CN102822676A - 用于预测三阴性乳腺癌对疗法的应答的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在肿瘤细胞(例如三阴性转移性乳腺肿瘤细胞)中检测信号转导通路的组分的表达和/或活化水平的组合物和方法。源于使用本发明得到的关于信号转导通路组分的表达和/或活化水平的信息可用于癌症诊断、预后和对癌症治疗的设计中。

Description

用于预测三阴性乳腺癌对疗法的应答的方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2010年1月12日提交的美国临时申请No.61/294,433、2010年4月19日提交的美国临时申请No.61/325,624、2010年4月27日提交的美国临时申请No.61/328,602和2010年6月4日提交的美国临时申请No.61/351,838的优先权，就所有目的而言，上述申请的公开内容均通过引用以其整体并入本文。

发明背景

细胞中信号转导的过程负责多种生物学功能，包括但不限于细胞分裂和死亡、代谢、免疫细胞活化、神经传导和感官知觉，等等。因此，细胞中正常信号转导中的错乱(derangements)可导致大量疾病状态，例如糖尿病、心脏病、自身免疫和癌症。

一种被良好表征的信号转导通路是MAP激酶通路，其负责从表皮生长因子(EGF)转导信号以促进细胞中的细胞增殖(见PCT公开No.WO2009/108637的图1，就所有目的而言，该文本公开内容通过引用以其整体并入本文)。EGF与和酪氨酸激酶连接的跨膜受体(表皮生长因子受体，EGFR)结合，其通过EGF的结合而被活化。EGF与EGFR的结合活化了受体胞质结构域的酪氨酸激酶活性。该激酶活化的一种后果是EGFR在酪氨酸残基上的自身磷酸化。活化的EGFR上经磷酸化的酪氨酸残基提供了含有SH2结构域的适体蛋白(例如GRB2)结合的停泊位点。在其作为适体的功能方面，GRB2还通过GRB2上的SH3结构域与鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS结合。EGFR-GRB2-SOS的复合体的形成导致鸟嘌呤核苷酸交换因子的SOS活化，这促进了GDP从Ras移除。GDP移除之后，Ras结合GTP并且成为活化的。

活化之后，Ras结合至并活化RAF激酶(丝氨酸/苏氨酸特异性的蛋白质激酶)的蛋白质激酶活性。之后是蛋白质激酶级联的活化，导致细胞增殖。概括之，RAF激酶之后对MEK(另一丝氨酸/苏氨酸激酶)磷酸化和活化。激活的MEK使得有丝分裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)磷酸化和活化。通过MAPK进一步磷酸化的靶包括40S核糖体蛋白S6激酶(RSK)。MAPK对RSK的磷酸化导致RSK活化，其进而磷酸化核糖体蛋白S6。MAPK的另一已知靶是原癌基因c-Myc，这是对于细胞增殖来说重要的基因，其在多种癌症中突变。MAPK还磷酸化并活化另一蛋白质激酶MNK，其进而磷酸化转化因子CREB。间接地，MAPK还调控Fos基因的转录，Fos基因编码涉及细胞增殖的另一转录因子。通过改变此类转录因子的水平和活性，MAPK将来自EGF的起初的细胞外信号转导为对于细胞周期进程来说重要的基因的改变的转录。

鉴于信号转导通路在细胞生长中扮演的重要角色，很多癌症是因信号转导组分的突变和其它改变(导致细胞增殖通路的异常活化)而产生的也就不出人意外了。例如，EGFR的过表达或过高活性已与大量癌症相关，包括多形性胶质母细胞瘤、结肠癌和肺癌。这已促使了针对EGFR的抗癌治疗剂的发展，包括用于肺癌的吉非替尼和埃罗替尼(erlotinib)和用于结肠癌的西妥昔单抗(cetuximab)。

西妥昔单抗是单克隆抗体抑制剂的例子，其与EGFR的细胞外配体结合结构域结合，由此阻止了活化EGFR酪氨酸激酶的配体的结合。相反，吉非替尼和埃罗替尼是抑制细胞内定位的EGFR酪氨酸激酶的小分子。不存在激酶活性的情况下，EGFR不能在酪氨酸残基处经历自身磷酸化(这是结合下游适体蛋白(例如GRB2)的前提条件)。通过停止生长依赖于该通路的细胞中的信号级联，肿瘤增殖和迁移被减弱。

此外，其它研究已显示，人黑色素瘤中的大约70％和其它肿瘤的较小比例具有Raf基因中的点突变(V599E)，这导致MAPK通路的持续活化(见例如Davies等，Nature，417：949-954(2002))。此类结果表明，特定信号转导通路中的突变可能是特定类型的肿瘤特征性的，并且，此类特别的、改变的信号转导通路可以是化疗介入的有希望的靶标。

鉴于不同癌症治疗(特别是癌症化疗)可通过分别封闭或活化涉及细胞增殖或死亡的细胞信号转导通路来直接或间接地发挥功能，给定信号转导通路在特定癌症形式中的活性可用作为多种癌症治疗效力的良好指示。因此，除了满足其它需求，本发明还提供了预测和评价针对个体患者的潜在抗癌疗法的有效性的方法。由此，本发明提供了辅助医师针对每名患者以正确剂量和正确时间选择合适的癌症疗法的方法。

发明内容

本发明提供了用于检测肿瘤细胞(例如三阴性乳腺肿瘤细胞)中信号转导通路的组分的状况(例如表达和/或活化水平)的组合物和方法。源于本发明的实践的关于信号转导通路的组分的表达和/或活化状态的信息可用于癌症诊断、预后和用于对癌症治疗的设计。

在一些特定的方面，本发明提供了能使得可测定或预测特定癌症是否能应答于或者是否可能有利地应答于一种或更多种抗癌药物的分子标志物(生物标志物)，所述抗癌药物例如贝伐单抗(bevacizumab)

卡铂和紫杉醇(例如或nabP)的组合(“三联疗法”)。如本文所述，已经令人吃惊地发现，生物标志物(例如VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R)特别有用于测定或预测肿瘤细胞(例如三阴性乳腺肿瘤细胞)对抗癌疗法(例如三联疗法)的灵敏性、效力或应答。

在一个方面，本发明提供了用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的方法，所述方法包括：

(a)裂解肿瘤细胞，产生细胞提取物；

(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平相比较，

其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HER1表达的高水平和/或IGF-1R表达的低水平的存在指示肿瘤细胞对抗癌药物敏感。

在一些实施方式中，本发明的方法可用于协助或辅助测定或预测三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性。在其它一些实施方式中，本发明的方法可用于改进对三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的测定或预测。

在另一方面，本发明提供了预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括：

(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，以产生细胞提取物；

(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平相比较，

其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HER1表达的高水平和/或IGF-1R表达的低水平的存在预示对使用抗癌药物的疗法的应答。

在一些实施方式中，本发明的方法可用于协助或辅助测定或预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答。在其它一些实施方式中，本发明的方法可用于改进对三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的测定或预测。

在另一方面，本发明提供了用于监测具有三阴性乳腺肿瘤并接受抗癌药物的受试者中对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括：

(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，产生细胞提取物；

(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平或与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R在疗法期间较早时间的表达水平相比较；以及

(d)基于步骤(c)中的比较确定是否应当继续或调节使用抗癌药物的疗法。

在一些实施方式中，本发明的方法可用于协助或辅助监测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答。在其它一些实施方式中，本发明的方法可用于改进对三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的监测。在某些实施方式中，步骤(d)中对疗法的调节包括改变抗癌药物的之后剂量或选择备选抗癌药物。

本发明的其它目的、特征和优点对于本领域技术人员而言根据以下详细描述和图将是显而易见的。

附图简述

图1显示了用于分析总的和经磷酸化的HER1和HER2水平的示例性玻片形式(slide formats)的阵列设计。

图2显示了用于检测磷酸化的HER1的示例性接近检验(proximity assay)的示意图。GO，葡糖氧化酶；HRP，辣根过氧化物酶。

图3显示了协同酶增强反应性免疫检(Collaborative EnzymeEnhanced Reactive ImmunoAssay，CEER)的示意图，其也被称为协同接近免疫检验(COllaborative Proximity ImmunoAssay，COPIA)。当与细胞裂解物孵育之后，靶蛋白与硝酸纤维素表面印制的特异性捕获抗体结合时，未结合的非靶蛋白从玻片上被移除。针对被捕获的靶蛋白上备选表位的检测抗体之一与GO缀合。另外的与HRP缀合的检测抗体的结合完成了免疫复合体的形成，所述检测抗体特异于靶蛋白上磷酸化位点(P)或另外的非重叠表位(p)，所述免疫复合体是信号产生和随后存在葡萄糖时酪胺介导的经由GO-HRP酶通道的信号扩增所必需的。选择捕获和检测抗体以最小化它们之间的竞争(即，所有抗体可同时结合信号转导蛋白上它们的相应表位)。

图4显示了针对ERBB2-T和ERBB2-P从CEER产生的滴定曲线。这些值被用作为标准以产生针对临床样品的定量值。

图5显示了对BT474细胞中t-ERBB2的测定。使用从BT474细胞制备的细胞裂解物进行ERBB2-CEER检验。从含有～25个BT474细胞的裂解物测定全长p185-ERBB2检验，通过分析免疫磁性移除p185-ERBB2后从～250个BT474细胞制备的细胞裂解物，测定t-ERBB2的水平。

图6显示了t-ERBB2在患者肿瘤中的表达和磷酸化。ERBB2、t-ERBB2、磷酸化的t-ERBB2。阵列构型被示出。CEER不仅允许对临床样品中全长和截短的ERBB2表达的区分，还以定量方式提供了对磷酸化水平的有价值信息。

图7显示了针对临床样品的针对ERBB2的示例性IP-Western。抗-ICD-ERBB2抗体被用于免疫沉淀ERBB2受体，以及使用第二抗-ICD-ERBB2抗体进行随后的Western杂交印迹分析，以将全长t-ERBB2与全长p185-ERBB2区分开。

