CN102827942A - Npc1基因突变的检测方法和试剂盒 - Google Patents

Npc1基因突变的检测方法和试剂盒 Download PDF

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CN102827942A CN2012103476237A CN201210347623A CN102827942A CN 102827942 A CN102827942 A CN 102827942A CN 2012103476237 A CN2012103476237 A CN 2012103476237A CN 201210347623 A CN201210347623 A CN 201210347623A CN 102827942 A CN102827942 A CN 102827942A
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annealing temperature
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宁光
崔斌
洪洁
曹旻
石娟
缪琳
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Abstract

本发明涉及NPC1基因突变的检测方法和试剂盒。首次揭示一类特别适合于扩增NPC1基因的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。

Description

NPC1基因突变的检测方法和试剂盒
技术领域
本发明属于基因技术领域；更具体地，本发明涉及NPC1基因突变的检测方法和试剂盒。
背景技术
胆固醇是哺乳动物细胞内的一种至关重要的脂质。它具有调节胞膜活动的独特理化性质，并且是甾类激素、羟固醇和维生素D的前体。胆固醇的失调会引发多种病变。
在正常细胞中，低密度脂蛋白经受体介导内吞到达早期内体。随着胞内体的pH值下降，逐渐获得各种酸性水解酶，形成晚期内体。在晚期内体中，低密度脂蛋白颗粒解体，胆固醇酯在酸性水解酶的作用下水解，释放出游离的胆固醇。这些胆固醇大部分被运送到质膜，还有一部分到达内质网和其它位点。C型1类尼曼-匹克蛋白(NPC1)是一个跨膜脂质泵，它能监测细胞内胆固醇水平的变化，通过改变小泡转运方式或直接参与脂质跨膜转运来调节细胞脂质的平衡。它能促进脂质(特别是胆固醇)从晚期内体/溶酶体转运到高尔基复合体、内质网和细胞膜(Vance,J.E.,Lipid imbalance in the neurological disorder,Niemann-Pick C disease.FEBS Lett,2006.580(23):p.5518-24)。NPC1蛋白几乎在每一种组织中都有表达(Dieschy,J.M.and S.D.Turley,Control of cholesterolturnover in the mouse.J Biol Chem,2002.277(6):p.3801-4)。
NPC1蛋白是细胞晚期内体中含有的一种跨膜糖蛋白，由1278个氨基酸组成，分子量为142kDa，包含13个跨膜区域。其中在第3个和第7个跨膜区域之间含有固醇感受域(SSD)，类似于内质网中的固醇感受蛋白，它能识别蛋白质环境中的游离固醇并参与介导溶酶体中胆固醇的流出。NPC1还包含8个保守的半胱氨酸和1个亮氨酸拉链结构，后者介导蛋白质二聚化，而前者类似于一个环指模体，参与蛋白质-蛋白质或蛋白质-脂质之间的相互作用。
已有研究证实，NPC1基因的突变与C型尼曼-匹克病(NPC)的发生密切相关。NPC是一种罕见的常染色体隐性遗传的神经脂质沉积症。发病率大约为1:150,000。患病个体通常在成年之前去世，并且至今尚无有效的治疗方法。临床表现为肝脾肿大以及神经退行性疾病，包括眼肌麻痹、运动失调、肌张力障碍和痴呆等。生物学上表现为因细胞内胆固醇转运障碍而导致的未酯化胆固醇在溶酶体和高尔基体内的堆积。目前，NPC被认为是由C型1类尼曼-匹克基因(NPC1)或C型2类尼曼-匹克基因(NPC2)的突变所导致的，其中95%的患者是由NPC1基因突变所致，目前已经被发现的突变达到200多个(Chang,T.Y.,etal.,Niemann-Pick type C disease and intracellular cholesterol trafficking.J BiolChem,2005.280(22):p.20917-20；Tamura,H.,et al.,Niemann-Pick type Cdisease:novel NPC1 mutations and characterization of the concomitant acidsphingomyelinase deficiency.Mol Genet Metab,2006.87(2):p.113-21)。
另外有报道指出，NPC 1基因的突变可能与肥胖的发生有关。有研究组对1380个欧洲的肥胖病人和1416个年龄匹配的正常体重的对照人群进行全基因组关联分析(GWAS)，并且在另外的14186个包含肥胖病人和正常对照的人群中对分析结果进行验证，发现一个位于NPC1基因上的单核苷酸多态性位点(SNP)与肥胖表型呈现显著的相关性(rs1805081，P=2.9×10-7)。但这个SNP位点rs1805081(H215R)对NPC1蛋白的功能有何影响尚不清楚(Meyre,D.,et al.,Genome-wide association study for early-onset and morbid adult obesity identifiesthree new risk loci in European populations.Nat Genet,2009.41(2):p.157-9)。以小鼠作为模型进行研究时，科学家发现与作为对照的正常(Npc1+/+)小鼠相比，NPC1纯合突变(Npc1-/-)的小鼠除了具有神经功能缺损和细胞胆固醇转运缺陷等症状之外，还表现为迟发性的减重和食欲减退(Xie,C.,et al.,Cholesterolbalance and metabolism in mice with loss of function of Niemann-Pick C protein.Am J Physiol,1999.276(2Pt 1):p.E336-44)。而杂合突变(Npc1+/-)的小鼠在高脂饮食的诱导下表现出明显的体重增加(Jelinek,D.,et al.,Decreased Npc1 genedosage in mice is associated with weight gain.Obesity(Silver Spring),2010.18(7):p.1457-9)。
