CN102824335A - 胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途 - Google Patents

胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途 Download PDF

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李岩
郭楠
马晓科
董继锐
付振平
赵剑璞
夏雨
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Abstract

本发明涉及医药技术领域，发现了胡桃醌用于调节小鼠免疫状态及氧化反应的用途，主要研究药效成分胡桃醌，化学名称：5-羟基-1，4-萘醌，5-羟基-1，4-萘二酮；英文名称：Juglone，walnuts quinone，5-hydroxy-1，4-naphthoquinone，5-hydroxynaphthoquinone，regianin，Nucin；分子式：C10H6O3；相对分子量174.15。本发明经过系统的药理试验，利用KM小鼠，采用地塞米松磷酸钠注射液建立免疫低下模型，绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠产生SRBC抗体及环磷酰胺建立小鼠免疫刺激模型，证明胡桃醌能够使低下的免疫功能恢复到正常水平，也能够改善免疫刺激状态，维持机体的自稳，显示出具有双向免疫调节作用；胡桃醌显示出具有通过调节机体内的氧化应激反应来调节机体免疫系统功能的作用。

Description

胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途
【所属领域】
本发明涉及药效学成分胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途，属于药效学研究领域。
【背景技术】
胡桃楸为胡桃科胡桃属植物，具有很高的药用价值，其味苦，辛，性寒，有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性、清热解毒、抗菌消炎和明目等功效。胡桃醌(Juglone)属于萘醌类成分，存在于胡桃科核桃属植物胡桃楸(Jugland mandshurica Maxim)和核桃(Juglans regia L)的根皮、树皮、青果皮(青龙衣)、叶中。国内外均有研究报道，胡桃醌具有广泛的药理作用，在医学和农业上都具有潜在的应用价值。胡桃醌不仅具有抗肿瘤作用，还具有抗真菌、抗衣原体、抗HIV病毒、降血糖和杀虫等生物活性，并且越来越受到人们的重视。胡桃醌能显著增加BEL-7402细胞的膜流动性，促进药物进入细胞内部，提高药物对细胞的毒性，具有抗血管生成作用。迄今，虽对胡桃醌的抗肿瘤活性研究较多，但对小鼠的不同免疫状态的免疫调节及氧化反方面鲜有研究。
【发明内容】
本发明发现了胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途，主要研究药效成分为胡桃醌，化学名称：5-羟基-1，4-萘醌，5-羟基-1，4-萘二酮；英文名称：Juglone，walnuts quinone，5-hydroxy-1，4-naphthoquinone，5-hydroxynaphthoquinone，regianin，Nucin；分子式：C10H6O3；相对分子量174.15；纯度：95％，理化性质：黑色粉末，不溶于冷水，微溶于热水，溶于乙醇、乙醚，易溶于氯仿、苯等有机溶剂。化学结构：
Figure BSA00000732102700011
本发明经过系统的药理动物实验证明：胡桃醌可以提高正常小鼠的体液免疫，提高地塞米松诱导的免疫低下小鼠的体液免疫水平。胡桃醌具有双向免疫调节作用，即上调地塞米松诱导的免疫抑制小鼠的体液免疫，并能下调绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠产生SRBC抗体及环磷酰胺建立的免疫刺激小鼠的体液免疫。胡桃醌能够使低下的免疫功恢复到正常水平，也能够改善免疫刺激状态维持机体的自稳；同时胡桃醌显示出具有通过调节机体内的氧化应激反应来调节机体免疫系统功能。
【具体实施方式】
为了进一步证明胡桃醌具有调节小鼠的免疫状态及氧化反应的作用，以下结合发明人对胡桃醌进行系统药理实验进行详细说明。
实施例1.胡桃醌对小鼠免疫状态的调节作用
1.1实验动物
KM小鼠，雄性，4～6周龄，体重18-22g，SPF级。北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SCXK(京)2006-0008。实验前适应性饲养3天。环境温度控制为22～25℃，湿度＞60％，自然光照(12小时/天)，自由进水，标准颗粒饲料喂养。
1.2试验材料
1.2.1药品与主要试剂
