氘，即2H，可提供给式II或任何式II亚组的化合物更大代谢稳定性，其可导致，例如，化合物的体内半衰期增加或剂量需求减少。例如，典型地，在对代谢倾向的位置掺入2H同位素。在本发明化合物中，掺入2H同位素的适宜的位置，为例如环丁烯基的取代基，即R2a和R2b中的一个或两个是2H。
可通过类似于那些在本文以下的流程和/或实施例中描述的方法，采用适当的同位素标记的试剂或起始原料替代相应的非-同位素标记的试剂或起始原料，或通过本领域技术人员已知的常规技术，制备同位素标记的式II或任何式II亚组的化合物。
应该指明的是，在定义中使用的任何分子部分上的基团位置可为在此部分上的无论何处，只要其是化学上稳定的。
如在本文使用的，以下术语具有如下面定义的含义：
Cm-Cn烷基，自身使用或以复合词表达，诸如Cm-Cn卤代烷基、Cm-Cn烷基羰基、Cm-Cn烷基胺、Cm-Cn烷基磺酰基、Cm-Cn烷基磺酰基氨基等使用，代表具有指定数量的碳原子的直链或支链烷基基团，如C1-C4烷基意指具有1-4个碳原子的烷基基团。在本发明中使用的优选的烷基基团为C1-C4烷基，且包括甲基、乙基、正-丙基、异丙基、叔-丁基、正-丁基和异丁基。典型地，甲基和叔-丁基是优选的。C1-C6烷基具有相应的含义，也包括所有戊基和己基的直链和支链异构体。其他的Cm-Cn烷基基团，诸如C5-C10烷基具有相应的含义。
术语Me意指甲基，MeO意指甲氧基，Et意指乙基和Ac意指乙酰基。
用于复合表达中的C0-C2亚烷基，诸如C3-C6环烷基C0-C2亚烷基指的是源于甲基或乙基的二价基团，或在C0的情况下，术语C0-C2亚烷基意指键。
C1-C4卤代烷基指的是C1-C4烷基基团，其中至少一个C原子被卤素取代，优选氯代或氟代。典型地，三氟甲基是优选的。
C1-C4烷氧基代表基团C1-C4烷基-O，其中C1-C4烷基如上定义，且包括甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、叔-丁氧基、正-丁氧基和异丁氧基。典型地，甲氧基和异丙氧基是优选的。C1-C6烷氧基具有相应的含义，扩大包括所有戊氧基和己氧基的直链和支链的异构体。Cm-Cn烷氧基的其他的基团，诸如C5-C10烷氧具有相应的含义。
如在本文中使用的，C1-C4卤代烷氧基意指包括C1-C4烷氧基，其中至少一个C-原子被一个或多个卤原子，典型地，为氯代或氟代取代。在许多情况下，三氟甲基是优选的。
C1-C4烷氧基羰基意指基团C1-C4烷基-O-C(=O)。
碳环基包括环戊基、环己基和特别是环丙基和环丁基。
碳环基还包括环戊烯基和环己烯基，在各种情况下具有单一双键。经常地，碳环基的优选的值是苯基。
环胺包括氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪和吗啉。
Het是稳定的、单环或双环、饱和的、部分饱和的或芳环系统，含1-4个独立选自O、S和N的杂原子，且各环具有5或6个环原子；例证性芳族Het包括呋喃、噻吩、吡咯、咪唑、吡唑、三唑、四唑、噻唑、噁唑、异噁唑、噁二唑、噻二唑、异噻唑、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、苯并呋喃、苯并噻吩、吲哚、吲唑等。例证性未饱和的Het包括四氢呋喃、吡喃、二氢吡喃、1,4-二氧杂环己烷、1,3-二氧杂环己烷、哌啶、吡咯烷、吗啉、四氢噻喃、四氢噻吩、2-H-吡咯、吡咯烷、吡唑啉、咪唑啉、噻唑烷、异噁唑烷等。
本发明的化合物包括许多处理，诸如可将OH、NH或COOH基团应用于常规前药部分。典型地，前药在体内水解以在血浆、肝脏或肠壁中释放母体化合物。有利的前药是羟基，诸如在R4的酚羟基，或胺官能团，诸如磺酰胺胺官能团的酯。优选的药学上可接受的酯包括那些源于C1-C6羧酸的酯，诸如乙酰基或特戊酰基或任选取代的苯甲酸酯，优选是未取代的或被广泛地如对R1a所描述的取代基，典型地，1-3个卤代(如F)、C1-C4烷基(如Me)、C1-C4卤代烷基(如CF3)或C1-C4烷基氧基(如MeO)基团所取代。有利的磺酰胺前药包括源于C1-C6羧酸的氨基酰基，诸如乙酰基或特戊酰基或任选取代的苯甲酸酯，优选未取代的或被广泛地如对R1a所描述的取代基，典型地，1-3个卤代(如F)、C1-C4烷基(如Me)、C1-C4卤代烷基(如CF3)或C1-C4烷基氧基(如MeO)基团所取代。
除非另外提到或指出，化合物的化学命名包括所有可能的立体化学异构形式的混合物，即所述化合物可拥有。所述混合物可包含所述化合物的基本分子结构的所有非对映异构体和/或对映体。本发明化合物的所有立体化学异构形式，不论是纯的形式或是彼此混合的形式，都意欲纳入本发明的范畴内。
如本文提到的化合物和中间体的纯的立体异构形式，被定义为异构体，其实质性没有所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映形式或非对映异构形式。具体是，术语“立体异构纯的”涉及化合物或中间体，它们具有的立体异构体过量至少80 % (即一种异构体最少90 %，而其他可能的异构体最多10 %)至最高达立体异构体过量100 % (即一种异构体100 %而没有其他异构体)，更特别的是这样的化合物或中间体，它们具有的立体异构体过量为90 %至最高达100 %，尤其更特别的是具有的立体异构体过量为94 %至最高达100 %，而最特别的是具有的立体异构体过量为97 %至最高达100 %。术语“对映体纯的”和“非对映异构体纯的”应该以类似的方式理解，不过分别考虑到正被讨论的混合物的对映体过量和非对映异构体过量。
可通过使化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应，以形成一对非对映异构体化合物，分离非对映异构体和回收光学纯的对映体，制备作为它们的单一立体异构体的本发明化合物。由于可用式II化合物的共价非对映异构体衍生物实施对映体的拆分，可分离的复合物是优选的(如结晶体；非对映异构体盐)。非对映异构体具有独特的物理性质(如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可易于通过利用这些相异点进行分离。可通过色谱法，例如HPLC，或优选，基于不同的溶解性通过分离/拆分技术，分离非对映异构体。然后通过将不导致外消旋作用的任何实用方法，连同拆分剂一起回收光学纯的对映体。对可应用于从它们的外消旋混合物拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述，可在Jean Jacques Andre Collet, Samuel H. Wilen, 对映体、外消旋体和拆分(Enantiomers, Racemates and Resolutions), John Wiley & Sons, Inc. (1981)中找到。
虽然可能单独给予活性剂，但是优选的是将其呈现为药用制剂的一部分。这样的制剂将包含与一个或多个可接受的载体/赋形剂一起的、如上定义的活性剂以及任选的其他治疗组分。载体在与制剂的其他成分相容而不伤害接受者的意义上说，必须是可接受的。
制剂包括那些适宜于直肠、鼻、局部(包括口颊和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)给药的制剂，但是优选制剂是口服给药的制剂。制剂可常规地以单位剂型呈现，如片剂和缓释胶囊，且可通过药学领域熟悉的任何方法制备上述制剂。这样的方法包括使以上定义的活性剂与载体结合的步骤。一般来说，通过使活性剂与液体载体或细微粉碎的固体载体或两者均匀和密切结合，然后，如果需要，使产品成型，制备制剂。本发明延及制备药用组合物的方法，所述方法包括将式II化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或媒介物组合(conjunction)或结合(association)。如果药用制剂的制备包括药用赋形剂与以盐形式呈现的活性成分的密切混合，则经常优选的是采用性质上非-碱性的，即或者酸性或者中性的赋形剂。
在本发明中，用于口服给药的制剂可呈现为离散的单位，诸如胶囊剂、颊片剂或片剂，且各自含预定量的活性剂；作为粉剂或颗粒剂；作为活性剂在水性液体或非-水性液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂和作为大剂量注射剂(bolus)等。
关于口服给药的组合物(如片剂和胶囊剂)，术语适宜的载体包括媒介物，诸如普通赋形剂，如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢二钙、氯化钠和藻酸；和润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他的硬脂酸金属盐类、硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅油、滑石粉、蜡油类和硅胶。调味剂，诸如胡椒薄荷、冬青油、樱桃调味剂等也可使用。可为合意的是，添加着色剂以使剂型易于识别。也可通过本领域熟悉的方法对片剂进行包衣。
可通过压制或模制，任选用一个或多个辅料成分制备片剂。可通过在适宜的机器中，对自由流动形式，诸如粉末或颗粒、任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的活性剂施压，制备压制片剂。可通过在适宜的机器中，对经用惰性液体稀释剂湿润的粉末化的化合物的混合物压模，制备模制片剂。可任选对片剂进行包衣或刻痕，且可配制以提供活性剂的缓慢或控制释放。
适宜口服给药的其他制剂包括锭剂(lozenges)，其包含在调味的基质，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶中的活性剂；喉片(pastilles)，其包含在惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性剂；和漱口剂，其包含在适宜的液体载体中的活性剂。
如同所有的药品一样，本发明化合物或制剂的适当剂量将有赖于适应症、疾病的严重程度、体格和代谢活力(metabolic vigour)和患者、给药模式，并且易于通过常规动物试验确定。提供细胞内(用于抑制木瓜蛋白酶超家族的生理性蛋白酶)浓度大约0.01-100 μΜ，更优选0.01-10 μΜ，诸如0.1-5 μΜ的剂量是通常合意的和可达到的。
通过多种液相和固相化学过程制备本发明化合物。
典型的第一步是制备式V的P1构造单元(building block)：
此处R2a和R2b如上定义，PG是常规的N保护基团，诸如Boc、CBz或Fmoc和PG*是H或常规的羧基保护基团，诸如C1-C4烷基或苄基。这些构造单元是新颖的并且构成本发明的又一方面。
典型地，如在以下流程1所描述的制备式V构造单元。
Figure 580588DEST_PATH_IMAGE009
适宜的起始原料是N-保护的环丁基氨基酸，其中几个可从商业获得或可如在下列实施例中所显示的或者如由Allan等在J. Med. Chem., 1990 33(10) 2905-2915所描述的制备。
羧酸(1a)经由Weinreb合成转化成提供相应的醛(1c)的Ν,Ο-二甲基异羟肟酸(1b)。也可通过使环丁基氨基酸的羧基官能团还原并在Dess Martin条件下氧化取得醛。随后可使醛(1c)与适当的异腈以Passerini反应进行反应，以得到所需要的α-羟基R1aR1b酰胺(1d)。然而，在不易获得适当的异氰化物的情况下，可备选使用异氰酸叔丁酯，由此得到叔-丁基酰胺，酰胺经水解后，提供α-羟基羧酸P1构造单元(1e)。一般来说，水解酰胺所需的强酸条件也导致失去NBoc保护，因此，如果使用，可直接将胺用于偶联至P2构造单元，否则，如果需要存储，可将胺再保护。
如在流程3中一般阐述的那样，然后将如此得到的P1构造单元在C和N末端延展以提供式II化合物。
Figure 993858DEST_PATH_IMAGE010
典型地，首先通过使式V构造单元(3a)与R1a*R1b*胺反应，延展C末端，此处R1a*和R1b*分别是R1a和R1b或由此的合成体(synthons) (考虑到R1b官能团对以下列出的P3延长条件的敏感性而选择)。与常规的肽化学物的反应如下所讨论的进行。其后，使如此制备的P1-引物侧边单元(prime side unit) (3b)在N末端去保护并且用P2构造单元延长，提供N-保护的中间体胺(3c)。例如可采用标准的偶联条件，诸如在DMF中的HATU、DIPEA，经由BocP2-OH引入P2残基。使用肽合成领域熟悉的标准技术，诸如在boc-保护基团的情况下用酸处理，随后与适宜的烷氧基羰基化剂，诸如氯甲酸烷基酯或碳酸二烷基酯，任选在的碱，诸如二异丙基乙胺或类似的碱存在下反应，去除N-保护基团，提供氨基甲酸酯3d。α-羟基的氧化和如上描述的R1a*和R1b*合成体的转化如果存在，则提供最终的α-酮酰胺衍生物3e。
广泛的适宜于P2构造单元的适当保护的L-氨基酸和适宜于P3构造单元的羧酸、羧酸卤化物和氨基甲酰基卤化物为商业上可获得的，或通过简单的化学过程或如在WO06/064286显示那样取得。P3和P2构造单元可备选地首先偶联，然后与P1-引物侧边单元反应。
典型地，在适宜的偶联剂的存在下进行延长，所述偶联剂为例如六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷子基磷鎓(PyBOP)、O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)或1,3-二环己基碳化二亚胺(DCC)，任选存在1-羟基苯并三唑(HOBT)和碱，诸如Ν,Ν-二异丙基乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉等。典型地，在20至30 ℃，优选在约25 ℃实施该反应，且需要2至24 h完成。适宜的反应溶剂是惰性有机溶剂，诸如卤化的有机溶剂(如二氯甲烷、氯仿等)、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、醚性(ethereal)溶剂，诸如四氢呋喃、二氧杂环已烷等。