图8显示观察到174BCA样品中宽范围的通路蛋白表达和活化。

图9显示了较之对照T47D乳腺癌细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)而言在三阴性乳腺癌核心活检样品上通过CEER描绘的功能性通路谱的例子。

图10显示了针对每种标志物针对低和高的样品组在无进展生存期(Progression Free Survival，PFS)之间的比较的结果。

图11显示了针对每种标志物针对低和高样品组在PFS之间的另一比较的结果。

图12显示测量c-KIT和VEGFR2两者的表达水平增加了在TNMBC中测定对三联疗法的应答的预示价值。

图13显示测量VEGFR2和HER1两者的表达水平增加了在TNMBC中测定对三联疗法的应答的预示价值。

图14显示了(A)总VEGFR2、(B)总c-KIT和(C)总HER1的增加的水平和对三联疗法的应答之间的关联。

就所有目的而言，来自PCT公开No.WO 2010/132723的图和表通过引用以其整体并入本文。

发明详述

I.导论

如上文所述，涉及细胞增殖的信号转导通路的活化和涉及细胞死亡的途径的去活化是表征很多不同类型癌症的分子特征的非限制性例子。在很多情况下，特定信号转导通路及其组分的活性可用作为给定类型的癌症的分子标识。此类活化的组分可进一步提供用于治疗性介入的有用靶标。因此，在治疗之前、期间和之后了解癌细胞内特定信号转导系统的活性水平为医师提供了可用于选择采用的适当疗程的高度相关的信息。此外，随治疗进程对在癌细胞中有活性的信号转导通路的持续监测可为医师提供关于治疗效力的额外信息，促使医师继续特定疗程或转向另外的治疗方向，例如当癌细胞通过活化相同或另外的信号转导通路的其它异常而对治疗已呈耐药性时。

因此，本发明提供了用于在特异性的、多重、高通量检验中检测一种或多种去调控的(deregulated)信号转导分子在肿瘤组织或肿瘤外细胞(例如实体瘤的稀少的循环细胞)中的表达和/或活化状态的方法和组合物。本发明还提供了用于选择用以下调或关闭去调控的信号通路的适当疗法(单一药物或药物组合)的方法和组合物。因此，本发明可用于帮助设计用于癌症患者的个性化疗法。

在某些实施方式中，通过在单一细胞的水平上测定信号转导通路的活性来检测和鉴定循环中肿瘤细胞的能力是本发明的重要优点。在多种癌症早期阶段的患者血液中经常发现为“微转移灶(micrometastases)”(弥散肿瘤细胞)的肿瘤细胞，肿瘤细胞也被发现于转移性癌中。血液中肿瘤细胞的数目将取决于肿瘤的阶段和类型。典型地在原发肿瘤上获得活检，而大多数转移性肿瘤没有被活检，使得对此类肿瘤样品的分子学分析非常困难。在肿瘤转移期间，最具侵略性的肿瘤细胞离开原发肿瘤，移动经过血液和淋巴系统，到达远处。因此，来自血液的循环中的肿瘤细胞代表了肿瘤细胞的最具侵略性和纯系的群体。但是，血液中转移性肿瘤细胞的数目经常非常低，在每毫升血中以一至数千个细胞间变动。在此类稀少的细胞中分离和检验信号转导通路的能力以及将该信息应用至更有效的癌症治疗的能力是本发明的一个目的。

在一些特定的实施方式中，本发明的多重、高通量免疫检验(例如协同酶增强反应性免疫检验(CEER)，也被称为协同接近免疫检验(COPIA))可以在单个细胞水平上检测从肿瘤组织(例如FNA样品)获得的细胞中或实体瘤的在循环中细胞中一种或更多种信号转导分子的表达和/或活化水平。事实上，可以以大约10^-19摩尔(100zeptomoles)的灵敏性以及大约10^-19摩尔(100zeptomoles)至大约10^-13摩尔(100femtomoles)的线性动态范围，检测信号转导分子(例如EGFR)。由此，对肿瘤细胞中一种或多种信号转导子表达和/或活化水平的单个细胞检测有利于癌症预后和诊断，以及对个性化靶标疗法的设计。

关于乳腺癌，目前的测试选项不令人满意，因为在乳腺癌患者中对原发和转移性肿瘤的治疗基于从疾病早期阶段采集的活检样品所进行的一次性诊断。特别地，针对乳腺癌早期和转移阶段的治疗性介入单纯基于疾病早期阶段采集的活检样品的最初诊断，因为从转移性的癌症患者获得活检样品是不切实际的。但是，乳腺肿瘤作为时间和治疗的函数改变，使得对乳腺肿瘤的时间性监测对于乳腺癌患者的最优管理来说非常关键。例如，受体酪氨酸激酶的ErbB(HER)家族中的一种或更多种的活化状态的变化可影响复发时的疗法选择。事实上，原发和转移性癌之间HER-2状况的不一致性是常见的，因为全部乳腺癌患者中可以有多达37％从HER-2阴性原发肿瘤变为HER-2阳性转移癌。此外，患者可由于HER-1和/或HER-2活化而具有对激素疗法的原发性(de novo)耐药性或发展出对激素疗法的获得性耐药性。在一些情况下，患者可由于存在表达p95HER-2的肿瘤细胞而具有对靶向ErbB的疗法的原发性耐药性或发展出对靶向ErbB的疗法的获得性耐药性。结果，对于用于辅助临床医师在适当的时间开适当癌症疗法的处方的检验存在尚未满足的临床需求，因为目前的技术缺乏灵敏性和特异性，不能用于监测接受疗法的患者，并且没有利用通路谱，以指导个体化的治疗决定。

与目前可获得的乳腺癌测试选项相反，本发明的方法使得能在疾病的所有阶段监测乳腺癌患者，这通过使用来自肿瘤和/或来自血液的循环中的肿瘤细胞(CTC)的样品例如细针抽吸物(FNA)提供实体乳腺肿瘤的“实时活检”来实现。作为非限制性的例子，本文描述的乳腺癌检验可在疾病早期阶段在患者中进行乳腺癌的最初诊断。通过使用本文描述的单项检测和接近双重检测检验(例如CEER)，描绘使用或不使用抗癌药物时一种或更多种特别的信号通路的表达和/或活化水平，来指导对合适的癌症疗法的选择。有利地，本发明的方法还可用于监测疾病的进程和/或衰退，因为治疗性介入可基于在疾病的任何阶段采集的样品，并可使用本文描述的单项检测和接近双重检测检验(例如CEER)对其加以分析。由此，对用于乳腺癌的早期和转移阶段的合适癌症疗法的预测、鉴定和/或选择由特别的信号通路分子的表达和/或活化状况的分析和实时诊断来指导。

本发明的方法可有益地被定制，以解决癌症管理中的关键问题，并且为乳腺癌患者(例如三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)患者)提供更高标准的护理，因为它们：(1)提供了增加的灵敏性(例如可实现单个细胞检测，以检测总的和/或磷酸化的信号转导分子，例如HER1(EGFR)、VEGFR2和/或c-KIT)；(2)提供了增加的特异性(例如，三抗体接近检验增强了用于检测总的和/或磷酸化的信号转导分子的特异性)；(3)使得能进行通路描绘(例如可在来自患者的FNA或CTC中检测一种或更多种特别的信号转导分子的表达和/或活化状态)；以及(4)消除了关于获得患者样品的任何问题(例如，检验可在数个肿瘤细胞上进行)。虽然在本文描述的新颖的检验中可使用任何样品，但是CTC是特别有用的，因为它们代表着最具有侵略性的肿瘤细胞，每种肿瘤都已知会释放CTC，它们可能是残余肿瘤或难于接近的转移性肿瘤的唯一来源，并且它们可被发现于血液中。由此，在某些实施方式中，本发明的方法使得能对乳腺肿瘤组织进行依序采样，产生作为时间和疗法函数的、在肿瘤细胞中发生的变化的有价值的信息，并且为临床医师提供监测迅速进化中的癌症通路标识的手段。

总结之，本发明的方法通过使用多重、基于抗体的单项检测或接近检验，在肿瘤细胞上进行通路描绘，有利地提供了对最可能受益于靶向疗法的癌症患者(例如TNMBC患者)的精确选择和监测。

II.定义

除非另有指明，在本文中使用时，下述术语具有归于它们的含义。

术语“癌症”意欲包括特征在于异常细胞不受控制的生长的疾病类别的任何成员。该术语包括所有已知的癌症和赘生物病况，无论是被表征为恶性、良性、软组织或实体的，以及所有阶段和级别的癌症，包括转移前和转移后的癌症。不同类型的癌症的例子包括但不限于，乳腺癌；肺癌(例如非小细胞肺癌)；消化道和肠胃癌症，例如结直肠癌、胃肠道间质肿瘤、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和胃(stomach，也作gastric)癌；食道癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；卵巢癌；肾癌(例如肾细胞癌)；中枢神经系统的癌症；皮肤癌；淋巴瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨原性肉瘤和血癌。在本文中使用时，“肿瘤”包含一种或更多种癌性细胞。在一种优选的实施方式中，乳腺肿瘤源于具有侵入性或原位形式的乳腺管癌和小叶癌的受试者。在另一优选的实施方式中，乳腺肿瘤源于具有复发性或转移性乳腺癌的受试者。

术语“分析物”包括其存在、量(表达水平)、活化状态和/或身份被测定的感兴趣的任何分子，典型地是大分子，例如多肽。在某些情况下，分析物是信号转导分子，例如HER1(EGFR)、VEGFR2或c-KIT。

