KR20060093269A

KR20060093269A - 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 ｎｐｃ１유전자 및 그 용도

Info

Publication number: KR20060093269A
Application number: KR1020060001479A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 양세란
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-02-21
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2006-08-24
Also published as: KR100875437B1

Abstract

본 발명은 NPC1 유전자가 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여한다는 새로운 기능규명에 근거한 것으로, 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자, 상기 NPC1 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경계 질환, 심근경색 등과 같은 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 유전자치료제 및 상기 NPC1 유전자를 함유하는 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경계 질환, 심근경색 등과 같은 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

NPC1 유전자, 니이만 픽 병, 세포치료제

Description

신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 ＮＰＣ１ 유전자 및 그 용도{NPC1 Gene Concerned in Self-renewal and Differentiation of Neural Stem Cells and Use Thereof}

도 1은 NPC1 유전자로 형질전환된 마우스에서 RT-PCR을 이용하여 태아의 꼬리 DNA 유전자형을 분석한 것이다 (+/+: 와일드 타입; -/-: 호모타입; +/-: 헤테로타입).

도 2a는 NPC1 ^+/+, NPC1 ^+/-및 NPC1 ^-/-에서 형성된 뉴로스피어를 나타낸 것이다.

도 2b 및 2c는 각각 뉴로스피어의 수 및 크기를 나타낸 것이다.

도 3a는 NPC1 ^+/+, NPC1 ^+/-및 NPC1 ^-/-마우스에서 MAP kanase 경로 관련 단백질들의 발현수준을 비교한 것이다.

도 3b는 GFAP/b-actin의 발현을 나타낸 것이다.

도 3c는 전체 ERK1 및 ERK2에 대한 인산화 ERK1 (pERK1) 및 인산화 ERK2 (pERK2)의 비율을 나타낸 것이다,.

도 4a는 NPC1 ^-/-마우스 유래 신경줄기세포에 ERK1/2 특이 저해제인 PD98059(PD) 및 p38 특이 저해제인 SB202190(SB)를 처리한 경우의 뉴로스피어를 나 타낸 것이다.

도 4b 및 4c는 각각 뉴로스피어의 수 및 크기를 나타낸 것이다.

도 5a는 NPC1 ^+/+, NPC1 ^+/-및 NPC1 ^-/-에서 PD 및 SB 처치시 뉴로스피어에서 분화한 세포의 GFAP와 MAP 카이네이즈 기전과 관련 단백질들의 발현을 비교한 것이다.

도 5b는 p38과 인산화 p38(pp38)의 비를 나타낸 것이다.

도 6은 NPC1 ^+/+ 및 NPC1 ^-/- 마우스 태자의 뇌에서 줄기세포를 분리하여 뉴로스피어를 만들고, 이를 분화유도한 후 면역염색법을 이용하여 성상세포의 표지인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)의 발현을 비교한 것이다.

도 7은 신경줄기세포의 자체재생능(self-renewality) 및 분화 조절에서 MAP 카이네이즈에 의해 매개된 NPC1 유전자의 발현과 기능에 대한 개략도를 나타낸 것이다.

본 발명은 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자, 상기 NPC1 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 유전자치료제 및 상기 NPC1 유전자를 함유하는 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

지질대사 장애질환 중에서 지질 축적 질환은 특이한 지질대사에 필요한 효소의 결핍으로 야기되는데, 대사 이상의 정도는 완정한 정도에서 중간적 정도까지 다양하게 나타나며, 지질들이 조직 또는 장기에 축적되는 질환을 의미한다. 특히 치명적으로 간 또는 비장종대와 중추 신경계의 손상을 동반하는 경우가 많으며 소아형 고셔(Gaucher) 병, 니이만 픽 병이 대표적으로 여기에 속하며, 중추 신경계의 손상없이, 간 또는 비장종대만 있는 질환으로는 Gaucher 병 타입 1, 니이만 픽 병 타입 B(만성형) 등이 있다.