或者，可通过首先将P3/P2构造单元转变为活性酸衍生物，诸如琥珀酰亚胺酯，然后，使其与P1胺反应，实施以上的延长偶联步骤。典型地，反应需要2至3 h完成。在该反应中所用到的条件依赖于活性酸衍生物的性质。例如，如果其是酰氯衍生物，则在适宜的碱(如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶等)的存在下实施该反应。适宜的反应溶剂极性有机溶剂，诸如乙腈、Ν,Ν-二甲基甲酰胺、二氯甲烷，或其任何适宜的混合物。
如在本文中使用的术语“N-保护基团”或“N-保护的”指的是那些意欲保护氨基酸或肽的N-末端，或保护氨基以防其在合成程序中不合意的反应的基团。通常使用的N-保护基团在Greene, "有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)" (John Wiley & Sons, New York, 1981)中公开，所述文献通过参考结合于本文。N-保护基团包括酰基基团，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、特戊酰基、叔-丁基乙酰基、2-氯代乙酰基、2-溴代乙酰基、三氟乙酰基、三氯代乙酰基、酞酰基、邻-硝基苯氧基乙酰基、α-氯代丁酰基、苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-溴代苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基基团，诸如苯磺酰基、对-甲苯磺酰基等，氨基甲酸酯形成基团，诸如苄基氧基羰基、对-氯代苄基氧基羰基、对-甲氧基苄基氧基羰基、对-硝基苄基氧基羰基、2-硝基苄基氧基羰基、对-溴代苄基氧基羰基、3,4-二甲氧基苄基氧基羰基、4-甲氧基苄基氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄基氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄基氧基羰基、1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄基氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔-丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙基氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2,2,2-三氯代乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己基氧基羰基、苯硫基羰基等；烷基基团，诸如苄基、三苯基甲基、苄基氧基甲基等；和甲硅烷基基团，诸如三甲基甲硅烷基等。有利的N-保护基团包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、特戊酰基、叔-丁基乙酰基、苯基磺酰基、苄基(bz)、叔-丁氧基羰基(BOC)和苄基氧基羰基(Cbz)。
羟基和/或羧基保护基团也在同上的Greene文献中广泛回顾，且包括醚类，诸如甲基、取代甲基醚类，诸如甲氧基甲基、甲硫基甲基、苄基氧基甲基、叔-丁氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基等，甲硅烷基醚类，诸如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)三苄基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、叔-丁基二苯基甲硅烷基三异丙基甲硅烷基等，取代乙基醚类，诸如1-乙氧基甲基、1-甲基-1-甲氧基乙基、叔-丁基、烯丙基、苄基、对-甲氧基苄基、二苯基甲基、三苯基甲基等，芳烷基基团，诸如三苯甲基和pixyl (9-羟基-9-苯基氧杂蒽衍生物，特别是氯化物)。酯羟基保护基团包括酯，诸如甲酸酯、甲酸苄酯、氯代乙酸酯、甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、特戊酸酯(pivaloate)、金刚烷酸酯、三甲基苯甲酸酯(mesitoate)、苯甲酸酯等。碳酸酯羟基保护基团包括甲基乙烯基、烯丙基、肉桂基、苄基等。
实施方案的详述
现在将通过仅参考下列实施例的阐述来描述本发明多种实施方案。
在下列实施例中，典型地使用以下系统：
核磁共振(NMR)谱记录在Varian Gemini 7 Tesla 300 MHz仪器上或在Bruker Avance 400 MHz仪器上(在指定溶剂中)。以与四甲基硅烷(TMS)的低和高场区(upfield)的ppm给出化学位移。共振多样性分别以s、d、t、m、br和app表示单峰、双峰、三重峰、多重峰、宽峰和表观值。质谱(MS)记录在Finnigan SSQ7000 TSP或Finnigan SSQ710 DI/EI仪器上。用配备Waters Xterra™ MS C8 2.5μm 2.1 x 30 mm柱、Waters 996光电二极管阵列检测器(Photodiode Array Detector)和Micromass ZMD的Waters 2790 LC-系统获得LC-MS。采用配备了Zorbax柱SB-C8 4.6 mm x15 cm的Hewlett Packard 1100系列HPLC系统，实施高压液相色谱(HPLC)分析。采用硅胶60 (230-400目ASTM, Merck)进行柱色谱检测和在TLC预涂布板、硅胶60 F254 (Merck)上实施薄层色谱(TLC)。
制备构造单元 1 ， P1 构造单元
Figure 138401DEST_PATH_IMAGE011
步骤 a) [1-( 甲氧基 - 甲基 - 氨基甲酰基 )- 环丁基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB1-a)
向1-叔-丁氧基羰基氨基-环丁烷羧酸(3 g, 13.94 mmol)的无水DMF (50 mL)溶液中加入Ν,Ο-二甲基羟基胺x HCl (1.36 g, 13.94 mmol)和DIEA (9.21 mL, 55.75 mmol)。反应烧瓶冷却至0 ℃和10分钟后，将HATU (5.30 g, 13.94 mmol)加至该溶液中(在加液时转为黄色)。2 hrs之后通过减压下旋转蒸发除去DMF。将残余物溶解在EtOAc (100 mL)中和用10 %柠檬酸(aq)和饱和NaHCO3(aq)溶液洗涤两次。有机相经Na2SO4干燥，过滤和在硅胶上蒸发。产物经快速色谱法(正庚烷∶乙酸乙酯(1: 1))纯化，以得到无色油样产物，其缓慢结晶(3.13 g)，得率87 %。
步骤 b (1- 甲酰基 - 环丁基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB1-b)
于0 ℃，将LiAlH4 (202 mg, 5.33 mmol)加至溶解于无水乙醚(35 mL)的Weinreb酰胺BB1-a (1.10 g, 4.27 mmol)的溶液中。搅拌溶液15分钟，之后通过缓慢加入酒石酸氢钾(sat, aq)猝灭反应并搅拌10分钟。将溶液倒入分液漏斗和用乙酸乙酯提取水相两次。用0.5 M HCl (3次)、NaHCO3(aq) (2次)和盐水(1次)洗涤合并的有机相。有机相经Na2SO4干燥，过滤和在硅胶上蒸发。产物经快速色谱法(正庚烷∶乙酸乙酯(4: 1→ 3: 1))纯化，以得到白色晶体样产物(0.647 g)，得率76 %。
步骤 c) [1-( 叔丁基氨基甲酰基 - 羟基 - 甲基 )- 环丁基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB1-c)
在惰性气体下，将BB1-b (1.75 g, 8.78 mmol)溶解在CH2Cl2 (18 mL)中并在冰浴中冷却。加入吡啶(2.85 mL)，随后加入叔-丁基异腈(1.50 mL, 13.3 mmol)。然后用30 min滴加三氟乙酸(1.35 mL, 17.5 mmol)。于RT搅拌黄色溶液过夜。浓缩混合物，用EtOAc (100 mL)稀释和连续用1N HCl (50 mL)、饱和NaHCO3 (50 mL)和饱和NaCl (2 x 50 mL)洗涤。干燥(Na2SO4)和真空下浓缩。于RT，用THF (2.5 mL)和1M LiOH的3/1 MeOH-水(2.5 mL)溶液处理得到的粗产物。15 min之后TLC (3/1石油醚-EtOAc)显示完全酯水解。45 min反应时间之后，加入1N HCl (2.5 mL)、水(10 mL)和EtOAc (20 mL)，并分离各层。用饱和NaHCO3 (20 mL)，然后用饱和NaCl (2 x 20 mL)洗涤有机相，干燥(Na2SO4)和浓缩。快速色谱法(75 g硅胶，5/1至1/1石油醚-EtOAc)得到白色固体(2.36 g, 89 %)。
步骤 d (1- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 - 环丁基 - 羟基乙酸 (BB1)
用6N HCl (40 mL)回流BB1-c (1.30 g, 4.33 mmol)，直至由LCMS监测的那样酰胺水解完全。使混合物蒸发，与水共蒸发数次。将1M NaOH (15 mL)加至残余物并在真空下搅拌该碱性溶液15 min。加入于二氧杂环已烷(10 mL)中的Boc2O (1.92 g, 8.80 mmol)，维持pH于10-11，并于RT搅拌混合物过夜。该混合物经用水(50 mL)稀释，在冰浴中用1N HCl酸化至pH 3，然后用EtOAc (2 x 50 mL，然后30 mL)提取。有机相经用饱和NaCl (50 mL)洗涤，干燥(Na2SO4)和蒸发，以得到粗的P1构造单元BB1 (0.649 g)。
1HNMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 6.88 (br s, 1H), 4.15 (s, 1H), 2.40 (br m, 2H), 1.98 (br m, 2H), 1.80 (br m, 2H), 1.35 (s, 9H)；ms ES+ m/z 146 (100 %), 190 (50 %)。
制备构造单元 2 ， P1 构造单元；
Figure 813096DEST_PATH_IMAGE012
步骤 a) ((1- 溴代 -3- 氯代丙 -2- 基氧基 ) 甲基 ) 苯 (BB2-a)
向搅拌的苄基溴(185 g, 1.08 mol)和(1.5 g)的氯化亚汞混合物中加入表氯醇(100 g, 1.08 mol)。于100 ℃加热反应混合物12 hr。TLC分析证实产物形成。经柱色谱法用石油醚作为洗提剂将产物从深棕色反应混合物分离。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(9: 1)，RF = 0.7。得到：148 g, 51 %。
步骤 b) 3- 苄基氧基 - 环丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB2-b)
用20 min向搅拌的于800 mL的无水二氧杂环已烷中的氢化钠(22.5 g, 0.562 mol)混悬液中逐滴加入丙二酸二乙酯(90 g, 0.562 mol)。此次加液完成之后，用20 min逐滴添加BB2-a (148 g, 0.56 mol)。然后于回流加热混合物24 hr。冷却至室温之后，将于少量二氧杂环已烷(~ 20 mL)中的氢化钠(22.5 g, 0.562 mol)加至该混合物中并于回流加热再持续48 hr。减压下部分去除溶剂，且用800 mL水处理该混合物。然后用乙酸乙酯(500 mL x 3)提取该混合物，提取物经干燥(Na2SO4)和真空浓缩，残余物经柱色谱法用石油醚∶乙酸乙酯(10 %)纯化，得到标题化合物。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(9: 1)，RF = 0.3。得到：100 g, 58 %。
步骤 c) 3- 羟基环 丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB2-c)
向化合物BB2-b (40 g)于EtOH (500 mL)的溶液中加入10 %披钯炭(4 g)并使该混合物于50 psi、室温下氢化3.5小时。经过滤去除催化剂，用乙酸乙酯、EtOH洗涤，然后减压下去除溶剂。残余物经硅胶色谱法用正己烷/乙酸乙酯作为洗提剂纯化，以提供标题化合物。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(9: 1)，RF = 0.3。得到：18 g, 64 %。
步骤 d) 3- 氧代环 丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB2-d)
向化合物BB2-c (18 g, 0.0833 mol)于DCM (200 mL)的溶液中加入PCC (37 g, 0.176 mol)，并于室温搅拌该混合物四个小时。经硅胶柱过滤溶液，用DCM/MeOH 98/2洗涤残余物，然后经类似的柱过滤。减压下蒸发合并的部分，以提供需要的化合物。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(9: 1)，RF = 0.3。得到：11 g, 62 %。
步骤 e) 3,3- 二氟代环 丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB2-e)
向冷却的、化合物BB2-d (11 g, 0.0513 mol)于无水DCM (150 mL)的溶液中逐滴添加DAST (18.72 g, 0.116 mol)溶液，并于室温搅拌该混合物过夜。将该混合物加至冰水中，并用DCM提取三次。该溶液经硫酸钠干燥和减压下蒸发。残余物经硅胶色谱法、利用正己烷/乙酸乙酯作为洗提剂纯化，以提供标题化合物。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(7: 3)，RF = 0.5。得到：7.7 g, 64 %。