1)药品：胡桃醌，由北京百灵威科技有限公司提供；地塞米松磷酸钠注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供；环磷酰胺，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。
2)试剂：绵羊红细胞，由广州蕊特生物科技有限公司提供；冰醋酸，由北京化工厂提供。
1.2.2主要仪器
1)HH-4型数显恒温水浴锅，BOKE博科试验设备研究所生产；
2)FA2104N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司生产；
3)WH-3微型涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂产品生产；
4)SB5200D型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产；
5)DT5-2型低速自动平衡离心机，北京时代北利离心机有限公司生产；
6)TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产。
1.3动物处理
将48只小鼠按体重随机分为6组，雄性，分组饲养。6组分别为正常对照组、正常给药组；免疫低下对照组、免疫低下胡桃醌组；免疫刺激对照组和免疫刺激胡桃醌组。(1)地塞米松致KM小鼠免疫低下模型：地塞米松磷酸钠注射液连续七日腹腔注射造模，注射剂量为0.2mL/只。(2)绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠产生SRBC抗体及环磷酰胺致免疫超常模型：每只小鼠腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC 0.2mL进行免疫，于致敏前三天腹腔注射环磷酰胺250mg/Kg。
各实验组给药方式：(1)正常对照组：连续10日腹腔注射，生理盐水；
(2)正常给药组：连续10日腹腔注射，300mg/Kg的胡桃醌；
(3)免疫低下对照组：连续10日腹腔注射，生理盐水；
(4)免疫低下胡桃醌组：连续10日腹腔注射，300mg/Kg的胡桃醌；
(5)免疫刺激对照组：连续10日腹腔注射，生理盐水；
(6)免疫刺激胡桃醌组：连续10日腹腔注射，300mg/Kg的胡桃醌.
1.4胡桃醌对小鼠免疫器官指数的影响
1)试验方法
每日给药前对小鼠体重进行测量并记录。于第11日称重所有小鼠，随后摘眼球取血，制备血清。断颈处死，迅速取出胸腺和脾脏，用0℃生理盐水清洗，除去血液，并用滤纸吸干水分，称重，计算胸腺指数和脾脏指数。称取0.1g脾脏组织放入10mL的离心管中，按照质量体积比为1∶9的比例，使用移液枪加入冷的生理盐水，并用超声破碎仪进行匀浆，将匀浆后的组织悬液在低温离心机中离心，收集上清液，即得10％脾脏组织匀浆。如若部分脾脏不够0.1g，则按相同比例配制。
其中，分别以小鼠的胸腺重量(g)和脾脏重量(g)与其体重(g)的比值作为胸腺指数和脾脏指数。计算公式如下：胸腺(脾脏)指数＝胸腺重(g)/体重(g)
2)统计学处理所用的数据均用
Figure BSA00000732102700031
表示，统计学分析用t检验。
3)结果
胸腺指数和脾脏指数是反映机体免疫功能的最基本最常规的指标。由表1可知，从免疫器官指数方面来看，免疫低下模型及免疫刺激模型造模成功，胡桃醌能够显著提高免疫低下小鼠的胸腺、脾脏指数，同时也能降低免疫刺激小鼠的胸腺、脾脏指数，并对免疫力正常小鼠的胸腺、脾脏指数也有一定的提高作用。因此，初步证明胡桃醌能够调节小鼠的不同免疫状态，维持免疫功能于平稳状态。
表1胡桃醌对实验小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
Figure BSA00000732102700032
Figure BSA00000732102700033
注：与正常对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
1.5MTT法测LPS诱导的B细胞增殖测定
1)试验方法
小鼠处死后，无菌取出脾脏，将称重后的脾脏置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，使用注射器芯和100目网筛轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，收集细胞，用含有5％胎牛血清的PBS溶液洗涤，用Hank’s液洗，离心，然后用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，调细胞数到1×107mL-1。于96孔无菌细胞培养板中每孔分别加入细胞悬液100μL，20mg·L-1浓度的LPS 100μL，每个样本设5个复孔。置37℃，5％CO2培养箱内培养48h，在终止培养前4h，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，于振荡器上振荡3次，继续放入37℃，5％CO2培养箱继续培养4h。结束培养后离心，吸弃上清后每孔加入DMSO，在酶标仪上于490nm波长处读每孔吸光度(A)，结果以A均值表示。