NPC(Niemann-Pick disease type C)는 유전형 열성유전 질병으로서 18번 염색체의 장완(18q11-12)에 위치하는 콜레스테롤 대사에 관여하는 유전자(NPC1) 결핍에 의해 발병하는 질환이다(Carstea, E.D. et al ., Science, 277:228, 1997). 또한 생태학적으로나 유전학적인 배경이 다른 질환으로 모든 인종에서 나타난다고 알려져 있으며, 특히 중추신경계와 간 등에서 많은 양의 콜레스테롤이 세포 내에 축적되어 혈액내에서 저콜레스테롤 혈증을 보이는 것이 특징이다. 일반적인 발병률은 신생아에서 100,000명 중 하나의 꼴로 집계되고 있으나 지질학적으로 유행성의 차이가 크기에 캐나다 노바 스코티아(Nova Scotia) 주의 경우 신생아의 1%가 NPC 발병률을 보였고 캐리어(carrier)의 비율은 10명 중 1명이 가지고 있는 것으로 조사되었다. 니이만 픽 병 타입 C는 NPC1 단백질의 결손에 의해 유발되며, 이것이 세포간 콜레스테롤 수송의 혼란을 일으키게 되는 것으로 알려져 있다(Genomics, 65(2):137, 2000).

NPC 질환에서 특징적인 액손(axon), 스피어로이드(spheroids)는 브레인 스템(brain stem)이나 소뇌의 백색질 같은 긴 마이얼린 액손(long myelinated axon)을 갖는 지역에서 집중되지만, NFTs(neurofibrillary tangles)와 같은 것은 알츠하이머 병에서 NFTs가 호발하는 부위(hippocampus, entorhinal cortex, thalamus and basal ganglia)에서 발견되었다. 또한 니이만 픽 병에서는 진행성 뉴런의 소실(특히 퍼킨제 세포)과 별아교세포종과 거품대식세포의 침윤이 특징적으로 나타난다. 이들 신경세포중 성상세포(astrocyte)는 뉴론의 기능을 도와주며 중추신경계의 항상성을 유지시켜주는 중요한 기능을 담당하고 있으나 니이만 픽 병에 걸렸을 경우에는 성상세포종이 발생하며 지방구가 축적되는 병리적 관찰소견을 나타내게 된다.

니이만 픽 병 타입 B의 경우 골수이식을 통해 몇몇의 환자에서 효과를 보았다는 보고가 있으며, 효소이식, 유전자 치료가 동물실험을 통해 성과를 거뒀다고 보고되어 있다. 타입 A의 경우, 환자의 뇌에 직접적으로 ASM의 수치를 올릴 수 있는 방법 등의 연구가 진행 중이며 타입 C의 경우에는 저콜레스테롤 식이를 권장하고 있다. 그러나 니이만 픽병에 대한 치료는 실험동물을 이용한 in vivo 단계에 머물고 있으며, 사람에 대한 적용은 아직 실험단계에 있다. 특히, 타입 C의 경우 특별한 치료법이 없이 식이요법만을 진행하고 있으며, 저콜레스테롤 식이와 콜레스테롤을 낮추는 약물로서 니이만 픽 병의 진행을 늦추거나 세포 내의 콜레스테롤 대사에 변화를 유도하여 치료하긴 어려운 실정이다.

퇴행성 신경계 질환은 중추신경의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서, 여 러 가지 증상을 유발한다 (Ross, C.A. & Poirier, M.A., Nat . Med ., Suppl: S10-7, 2004; Lindvall, O. et al., Nat . Med ., Suppl: S42-50, 2004). 증상의 특징은 질환의 발병이 서서히 시작되고, 일단 발병하였더라도, 사망할 때까지 수년 혹은 수십 년간 지속되며, 증상이 양측성, 대칭성이 있으며, 가족력에 많이 좌우되는 경향이 있다. 질환에 따라, 해부학적 혹은 생리학적으로 연관되어 있는 신경계를 선택적으로 침범한다. 대표적인 질병으로는 알츠하이머(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 픽병(Pick's disease), 니이만병(Niemann pick disease) 등이 있다.