术语“信号转导分子”或“信号转导子”包括进行下述过程的蛋白质和其它分子，通过所述过程，细胞将细胞外信号或刺激转化为应答，典型地，涉及细胞中生物化学反应的既定顺序。信号转导分子的例子包括但不限于：受体酪氨酸激酶，例如，EGFR(例如EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)，VEGFR1/FLT1，VEGFR2/FLK1/KDR，VEGFR3/FLT4，FLT3/FLK2，PDGFR(例如PDGFRA、PDGFRB)，c-KIT/SCFR，INSR(胰岛素受体)，IGF-IR，IGF-IIR，IRR(胰岛素受体相关的受体)，CSF-1R，FGFR 1-4，HGFR 1-2，CCK4，TRK A-C，c-MET，RON，EPHA 1-8，EPHB 1-6，AXL，MER，TYRO3，TIE 1-2，TEK，RYK，DDR 1-2，RET，c-ROS，V-钙粘蛋白，LTK(白细胞酪氨酸激酶)，ALK(间变型淋巴瘤激酶)，ROR 1-2，MUSK，AATYK 1-3和RTK 106；受体酪氨酸激酶的截短形式，例如没有氨基末端细胞外结构域的截短的HER2受体(例如p95ErbB2(p95m)、p110、p95c、p95n等等)；受体酪氨酸激酶二体(例如p95HER2/HER3、p95HER2/HER2、HER2/HER2、HER2/HER3、HER1/HER2、HER2/HER3、HER2/HER4等等)；非受体酪氨酸激酶，例如BCR-ABL，Src，Frk，Btk，Csk，Abl，Zap70，Fes/Fps，Fak，Jak，Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号级联组分，例如AKT(例如AKT1、AKT2、AKT3)，MEK(MAP2K1)，ERK2(MAPK1)，ERK1(MAPK3)，PI3K(例如PIK3CA(p110)，PIK3R1(p85))，PDK1，PDK2，磷酸酶和张力蛋白同源体(PTEN)，SGK3，4E-BP1，P70S6K(例如p70S6激酶剪接变体αI)，蛋白酪氨酸磷酸酶(例如PTP1B、PTPN13、BDP1等等)，RAF，PLA2，MEKK，JNKK，JNK，p38，Shc(p66)，Ras(例如K-Ras，N-Ras，H-Ras)，Rho，Rac1，Cdc42，PLC，PKC，p53，细胞周期蛋白D1，STAT1，STAT3，磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)，磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，mTOR，BAD，p21，p27，ROCK，IP3，TSP-1，NOS，GSK-3β，RSK 1-3，JNK，c-Jun，Rb，CREB，Ki67和桩蛋白(paxillin)；核激素受体，例如雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，雄激素受体，糖皮质激素受体，盐质皮激素受体，维生素A受体，维生素D受体，类维生素A受体，甲状腺激素受体和孤儿受体(orphan receptors)；核受体共活化因子和阻遏因子，例如分别在乳腺癌-1(AIB1)和核受体共阻遏因子1(NCOR)中扩增的；以及它们的组合。

术语“活化状态”指特定信号转导分子是否被活化。类似地，术语“活化水平”指特定信号转导分子被活化的程度。活化状态或水平典型地对应于一种或更多种(例如多种)信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合化的状态或水平。活化状态的非限制性例子(括号中列出的)包括：HER1/EGFR(EGFRvIII，磷酸化的(p-)EGFR，EGFR：Shc，泛素化的(u-)EGFR，p-EGFRvIII)；ErbB2(p-ErbB2，p95HER2(截短的ErbB2)，p-p95HER2，ErbB2：Shc，ErbB2：PI3K，ErbB2：EGFR，ErbB2：ErbB3，ErbB2：ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3，ErbB3：PI3K，p-ErbB3：PI3K，ErbB3：Shc)；ErbB4(p-ErbB4，ErbB4：Shc)；c-MET(p-c-MET，c-Met：HGF复合体)；AKT1(p-AKT1)；AKT2(p-AKT2)；AKT3(p-AKT3)；PTEN(p-PTEN)；P70S6K(p-P70S6K)；MEK(p-MEK)；ERK1(p-ERK1)；ERK2(p-ERK2)；PDK1(p-PDK1)；PDK2(p-PDK2)；SGK3(p-SGK3)；4E-BP1(p-4E-BP1)；PIK3R1(p-PIK3R1)；c-KIT(p-c-KIT)；ER(p-ER)；IGF-1R(p-IGF-1R，IGF-1R：IRS，IRS：PI3K，p-IRS，IGF-1R：PI3K)；INSR(p-INSR)；FLT3(p-FLT3)；HGFR1(p-HGFR1)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRA(p-PDGFRA)；PDGFRB(p-PDGFRB)；VEGFR1(p-VEGFR1，VEGFR1：PLCγ，VEGFR1：Src)；VEGFR2(p-VEGFR2，VEGFR2：PLCγ，VEGFR2：Src，VEGFR2：硫酸肝素，VEGFR2：VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；TIEl(p-TIEl)；TIE2(p-TIE2)；EPHA(p-EPHA)；EPHB(p-EPHB)；GSK-3β(p-GSK-3β)；NFKB(p-NFKB)，IKB(p-IKB，p-P65：IKB)；BAD(p-BAD，BAD：14-3-3)；mTOR(p-mTOR)；Rsk-1(p-Rsk-1)；Jnk(p-Jnk)；P38(p-P38)；STAT1(p-STAT1)；STAT3(p-STAT3)；FAK(p-FAK)；RB(p-RB)；Ki67；p53(p-p53)；CREB(p-CREB)；c-Jun(p-c-Jun)；c-Src(p-c-Src)；桩蛋白(p-桩蛋白)；GRB2(p-GRB2)，Shc(p-Shc)，Ras(p-Ras)，GAB1(p-GAB1)，SHP2(p-SHP2)，GRB2(p-GRB2)，CRKL(p-CRKL)，PLCγ(p-PLCγ)，PKC(例如p-PKCα，p-PKCβ，p-PKCδ)，内收蛋白(p-内收蛋白)，RB1(p-RB1)和PYK2(p-PYK2)。

在本文中使用时，术语“稀释系列”意欲包括特定样品(例如细胞裂解物)或试剂(例如抗体)的一系列递减浓度。稀释系列典型地通过下述过程产生：将经测量的量的起始浓度的样品或试剂与稀释剂(例如稀释缓冲液)混合，以产生更低浓度的样品或试剂，以及重复该过程足够的次数以获得合意的数目的系列稀释液。样品或试剂可以被稀释至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500或1000倍，以产生包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50种递减浓度的样品或试剂的稀释系列。例如，包含起始浓度为1mg/ml的捕获抗体试剂的2倍系列稀释液的稀释系列可通过下述过程来产生：将一定量的起始浓度的捕获抗体与等量的稀释缓冲液混合，以产生0.5mg/ml浓度的捕获抗体，以及重复该过程，以获得0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0325mg/ml等等的捕获抗体浓度。

术语“优越动态范围(superior dynamic range)”在本文中使用时指用于在少至一个细胞或在多至数千细胞中检测具体待分析物的检验的能力。例如，本文描述的免疫检验具有优越动态范围，因为它们有利地使用捕获抗体浓缩物的稀释系列在大约1-10,000个细胞(例如大约1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500或10,000个细胞)中检测目的特定信号转导分子。

术语“样品”在本文中使用时包括从患者获得的任何生物样本。样品包括但不限于全血、血浆、血清、血红细胞、白细胞(例如外周血单核细胞)、导管灌洗液(ductal lavage fluid)、乳头抽吸物、淋巴(例如淋巴结的弥散肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿、大便(即粪便)、痰、支气管灌洗液、泪液、细针抽吸物(例如通过随机乳晕细针抽吸物收获的)，任何其它体液，组织样品(例如肿瘤组织)例如肿瘤(例如针吸活检)或淋巴结(例如前哨淋巴结活检)的活检，组织样品(例如肿瘤组织)例如肿瘤的手术切除，以及它们的细胞提取物。在一些实施方式中，样品是全血或其级分，例如血浆、血清或细胞沉淀团。在某些情况下，样品是通过使用本领域已知的任何技术将实体瘤的循环中细胞与全血或其细胞级分分离来获得的。在其它一些实施方式中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织样品，例如来自乳腺实体瘤的。

“活检”指移出组织样品以用于诊断或预后评价的过程，以及指组织样本本身。本领域中已知的任何活检技术都可用于本发明的方法和组合物。应用的活检技术将通常取决于待评价的组织类型以及肿瘤的尺寸和类型(即，实体或悬浮的(即血或腹水))，其它因素等等。代表性的活检技术包括切除活检(excisional biopsy)、切口活检(incisional biopsy)、针吸活检(例如，核心针吸活检、细针抽吸物活检等等)、手术活检以及骨髓活检。活检技术被例如讨论于Harrison’s Principles of InternalMedicine，Kasper等编著，第16次编辑，2005，第70章以及部分V通篇中。本领域技术人员将知道，可进行活检技术来在给定的组织样品中鉴定癌和/或前癌细胞。

在本文中使用时，术语“循环中细胞”包含已从实体瘤转移或微转移的肿瘤外细胞。循环中细胞的例子包括但不限于：循环中的肿瘤细胞、癌干细胞和/或迁移至肿瘤的细胞(例如循环中的内皮祖细胞、循环中的内皮细胞、循环中的前血管形成髓样细胞(circulating pro-angiogenicmyeloid cells)、循环中的树突细胞等等)。含有循环中细胞的患者样品可从任何可取得的生物液体(例如全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物等等)获得。在某些情况下，全血样品被分离为血浆或血清级分以及细胞级分(即，细胞沉淀团)。细胞级分典型地含有血红细胞、白细胞以及实体瘤的循环中细胞，例如循环中的肿瘤细胞(CTC)、循环中的内皮细胞(CEC)、循环中的内皮祖细胞(CEPC)、癌干细胞(CSC)、淋巴结的弥散肿瘤细胞及它们的组合。此外，血浆或血清级分通常含有实体瘤的循环中细胞释放的蛋白质和核酸(例如DNA、RNA)。

循环中细胞典型地是使用一种或更多种分离方法从患者样品分离的，例如免疫磁性分离(见例如Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：4589-4594(1998)；Bilkenroth等，Int.J.Cancer，92：577-582(2001))，