步骤 f) 1-( 乙氧基羰基 )-3,3- 二氟代环 丁烷羧酸 (BB2-f)
将化合物BB2-e (7.7 g, 0.0325 mol)溶解在冰冷的0.5 M乙醇制氢氧化钾溶液(30 mL)和水(6 mL)中。于室温搅拌该混合物过夜。加入水和减压下去除大部分乙醇。用2M HCl使混合物酸化并用乙酸乙酯提取三次。有机相经硫酸钠干燥和减压下蒸发，以得到需要的化合物。TLC系统：石油醚∶乙酸乙酯(1: 1)，RF = 0.3。得到：5.8 g, 86 %。
步骤 g) 1-( 叔 - 丁氧基 羰基氨基 )-3,3- 二氟代环 丁烷羧酸乙酯 (BB2-g)
向化合物BB2-f (5.8 g, 0.0273 mol)于无水二氧杂环已烷(100 mL)的溶液中加入叔-丁醇(24.4 mL)、DPPA (7.87 g, 0.027 mol)和TEA (2.87 g, 0.0284 mol)，并使混合物回流五个小时。加入乙酸乙酯(约200 mL)，且有机相经用5 %柠檬酸和饱和碳酸氢钠洗涤两次。使溶液干燥和减压下蒸发。经硅胶色谱法用正己烷/乙酸乙酯分离需要的产物。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(1: 1)，RF = 0.5。得到：4 g, 51.4 %。
步骤 h) 3,3- 二氟代 -1-( 羟基甲基 ) 环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB2-h)
向冰冷的、化合物BB2-g (4 g,0.0143 mol)于无水THF (100 mL)的溶液中缓慢加入2 M硼氢化锂(30 mL)溶液，并使该混合物温热最高至室温。于室温搅拌该混合物三个小时。加入冰水和5 %柠檬酸，并用DCM提取该混合物三次。有机相经干燥(Na2SO4)、过滤和减压下蒸发，得到标题化合物。TLC系统石油醚∶乙酸乙酯(1: 1)，RF = 0.3。得到：3.1 g, 91 %。
步骤 i) 3,3- 二氟代 -1- 甲酰基环丁基氨基甲酸叔丁酯 ( ΒΒ 2-i)
向化合物BB2-h (3.1 g, 0.0130 mol)于无水DCM (100 mL)的溶液中加入戴斯马丁高碘烷(Dess Martin Period inane) (19.9 g, 0.0470 mol)，且该混合物于室温搅拌三个小时。加入乙酸乙酯(200 mL)，且有机相用10 %硫代硫酸钠溶液洗涤两次，用0.5 M NaOH和用盐水洗涤两次。有机相经干燥和减压下蒸发。残余物经硅胶色谱法用正己烷/乙酸乙酯作为洗提剂纯化，得到标题化合物。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(1: 1)，RF = 0.4。得到：2.7 g, 87 %。
步骤 j) 1-(2-( 叔丁基氨基 )-1- 羟基 -2- 氧代乙 基 )-3,3- 二氟代环 丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB2-j)
向冰冷的、化合物BB2-i (1.5 g, 0.0064 mol)于无水DCM (100 mL)的溶液中加入异氰酸叔丁酯(0.81 g, 0.009 mol)和吡啶(2.04 g, 0.027 mol)。用十分钟时间加入三氟乙酸(1.58 g, 0.015 mol)。于室温搅拌该混合物五个小时。加入乙酸乙酯，并用5 %柠檬酸和盐水洗涤有机相两次。蒸发有机相，并将其溶解在二氧杂环已烷(50 mL)中。加入1M LiOH溶液(100 mL)，且于室温搅拌该混合物过夜。加入5 %柠檬酸，并用乙酸乙酯提取该混合物三次。有机相经用盐水洗涤、干燥(Na2SO4)、过滤和减压下蒸发。产物经硅胶色谱法用正己烷/乙酸乙酯作为洗提剂纯化。TLC系统；石油醚∶乙酸乙酯(1: 1)，RF = 0.4。得到：1.0 g, 46 %。
步骤 k) 2-(1-( 叔 - 丁氧基 羰基氨基 )-3,3- 二氟代环 丁基 )-2- 羟基乙酸 (BB2)
将化合物BB2-j (1 g)溶解在6 N HCl (40 mL)中，并加热至回流计24 h，其之后TLC显示反应已经完成。真空浓缩反应混合物，并将残余物溶解在THF中；加入H2O (7; 3, 50 mL)和TEA (1.8 mL, 0.012 mol)和Boc酸酐(2.6 g, 0.012 mol)。于RT搅拌该混合物8 h，此时TLC证实反应达到完成。真空浓缩反应混合物，且残余物经柱色谱法用于氯仿中的5 %的甲醇纯化，得到标题化合物。TLC系统；MeOH: CHCl 3 (1: 9)，RF = 0.4。得到：0.6 g, 72 %。
1HNMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7.30 (br s, 1H), 4.11 (s, 1H), 2.90 (br m, 2H), 2.61 (br m, 2H), 1.35 (s, 9H)；ms ES+ m/z 281 (100 %)。
制备构造单元 3 － P1 构造单元；
Figure 24897DEST_PATH_IMAGE013
步骤 a) ((1- 溴代 -3- 氯代丙 -2- 基氧基 ) 甲基 ) 苯 (BB3-a)
将苄基溴(46.0 g, 0.269 mol)和表氯醇(24.9 g, 0.269 mol)和氯化亚汞(0.04 g, 0.085 mmol)的混合物于150 ℃加热12 h。粗产物经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚(pet ether)中的1 %的EtOAc)纯化，得到粘性液体样标题化合物(50 g，得率70 %)。TLC系统：于石油醚中的10 %的EtOAc，Rf = 0.6。
步骤 b) 3-( 苄基氧基 ) 环丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB3-b)
在配备搅拌器、加液漏斗和回流冷凝器的三颈烧瓶中放入NaH (4.6 g, 0.192 mol)于无水二氧杂环己烷(150 mL)中。向该搅拌的反应混合物中，用30 min逐滴加入丙二酸二乙酯(30.75 g, 0.192 mol)。加液完成之后，用30 min逐滴加入化合物BB3-a (50 g, 0.19 mol)。使反应混合物回流24 h。冷却至室温之后，将NaH (4.6 g, 0.192 mol)和无水二氧杂环己烷(40 mL)加至反应混合物并再加热至回流另外48 h。减压下部分去除溶剂，并用水(150 mL)处理混合物。用二乙醚(3 x 100 mL)提取产物，有机层用盐水洗涤和经无水Na2SO4干燥。真空浓缩溶剂，粗产物经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚中的2 %的EtOAc)纯化，得到粘性液体样标题化合物(33g，得率57 %)。TLC系统：于石油醚中的15 %的EtOAc，Rf = 0.5。
步骤 c) 3- 羟基环 丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB3-c)
向化合物BB3-b (33 g, 0.108 mol)于EtOH (300 mL)的溶液中加入10 %披钯炭(10 g)，且于室温50 psi压力下使混合物氢化48 h。经硅藻土垫过滤去除催化剂，并用EtOAc充分洗涤。减压下去除溶剂。产物经硅胶色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚中的20 %的EtOAc)纯化，得到粘性液体样标题化合物(12 g，得率51 %)。TLC系统：于石油醚中的30 %的EtOAc，Rf = 0.3。
步骤 d) 3- 氟代环 丁烷 -1,1- 二羧酸二乙酯 (BB3-d)
将化合物BB3-C (0.8 g, 0.0037 mol)溶解于无水DCM (16 mL)中并冷却至0 ℃。将DAST (1.8 g, 0.011 mol)逐滴加至冷的溶液中。使反应混合物温热至室温搅拌12 h。用冷的饱和NaHCO3溶液猝灭反应混合物。用DCM (100 mL)提取粗产物。有机层经用10 % NaHCO3溶液、水，随后用盐水洗涤，并经无水Na2SO4干燥。真空浓缩溶剂，且粗产物经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚中的1-2 %的EtOAc)纯化，得到浅黄色液体样标题化合物(460 mg，得率57 %)。TLC系统：于石油醚中的10 %的EtOAc，Rf = 0.4。
步骤 e) 1-( 乙氧基羰基 )-3- 氟代环 丁烷羧酸 (BB3-e)
将化合物BB3-d (0.46 g, 0.0021 mol)溶解于冰冷的、于EtOH (4.2 mL)和水(1.4 mL)中的0.5M氢氧化钾溶液中。于室温搅拌混合物过夜。加入水和减压下去除大部分乙醇。混合物经用2N HCl酸化和用EtOAc (3 x 50 mL)提取。有机相经无水Na2SO4干燥。真空浓缩溶剂以得到粗标题化合物(0.35 g, 粗品)，其原样用于下一步骤。TLC系统：于石油醚中的50 %的EtOAc，Rf = 0.3。
步骤 f) 1-( 叔 - 丁氧基 羰基氨基 )-3- 氟代环 丁烷羧酸乙酯 (BB3-f)
向于化合物BB3-e (0.35 g, 0.0018 mol)无水二氧杂环己烷(6 mL)的溶液中加入叔-丁醇(1.8 mL)、二苯基膦酰叠氮化物(0.56 g, 0.002 mol)和三乙胺(0.2 g, 0.002 mol)，且将混合物回流5 h。反应完成后，将EtOAc (60 mL)加至反应混合物中，且用5 %柠檬酸(2 x 20mL)，随后用饱和NaHCO3 (50 mL)洗涤有机层。减压下蒸发有机溶剂。向残余物加入EtOAc (100 mL)，且有机层将用盐水洗涤和经无水Na2SO4干燥。真空浓缩溶剂，粗产物经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚中的5-10 %的EtOAc)纯化，得到白色结晶样标题化合物(0.27 g，得率56 %)。TLC系统：于石油醚中的20 %的EtOAc，Rf = 0.4。
步骤 g) 3- 氟代 -1-( 羟基甲基 ) 环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB3-g)
向冰冷的、化合物BB3-f (0.27 g, 0.001 mol)于无水THF (10 mL)的溶液中缓慢加入2 M硼氢化锂(2 mL, 0.004 mol)溶液，并使混合物温热最高至室温。于室温搅拌混合物3 h。用冰水(2 mL)和5 %柠檬酸(5 mL)猝灭反应混合物，且用DCM (2 x 50mL)提取粗产物。有机层经用盐水洗涤和经无水Na2SO4干燥。真空浓缩溶剂，粗产物经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚中的15-18 %的EtOAc)纯化，得到白色固体样标题化合物(90 mg，得率39 %)。TLC系统：于石油醚中的50 %的EtOAc，Rf = 0.5。
步骤 h) 3- 氟代 -1- 甲酰基环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB3-h)
向除气的、化合物BB3-g (90 mg, 0.0004 mol)于无水DCM (4.5 mL)的溶液中加入Dess-Martin高碘烷(0.21 g, 0.0005 mol)，且于室温搅拌该混合物3 h。加入EtOAc (30 mL)，并用10 %硫代硫酸钠溶液(2 x 10 mL)、0.5 M NaOH (20 mL)和用盐水洗涤有机层。有机层经无水Na2SO4干燥。真空浓缩溶剂，且粗产物经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于石油醚中的10-15 %的EtOAc)纯化，得到白色结晶固体样标题化合物(75 mg，得率87 %)。TLC系统：于石油醚中的20 %的EtOAc，Rf = 0.4。
步骤 i) 1-(2-( 叔丁基氨基 )-1- 羟基 -2- 氧代乙 基 )-3- 氟代环 丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB3-i)
向冰冷的、化合物BB3-h (1.3 g, 0.0059 mol)于无水DCM (25 mL)的溶液中加入叔丁基异腈(0.75 g, 0.0089 mol)和无水吡啶(2.6 mL)。在维持温度于0 ℃下，用十分钟加入三氟乙酸(0.9 mL, 0.01 18 mol)。使反应混合物缓慢温热至室温并搅拌16 h。加入EtOAc (50 mL)，且用5 %柠檬酸和盐水洗涤有机相两次。蒸发有机相并将粗产物溶解于THF (25 mL)中。加入于MeOH-H2O (3: 2 v/v) (2.6 mL)中的1 M LiOH溶液，且于室温搅拌混合物2 h。用5 %柠檬酸猝灭反应混合物，且用乙酸乙酯(2 x 25 mL)提取混合物。有机层经用盐水洗涤和经无水Na2SO4干燥。真空中蒸发溶剂并且得到标题化合物，其足够纯用于下一步骤(1.6 g，得率84 %)。TLC系统：于石油醚中的20 %的EtOAc，Rf = 0.3。
步骤 j) 2-(1-( 叔 - 丁氧基 羰基氨基 )-3- 氟代环 丁基 )-2- 羟基乙酸 (BB3)
用6 N HCl (60 mL)使化合物BB3-i (1.6 g, 0.005 mol)回流16 h直至酰胺水解完成。减压下蒸发溶剂并与水共蒸发数次。将产物溶解于THF: H2O (7:3 v/v, 50 mL)中，冷却至0 ℃和加入Et3N (2.1 mL, 0.015 mol)，随后加入二碳酸二叔丁酯(2.18 g, 0.01 mol)。于室温搅拌混合物过夜(监测pH处于正常区间并在整个反应中维持 在~11)。用1 N HCl中和反应混合物，并用EtOAc (2 x 50 mL)提取产物。有机层经用盐水洗涤和经无水Na2SO4干燥。减压下蒸发溶剂，随后经柱色谱法(硅胶60-120目，洗提剂为于CHCl3中的5 %的MeOH)纯化，得到固体样标题P1构造单元(0.65 g，得率50 %)。TLC系统：于CHCl 3中的30 % MeOH，Rf = 0.3。