한편, MAP 카이네이즈(mitogen-activated protine 카이네이즈)는 세포내 증식, 분화와 사멸의 과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 중추신경계에서도 배아의 발생과 기형형성, 분화 등에 핵심적인 역할을 담당하고 있다. 이러한 MAP 카이네이즈 family에는 다양한 단백질을 포함하고 있으며, EGF와 FGF와 같은 성장인자의 기전과 같이 티로신 경로와도 유사하다. 이중 p38 MAP 카이네이즈와 ERK1/2는 MAP 카이네이즈 기전에 주축을 이루며, 특히 p38 MAP 카이네이즈의 경우 스트레스 경로와도 관계하여 UV와 같은 스트레스인자에 반응하기도 한다. 그러나 이들의 역할은 세포와 환경에 따라 각각 다른 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

줄기세포(stem cells)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포 분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고 증식(proliferation)하는 특성이 있으며, 또한 분화자극이 가해지면 특정세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성을 가지고 있는 것이 특징이다. 그래서 줄기세포를 그 분화 유연성에 따라 배아발생과정을 토대로 분류한다. 배아발생초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서, 이 세포내괴로부터 확립한 배아간세포(embryonic stem cell)는 이론적으로는 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포로 볼 수 있다. 그 후 태아 발생과정이 진행되어 태아의 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cell)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정하게 되며(multipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.

약 10여년 전만 해도 중추신경계(Central Nervous System Cell)에는 다른 대부분의 조직과는 달리 줄기세포가 존재하지 않는다고 여겨졌으며, 이것이 뇌신경조직이 손상을 받았을 때 스스로 복구되지 않는 원인이라 여겨졌었다. 그러나 근자에 들어와서 성인의 뇌조직에도 줄기세포(뇌신경줄기세포)가 존재하며, 그 줄기세포로부터 신경세포의 형성과정이 증명되었다. 다중잠재성인 신경줄기세포는 분화 유도시 뇌신경조직을 구성하는 세포인 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 올리 고덴트로사이트(oligodentrocyte)로 분화된다.

신경줄기세포는 태아 발생 과정 중 태아 중추신경계의 각 세부조직 어디에나 존재하므로 원하는 태아 뇌신경조직을 잘라내어 그 신경줄기세포를 분리 배양할 수 있고, 성인의 경우에는 측면 뇌실의 SVZ나 해마로부터 성인 신경줄기세포를 분리하여 배양할 수 있으며, 이와 같은 신경줄기세포 배양을 이용한 연구는 신경줄기세포로부터 정상적인 뇌신경계 발생과정을 이해하는데 많은 정보를 제공할 수 있다.

신경줄기세포는 신경세포와 관련한 뉴런, 희돌기세포, 성상세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 동시에 자체재생능력(self-renewal)을 갖는다. 이러한 신경줄기세포는 in vitro 시험에서 뉴로스피어(neurosphere)라고 불리는 특징적 소견을 나타내는데, 이는 신경줄기세포의 표지인 네스틴(nestin)에 반응함으로써 형성되는 신경줄기세포 덩어리이다 (Gage, F.H., Science, 287:1433, 2000).

이에 본 발명자들은 NPC 질환이 신생아를 비롯한 초기에 발병하는 점에 착안하여, 초기 발생단계에서의 신경줄기세포에서 NPC1 유전자의 역할, 신경줄기세포의 분화 후 세포내 신호전달과정에 미치는 NPC1 유전자의 영향을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자와, 상기 NPC1 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세 포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 유전자치료제를 제공하는데 있다.

본 발명은 또 다른 목적은 상기 NPC1 유전자를 함유하는 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 NPC1 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 유전자치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 NPC1 유전자를 함유하는 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환은 퇴행성 신경계 질환 또는 심근경색인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 상기 퇴행성 신경계 질환은 알츠하이머(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 픽병(Pick's disease), 또는 니이만병(Niemann pick disease)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 NPC1 유전자는 사람의 18번 염색체의 장완(18q11-12)에 위치하는 콜레스테롤 대사에 관여하는 유전자로서 니이만 픽 병을 유발하는 유전자를 의미한다(Carstea, E.D. et al ., Science , 277:228, 1997; Loftus, S.K. et al ., Science , 277:232, 1997).

