CN113332420A - 日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动脉粥样硬化方面的应用 - Google Patents

日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动脉粥样硬化方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动脉粥样硬化方面的应用，属于药物化学技术领域。本发明提供了一种可以预防、缓解或治疗动脉粥样硬化的药物，此药物的有效成分为日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin，简称rSj‑Cys。rSj‑Cys可以有效缓解动脉粥样硬化，可以降低血清脂质水平、延缓动脉粥样硬化小鼠炎症反应、稳定斑块发展及逆转脏器病理损害，为临床治疗动脉粥样硬化提供新的思路。

Description

日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动脉粥样硬化方面的 应用
技术领域
本发明涉及日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动脉粥样硬化方面的应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种持续进展的慢性炎症反应，主要累及大动脉和中型动脉。病变特征为脂质沉积在动脉内膜，导致动脉内膜形成粥样斑块，从而导致血管变硬、变窄和组织缺血，引起一系列的并发症，严重威胁人类健康。目前，对于动脉粥样硬化发病机制的研究尚未明确。随着人类生活水平的提高，肥胖、高血压、高脂血症等均是动脉粥样硬化的危险因素，人们普遍认为脂质代谢异常、慢性炎症反应、氧化应激和免疫功能紊乱等可导致动脉粥样硬化且其发生会损害多个器官，如心、脑、肾等。自从脂质肾损害假说的提出，Moorhead等人的研究证实肾损害与脂代谢紊乱相互联系并且彼此加重，高脂血症可导致动脉粥样硬化，异常的脂蛋白沉积在肾组织中，损害肾小球及内皮细胞，诱发肾脏的炎症反应，患有基础肾脏疾病的患者又可以通过加速动脉粥样硬化的进程而增加死亡率。因此在动脉粥样硬化的治疗中，肾脏是个值得关注的问题。
基于“卫生假说”，“蠕虫疗法”即蠕虫及其衍生物防治多种疾病如免疫代谢性疾病和炎症性疾病的策略受到广泛的关注。蠕虫分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，是一类半胱氨酸蛋白酶高效抑制剂。依据氨基酸序列，半胱氨酸酶蛋白酶抑制剂家族被分为Stefins(家族1)，Cystatins(家族2)和Kininogens(家族3)。蠕虫的Cystatin，能够抑制半胱氨酸蛋白酶，既可以抑制宿主体内组织蛋白酶的活性又可以调节宿主的细胞因子来抑制宿主的免疫反应。已有实验证实丝虫以及华支睾吸虫的Cystatin改善小鼠的急性结肠炎症，魏氏棘唇线虫的Cystatin诱导的调节性T细胞过继输注小鼠，能够显著减轻小鼠的结肠黏膜炎。日本血吸虫I型Cystatin基因组DNA和cDNA的全长序列在基因库里分别编号为FJ617451和FJ617450，cDNA的全长基因序列的开放阅读框长度为306bp，编码101个氨基酸，理论分子量为11.3kDa。已有报道证实血吸虫Cystatin可以治疗关节炎，脓毒症，结肠炎，但是血吸虫Cystatin是否可以预防、缓解或治疗动脉粥样硬化及其并发症目前还未有人研究。
发明内容
本发明的目的在于提供rSj-Cys在制备预防、缓解或治疗动脉粥样硬化药物方面的应用。动物实验证实rSj-Cys可以延缓动脉粥样硬化小鼠炎症反应、稳定斑块发展及逆转脏器病理损害，为临床治疗动脉粥样硬化提供新思路。
日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化药物方面的应用。
在一种实施方式中，所述Cystatin的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化包括如下至少一种功能：
(1)降低血清脂质水平及延缓肾功能损害；
(2)降低肾脏中的MDA水平并增加SOD水平；
(3)减少主动脉斑块病变面积；
(4)抑制促炎细胞因子TNF-α，IL-6和iNOS水平，增加免疫调节因子IL-10、TGF-β和Arg-1的表达。
在一种实施方式中，所述Cystatin单独作为药物的有效成分。
在一种实施方式中，所述Cystatin的有效剂量为0.05～0.15mg/kg。
在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的药物载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
在一种实施方式中，所述药用辅料包含填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。
在一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素；所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠；所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚乙二醇；所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