1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7.01 (br s, 1H), 5.16 (br m, 1H), 4.97 (br m, 1H), 2.49 (br m, 5H), 1.36 (s, 9H)；ms ES+ m/z 262 (100 %)。
构造单元 4-P1- 引物侧边构造单元
Figure 392424DEST_PATH_IMAGE014
步骤 a) 1-( 羟基甲基 )-3- 甲氧基环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB4-a)
将500 mg (1.51 mmol)的1-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-3-羟基环丁基氨基甲酸叔丁酯(通过如在J. Med. Chem., 1990 33(10) 2905-2915中描述的1 [[(叔丁基氧基)羰基]氨基]-3-羟基环丁烷-1-羧酸乙酯反应制备)和质子海绵(Ν,Ν,Ν',Ν'四甲基萘-1,8二胺) (1.63 g, 6.04 mmol)溶解于DCM (18 mL)中，冷却至0 ℃，并在剧烈搅动下以一份量加入固体样447mg (3.02 mmol)的三甲基氧鎓四氟化硼。搅拌反应混合物3 h并用DCM (50 mL)稀释，和在剧烈搅动下加入盐水(20 mL)。有机相经用碳酸氢钠、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，蒸发和在短硅胶柱(DCM作为洗提剂)上纯化。将得到的产物溶解于THF(5 mL)中，并加入于THF (1 M, 4.5 mL)中的四丁基氟化铵溶液中，并使反应于室温搅拌4.5 h。通过TLC监测反应，且一旦被认为已经达到完成，将其吸收至硅胶上并经硅胶色谱法(EtOAc-正己烷1: 1至纯EtOAc)纯化，得到标题化合物(251 mg, 72 %)。LC/MS 232 (M+l)。
步骤 b) 1- 甲酰基 -3- 甲氧基环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB4-b)
将醇BB4-a溶解于DCM (20 mL)中并以一份量加入Dess-Martin试剂。搅拌反应2.5小时。一旦认为反应已经达到完成，用50 mL的DCM稀释和加入20 mL的10 % Na2S2O3。搅拌混合物，用碳酸氢钠、盐水洗涤之，且用硫酸钠干燥有机相。经硅胶色谱法(EtOAc-正己烷1: 1至纯EtOAc)纯化，得到标题化合物(500 mg, 59 %)。
步骤 c) 1-(2-( 环丙基氨基 )-1- 羟基 -2- 氧代乙 基 )-3- 甲氧基环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB4)
将醛BB4-b 498 mg (1.56 mmol)溶解于无水DCM (8 mL)中。在搅动条件下加入吡啶(0.52 mL)，随后加入环丙基异腈。将反应置于冰浴上，并在20 min过程中逐滴加入TFA (0.25 mL)。将反应混合物搅拌过夜。然后，认为反应已经达到完成和用1 M HCl、碳酸氢钠、盐水洗涤，且有机相经硫酸钠干燥和蒸发。将留下的残余物溶解于二氧杂环己烷中，并和氢氧化锂溶液搅拌过夜，然后用柠檬酸中和。用EtOAc从得到的溶液中提取产物，经硅胶色谱法(EtOAc-正己烷1: 3至1: 1)纯化，得到263 mg的标题化合物(54 %) LC/MS 314 (M+l)。
构造单元 5 (BB5)- P2 构造单元
Figure 821000DEST_PATH_IMAGE015
步骤 a) 2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3- 氯代 - 丙酸甲基酯 (BB5-a)
于氩气氛下，将于二氯甲烷(850 mL)中的三苯基膦(65.8 g, 0.251 mol))和六氯乙烷(59.4 g, 0.251 mol)溶液一次性加至N-Boc-丝氨酸甲基酯(50 g, 0.228 mol)的二氯甲烷(170 mL)溶液中。于室温搅拌反应混合物2 h，然后用饱和NaHCO3 (150 mL)溶液猝灭反应。用二氯甲烷(2x300 mL)提取有机产物，且合并的有机层，用盐水(300 mL)洗涤和经无水硫酸钠干燥。减压下浓缩溶液，然后用Et2O (500 mL)研磨。之后过滤和蒸发溶剂，粗产物经硅胶色谱法(用于石油醚中的6-8 %的EtOAc洗提)纯化，得到标题化合物(42 g, 78 %)。
步骤 b) (2- 氯代 -1- 羟基甲基 - 乙基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB5-b)
于0 ℃、氩气氛下，分数份量将硼氢化锂(4.3 g, 0.195 mol)加至搅拌的BB5-a (42 g, 0.177 mol)的EtOH-THF 9: 1溶液中。于室温搅拌反应8 h，然后用饱和的氯化铵(20 mL)溶液猝灭。用EtOAc (2 x 300 mL)提取产物。合并的有机层经用盐水(300 mL)洗涤和经无水硫酸钠干燥。减压下蒸发溶剂，且得到的粗产物经硅胶色谱法纯化，用于石油醚中的15 %的EtOAc洗提，得到标题化合物(27.5 g, 74 %)。
步骤 c) [2- 氯代 -1-(2- 三甲基硅烷基 - 乙氧基甲氧基甲基 )- 乙基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB5-c)
于0 ℃、氩气氛下，将(2-氯代甲氧基-乙基)-三甲基-硅烷(26.18 g, 0.157 mol)逐滴加至搅拌的化合物BB5-b (27.5 g, 0.131 mol)和N,N-二异丙基乙基胺(27.4 mL, 0.157 mol)的二氯甲烷(350 mL)溶液中。使反应物达到室温并搅拌18 h。真空浓缩反应混合物，然后用EtOAc (150 mL)稀释。用EtOAc (2 x 200 mL)提取产物，且有机层经用盐水(100 mL)洗涤和经无水硫酸钠干燥。减压下蒸发溶剂，得到的粗产物经硅胶色谱法纯化，用于石油醚中的5 %的EtOAc洗提，得到标题化合物(25.5 g, 57 %)。
步骤 d) [2-(1- 羟基 - 环丁基 )-1-(2- 三甲基硅烷基 - 乙氧基甲氧基甲基 )- 乙基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB5-d)
于-78 ℃、氩气氛下，将正-BuLi (10 mL, 0.016 mol, 1.6 M溶液，于正己烷中)逐滴加至搅拌的、化合物BB5-C (2 g, 5.88 mmol)于THF (170 mL)的溶液中。搅拌持续15 min，随后用5 min逐滴加入LiNp (104 mL, 0.42 M溶液，于THF, 0.044 mol中)。于-78 ℃搅拌该深色的溶液1 h，然后逐滴加入环丁酮(0.88 mL, 1 1.77 mmol)。于-78 ℃搅拌反应混合物16 h，然后用饱和NH4Cl (50 mL)溶液猝灭，并使之温热至室温。反应用乙醚(100 mL)和饱和NH4Cl (10 mL)溶液稀释。分离各层，且用乙醚(2 x 100 mL)提取水层。干燥(Na2SO4)合并的有机层，且减压下蒸发溶剂。粗产物经硅胶色谱法纯化，用庚烷:乙醚3: 2洗提，得到标题化合物(1.54 g, 70 %,)。
步骤 e) [2-(1- 氟代 - 环丁基 )-1-(2- 三甲基硅烷基 - 乙氧基甲氧基甲基 )- 乙基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB5-e)
将于THF (过量)中的BB5-d (0.5 g, 1.33 mmol)、50 % Deoxofluor和吡啶(过量)混合于DCM (10 mL)中。于rt搅拌得到的混合物过夜。反应混合物用10 %柠檬酸(aq)和sat. NaHCO3 (aq)洗涤。干燥(Na2SO4)和蒸发有机相。得到粗产物经硅胶色谱法纯化，使用正己烷:EtOAc (7: 1至2: 1)作为洗提剂，得到标题化合物(192 mg, 38 %)。
步骤 f) [2-(1- 氟代 - 环丁基 )-1- 羟基甲基 - 乙基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB5-f)
将BB5-e (192 mg, 0.51 mmol)于0.1 M HCl于MeOH (20 mL)的溶液搅拌3小时，然后加入三乙胺(1 mL)，并浓缩该溶液。得到粗产物经硅胶色谱法纯化，使用正己烷:EtOAc (2: 1)作为洗提剂，得到白色固体样标题化合物(69.3 mg, 55 %)。
步骤 g) 2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环丁基 )- 丙酸 (BB5)
将BB5-f (69 mg, 0.279 mmol)和重铬酸吡啶盐(1.15 g, 3.05 mmol)溶解于无水DMF (5 mL)中。五个小时之后加入H2O (15 mL)，且用DCM (3 x 20 mL)提取产物。干燥(Na2SO4)和蒸发合并的有机层。粗品经硅胶色谱法纯化，使用正己烷:EtOAc (1: 1)，随后EtOH (100 %))作为洗提剂。此得到白色固体样标题化合物(22.3 mg, 31 %)，262.4 [M+H]+。
构造单元 6 (BB6)-P1- 引物侧边构造单元
Figure 407708DEST_PATH_IMAGE016
步骤 a) 乙酰氧基 -(1- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 - 环丁基 )- 乙酸 BB6-a
使(1-叔-丁氧基羰基氨基环丁基)-羟基乙酸(201.5 mg, 0.822 mmol)与在吡啶(1.5 mL)中的乙酸酐(95 μl)搅拌24 h。首先使混合物真空浓缩，然后用5 mL EtOAc稀释。有机溶液经用1 N HCl (2 mL)，随后饱和的NaCl (2 mL)水溶液洗涤，干燥(Na2SO4)和蒸发真空，得到标题化合物。LC-UV/MS API-ES-m/z 286 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, DMSO-6) δ ppm 7.11 (s, 1H), 5.00 (s, 1H, CHOAc), 2.28 (m, 2H), 2,07 (s, 3H, Me), 2.04 (m, 2H), 1.81 (m, 1H), 1.67 (m, 1H), 1.35 (s, 9H, Boc)。
步骤 b) 乙酸 (1- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 - 环丁基 -(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基氨基甲酰基 )- 甲基酯 (BB6-b)
于rt，搅拌α-乙酰氧基羧酸BB6-a (0.23 mmol)和1,1'-羰基二咪唑(87 mg, 0.54 mmol)于无水THF (5.6 mL)的混合物。18 h之后，加入4-甲基-2-氨基噻唑盐酸盐(0.28 mmol)、咪唑(20 mg, 0.29 mmol)和DMAP (0.5 mg)，并于rt继续搅拌。26 h之后，形成非常少的酰胺，这样使混合物于65 ℃加热4 h，然后真空浓缩。使残余物在10 mL EtOAc和10 mL饱和的NaCl水溶液之间分配。再用EtOAc (2 x 10 mL)提取水相。合并有机相，干燥(Na2SO4)和真空中蒸发，得到作为粗物质的152 mg油。快速柱色谱法(硅胶，80/20 CH2Cl2-丙酮)，得到白色固体样标题化合物(62.8 mg，得率71 %)。
TLC Rf (9/1 CH2Cl2-丙酮) 0.70, LC-UV/MS 97 % DAD, API-ES+ m/z 384 [M+H]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 6.95 (s, 1H), 6.76 (s, 1H，噻唑), 5.16 (s, 1H, CHOAc), 2.26 (s, 3H，噻唑Me), 2.14 (s, 3H, Ac), 2.4-2.1 (m, 4H), 1.8-1.6 (m, 2H), 1.33 (m, 9H)。
步骤 c) {1-[ 羟基 -(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB6)
通过于rt与LiOH (1 N, 0.30 mL)于1 mL甲醇中的水溶液一起搅拌BB6-b (56 mg, 0.15 mmol) 1 h，使乙酰基水解。浓缩反应混合物，然后使之在每次5 ml EtOAc和饱和的NaCl水溶液之间分配。再用EtOAc (2 x 5 mL)提取水相。合并有机相，干燥(Na2SO4)和真空中蒸发，得到39.6 mg粗物质样固体。快速柱色谱法(硅胶，95/5 CH2Cl2-丙酮)，得到白色固体样标题化合物(36.2 mg，得率71 %)。LC-UV/MS 100 % DAD, AP-ES+ m/z 342 [M+H]+
构造单元 7 (BB7)- P1 构造单元
Figure 238130DEST_PATH_IMAGE017
步骤 a) 3- 氟代 -1-(1- 羟基 -2-( 甲基氨基 )-2- 氧代乙 基 ) 环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB7)
将碳酸钾(147.5 mg, 1.06 mmol)加至P1-构造单元BB3 (254 mg, 0.96 mmol)的DMF (5 mL)溶液中，随后加入甲基碘(72 μl, 1.15 mmol)。于室温搅拌反应混合物2.5h，然后在DCM和aq. NaHCO3 (sat.)之间分配。分离各相和有机层经用水洗涤，干燥(Na2SO4)和浓缩。将形成的甲基酯的粗残余物溶解于甲基胺的乙醇(33 % (w/w), 10 mL)溶液中，于60 ℃加热2天，然后浓缩，得到α-羟基酰胺BB7，其足够纯而无需进一步纯化用于下一步骤。MS m/z 277.4 (M+H)+。