因此，NPC1基因的突变可视为危险因素，对其突变的检测对于生物学研究和临床诊断都具有重要的意义。
目前，对于基因变异的检测较为常用的技术是聚合酶链式反应(PCR)。然而，NPC1基因的扩增模板通常为待检测个体的血液基因组DNA，复杂度较高，难以得到理想的目的基因片段用于后续的测序。因此，对于NPC1基因突变的检测还有待于进一步优化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NPC1基因突变的检测方法和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种检测样品中是否存在NPC1基因变异的试剂，所述的试剂是引物对，选自下组：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；和/或
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
在另一优选例中，引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于扩增NPC1外显子1序列；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增NPC1外显子2序列；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增NPC1外显子3序列；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增NPC1外显子4序列；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10用于扩增NPC1外显子5序列；
SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12用于扩增NPC1外显子6序列；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14用于扩增NPC1外显子7序列；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16用于扩增NPC1外显子8序列；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18用于扩增NPC1外显子9序列；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20用于扩增NPC1外显子10序列；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22用于扩增NPC1外显子11序列；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24用于扩增NPC1外显子12序列；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26用于扩增NPC1外显子13序列；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28用于扩增NPC1外显子14序列；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30用于扩增NPC1外显子15和16序列；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32用于扩增NPC1外显子17序列；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34用于扩增NPC1外显子18和19序列；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36用于扩增NPC1外显子20序列；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38用于扩增NPC1外显子21序列；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40用于扩增NPC1外显子22序列；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42用于扩增NPC1外显子23序列；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44用于扩增NPC1外显子24序列；和/或
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46用于扩增NPC1外显子25序列。
在本发明的另一方面，提供一种检测样品中是否存在NPC1基因变异的试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的一种或多种引物对；较佳的，所述的试剂盒中含有SEQ ID NO:1-46的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：
PCR扩增试剂；
核酸提取试剂；
核酸序列分析软件；和/或
使用说明书。
在本发明的另一方面，提供一种获得NPC1基因扩增产物的方法，所述的方法包括：
以核酸样品为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，PCR热循环步骤如下：
(a)94±1℃进行30±5秒；
(b)59±4℃退火45±5秒；
(c)72±1℃进行45±5秒；
重复步骤(a)-(c)25±5次。
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，
若以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44为引物，退火温度是60±1℃；或
若以SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46为引物，退火温度是60±1℃。
在另一优选例中，在进行PCR热循环前，还包括模板变性步骤：95±1℃进行3±2分钟；或
在进行PCR热循环后，还包括延伸步骤：72±1℃进行10±2分钟。
在另一优选例中，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10%。
在本发明的另一方面，提供一种确定待测核酸样品中是否存在NPC1基因变异的方法，所述的方法包括：