System by Immunicon(Huntingdon Valley，PA)，微流体分离(见例如Mohamed等，IEEE Trans.Nanobiosci.，3：251-256(2004)；Lin等，Abstract No.5147，97th AACR Annual Meeting，Washington，D.C.(2006))，FACS(见例如Mancuso等，Blood，97：3658-3661(2001))，密度梯度离心(见例如Baker等，Clin.Cancer Res.，13：4865-4871(2003))和消耗法(见例如Meye等，Int.J.Oncol.，21：521-530(2002))。

目的信号转导分子典型地是在循环中细胞被分离之后短时间内提取的以维持它们的原位活化状态，优选地，在大约24、6或1小时内，以及更优选地，大约30、15或5分钟内。分离的细胞还可与一种或更多种生长因子(通常以纳摩尔至微摩尔浓度)一起孵育大约1-30分钟，以复苏或刺激信号转导分子的活化(见例如Irish等，Cell，118：217-228(2004))。例如，为针对个体患者评价潜在抗癌疗法，可将分离的细胞与浓度变动的一种或更多种抗癌药物一起孵育。然后可进行数分钟(例如大约1-5分钟)或若干小时(例如大约1-6小时)的生长因子刺激。有或没有抗癌药物的信号通路的差异性活化协助针对每个个体患者选择正确剂量的合适的癌症疗法。还可在抗癌药物治疗期间从患者样品分离循环中的细胞，以及可用一种或更多种生长因子对其加以刺激，以测定是否应当执行疗法变化。

术语“受试者”或“患者”或“个体”典型地包括人，但还包括其它动物，例如，其它灵长类、啮齿类、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊、猪等等。

“阵列”或“微阵列”包含被固定于或被限制制于固体支持物上的捕获抗体的有区别的组和/或稀释系列，所述支持物例如是玻璃(例如玻片)、塑料、芯片、别针(pin)、滤器、珠粒(例如磁性珠粒、聚苯乙烯珠粒等等)、纸、膜(例如尼龙、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)等等)、纤维束或者任何其它合适底物。捕获抗体通常通过共价或非共价相互作用(例如离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)被固定于或被限制于固体支持物上。在某些情况下，捕获抗体包含与固体支持物上结合的捕获剂相互作用的捕获标签。用于本文描述的检验中的阵列典型地包含多种不同的捕获抗体和/或捕获抗体浓度，它们在不同的已知/可寻址的位置与固体支持物表面偶联。

术语“捕获抗体”意欲包括被固定的、特异于(即，与......结合、被......结合或与......形成复合体)样品(例如细胞提取物)中一种或更多种目的分析物的抗体。在一些特定的实施方式中，捕获抗体被限制于阵列中的固体支持物上。用于在固体支持物上固定多种信号转导分子中的任何的合适的捕获抗体可从Upstate(Temecula，CA)、Biosource(Camarillo，CA)、Cell Signaling Technologies(Danvers，MA)、R&DSystems(Minneapolis，MN)、Lab Vision(Fremont，CA)、Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA)、Sigma(St.Louis，MO)和BD Biosciences(San Jose，CA)获得。

术语“检测抗体”在本文中使用时包括下述抗体，所述抗体包含可检测标记的特异于(即，与......结合、被......结合或与......形成复合体)样品中一种或更多种目的分析物。该术语还包括特异于一种或更多种目的分析物的抗体，其中所述抗体可被包含可检测标记的另外的种类结合。可检测标记的例子包括但不限于，生物素/链霉抗生物素标记，核酸(例如寡核苷酸)标记，化学反应性标记，荧光标记，酶标记，放射活性标记以及它们的组合。用于检测多种信号转导分子中的任何的活化状态和/或总量的合适的检测抗体可从Upstate(Temecula，CA)、Biosource(Camarillo，CA)、Cell Signaling Technologies(Danvers，MA)、R&D Systems(Minneapolis，MN)、Lab Vision(Fremont，CA)、Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA)、Sigma(St.Louis，MO)和BD Biosciences(San Jose，CA)获得。作为非限制性的例子，针对信号转导分子(例如EGFR，c-KIT，c-Src，FLK-1，PDGFRA，PDGFRB，AKT，MAPK，PTEN，Raf和MEK)的多种磷酸化形式的磷特异性抗体，可从Santa CruzBiotechnology获得。

术语“活化状态依赖性抗体”包括特异于(即，与......结合、被......结合或与......形成复合体)样品中一种或更多种目的分析物的特定活化状态的检测抗体。在一些优选的实施方式中，活化状态依赖性抗体检测一种或更多种分析物(例如一种或更多种信号转导分子)的磷酸化、泛素化和/或复合化。在一些实施方式中，受体酪氨酸激酶的EGFR家族的成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间异源二聚复合体的形成是使用活化状态依赖性抗体来检测的。在一些特定的实施方式中，活化状态依赖性抗体可用于检测一种或更多种下述信号转导分子中磷酸化的一个或更多个位点(磷酸化位点对应于人蛋白质序列中氨基酸的位置)：EGFR/HER1/ErbB1(例如酪氨酸(Y)1068)；ErbB2/HER2(例如Y1248)；ErbB3/HER3(例如Y1289)；ErbB4/HER4(例如Y1284)；c-Met(例如Y1003、Y1230、Y1234、Y1235和/或Y1349)；SGK3(例如苏氨酸(T)256和/或丝氨酸(S)422)；4E-BP1(例如T70)；ERK1(例如T185、Y187、T202和/或Y204)；ERK2(例如T185、Y187、T202和/或Y204)；MEK(例如S217和/或S221)；PIK3R1(例如Y688)；PDK1(例如S241)；P70S6K(例如T229、T389和/或S421)；PTEN(例如S380)；AKT1(例如S473和/或T308)；AKT2(例如S474和/或T309)；AKT3(例如S472和/或T305)；GSK-3β(例如S9)；NFKB(例如S536)；IKB(例如S32)；BAD(例如S112和/或S136)；mTOR(例如S2448)；Rsk-1(例如T357和/或S363)；Jnk(例如T183和/或Y185)；P38(例如T180和/或Y182)；STAT3(例如Y705和/或S727)；FAK(例如Y397、Y576、S722、Y861和/或S910)；RB(例如S249、T252、S612和/或S780)；RB1(例如S780)；内收蛋白(例如S662和/或S724)；PYK2(例如Y402和/或Y881)；PKCα(例如S657)；PKCα/β(例如T368和/或T641)；PKCδ(例如T505)；p53(例如S392和/或S20)；CREB(例如S133)；c-Jun(例如S63)；c-Src(例如Y416)；和桩蛋白(例如Y31和/或Y118)。

术语“不依赖活化状态的抗体”包括以与它们的活化状态无关的方式特异于(即，与......结合、被......结合或与......形成复合体)样品中一种或更多种目的待分析物的检测抗体。例如，不依赖活化状态的抗体可检测一种或更多种待分析物(例如一种或更多种信号转导分子)的磷酸化和非磷酸化形式二者。

术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在和非天然存在的，并且其具有与参照核酸相似的结合性质。此类类似物的例子包括但不限于，硫代磷酸、磷酰胺盐/酯、甲基膦酸、手性-甲基膦酸、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。除非有明确限制，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合性质。除非另有指示，特定核酸序列无疑还包括其经保守修饰的变体和互补序列以及明确示出的序列。

术语“寡核苷酸”包括RNA、DNA、RNA/DNA杂交体的单链寡聚物或多聚物，和/或其模拟物。在某些情况下，寡核苷酸由天然存在(即未经修饰的)核苷碱基、糖和核苷间(主链)连接构成。在某些其它情况下，寡核苷酸包含经修饰的核苷碱基、糖和/或核苷间连接。

在本文中使用时，术语“错配基序”或“错配区域”指寡核苷酸与其互补序列不具有100％互补性的部分。寡核苷酸可具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个错配区域。错配区域可以是连续的，或者可以被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸分开。错配基序或区域可包含单个核苷酸或可包含两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸。

短语“严格杂交条件”指下述条件，在所述条件下，寡核苷酸与其互补序列杂交而不与其它序列杂交。杂交条件是序列依赖性的，并且将在不同情况下有所不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导见Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。通常，严格条件被选择为比在定义的离子强度pH下针对具体序列的热熔点(T_m)低大约5-10℃。T_m是这样的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度时，与靶互补的探针的50％在平衡下与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，在T_m时，探针的50％在平衡下被占据)。还可添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现严格条件。关于选择性或特异性杂交，阳性信号是至少两倍的背景，优选地，是10倍背景杂交。

术语“实质相同”或“实质同一性”在两条或更多条核酸的上下文中指：当使用序列比较算法或通过人工比对和视觉检查，在比较窗或指定的区域上，针对最大的对应性进行比较和比对时，相同的或具有指出的相同核苷酸百分比(即，在指出的区域上至少大约60％，优选至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)的两条或更多条序列或亚序列。当下文中指出时，该定义还类似地指序列的互补序列。优选地，优选地，在长度为至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸的区域上存在实质同一性。

术语“孵育”与“接触”和“暴露”同义使用，并且不暗示任何特别的时间或温度要求，除非另有指示。

“受体酪氨酸激酶”或“RTK”包括特征在于跨膜结构域和酪氨酸激酶基序的五十六(56)种蛋白质的家族。RTK在细胞信号中发挥功能，并且传送调控生长、分化、粘附、迁移和凋亡的信号。受体酪氨酸激酶的突变性活化和/或过表达使细胞变形，并且在癌症的发育中具有决定性的作用。RTK已经成为了多种分子靶向型药剂(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗、吉非替尼、埃罗替尼、舒尼替尼(sunitinib)、伊马替尼(imatinib)、尼罗替尼(nilotinib)等等)的靶标。一种被良好表征的信号转导通路是MAP激酶通路，其在细胞中负责转导来自表皮生长因子(EGF)的信号，以促进细胞增殖。

术语“无进展生存期”或“PFS”包括在疾病(例如癌症)治疗期间和之后的时间长度，其间患者带病生活，但没有疾病的额外症状。

术语“三阴性”在本发明上下文中包括肿瘤细胞(例如循环中的肿瘤细胞)、肿瘤或癌症，例如三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)，其中没有可检测到的雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或人表皮生长因子受体2(HER2)的表达。