在一种实施方式中，所述药物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
有益效果：
拓展“蠕虫疗法”治疗领域(心血管疾病)，不仅进一步完善蠕虫免疫调节作用的分子机制，本研究如果能证实rSj-Cys发挥对动脉粥样硬化小鼠的防治作用，亦为开发出具有自主知识产权的虫源分子抗原作为新型免疫调节药物发挥靶向治疗动脉粥样硬化，甚或其他常见的代谢性或免疫相关性疾病的防治提供新策略。
针对蠕虫疗法对多种疾病模型的治疗机制以及各项临床指标改善的情况，以此为基础，调整心血管疾病的治疗方案最适化，以期获得更好的治疗效果，重启新动力，畅享新生活。同时对于其他常见的代谢性或免疫相关性疾病，及时开启新型免疫调节药物的干预，极大减轻了患者的经济负担，提高了患者的生存质量，促进人口健康发展。
附图说明
图1纯化的rSj-Cys电泳图(1泳道：marker；2泳道：rSj-Cys)；
图2各组小鼠体重及肾指数的变化(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)；
图3各组小鼠脂质代谢和肾功能水平(**P<0.01,***P<0.001)；
图4各组小鼠肾脏氧化应激水平及尿蛋白的变化(***P<0.001)；
图5各组小鼠血流动力学的变化(**P<0.01,***P<0.001)；
图6各组小鼠主动脉及肾脏结构变化(***P<0.001)；
图7各组小鼠促炎因子及免疫调节因子变化(**P<0.01,***P<0.001)；
图8各组小鼠TLR2和Myd88的表达变化(***P<0.001)。
具体实施方式
rSj-Cys的制备和纯化：
(1)rSj-Cys的原核表达
使用以下引物(正向：5'-CAGAAT TCATGC CTT TAT GTT GTG GTG GT G-3'；反向：5'-GCC TCGAGT TAGAAATAATAGAAATGTAAC AGC-3')从日本血吸虫成虫的总cDNA中，扩增rSj-Cys中DNA全长。20μlE.coli BL21目的菌种加入10ml LB培养基及卡那霉素，37℃摇菌过夜。取过夜培养的菌液8ml加入400ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌培养3小时，监测菌液OD600值达到0.6-0.8之间，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续摇菌，诱导表达5小时后，收集菌液离心，弃上清收集沉淀，用非变性裂解液充分重悬沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)。超声充分破碎细菌，细菌破碎液离心，收集上清，取10μl SDS-PAGE检测，其余置于-80℃。
(2)His-标签的rSj-Cys蛋白纯化
蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时。离心后用0.4μm微孔滤膜过滤。将过滤后混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，收集流出液体。用Washbuffer洗涤层析柱，用Elutionbuffer洗柱，收集的洗涤液和洗脱液，根据测定A280，留取有目的蛋白的EP管。收集的蛋白保存于-20℃(图1)。
(3)rSj-Cys进行12％SDS-PAGE电泳
用ToxOutTM高效去内毒素试剂盒去除纯化rSj-Cys中的内毒素，再用内毒素检测试剂盒检测蛋白中内毒素浓度，确保蛋白中内毒素含量小于0.06EU/ml。取去内毒素纯化后的rSj-Cys进行SDS-PAGE电泳。电泳显示纯化rSj-Cys大小约为11kDa，与推测基因产物大小(11.3kDa)相吻合，rSj-Cys的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1.rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠周体重变化及肾指数的影响
(1)实验材料：
动物：雄性apoE-/-小鼠(C57BL/6J背景，7-8周龄，SPF级，体重约为22g)购于蚌埠医学院实验动物中心。小鼠饲养于普通动物房，自由进食饮水，光照控制规律。动物实验操作过程获得伦理委员会认可并且符合动物伦理学标准(LAEC-2014-039)。
饲料：高脂饲料(HFD：D12108C：20％脂肪，1.25％胆固醇，南京协同生物技术有限公司)；正常饲料(NCD，南京协同生物技术有限公司)。
(2)实验方法：
实验共分为4组，每组6只小鼠，分别为：apoE-/-+NCD组：喂养正常饲料NCD，注射PBS；apoE-/-+NCD+rSj-Cys组：喂养正常饲料NCD，注射rSj-Cys；apoE-/-+HFD组：喂养高脂饲料HFD，注射PBS；apoE-/-+HFD+rSj-Cys组：喂养高脂饲料HFD，注射rSj-Cys。