(1)采用所述的方法从待测核酸样品中扩增NPC1基因片段；
(2)分析(1)扩增产物中NPC1基因片段的序列，并与野生型NPC1基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明待测核酸样品中存在NPC1基因变异。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1和2显示了采用本发明优化的引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1-23依次表示DNA Marker，以及利用表1中NPC1-1(F和R)、NPC1-2(F和R)、NPC1-3(F和R)、NPC1-4(F和R)、NPC1-5(F和R)、NPC1-6(F和R)、NPC1-7(F和R)、NPC1-8(F和R)、NPC1-9(F和R)、NPC1-10(F和R)、NPC1-11(F和R)、NPC1-12(F和R)、NPC1-13(F和R)、NPC1-14(F和R)、NPC1-15/16(F和R)、NPC1-17(F和R)、NPC1-18/19(F和R)、NPC1-20(F和R)、NPC1-21(F和R)、NPC1-22(F和R)、NPC1-23(F和R)、NPC1-24(F和R)、NPC1-25(F和R)相应引物，对C型尼曼-匹克病患者的血液基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。
图3和4显示了采用其它引物(表2)进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1-23依次表示DNA Marker，以及利用表2中NPC1_1F_a和NPC1_1R_a，NPC1_2F_a和NPC1_2R_a，NPC1_3F_a和NPC1_3R_a，NPC1_4F_a和NPC1_4R_a，NPC1_5F_a和NPC1_5R_a，NPC1_6F_a和NPC1_6R_a，NPC1_7F_a和NPC1_7R_a，NPC1_8F_a和NPC1_8R_a，NPC1_9F_a和NPC1_9R_a，NPC1_10F_a和NPC1_10R_a，NPC1_11F_a和NPC1_11R_a，NPC1_12F_a和NPC1_12R_a，NPC1_13F_a和NPC1_13R_a，NPC1_14F_a和NPC1_14R_a，NPC1_15/16F_a和NPC1_15/16R_a，NPC1_17F_a和NPC1_17R_a，NPC1_18/19F_a和NPC1_18/19R_a，NPC1_20F_a和NPC1_20R_a，NPC1_21F_a和NPC1_21R_a，NPC1_22F_a和NPC1_22R_a，NPC1_23F_a和NPC1_23R_a，NPC1_24F_a和NPC1_24R_a，NPC1_25F_a和NPC1_25R_a引物，对C型尼曼-匹克病患者的血液基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，找到了一类特别适合于扩增NPC1基因的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。
NPC1基因
C型1类尼曼-匹克蛋白(NPC1)是参与胞内胆固醇转运的重要跨膜蛋白。NPC1基因定位于18q11-q12，基因组DNA包含约55kb，共25个外显子，编码1278个氨基酸。
NPC1蛋白广泛表达于脑神经细胞，其功能异常引起细胞内胆固醇转运障碍，从而导致一系列病理变化(Vanier,M.T.,et al.,Genetic heterogeneity inNiemann-Pick C disease:a study using somatic cell hybridization and linkageanalysis.Am J Hum Genet,1996.58(1):p.118-25)。并且研究发现，NPC1基因在患病人群中变异率较高，而在正常人群中变异率很低。因此，针对NPC1基因各外显子上碱基的突变检测对于疾病的诊断是重要的。
NPC1基因变异的检测试剂或试剂盒
基于NPC1基因与C型尼曼-匹克病和肥胖的密切相关性，可以通过分析NPC1基因的变异情况，对C型尼曼-匹克病和肥胖的患病人群进行易感性分析，还可以对相关人群的患病风险进行早期评估。
可以采用多种技术来检测NPC1基因的变异位点，目前较为方便的是用NPC1基因特异的引物进行PCR扩增，然后对扩增产物进行序列测定，从而判断是否发生变异。该检测技术既可以针对cDNA，也可以针对基因组DNA。
本发明人在研究中发现，检测NPC1基因突变时，利用一般的引物进行PCR扩增时特异性较差，扩增效率不高。因此，需要设计和筛选特异性好的引物。经过大量的实验和比较，本发明人找到了对应于NPC1基因25个外显子的23对引物。经验证，所述引物获得的扩增产物既包含了NPC1基因各外显子上完整的序列，且特异性非常好，PCR扩增成功率接近100%，特别适用于复杂体系的PCR扩增。各引物的核苷酸序列及其较佳的退火温度如表1所示。
表1、引物核苷酸序列
Figure BDA00002154271300081
Figure BDA00002154271300091
Figure BDA00002154271300101
获得NPC1基因扩增产物的方法
本发明人提供了一种优化的从核酸样品中获得NPC1基因扩增产物的方法，所述的方法包括：以核酸样品为模板，利用选自表1的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
利用所述的引物，采用常规的PCR扩增方法即可获得较为理想的扩增结果。一种可选的PCR扩增方法中，PCR热循环步骤如下：(a)94±1℃进行30±5秒；(b)59±4℃退火45±5秒；(c)72±1℃进行45±5秒；重复步骤(a)-(c)25±5次。
进行PCR热循环前的模板变性步骤可采用本领域常规的方法。较佳的方法为：94±1℃进行5±1分钟；更佳的是94±0.5℃进行5分钟。
进行PCR热循环后的序列延伸步骤可采用本领域常规的方法。较佳的方法为：72±1℃进行10±2分钟；较佳的是72℃进行10±1分钟。
除了采用本发明的引物，本发明对PCR扩增体系中其它各成分及其终浓度没有特别的限制。本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR扩增体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。