构造单元 8-P1- 引物侧边构造单元 (BB8)
Figure 510979DEST_PATH_IMAGE018
步骤 a) [1-( 叔丁基氨基甲酰基 - 羟基 - 甲基 )-3- 甲氧基 - 环丁基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB8-a)
依据制备BB4-C所描述的方法，但是使用叔丁基异氰化物(6.68 mmol)替代环丙基异腈，与醛BB4-b, 4.45 mmol反应，得到标题化合物(850 mg, 58 %)，(TLC: rf=0.61(EtOAc∶正己烷1: 1)。
步骤 d) (1- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3- 甲氧基 - 环丁基 )- 羟基 - 乙酸 (BB8-b)
用6 N HCl (60 mL)使化合物DJ14 (850 mg, 2.57 mmol)回流16 h直至酰胺水解完成。减压下蒸发溶剂并与水共蒸发。将产物溶解于THF∶H2O (7: 3 v/v, 50 mL)中，冷却至0 ℃，且加入Et3N (1.4 mL, 10.2 mmol)，随后加入二碳酸二叔丁酯(2.25 g, 10.2 mol)。于室温搅拌混合物过夜。反应混合物用EtOAc洗涤，随后用1N HCl酸化至pH3，和用EtOAc (2 x 50 mL)提取。有机层经用盐水洗涤和经无水Na2SO4干燥。减压下蒸发溶剂，得到固体样标题P1构造单元(360 mg，得率51 %)。
步骤 e) {1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]-3- 甲氧基 - 环丁基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (BB8)
依据在实施例1，步骤a中描述的方法，使羟酸BB8-b与1-甲基-1H-吡唑-3-胺反应，得到标题化合物(232 mg，得率50 %)。
构造单元 9-P1- 引物侧边构造单元 (BB9)
Figure 239901DEST_PATH_IMAGE019
(1R,3S)-3- 氟代 -1-((S)-1- 羟基 -2-(1-D3- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基 )-2- 氧代乙 基 ) 环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB9)
将D3-甲基碘(4.42 mmol, 0.281 mL)加至搅拌的3-硝基吡唑(4.42 mmol, 500 mg)和DBU (0.75 mL)于DMF的溶液中。16 h之后，加入aq. NaHCO3，且用DCM提取混合物。小心浓缩有机相，且得到的粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用DCM洗提。将得到残余物溶解于MeOH中，经Pd/C-10 %氢化，通过硅藻土过滤和浓缩，得到1-(D3-甲基)-1H-吡唑-3-基胺。依据在实施例1，步骤a中描述的方法，将1-(D3-甲基)-1H-吡唑-3-基胺与BB3反应，得到标题化合物。
构造单元 10- P2- 构造单元 (BB10)
Figure 4201DEST_PATH_IMAGE020
步骤 a) (S)-2-( 叔 - 丁氧基 羰基氨基 )-3-(3- 氧代环戊 -1- 烯基 ) 丙酸甲酯 (BB10-a)
于N2下将Boc-β-碘代-Ala-OMe (1.0 g, 3 mmol)加至于3 ml DMF中的锌粉(0.596 g, 9 mmol)和I2 (0.2 mg)的浆液中。搅拌混合物1 h，然后加入Pd2dba3 (0.070 g, 0.076 mmol)、有机膦(SPhos)配体(0.062 g, 0.15 mmol)和1,3-环戊烷二酮(0.63 g, 3.9 mmol)。搅拌反应混合物过夜。经快速色谱法(于异-己烷中的0-100 % EtOAc)纯化，以得率70 %得到化合物，标题化合物(0.468 g)。[M+H]+：284。
步骤 b) (S)-2-( 叔 - 丁氧基 羰基氨基 )-3-(3,3- 二氟代环戊基丙 酸 (BB10)
将化合物BB10-a (0.468 g, 1.7 mmol)溶解于500 ml MeOH中并用带有药筒10 % Pd/C的H-Qube氢化。浓缩混合物并直接使用。将0.103 g (0.36 mmol)的浓缩混合物溶解于1.6 ml DCM中并在冰(0 ℃)上冷却。加入Deoxofluor (于THF中的，313 μl 50 %, 0.72 mmol)和EtOH (10滴)。使反应混合物经三天达到室温，然后经快速色谱法(于异-己烷中的0-100 % EtOAc)纯化。于室温，使用在THF/MeOH (5: 3；3.5 ml)中的LiOH (0.009 g, 0.037 mmol)，使得到的二氟化的化合物水解4 h，此后用5 %柠檬酸(aq)酸化反应混合物之后，用DCM提取和干燥(Na2SO4)。浓缩之后，于33 %得率得到非对映异构体混合物样的标题化合物。[M-H]- 292。
构造单元 11-P1- 引物侧边构造单元 (BB11)
Figure 439862DEST_PATH_IMAGE021
1-(1- 羟基 -2-(2- 甲氧基乙基氨基 )-2- 氧代乙 基 ) 环丁基氨基甲酸叔丁酯 (BB7)
向装有溶解于DMF (10 mL)的BB1 (200 mg, 0.815 mmol)的圆底烧瓶中加入2-甲氧基乙胺(78 μl, 0.897 mmol)和DIEA (540 mL, 3.26 mmol)。将烧瓶置于冰浴上，10分钟之后，加入HATU (310 mg, 0.815 mmol)。1 hr之后，经旋转蒸发去除溶剂，并将粗品溶解于50 mL乙酸乙酯中。用20 mL的1 M HCl、随后用20 mL的sat. NaHCO3洗涤有机相。有机相经干燥(Na2SO4)、在硅胶上过滤和蒸发。硅胶上的粗品经快速色谱法用纯的乙酸乙酯作为流动相纯化，且以定量得率得到产物(245 mg), 303.2 [M+H]+。
实施例 1
Figure 211509DEST_PATH_IMAGE022
步骤 a) {3- 氟代 -1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (1-a)
将1-甲基-1H-吡唑-3-胺(1 eq.)和DIEA (4 eq)加至溶解于DMF中的P1-构造单元BB3 (1 eq)溶液中。使该溶液冷却至0 ℃和10分钟之后加入HATU (1 eq)。于RT约2小时之后，LC-MS显示产物和无起始原料，并经旋转蒸发去除溶剂。将粗产物溶解于40 mL EtOAc中，并用25 mL sat. NaHCO3 (aq)洗涤。有机相经用Na2SO4干燥、过滤和蒸发至干。粗产物在25 g 硅胶柱上经Biotage Flashmaster纯化，得到标题化合物。
步骤 b) 2-(1- 氨基 -3- 氟代 - 环丁基 )-2- 羟基 -N-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基 )- 乙酰胺 (1-b)
用7.5 mL的TFA∶DCM∶TIS∶水(20: 80: 1: 1)混合物处理化合物1-a (363 mg, 1.06 mmol)。于室温2 h后，LC/MS分析确认完成去除Boc基团，真空浓缩溶液并与二氯甲烷(3 x)共沸以去除过量的TFA。将粗产物(339 mg, 0.9 mmol)溶于DCM (10 mL)，并将其加至已于室温中搅拌5 min的2-氨基-3-(1-甲基-环戊基)-丙酰胺(如在WO2006/064286的Ex. 1中制备) (1.2 eq)、PyBOP (1.2 eq)和二异丙基乙基胺(4 eq)于DCM (5 mL)的溶液中。于室温搅拌该混合物直至LC/MS分析指明完成酰胺形成(~30 min)。将DCM加至反应中，且用0.1 M HCl (aq) (2 x)和10 % NaHCO3 (aq) (2 x)洗涤有机相。有机相经干燥和真空浓缩，以得到标题化合物，其无需进一步纯化用于后来的步骤。
步骤 c) N-{3- 氟代 -1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基 }-3-(1- 甲基 - 环戊基 -2- 丙酰基氨基 - 丙酰胺 (1-c)
用7.5 mL的TFA∶DCM∶TIS∶水(20: 80: 1: 1)混合物处理化合物1-b (0.9 mmol)。于室温2 h之后，LC/MS分析确认完成去除Boc基团，且真空浓缩溶液并与二氯甲烷(3 x)共沸以去除过量的TFA。将残余物溶解于DCM中，并用0.1M HCl (aq) (3 x)提取之。用NaOH (aq)将汇集的水溶液层碱化至pH 10，且产物用DCM (3 x)提取。汇集的有机层经干燥(MgSO4)和真空浓缩。将得到粗化合物(33 mg, 83 μmol)溶解于DCM (2 mL)和DIEA (3 eq.)中，并加入氯甲酸甲酯(91.3 μmol)。于室温搅拌反应1 h，之后LC/MS分析指明完成酰化。通过加入甲醇(0.5 mL)猝灭反应且真空浓缩反应物。将残余物溶解于DCM (5 mL)中，且用0.1 M HCl (aq) (2 x)和10 % NaHCO3 (aq) (2 x)洗涤有机相，通过疏水相离析器洗提和真空浓缩，得到标题化合物。
步骤 d) N-[3- 氟代 -1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基 ]-3-(1- 甲基 - 环戊基 )-2- 丙酰基氨基 - 丙酰胺 (1)
于室温将于步骤c获得的残余物再溶解于DCM (1.5 mL)中，并以一份量加入戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin periodinane) (91.3 μmol)。于室温搅拌反应2 h，在此之后，LC/MS分析指明完成氧化。用DCM稀释反应混合物，且用1: 1的10 % Na2S2O3 (aq)和10 % NaHCO3 (aq)混合物洗涤溶液。有机层通过疏水相分离器洗提和真空浓缩。残余物经制备型LC/MS纯化，以得到目标化合物，总得率31 %，M/Z 452.2 [M+H]+
实施例 2-8
以类似于在实施例1中概述的方法，采用适当的R1aR1b 胺、P1/P2和P3构造单元，随后经Dess Martin氧化至终产物α-酮胺，制备于下表中图解的化合物。
表1
Figure 349098DEST_PATH_IMAGE023
1使用4 M HCl于二氧杂环己烷中实施Boc基团的去除
实施例 9
步骤 a) 1-(1- 羟基 -2-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基 )-2- 氧代乙 基 )- 环丁基氨基甲酸叔丁酯 (9-a)
将1-甲基-1H-吡唑-3-胺(158 mg, 1.63 mmol)和DIEA (1.08 mL, 6.52 mmol)加至溶解于DMF (20 mL)的2-(1-(叔-丁氧基羰基氨基)环丁基)-2-羟基乙酸(400 mg, 1.63 mmol)溶液中。使溶液冷却至0 ℃，10分钟之后，加入HATU (620 mg, 1.63 mmol)。于RT约2小时之后，LC-MS显示产物和无起始原料，并经旋转蒸发去除溶剂。将粗产物溶解于40 mL EtOAc并用25 mL sat. NaHCO3 (aq)洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤和蒸发至干。粗产物经25 g硅胶柱在Biotage Flashmaster上纯化，得到白色固体样标题产物(488 mg, 92 %)。TLC rf: 0.07，于庚烷:乙酸乙酯1: 1中。[M+H]+ = 325。
步骤 b [1-{1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基氨基甲酰基 }-2-(1- 甲基 - 环戊基 )- 乙基 ]- 氨基甲酸叔丁基酯 (9-b)
将9-a (204 mg, 0.629 mmol)溶解于MeOH (3 mL)中。加入于二氧杂环己烷(4 M, 1.5 mL)中的HCl溶液。于RT搅拌该溶液16 h，然后浓缩并用甲苯共蒸发。将得到的残余物(0.63 mmol)溶解于无水DMF (1 mL)中，然后于0 ℃添加至冷的于无水DMF (2 mL)中的2-氨基-3-(1-甲基-环戊基)-丙酰胺(如在WO2006/064286的Ex. 1中制备的) (187.5 mg, 0.69 mmol)和HATU (263 mg, 0.69 mmol)溶液。加入DIEA (550 μl, 3.15 mmol)，且于0℃搅拌反应混合物30分钟，然后于RT搅拌2 h。真空浓缩溶液，将残余物溶解于DCM (3 mL)中并应用于硅胶柱(10 g)。化合物经快速色谱法(庚烷:乙酸乙酯75: 25-25: 75)纯化，得到标题化合物(271 mg, 90 %)，作为两个色谱峰。MS m/z 478.2 (M+H)+。
步骤 c) {2-(1- 甲基 - 环戊基 )-1-[1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (9)
依据在实施例1 步骤d中描述的方法使α-羟基酰胺9b氧化。经制备型LCMS (50-70 %梯度，流动相:乙腈-水，1 % NH4OH)纯化，得到标题化合物。MS m/z 476.2 (M+H)+。由LCMS分析评估纯度为99.4 %。
实施例 10-24
以类似于在实施例9中概述的方法，采用适当的构造单元和P1'胺，制备于下表中图解的化合物。
表 2
Figure 210186DEST_PATH_IMAGE025
1于步骤b中用TFA-H2O-TIS实施Boc基团的去除。
2于步骤b中，采用DMF作为溶剂和PyBOP作为偶联剂，使P2构造单元偶联至P1-P1'构造单元；
3通过相应的硝基化合物还原和使用HATU作为偶联剂偶联至P1构造单元制备P1'-胺；
4没有定义在R2a和R2b所连接的原子空间排列中心的立体化学；
5于步骤b中用MeOH:AcCl 9: 1实施Boc基团的去除。
