CN102824637B

CN102824637B - Trpc5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用

Info

Publication number: CN102824637B
Application number: CN201210318389.5A
Authority: CN
Inventors: 金坚; 马鑫; 陈蕴; 蔡燕飞; 何冬旭
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-09-02
Filing date: 2012-09-02
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-09-02
Also published as: CN102824637A

Abstract

本发明提供TRPC5的一种新用途，即：TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用，所述药物为TRPC5抑制剂，包括TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN和Lenti-TRPC5-DN、TRPC5的SiRNAsiC5，所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本发明的重要之处是发现了TRPC5与介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白表达密切相关，以及TRPC5抑制剂对体外和体内肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，因此，本发明为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。

Description

TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用

技术领域

本发明涉及TRPC5的一种新用途，尤其涉及瞬时受体电位通道TRPC5的抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的应用。

背景技术

肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指肿瘤细胞接触某种抗肿瘤药物后，不仅对该药物产生耐药性，而且对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降低了抗肿瘤药物的疗效。多年来研究者发现了多种MDR产生机制，其中，由多药耐药基因MDR1编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是目前研究最多也是最为重要的多药耐药相关蛋白。P-gp在肿瘤组织中总体表达水平较低，但在恶性肿瘤中有却有一定水平的表达，尤其是在耐药肿瘤组织中其表达量明显上调。P-gp的功能可归如下：一方面，P-gp是一种细胞膜ATP依赖泵，可结合并以耗能的方式排出多种药物，从而降低细胞内药物浓度，使其产生耐药性；另一方面，P-gp可能是钙离子通道的一部分，钙通道阻滞剂和一些钙调蛋白抑制剂均可与P-gp结合，通过屏蔽P-gp来提高细胞内的药物浓度，从而增加多药耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。P-gp主要介导亲脂性抗肿瘤药物引起的MDR，包括抗生素类如多柔比星/阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）,植物类药物如长春新碱（VCR）、依托泊苷（Vp216）等。

到目前为止设计和筛选出的肿瘤MDR逆转剂大多以P-gp作为靶点，主要包括以下三代：

（1）第一代逆转剂：维拉帕米和环孢菌素A

维拉帕米和环孢菌素A是被最早被发现的可在体外抑制MDR1介导MDR的药物，但其在临床上出现的剂量依赖性副作用严重限制了它们的应用；

（2）第二代逆转剂：dex-维拉帕米、valsodar（PSC833）、bricoda（VX-710）

比第一代逆转剂的逆转活性更强，但该类逆转剂能同时抑制P-gp介导的胆汁排泄和肠道转运，并与抗肿瘤药物竞争性结合细胞色素P-450，从而抑制药物的肝肠代谢，导致抗肿瘤药物的毒性增大。

（3）第三代逆转剂：Tariquidar（XR9576）、Zosuquidar（LY335979）、Laniquidar（R101933）

第三代逆转剂通过直接与P-gp结合，使其丧失外排抗肿瘤药物的功能，从而逆转多药耐药，但该类逆转剂仍处于临床试验阶段，尚不成熟。

综上所述，目前大部以P-gp为作用靶点的MDR逆转剂都具有严重的毒副作用，因而阻碍了它们的临床应用，因此，寻找新的肿瘤耐药相关靶点，并在此基础上设计筛选出高效低毒的多药耐药逆转剂亟不可待。

瞬时受体电位通道（transient receptor potential channels，TRP通道）是位于细胞膜的一类非常重要的非选择性阳离子（主要为钙离子和钠离子）通道，最早被发现于果蝇视觉系统，在哺乳动物，已发现28种TRP通道亚型，分属于6个亚家族：TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML，其调节机制各异，涉及功能广泛，参与多种疾病的病理生理过程。其中，TRPC(Cannonical TRP)，即传统型TRP通道，包括TRPC1-7共七个亚型，主要参与细胞膜受体激活磷脂酶C后所介导的钙离子进入。TRPC5主要分布于脑、肺、睾丸和胎盘，并主要参与生长锥的形成和脑的发育，近几年来研究表明很多TRP通道均参与细胞的生存、增殖和死亡等基本生命活动，随着研究的深入，有理由相信TRP通道将会参与更多疾病的病理生理过程。