作为本发明的优选方式，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜(DMSO)，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10%；较佳的是3-8%；更佳的是4-6%。DMSO的应用可一定程度地降低反应体系中引物二聚体的形成或错配的形成。
采用本发明获得NPC1基因扩增产物的方法，扩增效率和特异性均非常理想，且特别适合于复杂体系的PCR扩增，例如以血液基因组DNA作为PCR模板的扩增。
本发明还提供了一种确定待测核酸样品中是否存在NPC1基因变异的方法。所述的方法包括：采用前述的方法从待测核酸样品中扩增NPC1基因片段，获得扩增产物；以及分析扩增产物中NPC1基因片段的序列，并与野生型NPC1基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明待测核酸样品中存在NPC1基因变异。
通过判断NPC1基因变异的情况，可进一步得知受试者的患病风险，从而达到早期监测早期防治的目的。NPC1基因各外显子上的突变位点和突变碱基种类与疾病的相关性可参考现有文献。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、获取待测者血液基因组DNA
采集患者的外周抗凝血5ml，使用U-gene Blood DNA Kit进行血液基因组DNA的抽提，具体步骤如下：
(1)在l.5ml离心管中加入250μl全血样品。
(2)加入250μl的XY缓冲液(U-gene)，振荡混合均匀。
(3)再加入20μl的蛋白酶K(10mg/ml)，剧烈振荡混合均匀。
(4)56℃温浴过夜。
(5)加入260μl的无水乙醇，振荡混合，12000rpm离心1分钟，使溶液中的固体沉淀物甩至管底。
(6)将DNA分离柱置于一个2ml的收集管中，将上步得到溶液倒入柱子中，8000rpm离心1min，弃去该收集管和流出液。
(7)分离柱放于另一新的收集管，加入700μl的乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液(U-gene)洗涤，8000rmp离心1min，保留该收集管，弃去流出液。
(8)重复(7)一次。
(9)使用同上的收集管，12000rmp离心2min以甩干柱子内残留的乙醇。
(10)将分离柱置于新的1.5ml离心管中，在空气中放置5min左右以待乙醇气味消退，同时预热DNA洗脱液(U-gene)以备用。
(11)将100μl的DNA洗脱液加入柱子中，并在室温中放置5min，12000rpm离心3min。
(12)重复(11)一次。
(13)弃去分离柱，获取DNA洗脱液，其中含待测者的基因组DNA，作为PCR模板。
实施例2、PCR实验准备
缓冲液必须全部融化，振荡均匀；dNTP融化后需放入冰块中；Taq酶(申能博彩Taq DNA聚合酶)需要放入冰块中，避免手指接触和长时间暴露于空气中；模板(待测者的基因组DNA)完全融化后，放入冰块中。
实施例3、PCR反应体系
Figure BDA00002154271300121
实施例4、PCR操作过程
(1)制备预混液：一般先加入ddH2O，然后加入引物、缓冲液、DMSO(加入DMSO后振荡混匀，终浓度5%(v/v)，加入dNTP，最后加入Taq DNA聚合酶，立即振荡混和均匀；
(2)把模板加入到PCR薄壁管的底部，最后一管加入ddH2O作为阴性对照；
(3)将PCR预混液分装到每一个PCR反应管中；
(4)全部溶液加完后，离心以保证管壁上没有残留PCR反应液。
PCR反应的一般程序：
94℃5min，变性；
94℃30sec，表1相应退火温度下45sec，72℃45min，进行25个循环。
72℃10min，延伸；
22℃保存。
实施例5、PCR扩增条件的比较
以1例C型尼曼-匹克病患者的血液基因组DNA为模板，采用表1中所示的引物扩增NPC1基因的外显子，PCR扩增方法和条件如前所述，将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1和2。由图可见，各PCR反应产物呈单一的目的基因片段大小的条带，且条带明亮，清晰，无杂带。
同样以前述的患者血液基因组DNA为模板，采用下面表2所列的引物(引物根据NPC1基因序列设计但与表1的引物序列不同)进行PCR扩增，扩增方法和条件如前所述。
表2、引物核苷酸序列
Figure BDA00002154271300131
Figure BDA00002154271300141
同样对根据表2引物进行PCR扩增后获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3和4。由图可见，其中一些引物扩增得到了非特异性的产物(即产生多于一条的电泳条带)；一些目的基因片段的条带很不明显甚至没有，可能是由于引物扩增效率不高，使得扩增产物少，扩增效率低下，有些则有非特异性的条带。
因此，本发明中经过大量的试验和比较或获得的表1引物特异性非常好，PCR扩增成功率约100%，特别适用于复杂体系的PCR扩增。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA00002154271900011
Figure IDA00002154271900021
Figure IDA00002154271900031
Figure IDA00002154271900041
Figure IDA00002154271900051
Figure IDA00002154271900061
Figure IDA00002154271900071
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Figure IDA00002154271900091
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Figure IDA00002154271900121
Figure IDA00002154271900131

Claims (10)

1.一种检测样品中是否存在NPC1基因变异的试剂，其特征在于，所述的试剂是引物对，选自下组：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；和/或
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于扩增NPC1外显子1序列；
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增NPC1外显子2序列；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增NPC1外显子3序列；