实验周期共12周，老鼠在喂养饲料的同时，进行蛋白rSj-Cys注射干预。首周4组小鼠均进行4次腹腔注射，接下来的11周每周进行1次腹腔注射。蛋白rSj-Cys注射量为每次每只小鼠20μg，同体积注射PBS。
实验过程中，每周测量小鼠的体重变化情况，12周后，对所有小鼠实施安乐死，收集血清、心脏组织、主动脉和肾脏，称量肾脏并计算肾指数(肾脏重量/体重)。
(3)实验结果：
结果如图1所示，随着时间的增加，喂食HFD的apoE-/-小鼠体重增加，最多可增加至35g，rSj-Cys干预后小鼠体重显着降低，并且这种差异在第4周开始出现，周数越长，差异变得更加明显(图2A)。12周后，处死小鼠并记录小鼠的肾脏重量。在这两组之间，小鼠的肾脏重量/体重亦存在统计学差异。apoE-/-+HFD+rSj-Cys组的肾脏重量/体重显着低于apoE-/-+HFD组(图2B)。
实施例2.rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠脂质代谢和肾功能的影响
(1)实验材料：
样本：实施例1采集的小鼠血清。
材料：全自动生化分析仪(Beckman Coulter公司)。
(2)实验方法：
将实施例1采集的小鼠血清，于全自动生化分析仪上检测小鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)、高密度脂蛋白(HDL-c)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。
(3)实验结果：
结果表明，与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD组的TC、TG、LDL-c、Cr和BUN水平明显升高，HDL-c水平明显下降；rSj-Cys干预后，与apoE-/-+HFD组相比，TC、TG、LDL-c、Cr和BUN水平明显降低，HDL-c水平显着增加。apoE-/-+NCD组和apoE-/-+NCD+rSj-Cys组的脂质水平及肾功能指标无显着差异。rSj-Cys可以降低动脉粥样硬化小鼠血清脂质水平及延缓肾功能损害(图3A)。
表1 rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠脂质代谢和肾功能的影响
Figure BDA0003142262580000051
实施例3.rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠氧化应激及尿蛋白的影响
(1)实验材料：
样本：实施例1采集的小鼠肾脏。
材料：丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)检测试剂盒购于上海碧云天公司，尿蛋白(urine protein)检测试剂盒购于南京建成有限公司。
(2)实验方法：
将实施例1采集的肾脏组织用PBS冲洗，使用匀浆机对肾脏组织进行匀浆，匀浆液4℃，12000g离心15分钟，收取上清液，用于MDA，SOD和总蛋白定量。酶标仪于530nm至540nm处测量MDA，在560nm处测量SOD。
在实验的第12周的最后一天，使用代谢笼24h收集小鼠尿液，并在4℃以4000rpm离心15分钟以获得上清液。考马斯亮蓝(CBB)分析试剂盒用于尿蛋白水平的检测。
(3)实验结果：
MDA反映了脂质的过氧化程度，而SOD具有抗氧化作用。结果表明，与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD组肾脏组织中MDA水平明显升高，SOD水平显着降低；rSj-Cys治疗后，与apoE-/-+HFD组相比，肾组织中MDA水平明显降低，SOD水平显着增加。apoE-/-+NCD组和apoE-/-+NCD+rSj-Cys组的MDA及SOD水平无显着差异。rSj-Cys可以降低动脉粥样硬化小鼠肾脏中的MDA水平并增加SOD水平，使MDA和SOD的水平接近apoE-/-+NCD组(正常组)，从而产生抗氧化作用保护动脉粥样硬化性肾脏损害(图4A)。
尿蛋白定量结果显示，与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD组尿蛋白水平显着增加，rSj-Cys处理后，与apoE-/-+HFD组相比，尿蛋白水平明显下降(图4B)。
表2 rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠氧化应激及尿蛋白的影响
Figure BDA0003142262580000061
实施例4.rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠升主动脉血流水平的影响
(1)实验材料：
样本：各组apoE-/-小鼠。
材料：瑞沃德小动物吸入麻醉机，小动物超声成像系统(加拿大VisualSonics)，异氟烷。
(2)实验方法：
实验进行至第12周，在安乐死小鼠之前，进行升主动脉血流水平的检测，鼻腔吸入异氟烷以麻醉小鼠，剔除胸腹部的毛发并涂抹超声耦合剂。通过高分辨率超声成像系统进行血流动力学评估。通过彩色多普勒测量峰值速度(AVPeakVel)，升主动脉的平均压差(Mean Grad)。
(3)实验结果：