目前，国内外未见有TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。

发明内容

针对现有技术存在的上述的缺陷，本发明的目的在于提供TRPC5的一种新用途，即： TRPC5抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的应用。

所述TRPC5抑制剂包括TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的SiRNA或TRPC5的显性抑制质粒，其中，所述TRPC5的显性抑制质粒包括pCDNA6-TRPC5-DN、Lenti-TRPC5-DN。

所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。

本发明的有益技术效果为：

经本发明人研究发现，与敏感型肿瘤细胞（如MCF-7/WT）相比，瞬时受体电位通道TRPC5在多药耐药肿瘤细胞（如MCF-7/ADM）中有更高水平的表达，且该通道具有通透钙离子的生理活性，并与介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白表达密切相关，能间接上调P-gp蛋白的表达水平；实验表明，TRPC5抑制剂（TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN、TRPC5的SiRNA siC5）对体外和体内肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用；因此，本发明为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药逆转药物的开发和制备提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中多药耐药肿瘤细胞中TRPC5的表达水平及其钙离子通透活性的检测结果示意图。

图2为本发明实施例2中 TRPC5与P-gp表达水平的关系检测结果示意图。

图3为本发明实施例3中 TRPC5抑制剂对体外肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。

图4为本发明实施例4中 TRPC5抑制剂对体内肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。

以下实施例所使用实验材料如下:

细胞系：野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT购自美国模式培养物寄存库（ATCC）; 耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存，其制备方法为：将新复苏的野生型MCF-7/WT细胞（购自ATCC）于细胞培养常规条件下培养2 代～3 代，使细胞生长稳定，待细胞汇合时用胰酶进行消化并传代，第二天更新培养基，同时以MCF-7/WT IC50的1/10为起始浓度加入阿霉素，加药第二天后再次换液，并维持阿霉素的浓度进行常规传代培养，待细胞稳定生长后提高药物浓度继续培养，直到细胞可在阿霉素浓度为5 μg/ml的培养基中稳定生长，即得，整个制备过程历时8个月。

质粒： TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN由美国哈佛大学教授D. E. Clapham赠送（该质粒还可通过文献（Shang-Zhong Xu, Katsuhiko Muraki, et al. A Sphingosine-1-Phosphate-Activated Calcium Channel Controlling Vascular Smooth Muscle Cell Motility[J]. Cellular Biology,2006,1381-1389）所述方法制备得到）；pCDNA6购自美国Addgene公司；Lenti-TRPC5-DN和 Lenti-GFP由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存。上述Lenti-TRPC5-DN的制备方法为：将TRPC5-DN基因（由美国哈佛大学教授D. E. Clapham赠送，其制备方法同上文文献中所述TRPC5-DN基因的制备方法）克隆至慢病毒载体pRRL-cPPT-CMV-X-PRE-sin（购自美国invitrogen公司）中，与包装质粒（包括pLP1，pLP2，pLP/VSVG三个质粒，均购自美国invitrogen公司）共转染

人胚胎肾细胞HEK293（购自ATCC）后收获病毒；上述Lenti-GFP的制备方法为：将EGFP基因（购自美国Addgene公司）克隆至慢病毒载体pRRL-cPPT-CMV-X-PRE-sin（购自美国invitrogen公司）中，其余制备方法同Lenti-TRPC5-DN。