2)统计学处理所用的数据均用
Figure BSA00000732102700041
表示，统计学分析用t检验。
3)结果
如表2所示，SRBC本身不具有增强或者抑制小鼠体液免疫功能的作用，胡桃醌能够显著提高免疫低下小鼠B细胞增殖反应，并且亦能够显著降低免疫刺激小鼠B细胞增殖反应，也可使正常免疫小鼠的B细胞增殖有一定程度的提高，说明了胡桃醌对于免疫力正常小鼠的抗体生成有一定程度的提高作用，这也说明了胡桃醌能够维持体液免疫于相对稳定的状态。
表2胡桃醌对小鼠B细胞增殖的影响
Figure BSA00000732102700042
Figure BSA00000732102700043
注：与正常对照组相比较，**P＜0.01；与模型对照组相比较，##P＜0.01，与免疫刺激胡桃醌组比较，△△P＜0.01
1.6结论
以上实验显示：胡桃醌可以提高正常小鼠的体液免疫，使低下的免疫功能恢复到正常水平，也能对异常过高的免疫状态下调从而使之改善，维持机体的自稳。
实施例2胡桃醌对小鼠的抗氧化能力影响
2.1实验动物
KM小鼠，雄性，4～6周龄，体重18-22g，SPF级。北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SCXK(京)2006-0008。实验前适应性饲养3天。环境温度控制为22～25℃，湿度＞60％，自然光照(12小时/天)，自由进水，标准颗粒饲料喂养。
2.2试验材料
2.2.1药品与主要试剂
1)药品：胡桃醌，由北京百灵威科技有限公司提供；地塞米松磷酸钠注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供；环磷酰胺，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。
2)试剂：绵羊红细胞，由广州蕊特生物科技有限公司提供；冰醋酸，由北京化工厂提供。
3)试剂盒：考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，溶菌酶(LZM)检测试剂盒，丙二醛检测试剂盒(TBA法)，总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒，还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒，一氧化氮(NO)测试盒，超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒，抗超氧阴离子能力自由基测试盒，以上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
2.2.2主要仪器
1)RT-6000酶标分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司生产；
2)FA2104N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司生产；
3)WH-3微型涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂产品生产；
4)SB5200D型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产；
5)DT5-2型低速自动平衡离心机，北京时代北利离心机有限公司生产；
6)TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；
7)HH-4型数显恒温水浴锅，BOKE博科试验设备研究所生产。
2.3动物处理
将48只小鼠按体重随机分为6组，雄性，分组饲养。6组分别为正常对照组、正常给药组；免疫免疫低下对照组、免疫免疫低下胡桃醌组；免疫免疫刺激胡桃醌组和免疫免疫刺激胡桃醌组。(1)地塞米松致KM小鼠免疫低下模型：地塞米松磷酸钠注射液连续七日腹腔注射造模，注射剂量为0.2mL/只。(2)绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠产生SRBC抗体及环磷酰胺致免疫超常模型：每只小鼠腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC 0.2mL进行免疫，于致敏前三天腹腔注射环磷酰胺250mg/Kg。
各实验组给药方式：(1)正常对照组：连续10日腹腔注射，生理盐水；
(2)正常给药组：连续10日腹腔注射，300mg/Kg的胡桃醌；
(3)免疫低下对照组：连续10日腹腔注射，生理盐水；
(4)免疫低下胡桃醌组：连续10日腹腔注射，300mg/Kg的胡桃醌；
(5)免疫刺激对照组：连续10日腹腔注射，生理盐水；
(6)免疫刺激胡桃醌组：连续10日腹腔注射，300mg/Kg的胡桃醌.