如图5A，B所示，与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD小鼠升主动脉的峰值速度及平均压差显着增加。rSj-Cys治疗后显着逆转了由HFD引起的血液动力学紊乱。apoE-/-+NCD组与apoE-/-+NCD+rSj-Cys组之间无显着性差异。
表3 rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠升主动脉血流水平的影响
Figure BDA0003142262580000062
实施例5.rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠病理结构的影响
(1)实验材料：
样本：实施例1采集的小鼠肾脏、心脏和主动脉。
材料：油红O染料，苏木精&伊红染料(HE)购于武汉塞维尔生物技术有限公司，显微镜(日本Nikon)。
(2)实验方法：
将实施例1采集的肾脏组织用预冷的PBS洗涤。肾脏用4％多聚甲醛固定，组织切片后用HE、油红O染色溶液进行染色，显微镜下读片。
将实施例1采集的心脏组织和整条主动脉。尽可能去除血管周围脂肪组织。垂直打开主动脉并将其浸入油红O染色溶液中。解剖小鼠心脏以获得主动脉窦，冰冻切片后进行油红O染色。显微镜拍照后对主动脉斑块的面积进行定量。
(3)实验结果：
通过测量整条主动脉上动脉粥样硬化斑块的发展情况，并量化了斑块面积。结果显示，在apoE-/-+NCD组与apoE-/-+NCD+rSj-Cys组中，没有明显的动脉粥样硬化病变。与apoE-/-+HFD组相比，rSj-Cys显着减少了主动脉斑块病变面积(图6A，C)。此外，通过进一步量化主动脉窦斑块的程度，结果表明：apoE-/-+HFD组脂质染色区域清晰可见，用rSj-Cys处理后，与apoE-/-+HFD组相比较，主动脉窦斑块面积显着减少(图6B，C)。
通过肾脏组织油红O染色，结果表明：apoE-/-+HFD组肾小球中有明显的脂质沉积，rSj-Cys处理后，与apoE-/-+HFD组相比，肾小球中的脂质沉积明显减少。在apoE-/-+NCD组与apoE-/-+NCD+rSj-Cys组中没有发现明显的肾脏脂质沉积(图6D)。HE染色结果表明，在apoE-/-+HFD组中，肾皮质与髓质之间的边界清晰，肾小球体积增大并充满囊腔，肾小球和肾小囊粘连，球囊间隙变窄，肾间质可见炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀，肾小管腔不规则。rSj-Cys治疗后，肾脏损害明显改善(图6E)。
表4 rSj-Cys对动脉粥样硬化小鼠病理结构的影响
Figure BDA0003142262580000071
实施例6.rSj-Cys抑制小鼠促炎细胞因子水平并上调免疫调节细胞因子水平
(1)实验材料：
样本：实施例1采集的小鼠血清和肾脏。
材料：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒购于上海达科为公司；诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)ELISA试剂盒购于武汉Elabscience生物技术公司；转化生长因子-β(TGF-β)ELISA试剂盒购于武汉ABclonal生物技术公司。SYBR Green Super Mix Kit(日本Takara)；罗氏
Figure BDA0003142262580000072
96real-time PCR system(美国)。
(2)实验方法：
小鼠眼球取血后，4℃，5000rpm离心15min，收集小鼠血清，保存于-80℃，用于后续ELISA检测。
取出的小鼠肾脏用预冷PBS冲洗，称取适量组织，加入Trizol裂解液，以60Hz，60s的频率在匀浆机中研磨，按照步骤提取肾脏组织总RNA。然后使用逆转录试剂盒从2μg总RNA中合成cDNA。使用SYBR Green Super Mix试剂盒，以2μl cDNA作为模板，总体积为20μl上样，GAPDH为内参，于
Figure BDA0003142262580000081
上分析。通过2-△△Cq，检测肾组织中上述细胞因子的相对mRNA表达水平。
(3)实验结果：
为了探讨动脉粥样硬化引起肾脏损害的免疫机制，检测了小鼠体内促炎因子(TNF-α，IL-6和iNOS)和免疫调节因子(IL-10，TGF-β和Arg-1)的水平，并测量其在肾脏中的mRNA表达水平。结果表明，与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD组血清中TNF-α、IL-6和iNOS水平明显升高，经过rSj-Cys处理后，与apoE-/-+HFD组相比，促炎因子的表达明显降低，IL-10、TGF-β和Arg-1明显升高。然而，在apoE-/-+NCD组与apoE-/-+NCD+rSj-Cys组之间，上述因子之间没有显着性差异(图7A)。肾脏组织中TNF-α、IL-6、iNOS和免疫调节因子IL-10、TGF-β、Arg-1表达水平与血清中的表达水平一致。与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD组的促炎因子显着增加。与apoE-/-+HFD组相比，rSj-Cys的治疗能够抑制促炎因子的表达，并增加IL-10、TGF-β和Arg-1的表达(图7B)。