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增NPC1外显子4序列；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10用于扩增NPC1外显子5序列；
SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12用于扩增NPC1外显子6序列；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14用于扩增NPC1外显子7序列；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16用于扩增NPC1外显子8序列；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18用于扩增NPC1外显子9序列；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20用于扩增NPC1外显子10序列；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22用于扩增NPC1外显子11序列；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24用于扩增NPC1外显子12序列；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26用于扩增NPC1外显子13序列；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28用于扩增NPC1外显子14序列；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30用于扩增NPC1外显子15和16序列；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32用于扩增NPC1外显子17序列；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34用于扩增NPC1外显子18和19序列；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36用于扩增NPC1外显子20序列；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38用于扩增NPC1外显子21序列；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40用于扩增NPC1外显子22序列；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42用于扩增NPC1外显子23序列；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44用于扩增NPC1外显子24序列；和/或
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46用于扩增NPC1外显子25序列。
3.一种检测样品中是否存在NPC1基因变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有选自权利要求1的一种或多种引物对；
较佳的，所述的试剂盒中含有SEQ ID NO:1-46的引物。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：
PCR扩增试剂；
核酸提取试剂；
核酸序列分析软件；和/或
使用说明书。
5.一种获得NPC1基因扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包括：
以核酸样品为模板，利用选自权利要求1的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，PCR热循环步骤如下：
(a)94±1℃进行30±5秒；
(b)59±4℃退火45±5秒；
(c)72±1℃进行45±5秒；
重复步骤(a)-(c)25±5次。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，
若以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，退火温度是58±1℃；
若以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42为引物，退火温度是60±1℃；
若以SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44为引物，退火温度是60±1℃；或
若以SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46为引物，退火温度是60±1℃。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
在进行PCR热循环前，还包括模板变性步骤：95±1℃进行3±2分钟；或
在进行PCR热循环后，还包括延伸步骤：72±1℃进行10±2分钟。
9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10%。
10.一种确定待测核酸样品中是否存在NPC1基因变异的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)采用权利要求5所述的方法从待测核酸样品中扩增NPC1基因片段；
(2)分析(1)扩增产物中NPC1基因片段的序列，并与野生型NPC1基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明测核酸样品中存在NPC1基因变异。
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KR20060093269A (ko) * 2005-02-21 2006-08-24 재단법인서울대학교산학협력재단 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 ｎｐｃ１유전자 및 그 용도
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