实施例 25
Figure 90417DEST_PATH_IMAGE026
(S)-1-(1-(2-( 叔丁基氨基 )-2- 氧代乙 酰基 ) 环丁基氨基 )-3-(1- 甲基环戊基 ) 丙 -2- 基氨基甲酸叔丁酯 (25)
依据在实施例9，步骤b中描述的方法，使BB1-c (85 mg, 0.283 mmol)偶联至(S)-2-(叔-丁氧基羰基氨基)-3-(1-甲基环戊基)丙酸。粗产物经快速色谱法用庚烷:EtOAc 2: 1纯化，得到α-羟基酰胺(103 mg, 80 %)。[M+H]+ = 454。
依据在实施例1，步骤d中描述的方法，将得到的α-羟基酰胺(10 mg, 0.0221 mmol)氧化，之后经使用庚烷:EtOAc (2: 1至1: 1)的快速色谱法纯化，和冷冻适当的部分，得到标题化合物(11.4 mg, 55 %)。[M+H]+ = 452。
实施例 26-43
以类似于在实施例1中概述的方法，采用适当的R1aR1b胺、P1/P2构造单元和氯甲酸酯，随后经Dess Martin氧化，至终产物α-酮胺，制备于下表中图解的化合物。
表 3
Figure 715302DEST_PATH_IMAGE027
Figure 759088DEST_PATH_IMAGE028
1使用于二氧杂环己烷中的4 M HCl实施Boc基团的去除；
2在负模式下检测MS，即峰是[M-H]-；
3 OMe在R2a/R2b中的异构体比例是1:1；
4在步骤b对在步骤a中获得的粗α-羟基酰胺实施氧化。
实施例 44-56
以类似于在实施例9中概述的方法，采用适当的构造单元和P1'胺，制备于下表中图解的化合物。
表4
Figure 169341DEST_PATH_IMAGE029
Figure 469741DEST_PATH_IMAGE030
1在负模式下检测MS，即峰是[M-H]-；
2没有定义在R2a和R2b所连接的原子空间排列中心的立体化学；
3在步骤a中，使用EtCO2Cl 作为偶联剂，使3-氨基异噁唑偶联至P1。在后处理中使用MeOH/sat. K2CO3 (aq.)，1: 1；
4在步骤b中，使用MeOH:AcCl 9: 1实施Boc基团的去除。
实施例 56
Figure 332655DEST_PATH_IMAGE031
步骤 a) (2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-{1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基氨基甲酰基 }- 乙基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 (56-a)
用于1,4-二氧杂环己烷中的4 M HCl处理氨基甲酸酯9a以去除Boc保护基团。将得到的双-HCl盐(220 mg, 0.74 mmol)溶解于DMF (2 mL)中并加入DIPEA (260 μL, 1.5 mmol)，且将混合物冷却至0 ℃。在分液瓶(separate flask)中，使(2R,3R)-2-(叔-丁氧基羰基氨基)-3-环戊基-3-氟代丙酸(201 mg, 0.74 mmol，如在WO06/064286中制备的那样)溶解于DMF中并加入DIPEA (385 μl, 2.2 mmol)，且将混合物冷却至0 ℃，之后加入HATU (295 mg, 0.77 mmol)，搅拌反应5 min。将第二个瓶中的内容物滴加至第一个瓶中，且持续搅拌1 h。加入Sat aq NaHCO3 (15 mL)和Et2O (15 mL)，且分离各相。用2 X 15 mL EtOAc提取水相，且用sat aq NaHCO3 (15 mL)洗涤合并的有机层。经旋转蒸发去除溶剂，且产物经梯度柱色谱法(DCM-于DCM中的6 % MeOH)纯化。得到标题化合物(332 mg, 93 %)。ES+ 482.2 [M+H]+。
步骤 b) 2- 氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )-N-{1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 ) 甲基 ]- 环丁基 }- 丙酰胺 (56-b)
在Boc-保护的胺56-a (332 mg, 0.689 mmol)中加入于1,4-二氧杂环己烷(5 mL)中的4 M HCl并搅拌反应20 min。经除气反应(N2/真空循环)分离产物，随后冻干。得到双HCl盐样标题化合物(310 mg, >99 %)。ES+ 382.1 [M+H]+。
步骤 c) (2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-{1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基氨基甲酰基 }- 乙基 )- 氨基甲酸 2- 氟代 -1- 甲基 - 乙基酯 (56-c)
将1-氟代丙烷-2-醇(38 mg, 0.48 mmol)和吡啶(39 μl, 0.48 mmol)溶解于DCM (1.5 mL)中，且搅拌混合物并冷却至0 ℃。以一份量加入碳酰氯(于甲苯中的1.9 M溶液，232 μl, 0.44 mmol)和使反应温热至rt并搅拌3 h，期间形成白色沉淀物。于分液瓶中，将胺56-b (36 mg, 0.080 mmol)和DIPEA (45 μl, 0.26 mmol)溶解于DCM (1 mL)中，且搅拌混合物并冷却至0 ℃。将第一个瓶中的250 μl的混合物加至第二个瓶中，并通过HPLC监测反应。15 min之后加入另一份250 μl等分试样并再搅拌反应15分钟，之后通过加饱和入NaHCO3水溶液(10 mL)和Et2O (10 mL)猝灭反应。分离各层，且用2 X 15 mL EtOAc提取水相。用sat aq NaHCO3 (5 mL)洗涤合并的有机相，并经旋转蒸发去除溶剂。产物经梯度柱色谱法(DCM-于DCM中的10 % MeOH)纯化。得到作为非对映异构体的混合物的标题化合物(22 mg, 57 %)。ES+ 486.3 [M+H]+。
步骤 d) {2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸 2- 氟代 -1- 甲基 - 乙基酯 (56)
使α-羟基酰胺58-c氧化，并使产物如在实施例1步骤d中描述的那样纯化，得到作为非对映异构体的混合物的标题化合物(16 mg, 74 %)。纯度99.7 % (LC/MS-DAD)，ES+ 483.3。
实施例 57
Figure 245378DEST_PATH_IMAGE032
步骤 a) {2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (57-a)
将BB1 (350 mg, 1.43 mrnol)溶解于MeOH (4 mL)中并用HCl (4 M，于二氧杂环己烷中，2 mL)处理。3.5 h之后，浓缩溶液，并使残余物与甲苯共蒸发。于0 ℃，将得到的胺加至2-叔-丁氧基羰基氨基-3-(1-氟代环戊基)-丙酸(393 mg, 1.43 mmol)、HATU (543 mg, 1.43 mmol)和DIEA (1 ml, 1.43 mmol)于anh. DMF的溶液中。使反应混合物达到室温并搅拌16 h。浓缩溶液，且得到的残余物经硅胶柱快速色谱法 (EtOAc/异-己烷，20: 80-40: 60)纯化，得到标题化合物(767 mg) MS m/z 417.2 (M+H)+。
步骤 b) {1-[2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酰基氨基 ]- 环丁基 }- 羟基 - 乙酸 (57-b)
将LiOH (0.5 M水溶液，0.64 mmol, 1.264 mL)加至化合物57-a (131.9 mg, 0.32 mmol)于乙腈∶THF 1: 1 (2.4 mL)的溶液中。于室温搅拌反应混合物40 min.，然后用1M HCl (1.5 mL)酸化。将水和乙酸乙酯加至该溶液中，且分离有机相，用酸性水洗涤，干燥(Na2SO4)和浓缩，得到标题化合物(150 mg)。MS m/z 403.2 (M+H)+。
步骤 c) (2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-{1-[ 羟基 -(1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基氨基甲酰基 }- 乙基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 (57-c)
将3-氨基吡唑(92mg, 1.08 mmol)和DIEA (110 μl, 1.08 mmol)加至化合物57-b (0.31 mmol)于anh. DMF (3 mL)的溶液中。使该溶液冷却至0℃并搅拌2-3分钟，然后加入于anh. DMF (1 mL)中的HATU (126 mg, 0.32 mmol)。使反应混合物达到室温，搅拌16 h，然后用DCM稀释。用NaHCO3 sat. aq溶液提取有机相。用乙酸乙酯提取水相，且合并的有机物经anh. Na2SO4干燥，然后浓缩。经快速柱色谱法(MeOH/DCM, 0: 1-2: 8)纯化，得到标题化合物(91mg g, 63 %)。MS m/z 468.3 (M+H)+。
步骤 d) 3-(2-{1-[2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酰基氨基 ]- 环丁基 }-2- 羟基 - 乙酰基氨基 )- 吡唑 -1- 羧酸 9H- 芴 -9- 基甲基酯 (57-d)
将化合物57-c (22.5 mg, 0.0482 mmol)溶解于二氧杂环己烷:水1: 1的混合物(4 mL)中。将NaHCO3 (14.2 mg, 0.168 mmol)加至该溶液中，随后加入Fmoc-Cl (48 mg, 0.18 mmol)。于室温搅拌反应混合物16 h，用DCM稀释和提取。有机相经用盐水洗涤，经anh. Na2SO4干燥和浓缩。经纯化快速柱色谱法(EtOAc/异-己烷，0: 100-40: 60)，得到标题化合物(28 mg, 84 %)。MS m/z 690.3 (M+H)+。
步骤 e) 3-(2-{1-[2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酰基氨基 ]- 环丁基 }-2- 氧代 - 乙酰基氨基 )- 吡唑 -1- 羧酸 9H- 芴 -9- 基甲基酯 (57-e)
将Dess-Martin高碘烷(24 mg, 0.056 mmol)加至醇57-d (28 mg, 0.04 mmol)于anh. DCE (3 ml)的溶液中。于室温搅拌反应混合物40min.，然后用10 % aq. Na2S2O3和aq. NaHCO3 (sat.)猝灭。分离各相和干燥(Na2SO4)并浓缩有机层。经快速柱色谱法(EtOAc/异-己烷，0:100-40: 60)纯化，得到标题化合物(21.7 mg, 79 %)。MS m/z 688.18 (M+H)+。
步骤 f) {2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (57)
向化合物57-e (0.015 mmol)于乙腈∶THF∶水1: 1: 0.5 (1.25 mL)的溶液中加入LiOH (0.5M水溶液, 0.015 mmol, 31.5 μl)。于室温搅拌反应混合物5 min.，然后用1M HCl (30 μl)酸化。加入水和乙酸乙酯，并分离有机相，用酸性水洗涤，干燥(Na2SO4)和浓缩。得到残余物经快速柱色谱法(MeOH/DCM, 0: 1-1 :9)纯化，得到标题化合物(2.3 mg, 31.5 %)。MS m/z 466.2 (M+H)+。
实施例 58
Figure 306875DEST_PATH_IMAGE033
步骤 a) 3-(2-{1-[2- 乙氧基羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酰基氨基 ]- 环丁基 }-2- 羟基 - 乙酰基氨基 )- 吡唑 -1- 羧酸 9H- 芴 -9- 基甲基酯 (58-a)
将化合物57-e (0.079 mmol)溶解于4M HCl的二氧杂环己烷(3 mL)中，然后于室温搅拌4 hrs。真空浓缩溶液，且粗品在aq. K2CO3 (0.5 M)和DCM之间分配。用EtOAc提取水相，合并的有机层经anh. Na2SO4干燥和真空浓缩。将得到的胺溶解于无水DCM (3 mL)中并加入过量的固体NaHCO3，随后添加氯甲酸乙酯(7.5 μl, 0.079 mmol)。搅拌反应2 hrs，然后过滤和浓缩。(MS m/z 662.05 (M+H)+。粗化合物无需进一步纯化用于下一步骤。
步骤 b) 3-(2-{1-[2- 乙氧基羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酰基氨基 ]- 环丁基 }-2- 氧代 - 乙酰基氨基 )- 吡唑 -1- 羧酸 9H- 芴 -9- 基甲基酯 (58-b)
将Dess-Martin高碘烷(47 mg, 0.11 mmol)加至醇58-a (0.079 mmol)于anh. DCE (3 ml)的溶液中。于室温搅拌反应混合物90 min，然后用10 % aq. Na2S2O3和aq. NaHCO3 (sat.)猝灭。分离各相且有机层经干燥(Na2SO4)和浓缩。经快速柱色谱法纯化(EtOAc/异-己烷，0: 100-40: 60)，得到标题化合物(6.5 mg, 13 %)。MS m/z 660.1 (M+H)+。
步骤 c) {2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(2H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸乙基酯 (58)
依据于实施例57步骤f描述的方法，使化合物58-b (0.01 mmol)反应，得到标题化合物(1 mg, 23 %)。MS m/z 437.95 (M+H)+。