유전자 치료(gene therapy)는 세포 또는 환부 기관내로 유전정보를 도입함으로서 결함 또는 이상(돌연변이, 이상발현 등)을 교정하는 것으로서, 이 유전정보는 생체외에서 또는 상기 기관으로부터 추출된 세포에 도입될 수 있다. 그 변형된 세포는 체내로 재도입하거나, 직접 생체내에서 적절한 조직내로 도입할 수 있다. 상기 두 번째 경우에는 DNA 및 DEAE-덱스트란(Pagano et al ., J. Virol ., 1:891, 1967)의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체(Kaneda et al ., Science, 243:375, 1989), DNA 및 지질의 복합체(Felgner et al ., PNAS, 84:7413, 1987) 등이 연루된 다양한 트랜스팩션 기술들을 이용할 수 있으며, 또한 유전자 전달벡터로 다양한 바이러스를 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 NPC1 유전자를 적절한 전달벡터에 도입하여 유전자 전달체를 제작한 다음, 이를 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 환자의 세포 또는 환부 기관내로 도입함으로써 퇴행성 신경계 질환, 심근경색 등을 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환을 치료하는 것이 가능하다.

또한, NPC1 유전자를 가지는 정상 신경줄기세포를 대량으로 배양하여 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환에 걸린 환자에 도입할 경우, 퇴행성 신경계 질환, 심근경색 등을 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환을 치료 하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 NPC1 유전자가 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여한다는 새로운 기능을 규명한 것에 근거한다.

본 발명에서는 NPC1 유전자 결손 마우스 모델을 이용하여 NPC1 유전자의 새로운 기능을 규명하였다. 그 결과, NPC1 유전자 결실 마우스 유래 신경줄기세포에서 신경줄기세포의 덩어리인 뉴로스피어의 수와 크기가 크게 감소한 것으로 나타났으며, 이로부터 NPC1 유전자가 신경줄기세포의 재생에 관여한다는 것을 확인하였다. 또한, NPC1 ^-/- 유래 신경줄기세포는 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 대하여 NPC1 ^+/+와 전혀 다른 면역활성 패턴을 나타냈다. 즉, NPC1 ^+/+의 신경줄기세포로부터 분화된 성상세포(astrocyte)는 전형적인 polygonal morphology를 나타낸 반면, NPC1 ^-/-의 신경줄기세포로부터 분화된 성상세포(astrocyte)는 clumpy 및 둥근형상(rounded appearance)을 나타냈는 바, 이로부터 NPC1 유전자가 신경줄기세포의 분화에 관여한다는 것과 아울러, NPC1 유전자 결핍에 의해 NPC 질환이 유발된다는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 또한, NPC1 ^-/- 마우스의 태아의 뇌로부터 분리한 세포에 PD98059 또는 SB202190 등의 MAP 카이네이즈 억제제를 처치함으로서 신경줄기세포 의 자체재생능력에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, NPC1 유전자가 정상적으로 발현되는 경우에는 MAP 카이네이즈 패밀리 단백질의 활성이 억제됨을 확인하였고, NPC1 유전자가 발현되지 않는 경우에는 신경줄기세포의 분화시에 MAP 카이네이즈가 활성화되어 신경줄기세포가 성상세포로 분화가 되기는 하지만 신경줄기세포가 병적인 형태의 신경세포로의 분화를 유도한다는 것을 확인하였다. NPC1 유전자가 결핍된 경우, 신경줄기세포의 분화에 있어서 그 병적인 형태로 분화를 유도하는 것은 p38 MAP 카이네이즈 활성과 관련이 있다는 것도 확인하였다. 결국, p38 MAP 카이네이즈를 억제시킬 경우, 신경줄기세포의 자체재생능력을 활성화시킬 수 있고, 신경줄기세포에서 성상세포로의 분화시에 병적인 형태를 유발하는 것을 억제하는 것이 가능하므로, p38 MAP 카이네이즈 억제제는 NPC1 유전자 결핍-질환 치료에 유용하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: NPC1 유전자 결손 마우스의 뉴로스피어 ( neurosphere ) 생성능력