III.对实施方式的描述

本发明提供了使用检验例如如本文所描述的特异性的、多重、高通量接近检验来检测源于肿瘤组织的肿瘤细胞或实体肿瘤的循环中细胞中信号转导通路的组分的状况(例如表达和/或活化水平)的方法。本发明还提供了选择适当的疗法来下调一种或更多种去调控的信号转导通路的方法。因此，本发明的某些实施方式可用于帮助设计个性化的疗法，这基于通过给定患者的肿瘤(例如三阴性乳腺肿瘤)中总的和/或活化的信号转导蛋白质的集合提供的特定分子标识来设计。

在一些特定的方面，本发明提供了能使得测定或预测特定癌症是否能应答于或者是否可能有利地于应答于一种或更多种抗癌药物的分子标志物(生物标志物)，所述药物例如是贝伐单抗

卡铂和紫杉醇(例如

或nabP)的组合(“三联疗法”))。在一些特别的实施方式中，测量VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R中至少一种、两种或更多种(例如全部)的表达和/或活化的水平特别用于选择合适的抗癌药物和/或鉴定或预测细胞(例如三阴性肿瘤细胞)中的疗效或对其的应答。

在一个方面，本发明提供了用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的方法，所述方法包括：

(a)裂解肿瘤细胞，产生细胞提取物；

(b)测定细胞提取物中选自VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R构成的组的一种或更多种待分析物的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平相比较，

其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HER1表达的高水平和/或IGF-1R表达的低水平的存在指示肿瘤细胞对抗癌药物敏感。

在一些实施方式中，较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的中等至高水平、c-KIT表达的中等至高水平、HER1表达的低至中等水平和/或IGF-1R表达的中等至高水平的存在指示肿瘤细胞对抗癌药物有耐药性。在一种特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和c-KIT、基本由VEGFR2和c-KIT构成、或由VEGFR2和c-KIT构成的待分析物组合的表达水平。在另一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和HER1、基本由VEGFR2和HER1构成、或由VEGFR2和HER1构成的待分析物组合的表达水平。在又一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2、c-KIT和HER1，基本由VEGFR2、c-KIT和HER1构成，或由VEGFR2、c-KIT和HER1构成的待分析物组合的表达水平。在还一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R，基本由VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R构成，或由VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R构成的待分析物组合的表达水平。在某些实施方式中，本发明的方法还包括在细胞提取物中测定VEGFR2、c-KIT、HER1、IGF-1R和/或AKT中至少一种、两种或更多种(例如全部)的活化水平。在其它一些情况下，所述方法还包括在步骤(a)之前将肿瘤细胞与抗癌药物进行接触。

在其它一些实施方式中，肿瘤细胞是乳腺癌细胞。在某些情况下，肿瘤细胞是从肿瘤(例如三阴性乳腺肿瘤)获得或从获得自体液样品的循环中的肿瘤细胞(CTC)获得的细针抽吸物(FNA)细胞。肿瘤细胞典型地分离自下述样品，所述样品包括全血、血清、血浆或肿瘤组织。在一些特定的实施方式中，样品获得自具有三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)的受试者。

在另一方面，本发明提供了预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括：

(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，产生细胞提取物；

(b)测定细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平相比较，

其中较之参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HER1表达的高水平和/或IGF-1R表达的低水平的存在预示对使用抗癌药物的疗法的应答。

在一些实施方式中，细胞提取物中VEGFR2表达的中等至高水平、c-KIT表达的中等至高水平、HER1表达的低至中等水平和/或IGF-1R表达的中等至高水平的存在预示缺乏对使用抗癌药物的疗法的应答。在一种特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和c-KIT、基本由VEGFR2和c-KIT构成、或由VEGFR2和c-KIT构成的待分析物组合的表达水平。在另一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2和HER1、基本由VEGFR2和HER1构成、或由VEGFR2和HER1构成的待分析物组合的表达水平。在又一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2、c-KIT和HER1，基本由VEGFR2、c-KIT和HER1构成，或由VEGFR2、c-KIT和HER1构成的待分析物组合的表达水平。在还一特定的实施方式中，所述方法包括在细胞提取物中测定包含VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R，基本由VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R构成，或由VEGFR2、c-KIT、HER1和IGF-1R构成的待分析物组合的表达水平。在某些实施方式中，本发明的方法还包括在细胞提取物中测定VEGFR2、c-KIT、HER1、IGF-1R和/或AKT中至少一种、两种或更多种(例如全部)的活化水平。在其它一些情况下，所述方法还包括在步骤(a)之前将来自三阴性乳腺肿瘤的肿瘤细胞与抗癌药物进行接触。

在其它一些实施方式中，肿瘤细胞是从肿瘤(例如三阴性乳腺肿瘤)获得或从获得自体液样品的循环中的肿瘤细胞(CTC)获得的细针抽吸物(FNA)细胞。肿瘤细胞典型地分离自下述样品，所述样品包括全血、血清、血浆或肿瘤组织。在一些特定的实施方式中，样品获得自具有三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)的受试者。

在一些情况下，VEGFR2表达的低水平的存在预示更长期的无进展生存期(PFS)。在其它一些情况下，c-KIT表达的低水平的存在预示更长期的PFS。在另一些情况下，HER1表达的高水平的存在预示更长期的PFS。在还一些情况下，IGF-1R表达的低水平的存在预示更长期的PFS。在一些特定的情况下，VEGFR2表达的低水平的存在组合c-KIT表达的低水平和/或HER1表达的高水平的存在预示更长期的PFS(较之VEGFR2、c-KIT或HER1单独的表达水平而言)。

在某些实施方式中，本发明的方法(例如，用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性和用于预测三阴性乳腺肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的应答的方法)还可包含步骤(d)：将在步骤(c)中获得的比较结果以可读形式提供给使用者(例如，临床医师，例如肿瘤学家，或普通医师)。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括将在步骤(c)中获得的比较结果发送或报告给临床医师，例如肿瘤学家或普通医师。在其它一些情况下，本发明的方法还可包括将步骤(c)中获得的比较结果记录或储存于计算机数据库或其它合适的机器或设备中，用于储存信息，例如在实验室中。

在一些特定的实施方式中，VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平是通过检测VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的总蛋白质水平来测定的，这例如使用待分析物特异性的抗体用免疫检验来进行。总表达水平和/或状况可使用多种技术中的任何技术来测定。作为非限制性的例子，可如本文所述使用单项检测检验或使用接近双重检测检验来测定VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平。在一些优选的实施方式中，接近双重检测检验是协同酶增强反应性免疫检验(Collaborative Enzyme Enhanced Reactive ImmunoAssay，CEER)。

在一些实施方式中，一种或更多种待分析物的表达(例如，总)水平和/或活化(例如磷酸化)水平被表示为相对荧光单位(RFU)值，其对应于使用例如CEER测定的特定目的待分析物的信号强度。在其它一些实施方式中，一种或更多种待分析物的表达水平和/或活化水平是这样来定量的：针对为特定目的待分析物产生的标准曲线，校正或归一化使用例如接近检验(例如CEER)测定的RFU值。在某些情况下，可基于标准曲线计算RFU值。

在另一些实施方式中，一种或更多种待分析物的表达水平和/或活化水平被表示为“低”、“中等”或“高”，这对应于使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的逐渐增加的信号强度。在一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的不可检测到的或仅被最小程度检测到的表达或活化水平可被表示为“不可检测到”。在其它一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的表达或活化的低水平可被表示为“低”。在还一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的表达或活化的中度水平可被表示为“中等”。在又一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的目的特定待分析物的表达或活化的中度至高水平可被表示为“中等至高”。在另一些情况下，使用例如接近检验(例如CEER)测定的特定目的待分析物的表达或活化的非常高的水平可被表示为“高”。

在一些特定的实施方式中，特定目的待分析物的参照表达水平和/或活化水平是从产生自样品(例如癌细胞系)的一条或更多条标准曲线计算的。作为非限制性的例子，针对用于测定特定目的待分析物的表达水平或活化水平的每种检验，可从制备自癌细胞系的经系列稀释的细胞裂解物的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种等等)浓度产生反曲(sigmoidal)标准曲线。在一些优选的实施方式中，癌细胞系表达一种或更多种目的待分析物，例如VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R。每条曲线可被绘制为信号强度对源于对数浓度的单位的函数，CU(计算后单位)可基于标准曲线来计算。实施例7提供了针对为特定目的待分析物产生的标准曲线来对特定目的待分析物的表达和/或活化水平进行的定量的更为详细的描述。

在某些实施方式中，当表示为“低”、“中等”或“高”时，特定目的待分析物的表达水平或活化水平可对应于至少大约0、5,000、10,000、15,000、20；000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70；000、80,000、90,000、100,000RFU或更高的表达或活化水平，例如当较之阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达水平和/或活化水平而言。在一些情况下，关联是待分析物特异性的。作为非限制性的例子，当较之参照表达或活化水平时，使用例如接近检验(例如CEER)测定的表达或活化的“低”水平针对一种待分析物可对应于表达或活化的10,000RFU，针对另一待分析物可对应于50,000RFU。

在某些实施方式中，特定目的待分析物的表达或活化水平可对应于相对于针对该特定目的待分析物的参照表达水平或活化水平而言被称为“低”、“中等”或“高”的表达或活化水平，例如当较之阴性对照(例如IgG对照)，当较之为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)，当较之阳性对照(例如pan-CK对照)，当较之存在抗癌药物时测定的表达或活化水平，和/或当较之不存在抗癌药物时测定的表达或活化水平而言。在一些情况下，关联是待分析物特异性的。作为非限制性的例子，当较之参照表达或活化水平时，使用例如接近检验(例如CEER)测定的表达或活化的“低”水平针对一种待分析物可对应于表达或活化的2倍增加，针对另一待分析物可对应于5倍增加。

在某些实施方式中，特定目的待分析物的表达或活化水平可对应于较之在阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达水平和/或活化水平的表达或活化水平。