2.4胡桃醌对小鼠的抗氧化能力作用
1)试验方法：
血样本处理方法：摘眼球取血1mL，与离心管中，静置1h后，以3000r/min速度离心20min，得血清。
组织液处理方法：称取0.1g脾脏组织放入10mL的离心管中，按照质量体积比为1∶9的比例，使用移液枪加入冷的生理盐水，并用超声破碎仪进行匀浆，5s/次，间隔10s，连续3～5次，将匀浆后的组织悬液置于低温离心机中离心2000rpm，10min，收集上清液，即得10％脾脏组织匀浆。如若部分脾脏不够0.1g，则按相同比例配制。
用试剂盒进行检测：考马斯亮蓝测定小鼠胸腺及脾脏蛋白的浓度、小鼠血清溶菌酶(LZM)含量、小鼠血清血清丙二醛(MDA)含量、小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)、小鼠胸腺还原型谷胱甘肽(GSH)含量、小鼠脾脏一氧化氮(NO)含量、小鼠脾脏超氧化物歧化酶(T-SOD)能力、小鼠脾脏抗超氧阴离子能力自由基(anti-O2-)能力。
2)统计学处理所用的数据均用
Figure BSA00000732102700061
表示，统计学分析用t检验。
3)实验结果
①考马斯亮蓝测定小鼠胸腺及脾脏蛋白的浓度
采用南京建成生物工程研究所的考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定小鼠胸腺及脾脏中蛋白的浓度。结果见表3，所测得的蛋白浓度均用于胸腺和脾脏的抗氧化能力(胸腺还原型谷胱甘肽(GSH)含量，脾脏一氧化氮(NO)含量，脾脏超氧化物歧化酶(T-SOD)能力和抗超氧阴离子自由基(anti-O2-)能力)的测定。
表3考马斯亮蓝测定小鼠胸腺及脾脏蛋白的浓度
Figure BSA00000732102700062
Figure BSA00000732102700063
②小鼠血清溶菌酶(LZM)含量
结果见表4，胡桃醌能够显著提高免疫低下小鼠LZM含量，并且亦能够显著降低免疫刺激小鼠LZM含量。这也说明了胡桃醌能够维持体液免疫于相对稳定的状态。
表4胡桃醌对小鼠血清溶菌酶(LZM)含量的影响
Figure BSA00000732102700065
注：与正常对照组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组相比较，##p＜0.01，与免疫刺激对照组比较，△p＜0.05
③小鼠血清血清丙二醛(MDA)含量
结果见表5，胡桃醌能够显著降低正常小鼠和免疫低下小鼠血清MDA含量，并且亦能够显著提高免疫刺激小鼠血清MDA含量。这说明了胡桃醌能够维持不同免疫状态小鼠血清MDA含量于一稳定范围内，也表明了胡桃醌通过调节机体内的自由基水平或脂质过氧化程度来影响机体的免疫能力。
表5胡桃醌对实验对小鼠血清丙二醛(MDA)含量的影响
Figure BSA00000732102700071
Figure BSA00000732102700072
注：与正常对照组相比较**p＜0.01；与免疫低下对照组相比较，##p＜0.01；与免疫刺激胡桃醌组比较，△p＜0.05
④小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)
结果见表6，胡桃醌对于免疫抑制小鼠血清中T-AOC水平有显著的上调作用，即胡桃醌能够显著提高免疫低下小鼠血清抗氧化能力。这说明了胡桃醌能够提高小鼠血清抗氧化能力。
表6胡桃醌对实验小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)的影响
Figure BSA00000732102700073
Figure BSA00000732102700074
注：与正常对照组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组相比较，##p＜0.01
⑤小鼠胸腺还原型谷胱甘肽(GSH)含量
结果见表7，小鼠注射地塞米松后，胸腺GSH水平明显下降，胡桃醌的给予能使正常和免疫抑制小鼠的胸腺谷胱甘肽含量。