1-1. NPC1 유전자 결손 마우스의 생산 및 유전형 분석

Balb/c 종 마우스의 18번 염색체에서 NPC1 유전자를 헤테로(hetero) 형태로 결실시킨 후, 두 마리를 교배하여 NPC1 녹아웃 마우스를 제작하였다. 교배하여 임신한 마우스의 14일 이후의 태아에서, 바람직하게는 16일째 되는 태아의 뇌를 수거하여 각 태자의 꼬리를 잘라 primary DNA kit(GOMA, Japan)을 이용한 RT-PCR을 통해 유전형을 분석하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, NPC1 유전자에 대한 와일드(wild; +/+), 헤테로(hetero: +/-), 및 호모(homo: -/-) 타입 유전형을 확인하였다.

1-2. NPC1 유전자 결손 마우스 유래 신경줄기세포의 자체재생능력

상기에서 유전형을 분석한 각 태자의 뇌를 수거, 분리하여 새로운 디쉬에 옮겼다. 분리한 대뇌에 0.5% 트립신을 처리하여 20분간 세포를 배양한 후 배양액과 DNase를 첨가하여 피펫으로 수회 피펫팅(pipetting) 하였다. 획득한 세포를 세포배양용 디쉬에 씨딩(seeding)하여 신경배지인 DMEM/F12에 20ng/㎖ FGF(fibroblast growth factor), 10ng/㎖ EGF(epidermal growth factor), 2% B27 서플먼트(supplement)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 7일간 배양한 다음, 형성된 뉴로스피어를 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2a 내지 c에 나타난 바와 같이, 호모 타입의 유전자 결손형에서는, 정상인 와일드 타입의 유전형에 비하여, 뉴로스피어의 수와 크기면에서 유의적으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 호모 유전형은 NPC1 유전자가 결손된 마우스에서 유래된 것인 바, 호모타입 유전형에서 신경줄기세포의 덩어리인 뉴로스피어 의 수와 크기가 크게 감소한 것은 NPC1 유전자가 신경줄기세포의 재생에 관여하고 있다는 것을 의미한다.

실시예 2: NPC1 유전자와 MAP 카이네이즈와의 관계

여러 MAP 카이네이즈 관련 경로가 astroglia의 세포분화를 매개하므로, 본 실시예에서는 NPC1 ^+/+, NPC1 ^+/- 및 NPC1 ^-/- 마우스 유래 신경줄기세포로부터 MAP kanase 경로 관련 단백질들의 발현을 조사하였다.

NPC1 ^-/- 마우스의 16일령 태자의 뇌로부터 분리한 신경줄기세포를 상기 실시예 1-2에서와 동일한 방법으로 배양하여 뉴로스피어를 관찰하고, 1% FBS를 이용하여 폴리-디-라이신(poly-D-lysine)으로 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 뉴로스피어를 옮긴 후 인큐베이터에서 일주일간 배양함으로서 분화를 유도하였다. 다음으로, 상기 배양된 세포에 대한 웨스턴 블랏 분석을 위하여, 군에 따라 물질 처치를 실시하고 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1μM 루페틴(leupetin), 1μM 안티페인(antipain), 0.1 μM 소듐 올소바나데이트(sodium orthovanadate), 5mM 소듐 플로라이드(sodium fluoride)이 포함된 20% SDS를 이용하여 10초씩 6번 초음파처리를 하고, DC 프로테인 키트(Bio-Rad)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질을 12.5% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 200V에서 1시간동안 분리하고 100V, 350mA에서 PVDF 멤브레인에 1시간동안 트랜스퍼(transfer)시켰다. 이 멤브레인은 5% 건조된 피막(skim) 밀크가 포함된 T-PBS를 이용하여 세척한 후 1차 항체와 2차 항체를 1시 간동안 차례로 배양하고 각 단계마다 T-PBS를 이용하여 4회씩 세척하였다. 또한 ECL 화학발광 관측제(chemiluminiscenct detection reagent)를 이용하여 관측하고 멤브레인은 X-ray 필름에 15초에서 1분간 상태에 따라 노출시켰다.