在某些实施方式中，当表达或活化水平是在阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达或活化水平的至少大约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100倍高(例如大约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20或5-50倍高)，认为在样品(例如细胞提取物)中存在特定目的待分析物的表达或活化的较高水平。

在其它一些实施方式中，当表达或活化水平是在阴性对照(例如IgG对照)中、在为目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)中、在阳性对照(例如pan-CK对照)中、存在抗癌药物时和/或不存在抗癌药物时针对该特定目的待分析物的参照表达或活化水平的至少大约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100倍低(例如大约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20或5-50倍低)，认为在样品(例如细胞提取物)中存在特定目的待分析物的表达或活化的较低水平。

在另一些实施方式中，特定目的待分析物的参照表达或活化水平是分离点值(cutoff value)。在一些情况下，分离点值包括基于对特定目的待分析物的群体分析选择的数，其用于比较细胞提取物中该待分析物的表达或活化水平。作为非限制性的例子，分离点值可通过将来自个体群体的特定目的待分析物的表达或活化水平分入“高”和“低”组来获得，并且其被选为处于或紧邻群体中该待分析物的中位表达或活化水平。可将细胞提取物中目的待分析物的表达或活化水平与分离点值相比，并基于细胞提取物中的待分析物的表达或活化水平是否高于(例如“高”)或低于(例如“低”)分离点值将其确定为表达或活化的“高”和“低”水平。实施例5提供了根据本发明的方法计算、选择和使用分离点值的一种示例性实施方式。在其它一些实施方式中，分离点值可从为特定目的待分析物产生的标准曲线(例如产生自癌细胞系的标准曲线)获得，并与细胞提取物中该待分析物的表达或活化水平相比较。本领域技术人员将认识到，可根据使用者的需要和被分析的群体的特征来测定分离点值。

在一些实施方式中，抗癌药物包含干扰癌细胞中不正常表达和/或活化的信号转导通路组分的功能的一种或更多种药剂。此类药剂的非限制性例子包括下面在PCT公开No.WO 2010/132723的表1中列出的那些，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方式中，抗癌药物包含抗信号剂(anti-signalingagent)(即，细胞生长抑制药(cytostatic drug))，例如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂(即细胞毒性药)；激素性治疗剂；放疗剂；疫苗；和/或具有降低或终止异常细胞(例如癌细胞)不受控制的生长的任何其它化合物。在一些实施方式中，用一种或更多种抗信号剂、抗增殖剂和/或激素性治疗剂组合至少一种化疗剂来处理经分离的细胞。

适用于本发明的抗信号剂包括但不限于，单克隆抗体，例如曲妥珠单抗

帕妥珠单抗(pertuzumab)(2C4)，阿仑单抗(alemtuzumab)

贝伐单抗

西妥昔单抗

吉姆单抗(gemtuzumab)帕尼单抗(panitumumab)(Vectibix^TM)，利妥昔单抗(rituximab)

和托西莫单抗(tositumomab)

酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼

舒尼替尼

埃罗替尼

拉帕替尼(lapatinib)(GW-572016；

)，卡奈替尼(canertinib)(CI 1033)，semaxinib(SU5416)，伐他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)，索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006；

)，甲磺酸伊马替尼

来氟米特(leflunomide)(SU101)，凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA^TM；ZD6474)，培利替尼(pelitinib)，CP-654577，CP-724714，HKI-272，PKI-166，AEE788，BMS-599626，HKI-357，BIBW 2992，ARRY-334543，JNJ-26483327和JNJ-26483327；和它们的组合。

示例性的抗增殖剂包括mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)，坦西莫司(temsirolimus)(CCI-779)，依维莫司(everolimus)(RAD001)，BEZ235和XL765；AKT抑制剂，例如1L6-羟基甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八基-sn-甘油碳酸酯，9-甲氧基-2-methylellipticinium乙酸盐/酯，1，3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑[4，5-g]喹喔啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮，10-(4’-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩噁嗪，3-甲酸基色酮缩氨基硫脲(Cu(II)Cl₂复合体)，API-2，源自原癌基因TCL1的氨基酸10-24的15体肽(Hiromura等，J.Biol.Chem.，279：53407-53418(2004))，KP372-1，以及Kozikowski等，J.Am.Chem.Soc.，125：1144-1145(2003)和Kau等，Cancer Cell，4：463-476(2003)中描述的化合物；PI3K抑制剂，例如PX-866，渥曼青霉素(wortmannin)，LY 294002，栎精(quercetin)，河豚毒素柠檬酸盐/酯，硫丙咪胺马来酸盐/酯(thioperamide maleate)，GDC-0941(957054-30-7)，IC87114，PI-103，PIK93，BEZ235(NVP-BEZ235)，TGX-115，ZSTK474，(-)-鱼藤素，NU 7026，杨梅酮，坦度替尼(tandutinib)，GDC-0941二甲磺酸酯，GSK690693，KU-55933，MK-2206，OSU-03012，哌立福新(perifosine)，曲西立滨(triciribine)，XL-147，PIK75，TGX-221，NU 7441，PI 828，XL-765和WHI-P 154；MEK抑制剂，例如PD98059，ARRY-162，RDEA119，U0126，GDC-0973，PD184161，AZD6244，AZD8330，PD0325901和ARRY-142886；和它们的组合。

pan-HER抑制剂的非限制性例子包括PF-00299804，奈拉替尼(neratinib)(HKI-272)，AC480(BMS-599626)，BMS-690154，PF-02341066，HM781-36B，CI-1033，BIBW-2992，和它们的组合。

化疗剂的非限制性例子包括基于铂的药物(例如奥沙利铂(oxaliplatin)，顺铂，卡铂，螺铂(spiroplatin)，异丙铂(iproplatin)，satraplatin等等)，烷基化药剂(例如环磷酰胺，异环磷酰胺，苯丁酸氮芥，白消安，美法仑，氮芥，乌拉莫司汀，噻替派，亚硝基脲类等等)，抗代谢药(例如5-氟脲，硫唑嘌呤(azathioprine)，6-巯基嘌呤，甲氨蝶呤，甲酰四氢叶酸，卡培他滨(capecitabine)，阿糖胞苷，氟尿苷(floxuridine)，氟达拉滨(fludarabine)，吉西他滨(gemcitabine)

培美曲塞(pemetrexed)

雷替曲塞(raltitrexed)等等)，植物生物碱类(例如长春新碱，长春碱，长春瑞滨，长春地辛(vindesine)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)，紫杉醇

多西他赛(docetaxel)

等等)，拓扑异构酶抑制剂(例如依立替康(irinotecan)，托泊替康(topotecan)，安吖啶(amsacrine)，依托泊苷(etoposide)(VP16)，依托泊苷磷酸盐/酯，替尼泊苷(teniposide)等等)，抗肿瘤抗生素(例如阿霉素(doxorubicin)，阿霉素(adriamycin)，道诺霉素(daunorubicin)，表柔比星(epirubicin)，放射菌素(actinomycin)，博莱霉素，丝裂霉素，米托蒽醌(mitoxantrone)，普卡霉素(plicamycin)等等)，可药用的其盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物，和它们的组合。

激素性治疗剂的例子包括但不限于，芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特(aminoglutethimide)，阿那曲唑(anastrozole)

来曲唑(letrozole)

伏氯唑(vorozole)，依西美坦(exemestane)

4-雄甾烯-3，6，17-三酮(6-OXO)，1，4，6-雄甾三烯-3，17-二酮(ATD)，福美坦(formestane)

等等)，选择性雌激素受体调节剂(例如巴多昔芬(bazedoxifene)，氯米芬(clomifene)，氟维司群(fulvestrant)，拉索昔芬(lasofoxifene)，雷洛昔芬(raloxifene)，它莫西芬(tamoxifen)，托瑞米芬(toremifene)等等)，固醇类(例如地塞米松)，非那司提(finasteride)和释放促性腺激素的激素激动剂(GnRH)，例如戈舍瑞林(goserelin)，可药用的其盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物，和它们的组合。

可用于本发明的癌症疫苗的非限制性例子包括来自ActiveBiotech的ANYARA，来自Northwest Biotherapeutics的DCVax-LB，来自IDM Pharma的EP-2101，来自Pharmexa的GV1001，来自IderaPharmaceuticals的IO-2055，来自Introgen Therapeutics的INGN 225和来自Biomira/Merck的Stimuvax。

放疗剂的例子包括但不限于放射性核素，例如⁴⁷Sc、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁹Sr、⁸⁶Y、⁸⁷Y、⁹⁰Y、¹⁰⁵Rh、¹¹¹Ag、¹¹¹In、^117mSn、¹⁴⁹pm、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At和²¹²Bi，任选地，与针对肿瘤抗原的抗体缀合。

在一些优选的实施方式中，抗癌药物是贝伐单抗

卡铂和紫杉醇的组合(“三联疗法”))。在一些情况下，紫杉醇是纳米颗粒清蛋白结合的(nab)紫杉醇(

或nabP)。在其它一些实施方式中，抗癌药物包含下述中的一种或更多种：贝伐单抗卡铂，紫杉醇(例如nabP)，iniparib(BSI 201；4-碘-3-硝基苯甲酰胺)，NK012(释放SN-38的纳米设备，通过将SN-38与嵌段共聚物PEG-PGlu共价连结、之后在水性介质中两亲性嵌段共聚物进行自装配而构建的)，glembatumumab vedotin(也已知为CDX-011或CR011-vcMMAE；与靶向表达跨膜糖蛋白NMB的癌细胞的单甲基auristatin E(MMAE)相连的人单克隆抗体glembatumumab(CR011))，或它们的组合。在一种特定的实施方式中，抗癌药物是iniparib(PARP抑制剂)，吉西他滨