表7胡桃醌对实验小鼠胸腺还原型谷胱甘肽(GSH)含量的影响
Figure BSA00000732102700081
Figure BSA00000732102700082
注：与正常对照组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型对照组相比较，##p＜0.01
⑥小鼠脾脏一氧化氮(NO)含量
结果见表8，胡桃醌能够显著降低免疫低下小鼠脾脏NO含量，并且能够增加免疫刺激小鼠脾脏NO含量，在免疫低下的小鼠模型中，NO的含量会显著升高，说明了免疫系统功能的高低和机体氧化程度的高低之间的关系。即说明胡桃醌对于NO介导的细胞氧化应激反应具有一定的调节作用。
表8胡桃醌对实验小鼠脾脏一氧化氮(NO)含量的影响
Figure BSA00000732102700084
注：与正常对照组相比较*p＜0.05，**p＜0.01；与免疫低下对照组相比较，##p＜0.01；与免疫刺激胡桃醌组比较，△p＜0.05
⑦小鼠脾脏超氧化物歧化酶(T-SOD)
结果见表9，说明胡桃醌可以提高小鼠脾脏T-SOD的含量从而提高机体的抗氧化能力，并且对免疫低下模型小鼠，其刺激T-SOD产生的能力会进一步提高，也表明了胡桃醌能够明显的对抗免疫抑制模型鼠脾脏中SOD活力的下降，发挥抗氧化作用。
表9胡桃醌对实验小鼠脾脏超氧化物歧化酶(T-SOD)能力的影响
Figure BSA00000732102700091
Figure BSA00000732102700092
注：与正常对照组相比较*p＜0.05，**p＜0.01；与免疫低下对照组相比较，##p＜0.01；与免疫刺激胡桃醌组比较，△p＜0.05
⑧小鼠脾脏抗超氧阴离子能力自由基(anti-O2-)能力
结果见表10，正常给药组显著大于正常对照组(P＜0.01)，同时免疫刺激胡桃醌组的anti-O2 -显著高于正常对照组(P＜0.01)。此外，免疫低下组内相比较，免疫低下胡桃醌组极显著高于免疫低下对照组(P＜0.01)，免疫刺激组内相比较，免疫刺激胡桃醌组与免疫刺激对照组明显提高(p＜0.05)。这说明HT可以显著提高小鼠抗超氧阴离子能力自由基能力，从而达到保护机体免受氧化损伤。说明HT可以显著提高小鼠抗超氧阴离子能力自由基能力，从而达到保护机体免受氧化损伤。
表10胡桃醌对实验小鼠脾脏抗超氧阴离子能力自由基(anti-O2 -)能力的影响
Figure BSA00000732102700093
Figure BSA00000732102700094
注：与正常对照组相比较*p＜0.05，**p＜0.01；与免疫低下对照组相比较，#p＜0.05；与免疫刺激胡桃醌组比较，△p＜0.05
2.5结论：
以上各项实验结果显示：胡桃醌调节机体自由基水平及氧化还原信号的传递以维持机体免疫功能的稳定；胡桃醌在抗氧化机制中，更倾向于提高机体抗氧化能力，而非直接削弱氧化应激过程。

Claims (4)

1.胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途，其所述特征在于胡桃醌能够使低下的免疫功能恢复到正常水平，改善免疫刺激状态，维持机体的自稳，显示出具有双向免疫调节作用；胡桃醌显示出具有通过调节机体内的氧化应激反应来调节机体免疫系统功能。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于胡桃醌能够使正常、地塞米松诱导的免疫低下模型和绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠产生SRBC抗体及环磷酰胺致免疫刺激模型的实验动物的不同免疫状态维持在相对平稳的范围内。
3.根据权力要求1的方法，其特征在于在抗氧化机制中，胡桃醌具有提高机体抗氧化能力，而非直接削弱氧化应激过程。
4.根据权力要求1的方法，其特征在于胡桃醌调节机体自由基水平及氧化还原信号的传递以维持机体免疫功能的稳定。
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