实施例 59
Figure 715860DEST_PATH_IMAGE034
{2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸氧杂环 丁烷 -3- 基酯 (59)
类似于实施例C58，但是于步骤c中用氧杂环丁烷-3-醇替代1-氟代丙烷-2-醇，制备标题化合物。标题化合物经制备型HPLC-MS (23-24 % MeCN，于MQ与0.01 M NH3中)纯化。LCMS-ES-478.36。
实施例 60
Figure 128387DEST_PATH_IMAGE035
步骤 a) 2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3- 碘代 - 丙酸甲基酯 (60-a)
于N2气氛下，向填充了锌粉(2.23 g, 34.1 mmol)的三颈烧瓶中加入DMF (13 mL)。有效搅拌该混悬液和加入I2 (0.20 g, 0.80 mmol)。以一份量加入((S)-2-[(叔-丁氧基羰基)氨基]-3-碘代丙酸甲基酯(4.50 g, 13.7 mmol)，且此后立即加入更多的I2 (0.20 g, 0.80 mmol)，并继续搅拌2 h。然后，通过直接顺序加入Pd2dba3 (315 mg, 0.34 mmol)、2-二环己基膦基-2',6'-二甲氧基联苯(279 mg, 0.68 mmol)和1-溴代环戊烯(2.32 g, 15.8 mmol)的DMF (4 mL)，有效进行Negishi偶联反应。搅拌反应过夜。加入DCM (25 mL)，且过滤混合物，再用DCM洗涤固体，加入水(30 mL)，且分离各相。用DCM (2 X 20 mL)提取水相，且合并的有机相用H2O (20 mL)洗涤，干燥MgSO4，过滤和蒸发。残余物经梯度硅胶色谱法(于异己烷中的4-16 % EtOAc)纯化，得到标题化合物1.24 g (30 %)。GC-MS EI m/z 213 (w), 196 (w), 152, 88, 57, 41。
步骤 b) 2- 氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酸甲基酯 (60-b)
将来自前述步骤的烯烃产物(1.24 g, 4.62 mmol)溶解于特氟隆瓶中的冷却至0 ℃的甲苯(10 mL)中，且剧烈搅拌该溶液。加入HF-吡啶(70 % HF, 8 mL)。当不再可由LC-MS ES+检测到转化时，猝灭反应。小心将反应混合物转移至于0 ℃、含搅拌的CaCO3在H2O (100 mL)和DCM (50 mL)中的浆液(28 g)的烧瓶中。检核pH并通过加入sat aq Na2CO3调节至约10。迅速搅拌混悬液30 min。将硅藻土(16 g)加至猝灭的反应混合物中。过滤混悬液，并用DCM (100 mL，分次)和H2O (50 mL)洗涤滤饼。分离各相，且用DCM (2 X 40 mL)提取水层。合并的有机相经用sat aq NaHCO3 (40 mL)洗涤和蒸发。粗产物无需进一步纯化用于下一步骤。
步骤 c) 2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酸甲基酯 (60-c)
将来自前述步骤的粗氨基酯产物(0.94 g，约4.62 mmol)溶解于1,4-二氧杂环己烷(10 mL)中，加入aq sat NaHCO3 (15 mL)，且搅拌混合物并冷却至0 ℃。加入Boc2O (1.06 g, 4.85 mmol，于10 mL 1,4-二氧杂环己烷中)。使反应达到rt并搅拌1 h。加入Et2O (30 mL)和H2O (20 mL)，且分离各层。用Et2O (2 X 25 mL)提取水相。合并的有机相用H2O和盐水(20 mL每次)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发。产物经梯度硅胶色谱法(2-17 % EtOAc于异-己烷中)纯化。得到叔-丁氧基羰基氨基酯产物(391 mg, 29 %，用两步)。GC-MS m/z EI 230 (w), 196 (w), 174, 110, 59, 57, 41。
步骤 d) 2- 叔 - 丁氧基 羰基氨基 -3-(1- 氟代 - 环戊基 )- 丙酸 (60-d)
将来自前述步骤的甲基酯(391 mg, 1.35 mmol)溶解于MeCN (6 mL)和THF (6 mL)。搅拌该溶液并加入LiOH (0.5 M, 2.7 mmol, 5.4 mL)水溶液。搅拌该混合物30 min，然后用1M HCl (6 mL)酸化并立即用EtOAc (20 mL)和H2O (20 mL)稀释。分离各相，经用EtOAc (2 X 20 mL)提取有机层。合并的有机相经1: 1的1M HCl和盐水(20 mL)混合物洗涤，经Na2SO4干燥，过滤和蒸发。产物经梯度硅胶色谱法(10-30 % EtOAc，于异-己烷中，始终用1 % MeOH和0.25 % AcOH)纯化，得到标题化合物(345 mg, 93 %)。αD20: +16.8 (c 1.0, MeOH)。LC-MS m/z ES+ 200.1，ES-274.1。
步骤 e) (2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-{1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基氨基甲酰基 }- 乙基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 (60-e)
将化合物9-a (185 mg, 0.57 mmol)溶解于2 mL MeOH并用于二氧杂环己烷(4 mL)中的4 M HCl处理之。搅拌反应30 min，之后使溶液除气并冷冻干燥，以定量收率得到去保护的二盐酸盐。依据实施例C58，步骤a描述的方法，将该物质与酸C60-d (177 mg, 0.57 mmol)反应。产物经梯度硅胶色谱法(0-6 % MeOH于DCM中)纯化，得到259 mg (94 %)。LCMS-ES+ 482.2。
步骤 f) {2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (60)
依据于实施例C1，步骤d中描述的方法，使醇60-e (40 mg, 0.083 mmol)氧化。经制备型HPLC-MS (30-35 % MeCN于始终含0.01 M NH3的MQ中)分离标题化合物(18 mg, 43 %)。LCMS ES+ 480.5。
实施例 61
Figure 359648DEST_PATH_IMAGE036
步骤 a) (2-(1- 氟代环戊基 )-1-{1-[ 羟基 -(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基甲酰基 )- 甲基 ]- 环丁基氨基甲酰基 }- 乙基 )- 氨基甲酸乙基酯 (61-a)
如于实施例60步骤e中描述的，使化合物60-e (212 mg, 0.44 mmol)与4 M HCl在二氧杂环己烷中反应，得到定量收率的去保护的二盐酸盐的。
LCMS-ES+ 382.2。将50 mg (0.11 mmol)的该物质制成于DCM (1 mL)中的浆液并加入DIPEA (62 μL, 0.35 mmol)，且使混合物冷却至0° C并搅拌直至溶液清澈。逐滴加入氯甲酸乙酯(0.11 M于DCM中，0.9 mL)，且搅拌溶液30 min。加入Et2O (10 mL)和sat aq NaHCO3 (7 mL)，且分离各相。用EtOAc (2 x 5 mL)提取水相，且合并的有机相用sat aq NaHCO3 (7 mL)洗涤和蒸发，得到粗标题化合物，其原样用于下一步骤。
步骤 b) {2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸乙基酯 (61)
依据于实施例C1，步骤d中描述的方法，使粗的醇61-a氧化。经制备型HPLC-MS (25-40 % MeCN于含0.01 M NH3的MQ中)分离标题化合物(18 mg, 32 %，经两步)。LCMS ES+ 452.5。
实施例 62
Figure 226716DEST_PATH_IMAGE037
{2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸甲基酯 (62)
依据类似于在实施例61中描述的方法，但是在步骤a中，用氯甲酸甲酯替代氯甲酸乙酯，制备标题化合物。标题化合物经制备型HPLC-MS (25-30 % MeCN于含0.01 M NH3的MQ中)纯化。LCMS-ES+ 438.5。
实施例 63-72
类似于在实施例1中概述的方法，使用适当的R1aR1b胺、P1/P2构造单元和氯甲酸酯，随后经Dess Martin氧化至终产物α-酮胺，制备于下表中图解的化合物。
表5
1使用于二氧杂环己烷中的4 M HCl实施Boc基团的去除；
2于60 ℃经三天，使用P1-构造单元的甲基酯和在EtOH中的过量的30 % MeNH2实施步骤a。浓缩反应混合物且粗品用于下一步骤；
3在负模式下检测MS，即峰是[M-H]-。
实施例 73
Figure 253895DEST_PATH_IMAGE039
{2-(1- 氟代 - 环戊基 )-1-[3- 甲氧基 -1-(1- 甲基 -1H- 吡唑 -3- 基氨基草酰基 )- 环丁基氨基甲酰基 ]- 乙基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 (73)
依据在实施例9中概述的方法，使用适当的构造单元，制备标题化合物。通过分离在制备BB4-a中得到的对映体混合物，得到纯的构造单元BB8的异构体。[M+H]+ 510.5。
生物学实施例
组织蛋白酶 K 蛋白水解催化活性的测定
使用人重组酶，诸如在PDB中描述的，实施对组织蛋白酶K的便利分析。
ID BC016058标准；mRNA；HUM；1699 BP。
DE智人(Homo sapiens)组织蛋白酶K (pycnodysostosis)，mRNA (cDNA克隆MGC：23107
RX MEDLINE；RX PUBMED；12477932。
DR RZPD；IRALp962G1234。
DR SWISS-PROT；P43235；
可在多种商业上可获得的表达系统，包括大肠杆菌(E coli)、毕赤酵母属(Pichia)和杆状病毒(Baculovirus)系统中表达重组组织蛋白酶K。通过用常规方法去除前序列(prosequence)激活纯化酶。
测定动力学常数的标准分析条件使用荧光肽(fluorogenic peptid)底物，典型地，H-D-Ala-Leu-Lys-AMC，并在或者100 mM Mes/Tris，pH 7.0，含1 mM EDTA和10 mM 2-巯基乙醇；或者100 mM磷酸钠、1 mM EDTA、0.1 % PEG4000 pH 6.5；或者100 mM乙酸钠，pH 5.5，含5 mM EDTA和20 mM半胱氨酸中测定，在每种情况下，任选有1M DTT作为稳定剂。所用的酶浓度是5 nM。在10 mM于DMSO中制备储备的底物溶液。在固定的底物浓度60 μΜ进行筛查和用自250 μΜ双倍稀释底物详细进行动力学研究。该分析中总的DMSO浓度维持低于3 %。所有分析在室温下进行。用Labsystems Fluoroeskan Ascent荧光读板器监测产物荧光(激发波长390 nm，发射波长460 nm)。在产生AMC产物后经15分钟产生产物进展曲线(product progress curves)。
组织蛋白酶 S Ki 测定
该分析使用从Bachem可获得的、于384孔格式板中的杆状病毒-表达的人组织蛋白酶S和boc-Val-Leu-Lys-AMC荧光底物，其中可与包含已知组织蛋白酶S抑制剂比较剂(comparator)的阳性对照平行测试7种化合物。
底物稀释
将280 μL/孔的12.5 % DMSO加至96深孔聚丙烯板的两列中的B-H行。将70 μL/孔的底物加至A行。将2 x 250 μL/孔的分析缓冲液(100 mM磷酸钠、100 mM NaCl，pH 6.5)加至A行，混合，并沿着板向下2倍稀释至H行。
抑制剂稀释
将100 μL/孔的分析缓冲液加至96孔V型底聚丙烯板的4行中第2-5列和第7-12列的孔中。将200 μL/孔的分析缓冲液加至第1和6列。
将在DMSO中制备的第一个受试化合物加至顶行的第1列，典型地，加液体积提供最初测定的大致Ki的10和30倍之间。从初步运行中计算大致Ki，其中将10 μL/孔的1 mM boc-VLK-AMC (稀释至分析缓冲液的于DMSO中的10 mM储备液的1/10稀释液)分发至96孔MicrofluorTM板的B至H行和20 μl/孔加至A行。将2 μl的各10 mM受试化合物加至第1-10列A行的一个独立的孔。将90 μl含1 mM DTT和2 nM组织蛋白酶S的分析缓冲液，加至B-H行的各孔和180 μl加至A行的各孔。使用多通道移液器混合A行并双倍稀释至G行。使H行混合和在荧光分光光度计上读板。读数为与竞争抑制方程拟合的棱镜数据(Prism data)，设置S = 100 μΜ和KM = 100 μΜ，以得到Ki的估计值，最高至100 μΜ。
将第二个受试化合物加至顶行的第6列，第三个受试化合物加至第二行的第1列等。将1 μl 的比较剂加至底行的第6列。混合第1列并双倍稀释至第5列。混合第6列并双倍稀释至第10列。
采用8-通道多级自动平滑(multistepping)移液器设置在5 x 10 μl，分发10 μl/孔的底物至384孔试验板。将底物稀释板第一列分发至试验板的从A行开始的所有列。多通道移液器的尖头间距(tip spacing)将正确地跳过交替行(skip alternate rows)。从B行开始，将第二列分发至所有列。
采用12-通道多级自动平滑移液器吸取4 x 10 μl，将10 μl/孔的抑制剂分发至384孔试验板。将抑制剂稀释板的第一行分发至试验板的从A1开始的交替行。多通道移液器的尖头间距将正确地跳过交替列。类似地，分别从A2、B1和B2开始，将第二、第三和第四行分发至交替的行和列。
使20 mL分析缓冲液与20 μl 1 M DTT混合。添加足量的组织蛋白酶S，得到2 nM终浓度。