试剂与试剂盒：脂质体Liopo2000购自美国Invitrogen公司； Anti-P-gp (P-glycoprotein)（SC-55510）购自美国Santa Cruz 公司； TRPC5 antibody （ab63151）购自美国Abcam公司；βtubulin antibody（SC-9104）购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)（A0208 ）和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）购自上海碧云天生物科技； 2-APB（2- aminoethoxydiphenylborate）购自美国Sigma公司；T5E3特异的IgG纯化柱购自美国Thermo公司；血蓝蛋白购自美国国际Alpha诊断公司；TRPC5的SiRNA siC5购自美国Invitrogen公司。

实验动物：耐药荷瘤小鼠，其制备方法如下：取体外常规培养的MCF-7/ADM，待细胞汇集90%时，收集细胞，按照每只小鼠5×10⁶个细胞的接种量接种雌性裸鼠背部（购自香港中文大学动物中心），四周后开始成瘤。

实验仪器：膜片钳系统购自德国HEKA公司；酶标仪购自美国 Bio-Rad公司；5%CO₂恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司；蛋白转印仪购自美国 Bio-Rad公司；SDS-PAGE电泳仪系统购自美国 Bio-Rad公司。

实施例1 多药耐药肿瘤细胞中TRPC5的表达水平及其钙离子通透活性检测

实验方法：

分别收集MCF-7/WT和MCF-7/ADM各1.0x10⁵个，通过Western blot检测P-gp和TRPC5在MCF-7/WT和MCF-7/ADM中表达量的差异。

运用HEKA EPC9-9膜片钳系统检测MCF-7/WT和MCF-7/ADM及其被各种TRPC5抑制剂处理后的MCF-7/WT和MCF-7/ADM全细胞电流情况。细胞的钳制电压为0mV，电流-电压关系为-100mV~+100mV，间隔为20 mV，持续500ms，电极内液组成： 130mM Cs-天门冬氨酸Cs-aspartate, 2 mM MgCl₂，5 mM Na₂ATP， 5.9 mM CaCl₂，10 mM EGTA，10 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes（pH7.2）；电极外液为低渗溶液，渗透压为210mOsm，其组成为：65mM Na⁺-aspartate, 5mM KCl, 1mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM Hepes, 10 mM 葡萄糖glucose（pH 7.4）。

在低渗溶液中检测MCF-7/WT和MCF-7/ADM细胞的全细胞电流情况。

将MCF-7/ADM细胞用不同的TRPC5抑制剂处理后，检测其全细胞电流情况，使用的抑制剂包括：（1）TRPC5的药理学拮抗剂2-APB（2- aminoethoxydiphenylborate），将60μM 2-APB直接加入电极外液中检测，以0.1%DMSO作为对照组；（2）TRPC5的阻断型抗体T5E3，用20μg/mL T5E3孵育细胞60min后检测其全细胞电流情况，新西兰兔免疫前血清IgG作为对照，

阻断型抗体T5E3制备方法如下：人工合成TRPC5跨膜结构域的一段多肽（序列：CYETRAIDEPNNCKG; E3 肽段），并将该肽段与血蓝蛋白相连接，将连接后的肽段作为抗原免疫新西兰兔，运用T5E3特异的IgG纯化柱进行纯化后获得。（3）TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN，将MCF-7/ADM以每孔30万个细胞的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后用脂质体Liopo2000按照8μg每孔做转染，24小时后检测全细胞电流情况，以pCDNA6空载质粒作为对照组。

实验结果：

实验结果见图1。由图1-A和图1-B可知，与MCF-7/WT（在图中为WT）相比，MCF-7/ADM（在图中为ADM）中P-gp和TRPC5均发生高水平表达;由图1-C可知，在低渗条件下，与MCF-7/WT相比，MCF-7/ADM中的全细胞电流明显增强，说明 MCF-7/ADM中TRPC5的活性较高；由图1-D可知，在各种TRPC5抑制剂作用下，MCF-7/ADM中全细胞电流明显减弱，进一步证明在多药耐药肿瘤细胞中，TRPC5具有通透钙离子的生理活性。