和卡铂的组合。

在一些实施方式中，所述方法还包括在细胞提取物中测定一种或更多种额外的信号转导分子的表达和/或活化水平。可针对在样品(例如细胞提取物)中的表达(例如总量)水平和/或活化(例如磷酸化)水平进行考察的额外的信号转导分子的非限制性例子包括受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号级联组分、核激素受体、核受体共活化因子、核受体阻遏因子和它们的组合。可使用本发明来考察的信号转导分子和通路的特别的例子包括PCT公开No.WO 2010/132723的表2中显示的那些，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。在一些特定的实施方式中，一种或更多种额外的信号转导分子选自HER2、p95HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、P70S6K、GSK-3β、Shc、c-MET、VEGFR1、VEGFR3、受体二聚体和它们的组合构成的组。

在某些实施方式中，本发明还在细胞提取物中测定一种或更多种(例如至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或更多种)额外的待分析物的表达(例如总的)水平和/或活化(例如磷酸化)水平。在一些实施方式中，一种或更多种(例如至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或更多种)额外的待分析物包含选自受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号级联组分、核激素受体、核受体共活化因子、核受体阻遏因子及它们的组合构成的组的一种或更多种信号转导分子。

在一些特定的实施方式中，本发明还包括在细胞提取物中测定下述额外待分析物中一种或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或更多种的任何组合的表达(例如总的)水平和/或活化(例如磷酸化)水平：HER2、p95HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、P70S6K、GSK-3β、Shc、c-MET、VEGFR1、VEGFR3、PDK2、Raf、SRC、NFkB-IkB、mTOR、EPH-A、EPH-B、EPH-C、EPH-D、FLT-3、TIE-1、TIE-2、c-FMS、Abl、FTL 3、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、ER、PR、NCOR、AIB1、RON、PIP2、PIP3、p27、蛋白质酪氨酸磷酸(例如PTP1B、PTPN13、BDP1等等)、受体二聚体，和它们的组合。

IV.抗体阵列的构建

在某些方面，肿瘤细胞(例如乳腺癌细胞)中一种或更多种(例如多种)待分析物(例如信号转导分子)的表达水平和/或活化状态是使用基于抗体的阵列来检测的，所述阵列包含被限制于固体支持物上的捕获抗体的稀释系列。阵列典型地包含捕获抗体浓度范围内的多种不同的捕获抗体，它们在不同的可寻址的位置偶联于固体支持物的表面。在一种实施方式中，阵列包含用于检测和/或定量VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R中的至少一种或更多种以及一种或更多种对照(例如，阴性对照(例如IgG对照)、为目的待分析物产生的标准曲线、和/或阳性对照(例如pan-CK对照))的表达和/或活化的捕获抗体。

在一种特定的实施方式中，本发明提供了具有优越动态范围的可寻址的阵列，其包含被限制于固体支持物上的捕获抗体的多种稀释系列，其中每种稀释系列中的捕获抗体特异于对应信号转导通路的组分和其它靶蛋白的一种或更多种待分析物。在多个方面，该实施方式包括包含特定肿瘤特征性的信号转导通路(例如在乳腺癌细胞中有活性的信号转导通路)的组分的阵列。因此，本发明可有利地这样实践，其中，在单个阵列或芯片上呈现每种信号转导分子或具有导致乳腺癌的潜在表达或活化缺陷的其它目的蛋白质。在一些方面，在特定肿瘤细胞中有活性的给定信号转导通路的组分以下述线性顺序被排列，所述顺序对应于细胞内经过信号转导通路传递信息的顺序。此类阵列的例子被描述于本文中，以及还显示于PCT公开No.WO2009/108637的图5-9中，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。特异于在特定肿瘤细胞中有活性的给定信号转导通路的一种或更多种组分的捕获抗体还可被以随机方式印制，以最小化表面相关的人为干扰。

固体支持物可包含用于固定蛋白质的任何合适的基底。固体支持物的例子包括但不限于，玻璃(例如玻片)、塑料、芯片、别针(pins)、滤器、珠粒、纸、膜、纤维束、凝胶、金属、陶瓷及类似物。膜例如尼龙(Biotrans^TM，ICN Biomedicals，Inc.(Costa Mesa，CA)；Zeta-Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA))、硝酸纤维素(

WhatmanInc.(Florham Park，NJ))和PVDF(Immobilon^TM，Millipore Corp.(Billerica，MA))适于在本发明的阵列中用作为固体支持物。优选地，捕获抗体被限制于涂布有硝酸纤维素聚合物的玻片上，例如玻片，其可从Whatman Inc.(Florham Park，NJ)商业获得。

合意的固体支持物的特定方面包括结合大量捕获抗体的能力和结合变性最小化的捕获抗体的能力。另一合适的方面是当含有捕获抗体的抗体溶液被应用到支持物上时固体支持物展示出最小化的“毛细现象(wicking)”。具有最小化的毛细现象的固体支持物允许应用到支持物上的少量捕获抗体溶液产生被固定的捕获抗体的小的、界定的点。

捕获抗体典型地被直接或间接(例如经由捕获标签)经由共价或非共价(例如离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)被限制于固体支持物上。在一些实施方式中，使用标准交联方法和条件，使用同源双功能或异源双功能交联剂，将捕获抗体与固体支持物共价连结。合适的交联剂可从供应商(例如Pierce Biotechnology(Rockford，IL))商业获得。

用于产生适用于本发明的阵列的方法包括但不限于用于构建蛋白质或核酸阵列的任何技术。在一些实施方式中，使用微点样器(典型地是装备有开尾销(split pins)、平销(blunt pins)或喷墨印刷的机器人印刷机)，将捕获抗体点样到阵列上。用于印制本文所述的抗体阵列的合适的机器人系统包括具有ChipMaker2开尾销(TeleChem International；Sunnyvale，CA)的PixSys 5000机器人(Cartesian Technologies；Irvine，CA)以及可从BioRobics(Woburn，MA)和Packard Instrument Co.(Meriden，CT)获得的其它机器人印刷机。优选地，每种捕获抗体稀释液的至少2、3、4、5或6份重复被点样到阵列上。

用于产生适用于本发明的阵列的另一方法包括通过在能有效使定义的体积的液体流到支持物上的条件下将毛细分散器接触到固体支持物上，使已知体积的捕获抗体稀释液分散于每个选择的阵列位置，其中在每个选择的阵列位置使用选择的捕获抗体稀释液重复该过程，以产生完全阵列。该方法可在形成多个此类阵列的过程中实践，其中在每个重复循环中，将溶液沉积步骤应用于多个固体支持物中的每个的选择的位置上。关于此类方法的进一步描述可见例如美国专利No.5,807,522。

在某些情况下，用于印制到纸上的设备可用于产生抗体阵列。例如，合意的捕获抗体稀释液可被装载进台式喷墨印刷机的印刷头或被印制到合适的固体支持物上(见例如Silzel等，Clin.Chem.，44：2036-2043(1998))。

在一些实施方式中，在固体支持物上产生的阵列具有至少大约5个点/cm²的密度，优选地，至少大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000、或10,000个点/cm²。

在某些情况下，固体支持物上的每个点代表不同的捕获抗体。在某些其它情况下，固体支持物上的多个点代表相同的捕获抗体，例如，作为包含一系列递减的捕获抗体浓度的稀释系列。

用于在固体支持物上制备和构建抗体阵列的方法的额外例子被描述于美国专利No.6,197,599、6,777,239、6,780,582、6,897,073、7,179,638和7,192,720；美国专利公开No.20060115810、20060263837、20060292680和20070054326；以及Varnum等，Methods Mol.Biol.，264：161-172(2004)中。

用于扫描抗体阵列的方法是本领域已知的，其包括但不限于用于扫描蛋白质或核酸阵列的任何技术。适用于本发明的微阵列扫描仪可从PerkinElmer(Boston，MA)、Agilent Technologies(Palo Alto，CA)、AppliedPrecision(Issaquah，WA)、GSI Lumonics Inc.(Billerica，MA)和AxonInstruments(Union City，CA)获得。作为非限制性的例子，可用ImaGene软件，使用用于荧光检测的GSI ScanArray3000进行定量。

V.单项检测检验

在一些实施方式中，用于在细胞(例如肿瘤细胞)的细胞提取物中检测一种或更多种目的待分析物(例如一种或更多种信号转导分子)的表达和/或活化水平的检验是多重、高通量的、具有优越动态范围的两抗体检验。作为非限制性的例子，用于检验中的两种抗体可包含：(1)特异于特定目的待分析物的捕获抗体；以及(2)特异于待分析物的活化形式的检测抗体(即活化状态依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能检测，例如，待分析物的磷酸化、泛素化和/或复合化状态。备选地，检测抗体可包含不依赖活化状态的抗体，其检测细胞提取物中的待分析物的总量。不依赖活化状态的抗体通常能检测待分析物的活化和非活化形式二者。

在一种特定的实施方式中，用于检测目的待分析物的表达或活化水平的两抗体检验包括：

(i)将细胞提取物与捕获抗体的一种或多种稀释系列一起孵育，以形成多种被捕获的待分析物；

(ii)将多种被捕获的待分析物与特异于相应待分析物的检测抗体一起孵育，以形成多种可检测的被捕获的待分析物，其中所述检测抗体包含活化状态依赖性的抗体，用于检测待分析物的活化(例如，磷酸化)水平，或者包含不依赖活化状态的抗体，用于检测待分析物的表达水平(例如，总量)；

(iii)将多种可检测的被捕获的待分析物与信号扩增对的第一和第二成员一起孵育，以产生经放大的信号；以及

(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的经放大的信号。

本文描述的两抗体检验典型地是基于抗体的阵列，其包含捕获抗体浓度范围内的多种不同的捕获抗体，它们在不同的可寻址的位置偶联于固体支持物的表面。用于本发明的合适固体支持物的例子被描述于上文。

优选选择捕获抗体和检测抗体以最小化它们之间与待分析物结合相关的竞争(即，捕获抗体和检测抗体两者可同时结合它们相应的信号转导分子)。

在一种实施方式中，检测抗体包含结合对的第一成员(例如生物素)，以及信号扩增对的第一成员包含结合对的第二成员(例如链霉抗生物素)。可使用本领域公知的方法，将结合对成员直接或间接偶联至检测抗体或偶联至信号扩增对的第一成员。在某些情况下，信号扩增对的第一成员是过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯化物过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜酸粒细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等等)，以及信号扩增对的第二成员是酪胺(tyramide)试剂(例如生物素-酪胺)。在这些情况下，通过在存在过氧化氢(H₂O₂)的情况下，对酪胺试剂进行过氧化物酶氧化，以产生活化的酪胺，来产生经放大的信号。