그 결과, 도 3a 내지 3c에 나타난 바와 같이, NPC1 ^+/- 및 NPC1 ^-/- 마우스 유래 신경줄기세포에서 MKK3, p38, pMKK3/6, 및 pp38이, NPC1 ^+/+ 유래 신경줄기세포에 비해, 증가되었다. 또한, 도 3c에 나탄 바와 같이, NPC1 ^-/- 마우스 유래 신경줄기세포에서 ERK1/2 및 인산화된 ERK1/2도, NPC1 ^+/+ 유래 신경줄기세포에 비해 증가되었다. 이 결과로부터 NPC1 유전자가 정상적으로 발현되는 경우에는 MAP 카이네이즈 패밀리 단백질의 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한 NPC1 유전자가 발현되지 않는 경우에는 신경줄기세포의 분화시에 MAP 카이네이즈가 활성화되어 신경줄기세포가 성상세포로 분화가 되기는 하지만, 신경줄기세포가 병적인 형태의 신경세포로의 분화된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: NPC1 ^-/- 마우스 유래 뉴로스피어에서 p38MAP 카이네이즈 저해제에 의한 신경줄기세포의 자체 재생능력( self - renewal ability )

NPC1 유전자가 신경줄기세포의 자체 재생능력에 영향을 미침에 있어서 MAP 카이네이즈와의 관계를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. NPC1 ^-/- 마우스 의 뇌로부터 분리한 신경줄기세포를 MEK 억제제인 2μM PD98059와 p38 MAP 카이네이즈 억제제인 2μM SB202190로 각각 처리하였다.

그 결과, 도 4a-c에 나타난 바와 같이, SB202190 처치군에서는 유의적으로 뉴로스피어의 크기와 수가 증가하였고, PD98059 처치군에서는 뉴로스피어의 수는 무처치군보다 약간 증가하였으나, 그 크기는 유의적으로 증가였다. 이 결과로부터 p38 MAP 카이네이즈가 신경줄기세포의 재생을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 상기의 결과가 MAP 카이네이즈와 관련한 단백질의 증가가 특이적인 발현인지를 조사하기 위하여, NPC1 호모 유전형 뉴로스피어에 2μM PD98059와 2μM SB202190을 처치하여 배양한 뉴로스피어로부터 유도된 세포의 단백질 발현을 상기에서 행한 웨스턴 블랏 분석과 동일한 방법을 수행하여 분석하였다. 그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, MAP 카이네이즈 억제제 무처치군에 비하여 PD98059와 SB202190 처치군에서 GFAP, ERK1/2 및 pERK1/2의 발현은 유사하였다. 그러나, SB202190 처치군에서 인산화된 MAP 카이네이즈 관련 단백질(pMKK3/6, pp38)의 발현은 현저하게 감소하였다. pERK1/2의 발현은, NPC1 ^+/+와 비교하여, NPC1 ^+/- 및 NPC1 ^-/- 에서 증가하였음에도 불구하고(도 3a), NPC1 ^-/- 유래 신경줄기세포를 PD98059로 처치한 경우에는 대조군에 비해 증가하지 않았다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, p38에 대한 pp38의 발현 또한 유의적으로 감소하였다.

이 결과로부터, NPC1 유전자가 결핍된 경우, 신경줄기세포의 분화에 있어서 그 병적인 형태로 분화를 유도하는 것은 p38 MAP 카이네이즈 활성과 관련이 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: NPC1 ^-/- 마우스 유래 신경줄기세포의 분화

NPC1 ^-/- 마우스의 16일령 태자의 뇌로부터 분리한 신경줄기세포를 상기 실시예 1-2에서와 동일한 방법으로 배양하여 뉴로스피어를 관찰하고, 1% FBS를 이용하여 폴리-디-라이신(poly-D-lysine)으로 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 뉴로스피어를 옮긴 후 인큐베이터에서 일주일간 배양함으로서 분화를 유도하였다.