采用分发器，诸如Multidrop 384，添加30 μl/孔至试验板的所有孔并在荧光分光光度计，诸如Ascent上读板。
荧光读数，(激发波长和发射波长分别为390 nm和460 nm，采用带通滤波器(bandpass filters)设定)，其反映对荧光底物的酶裂解的程度，尽管是抑制剂，是与各孔匹配的线性速率。
使用SigmaPlot 2000，将对于各种抑制剂的所有孔的匹配的速率，与竞争性抑制方程式拟合，确定V、Km和Ki值。
组织蛋白酶 L Ki
以上的方法经下列修改被用于测定组织蛋白酶L的Ki。
该酶是商业上可获得的人组织蛋白酶L (例如Calbiochem)。底物是可从Bahcem获得的H-D-Val-Leu-Lys-AMC。分析缓冲液为100 mM乙酸钠、1 mM EDTA，pH5.5)。将DMSO储备液(10 mM，于100 %DMSO中)稀释至于分析缓冲液中的10 %。于分析缓冲液中制备5 nM浓度的酶，在即将使用前添加1 mM二硫苏糖醇。将在100 % DMSO中配制的2 μl的10 mM抑制剂分配至A行。10 μl的50 μΜ底物(=于DMSO中的10 mM储备液于分析缓冲液中稀释的1/200稀释液)。
抑制研究
采用以上分析，用可变浓度的受试化合物筛查潜在的抑制剂。通过添加酶至底物和抑制剂的缓冲溶液中启动反应。依据方程式1计算Ki值。
此处，v 0是反应速度，V是最大速度，S是具有Michaelis常数KM的底物浓度和I是抑制剂浓度。
由选择以nM表示的Ki值所代表的本发明化合物表现的组织蛋白酶S、组织蛋白酶K和组织蛋白酶L的抑制，呈现于表1中。
表1
Figure 246308DEST_PATH_IMAGE041
因此，式II化合物是组织蛋白酶S的有效抑制剂，且仍对密切相关的组织蛋白酶K和L具选择性。
渗透性
该实验检测通过人胃肠道细胞的抑制剂的转运(transport)。该项分析采用熟悉的具有传代次数(passage number)在40和60之间的Caco-2细胞。
顶端层 (Apical) 向基底外侧层 (basolateral) 转运
一般地，将在2-4个孔测试每一种化合物。基底外侧和顶端孔将分别含1.5 mL和0.4 mL转运缓冲液(TB)，且受试物质的标准浓度是10 μΜ。此外，所有受试溶液和缓冲液将含1 % DMSO。在实验之前，用含10 %血清的培养基将转运板预涂布(pre-coated) 30分钟，以避免非特异性结合至塑胶材料。在滤器支架(filter supports)上培养21-28天之后，细胞已准备用于渗透性实验。
1号转运板包含每行4个孔共3行。有指示，第1行为清洗，第2行为“30分钟”而第3行为“60分钟”。2号转运板包含每行4个孔共3行，一个指示第4行“90分钟”，第5行“120分钟”，而余下的行未予指定。
去除来自顶端孔的培养基，并将插入物(inserts)转移至没有插入物的2块板中的转运板(1号板)的清洗行(No.1)，其于第1-5行已经用1.5 mL转运缓冲液(HBSS, 25 mM HEPES, pH 7.4)制备。于A→B筛查中，基底外侧孔中的TB也含1 %牛血清白蛋白。
将0.5 mL转运缓冲液(HBSS, 25 mM MES, pH 6.5)加至插入物，且在微孔板(polymix)振荡器中，于37 ℃使细胞单层于转运缓冲液系统中平衡30分钟。平衡至缓冲液系统之后，用EVOM chop stick仪器检测各孔的跨上皮电阻抗(Transepithelial electrical resistance)值(TEER)。TEER值通常在每孔400至1000 Ω之间(取决于所用的传代次数)。
从顶端层一边去除转运缓冲液(TB, pH 6.5)，并将插入物转移至30分钟行(No.2)和将包括测试物质的新鲜的425 μL TB (pH 6.5)加至顶端层(供体)孔。于37 ℃、于约150 至300 rpm的低振荡速率的微孔板振荡器中孵育板。
于第2行孵育30分钟之后，每30分钟将插入物移至新的预先-温热的基底外侧层(受体)孔；第3行(60分钟)、第4行(90分钟)和第5行(120分钟)。
~2分钟之后和在实验结束时，从顶端层溶液取25份样品。这些样品代表从实验开始和结束的供体样品。
在各预定的时间点，从基底外侧层(受体)孔取300 μL，并在实验结束时检测TEER的后验值(post value)。向所有收集的样品中加入乙腈至终浓度为在样品中的50 %。收集的样品于-20 ℃存储直至HPLC或LC-MS分析用。
基底外侧层向顶端层转运
一般地，将在2-4个孔测试每一种化合物。基底外侧层和顶端层孔将分别含1.55 mL和0.4 mL TB，且受试物质的标准浓度是10 μΜ。此外，所有受试溶液和缓冲液将含1 % DMSO。在实验之前，用含10 %血清的培养基将转运板预涂布30分钟，以避免非特异性结合至塑胶材料。
在滤器支架上培养21-28天之后，细胞已准备用于渗透性实验。去除来自顶端层孔的培养基，并将插入物转移至没有插入物的新板(转运板)的清洗行(No.1)。
转运板包含每行4个孔共3行。第1行被指定为“清洗”，而第3行为“实验行”。 之前已经在清洗第1行中用1.5 mL TB (pH 7.4)，在实验行，第3行(供体侧)中用包含测试物质的1.55 mL TB (pH 7.4)，制备转运板。
将0.5 mL转运缓冲液(HBSS, 25 mM MES, pH 6.5)加至于第1行的插入物中，且在微孔板振荡器中，于37 ℃使细胞单层于转运缓冲液系统中平衡30分钟。平衡至缓冲液系统之后，用EVOM chop stick仪器检测各孔的TEER值。
从顶端层一边去除转运缓冲液(TB, pH 6.5)，并将插入物转移至第3行，并将400 μl、新鲜的TB，pH 6.5加至插入物中。30分钟之后，从顶端层(受体)孔抽吸250 μl并用新鲜的转运缓冲液替代之。此后，每30分钟，抽吸250 μl样品并用新鲜的转运缓冲液替代之，直至实验在120分钟结束，且在实验结束时检测TEER的后验值。在~2分钟之后和在实验结束时，从基底外侧层(供体)隔室取25 μl样品。这些样品代表从实验开始和结束的供体样品
向所有收集的样品中加入乙腈至样品的终浓度为50 %。将收集的样品于-20 ℃储存直至HPLC或LC-MS分析用。
计算
累积吸收部分FAcum对时间的测定。从下式计算FAcum：
Figure 419932DEST_PATH_IMAGE042
此处CRi是在间期i的受体浓度，且CDi是间期i开始时的供体浓度。应该得到线性相关。
从下式计算渗透系数(Papp，cm/s)的测定：
Figure 744734DEST_PATH_IMAGE043
此处k是转运速率(min-1)，定义为从作为时间(min)函数的累积吸收部分FAcum的线性回归获得的斜率，VR是受体腔室(mL)的体积，且A是滤器面积(cm2)。
参考化合物
Figure 114535DEST_PATH_IMAGE044
通过胃肠组织的更高的渗透性是有利的，其优点在于允许利用较小剂量达到与暴露于较差通透化合物用较高剂量给药所达到的类似水平。低剂量是有利的，其优点在于使每日剂量的药品成本降至最低，此对在延长的时间段服用的药品是至关重要的参数。
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除非上下文另有需求，本说明书和其后的权利要求书通篇，词语“包含”及其变化，诸如“包括”、“含有”，将应该被理解为意味着包括规定的整数、步骤、整数组或步骤组，但是不排斥任何其他的整数、步骤、整数组或步骤组。
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Claims (19)

1.一种式II化合物：
Figure 131787DEST_PATH_IMAGE001
其中
R1a是H；和
R1b是C1-C6烷基，其任选被独立选自以下的1-3个取代基取代：卤代、羟基、氰基、叠氮基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、C1-C4二烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、碳环基和Het；或
R1b是碳环基或Het；或
R1a和R1b与它们连接的N原子一起共同限定具有3-6个环原子的饱和环胺；
其中碳环基、Het或环胺任选被独立选自以下的1-3个取代基取代：卤代、羟基、氰基、叠氮基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、C1-C4二烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、RxOOC-C0-C2亚烷基(此处Rx是H、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基)、苯基、苄基或C3-C6环烷基C0-C2亚烷基；
其中苯基、苄基或环烷基部分任选被独立选自卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基的1-3个取代基取代；
R2a和R2b独立选自H、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基，或R2a和R2b与它们连接的碳原子一起共同形成C3-C6环烷基；
R3是C5-C10烷基，其任选被独立选自卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代；或
R3是具有至少2个氯代或3个氟代取代基的C2-C4烷基链；或
R3是C3-C7环烷基甲基，其任选被独立选自C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代；
R4'是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或氧杂环丁烷-3-基；
Het是含1-4个独立选自O、S和N的杂原子的、稳定的、单环或双环、饱和的、部分饱和的或芳环系统，各环具有5或6个环原子；
碳环基是C3-C6环烷基、C5-C6环烯基或苯基；
或其药学上可接受的盐、水合物或N-氧化物。
2.依据权利要求1化合物，其中R1b是甲基、环丙基、1-苯基乙基，或含1-3个氮原子和0或1个硫原子的5或6元杂环，所述环丙基、苯基或杂环任选被独立选自以下的至多3个取代基取代：C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基羰基、胺、C1-C4烷基胺、C1-C4-二烷基胺、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基磺酰基氨基、氨基羰基、氨基磺酰基、RxOOC-C0-C2亚烷基(此处Rx是H或C1-C4烷基)或C3-C6环烷基C0-C2亚烷基或苄基(所述环烷基，或苄基的苯基环任选被选自C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基的1-3个取代基取代)。
3.依据权利要求2的化合物，其中的杂环是吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噻唑基或噻二唑基，其中任一基团任选被C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C3-C6环烷基或C3-C6环烷基甲基取代。
4.依据权利要求3的化合物，其中的杂环是吡唑-1-基，任选被C1-C4烷基、卤代、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或环丙基取代。
5.依据权利要求4的化合物，其中的吡唑基被诸如乙基或甲基的C1-C4烷基N-取代。
6.依据权利要求1-5中任一项的化合物，其中R2a和R2b均为F。
7.依据权利要求1-5中任一项的化合物，其中R2a和R2b之一是H，而另一个是Cl、F、F3C或MeO。
8.依据权利要求1-5中任一项的化合物，其中R2a和R2b均为H。
9.依据权利要求1-8中任一项的化合物，其中R3是叔-丁基甲基、环丁基甲基、1-甲基环丁基甲基或1-甲基环戊基甲基，它们中的任一个任选被一个或两个F或MeO取代。
10.依据权利要求1-8中任一项的化合物，其中R3是1-甲基环戊基甲基或1-氟代环戊基甲基。
11.依据前述权利要求中任一项的化合物，其中R4'是C1-C4烷基。
12.依据权利要求11的化合物，其中R4'是甲基或乙基。
13.一种药用组合物，其包含依据前述权利要求中任一项的化合物和其药学上可接受的媒介物。
14.如在权利要求1-12中任一项定义的化合物在预防或治疗以组织蛋白酶S的不适当表达或激活为特征的紊乱中的用途。
15.依据权利要求14的用途，其中的紊乱选自：
a) 银屑病；
b) 自身免疫适应症，包括特发性血小板减少性紫癜(ITP)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、干燥性综合征、Grave's病和系统性红斑狼疮(SLE)；或
c) 非自身免疫适应症，包括过敏性鼻炎、哮喘、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)和慢性疼痛。
16.一种用于预防或治疗以组织蛋白酶S的不适当表达或激活为特征的紊乱的方法，该方法包括给予罹患所述紊乱或处于所述紊乱风险的人或动物以有效量的权利要求1-12中任一项定义的化合物。
17.依据权利要求16的方法，其中的紊乱是：
a) 银屑病；
b) 自身免疫适应症，其选自特发性血小板减少性紫癜(ITP)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、干燥性综合征、Grave's病和系统性红斑狼疮(SLE)；或
c) 非自身免疫适应症，其选自过敏性鼻炎、哮喘、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)和慢性疼痛。
18.依据权利要求1-12中任一项的化合物，其用作药物。
19.依据权利要求18的化合物，其用于预防或治疗以组织蛋白酶S的不适当表达或激活为特征的紊乱。
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