表5 rSj-Cys抑制小鼠促炎细胞因子水平并上调免疫调节细胞因子水平
Figure BDA0003142262580000082
Figure BDA0003142262580000091
实施例7.rSj-Cys抑制炎性信号TLR2/Myd88表达水平
(1)实验材料：
样本：实施例1采集的小鼠肾脏。
材料：兔抗TLR2抗体(Abcam公司)，兔抗Myd88抗体(Affinity公司)，兔抗β-actin抗体(CST公司)。
(2)实验方法：
从肾脏组织中提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。通过12％SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白质，然后将其转移到0.45μm PVDF膜上。然后将膜在5％脱脂牛奶中于室温孵育2h，一抗孵育在4℃过夜。洗膜后孵育二抗。通过Image Lab System对条带进行分析。
(3)实验结果：
Toll样受体(TLR)是表达在各种免疫细胞中的模式识别受体。髓样分化因子-88(Myd88)是TLR的衔接蛋白，起着连接下游炎症信号的桥梁的作用。为了研究rSj-Cys是否通过抑制TLR2和Myd88的表达来保护动脉粥样硬化性肾损伤，检测了肾脏组织中TLR2和Myd88蛋白的表达水平(图8A)。结果表明，与apoE-/-+NCD组相比，apoE-/-+HFD组肾脏中TLR2和Myd88的表达明显升高，经rSj-Cys治疗后，与apoE-/-+HFD组相比，其表达水平明显受到抑制(图8B)。
表6 rSj-Cys抑制炎性信号TLR2/Myd88表达水平
Figure BDA0003142262580000092
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 蚌埠医学院
<120> 日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动脉粥样硬化肾损害方面的应用
<130> BAA210738A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Pro Leu Cys Cys Gly Gly Val Gly Ala Pro Arg Glu Pro Ser Val
1 5 10 15
Glu Glu Lys Gln Lys Leu Lys Thr Leu Leu Glu Asn Asn Leu Glu Ala
20 25 30
His Ile Gly Arg Lys Pro Pro Val Cys Asp Ile Val Gln Val Ser Ser
35 40 45
Gln Val Val Ala Gly Thr Asn Tyr Phe Val Lys Val His Val Gly Asp
50 55 60
Asp Glu Tyr Val His Ala Arg Ile Phe Glu Pro Leu Pro Cys His Gly
65 70 75 80
Lys Glu Leu Gln Leu His Ser Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Asn Asp
85 90 95
Ala Leu Glu Tyr Phe
100

Claims (10)

1.日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Cystatin的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化包括如下至少一种功能：
(1)降低血清脂质水平及延缓肾功能损害；
(2)降低肾脏中的MDA水平并增加SOD水平；
(3)减少主动脉斑块病变面积；
(4)抑制促炎细胞因子TNF-α，IL-6和iNOS水平，增加免疫调节因子IL-10、TGF-β和Arg-1的表达。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Cystatin单独作为药物的有效成分。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Cystatin的有效剂量为0.05～0.15mg/kg。
6.根据权利要求1～5任一所述的应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的药物载体和/或药用辅料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药用辅料包含填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素；所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠；所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚乙二醇；所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
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