각 챔버에 4% 파라포름알데히드를 넣어 뉴로스피어를 10분간 고정한 후 PBS로 3회 세척한 후 0.3% 트리톤 X-100으로 5분간 퍼미어빌러제이션(permiabilization)시킨 다음, 10% NGS(normal goat serum)과 함께 1시간동안 전배양한 후, 2시간동안 1차 항체(anti-GFAP, 1:200, Chemicon, Temecula, CA, USA)와 반응시켰다. 그 후 PBS로 3회 세척한 후, 2차 항체(anti-mouse TRITC, 1:200, Zymed Lab. Inc., CA, USA)로 1시간동안 반응시키고, 다시 PBS로 3회 세척한 다음, 슬라이트의 텍(tek)을 제거하고 완전히 건조시키고, 마운턴트(mountant)로 커벌링하여 WG, WB 필터로 촬영하였다. 대조군으로서 NPC1 와일드 유전형 마우스의 태자 뇌로부터 분리한 신경줄기세포역시 상기와 동일한 방법을 수행하여 면역염색을 하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, NPC1 ^+/+ 및 NPC1 ^-/- 유래 신경줄기세포는 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 대하여 전혀 다른 면역활성 패턴을 나타 냈다. NPC1 ^+/+의 신경줄기세포로부터 분화된 성상세포는 전형적인 다각형 형태(polygonal morphology)를 나타낸 반면, NPC1 ^-/-의 신경줄기세포로부터 분화된 성상세포는 clumpy를 나타냈고, 둥근형상(rounded appearance)을 나타냈다. 이는 병적인 형태를 나타내는 선행문헌과 일치하는 결과이다 (Griffin, L.F. et al ., Nat . Med ., 10:704, 2004; Burns, M. et al ., Neurorx, 1:394, 2004).

이상 상세히 설명한 바와 같이, 신경줄기세포의 분화 및 자체복원능력은 NPC1 유전자의 존재여부에 의존한다. NPC1 유전자가 존재할 경우, MAP 카이네이즈의 발현을 저해하여 높은 자체복원능력을 가지게 되나, NPC1 유전자가 결핍된 경우에는 p38 MAP 카이네이즈의 활성화를 통해 자체복원능력의 저하 및 atrocyte의 형태학적 변형을 유발하게 된다 (도 7). 따라서, p38 MAP 카이네이즈 저해제는 NPC1 결핍에 의한 질환의 임상적용시 신경줄기세포의 자체복원을 증가시키는데 효과적일 것이다. 또한, NPC1 유전자는 신경줄기세포의 자체복원을 조절하는 핵심 유전자로, 퇘행성 신경계 질환의 유전자 치료용으로 할용이 가능할 뿐만 아니라, 세포치료제로도 활용이 가능하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자, 상기 NPC1 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 유전자치료제 및 상기 NPC1 유전자를 함유하는 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 치료제는 알츠하이머(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 픽병(Pick's disease), 니이만병(Niemann pick disease) 등과 같은 퇴행성 신경계 질환뿐만아니라, 심근경색 등을 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환을 치료하는데 유용하다.

Claims

신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 NPC1 유전자.
제1항의 NPC1 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 유전자치료제.
제2항에 있어서, 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환은 퇴행성 신경계 질환 또는 심근경색인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
제3항에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환은 알츠하이머(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 픽병(Pick's disease), 및 니이만병(Niemann pick disease)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
제1항의 NPC1 유전자를 함유하는 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환 치료용 세포치료제.
제5항에 있어서, 줄기세포 재생 또는 분화 불량에 의한 질환은 퇴행성 신경계 질환 또는 심근경색인 것을 특징으로 하는 세포치료제.
제6항에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환은 알츠하이머(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 픽병(Pick's disease), 및 니이만병(Niemann pick disease)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.