实施例2 TRPC5与P-gp表达水平的关系检测

将MCF-7/ADM以每孔30万个细胞的密度接种于六孔板，培养12小时后，分别转染TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN（4 μg/孔、8 μg/孔），以pCDNA6空载质粒作为对照组，以及TRPC5的SiRNA siC5（100pmol /孔）（其有意链为：CCA AUG GAC UGA ACC AGC UUU ACU U），以阴性siRNA作为对照组；对转染后的细胞进行常规培养，24小时后收集各孔细胞，按照常规操作方法，运用Western blot检测TRPC5被抑制前后细胞中P-gp的表达情况，其中，P-gp的孵育一抗为Anti-P-gp （P-glycoprotein），TRPC5的孵育一抗为TRPC5 antibody （ab63151），内参βtubulin的孵育一抗为β tubulin antibody（SC-9104），孵育二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（A0208 ）和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）。

实验结果：

实验结果见图2。由图2-A可知，随着TRPC5的显性抑制质粒浓度的增加， P-gp的表达水平逐渐下调；由图2-B可知，TRPC5的SiRNA（200nM）能明显抑制P-gp的表达。该实验结果表明TRPC5与 P-gp的表达水平密切相关。

实施例3 TRPC5抑制剂对体外肿瘤细胞多药耐药的逆转作用

实验方法：

将MCF-7/ADM和MCF-7/WT分别接种于25cm²的细胞瓶中，当MCF-7/ADM汇集80%时分别转染TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN（16μg/瓶），以pCDNA6空载质粒作为对照组，以及TRPC5的SiRNA siC5（200pmol /瓶），以阴性siRNA作为对照组；对细胞进行常规培养，24小时后分别收集经上述处理的MCF-7/ADM和未经处理的MCF-7/WT，并按照每孔7000个细胞的密度接种于96孔板，24小时后按照浓度梯度加入阿霉素，培养48小时后，用MTT法检测细胞的药敏性。

实验结果：

实验结果见图3。由图3-A和3-B可知，多药耐药肿瘤细胞（MCF-7/ADM）对阿霉素的敏感性明显低于野生型肿瘤细胞（MCF-7/WT），而当在MCF-7/ADM中转染TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN或TRPC5的SiRNA后，与对照组（MCF-7/ADM+vector以及MCF-7/ADM+scramble）相比，其药敏性发生了明显增强。该实验结果表明，TRPC5抑制剂对体外肿瘤细胞多药耐药具有明显的逆转作用，提示TRPC5可作为新的药物靶点为逆转肿瘤多药耐药提供新的思路。

实施例4 TRPC5抑制剂对体内肿瘤细胞多药耐药的逆转作用

实验方法

在耐药荷瘤小鼠肿瘤部位每三天注射一次TRPC5的抑制剂：（1）Lenti-TRPC5-DN，每个肿瘤注射1.5×10⁷拷贝，以Lenti-GFP作为对照组；（2）TRPC5 SiRNA，每个肿瘤注射10pmol；于每次注射TRPC5抑制剂的第二天继续注射ADM（4 mg/kg 鼠重）；30天后取下肿瘤，拍照并测量肿瘤体积。

实验结果：

实验结果见图4。由图4-A和4-B可知，TRPC5抑制剂Lenti-TRPC5-DN和SiRNA均能明显抑制耐药肿瘤的生长。该实验结果表明，TRPC5抑制剂对体内肿瘤多药耐药具有明显的逆转作用，且对实验动物无毒副作用，进一步提示TRPC5抑制剂可为肿瘤多药耐药逆转药物的开发和制备提供新的思路。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.TRPC5抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的应用，其特征在于：所述TRPC5抑制剂选自TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的SiRNA或TRPC5的显性抑制质粒。

2.根据权利要求1所述TRPC5抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的应用，其特征在于：所述TRPC5的显性抑制质粒包括pCDNA6-TRPC5-DN、Lenti-TRPC5-DN。

3.根据权利要求1所述TRPC5抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生的。