活化的酪胺可被直接检测，或可在添加信号检测试剂(例如，经链霉抗生物素标记的荧光团或经链霉抗生物素标记的过氧化物酶和发色试剂的组合)后检测。适用于本发明的荧光团的例子包括但不限于Alexa

染料(例如Alexa

555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon Green^TM；罗丹明、得克萨斯红、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、CyDye^TM氟石(例如Cy2、Cy3、Cy5)等等。可使用本领域公知的方法，将链霉抗生物素标记直接或间接偶联至荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的发色试剂的非限制性例子包括3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、3，3’-二氨基联苯胺(DAB)、2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或卟啉原。

用于进行本文所述的两抗体检验的示例性方案被提供于PCT公开No.WO2009/108637的实施例3中，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。

在两抗体手段的另一实施方式中，本发明提供了用于检测截短的受体的表达或活化水平的方法，所述方法包括：

(i)将细胞提取物与多个珠粒一起孵育，所述珠粒特异于全长受体的细胞外结构域(ECD)结合区域；

(ii)从细胞提取物移出多个珠粒，由此移出全长受体，以形成没有全长受体的细胞提取物；

(iii)将没有全长受体的细胞提取物与特异于全长受体的细胞内结构域(ICD)结合区域的一种或多种捕获抗体的稀释系列一起孵育，以形成多种被捕获的截短的受体；

(iv)将多种被捕获的截短的受体与特异于全长受体的ICD结合区域的检测抗体一起孵育，以形成多种可检测的被捕获的截短的受体，其中所述检测抗体包含活化状态依赖性的抗体，用于检测截短的受体的活化(例如，磷酸化)水平，或包含不依赖活化状态的抗体，用于检测截短的受体的表达水平(例如总量)；

(v)将多种可检测的被捕获的截短的受体与信号扩增对的第一和第二成员一起孵育，以产生经扩增的信号；以及

(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的经扩增的信号。

在某些实施方式中，截短的受体是p95HER2，全长受体是HER2。在某些其它实施方式中，特异于细胞外结构域(ECD)结合区域的多个珠粒包含链霉抗生物素-生物素对，其中生物素与珠粒连结，并且生物素与抗体连结(例如，其中抗体特异于全长受体的ECD结合区域)。

PCT公开No.WO2009/108637(就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文)的图14A显示，涂布有针对目的受体的细胞外结构域(ECD)的抗体的珠粒与全长受体(例如HER2)结合，但是不与截短的受体(例如p95HER2)结合，以从检验中移出任何全长受体。PCT公开No.WO2009/108637的图14B显示，截短的受体(例如p95HER2)一旦结合至捕获抗体，然后即可通过特异于全长受体(例如HER2)的细胞内结构域(ICD)的检测抗体来检测。检测抗体可直接缀合至辣根过氧化物酶(HRP)。然后可进行酪胺信号扩增(TSA)，以产生待被检测的信号。截短的受体(例如p95HER2)的表达水平或活化状态可被考察，以测定例如其总浓度或其磷酸化状态、泛素化状态和/或复合化状态。

在另一实施方式中，本发明提供了用于进行上文所述的两抗体检验的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)被限制于固体支持物上的一种或多种捕获抗体的稀释系列；以及(b)一种或多种检测抗体(例如活化状态依赖性抗体和/或不依赖活化状态的抗体)。在一些情况下，试剂盒还可含有关于使用试剂盒来检测细胞(例如肿瘤细胞)的一种或多种信号转导分子的表达水平和/或活化状态的方法的说明。试剂盒还可含有关于进行本发明的特别的方法的上述任何额外试剂，例如，信号扩增对的第一和第二成员、酪胺信号扩增试剂、洗涤缓冲液等等。

VI.接近双重检测检验

在一些实施方式中，用于在细胞(例如肿瘤细胞)的细胞提取物中检测一种或更多种目的待分析物(例如一种或更多种信号转导分子)的表达和/或活化水平的检验是多重、高通量的、具有优越动态范围的接近(即，三抗体)检验。作为非限制性的例子，用于接近检验中的三种抗体可包含：(1)特异于特定目的待分析物的捕获抗体；(2)特异于待分析物的活化形式的检测抗体(即活化状态依赖性抗体)；以及(3)检测待分析物总量的检测抗体(即，不依赖活化状态的抗体)。活化状态依赖性抗体能检测待分析物的例如磷酸化、泛素化和/或复合化状态，而不依赖活化状态的抗体能检测待分析物的总量(即，活化和非活化形式二者)。

在一种特定的实施方式中，用于检测目的待分析物的活化水平或状况的接近检验包括：

(i)将细胞提取物与捕获抗体的一种或多种稀释系列一起孵育，以形成多种被捕获的待分析物；

(ii)将多种被捕获的待分析物与包含特异于相应待分析物的、一种或多种活化状态依赖性抗体和一种或多种不依赖活化状态的抗体的检测抗体一起孵育，以形成多种可检测的被捕获的待分析物，

其中不依赖活化状态的抗体被协助性基元标记，活化状态依赖性抗体被信号扩增对的第一成员标记，并且所述协助性基元产生氧化剂，所述氧化剂经通道运送至(channel to)信号扩增对的第一成员并与其反应；

(iii)将多种可检测的被捕获的待分析物与信号扩增对的第二成员一起孵育，以产生经扩增的信号；以及

(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的经扩增的信号。

在另一特定的实施方式中，用于检测是截短的受体的目的待分析物的活化水平或状况的接近检验包括：

(i)将细胞提取物与多个珠粒一起孵育，所述珠粒特异于全长受体的细胞外结构域(ECD)结合区域；

(ii)从细胞提取物移出多个珠粒，由此移出全长受体，以形成没有全长受体的细胞提取物；

(iii)将没有全长受体的细胞提取物与特异于全长受体的细胞内结构域(ICD)结合区域的一种或多种捕获抗体一起孵育，以形成多种被捕获的截短的受体；

(iv)将多种被捕获的截短的受体与包含特异于全长受体的ICD结合区域的、一种或多种活化状态依赖性抗体和一种或多种不依赖活化状态的抗体的检测抗体一起孵育，以形成多种可检测的被捕获的截短的待分析物，

其中不依赖活化状态的抗体被协助性基元标记，活化状态依赖性抗体被信号扩增对的第一成员标记，并且所述协助性基元产生氧化剂，所述氧化剂经通道运送至信号扩增对的第一成员并与其反应；

(v)将多种可检测的被捕获的截短的受体与信号扩增对的第二成员一起孵育，以产生经扩增的信号；以及

(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的经扩增的信号。

在某些实施方式中，截短的受体是p95HER2，全长受体是HER2。在某些其它实施方式中，特异于细胞外结构域(ECD)结合区域的多个珠粒包含链霉抗生物素-生物素对，其中生物素与珠粒连结，并且生物素与抗体连结(例如，其中抗体特异于全长受体的ECD结合区域)。

在一些备选的实施方式中，活化状态依赖性抗体可被协助性基元标记，不依赖活化状态的抗体可被信号扩增对的第一成员标记。

作为另一非限制性的例子，用于接近检验的三种抗体可包含：(1)特异于特定目的待分析物的捕获抗体；(2)第一检测抗体，其检测待分析物的总量(即，第一不依赖活化状态的抗体)和(3)第二检测抗体，其检测待分析物的总量(即，第二不依赖活化状态的抗体)。在一些优选的实施方式中，第一和第二不依赖活化状态的抗体识别待分析物上不同的(例如，有区别的)表位。

在一种特定的实施方式中，用于检测目的待分析物的表达水平的接近检验包括：

(i)将细胞提取物与捕获抗体的一种或多种稀释系列一起孵育，以形成多种被捕获的待分析物；

(ii)将多种被捕获的待分析物与包含特异于相应待分析物的、一种或多种第一和第二不依赖活化状态的抗体的检测抗体一起孵育，以形成多种可检测的被捕获的待分析物，

其中第一不依赖活化状态的抗体被协助性基元标记，第二不依赖活化状态的抗体被信号扩增对的第一成员标记，并且所述协助性基元产生氧化剂，所述氧化剂经通道运送至信号扩增对的第一成员并与其反应；

(iii)将多种可检测的被捕获的待分析物与信号扩增对的第二成员一起孵育，以产生经扩增的信号；以及

(iv)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的经扩增的信号。

在另一特定的实施方式中，用于检测是截短的受体的目的待分析物的表达水平的接近检验包括：

(i)将细胞提取物与多个珠粒一起孵育，所述珠粒特异于全长受体的细胞外结构域(ECD)结合区域；

(ii)从细胞提取物移出多个珠粒，由此移出全长受体，以形成没有全长受体的细胞提取物；

(iii)将没有全长受体的细胞提取物与特异于全长受体的细胞内结构域(ICD)结合区域的一种或多种捕获抗体一起孵育，以形成多种被捕获的截短的受体；

(iv)将多种被捕获的截短的受体与包含特异于全长受体的ICD结合区域的、一种或多种第一和第二不依赖活化状态的抗体的检测抗体一起孵育，以形成多种可检测的被捕获的截短的受体，

其中第一不依赖活化状态的抗体被协助性基元标记，第二不依赖活化状态的抗体被信号扩增对的第一成员标记，并且所述协助性基元产生氧化剂，所述氧化剂经通道运送至信号扩增对的第一成员并与其反应；

(v)将多种可检测的被捕获的截短的受体与信号扩增对的第二成员一起孵育，以产生经扩增的信号；以及

(vi)检测产生自信号扩增对的第一和第二成员的经扩增的信号。

在某些实施方式中，截短的受体是p95HER2，全长受体是HER2。在某些其它实施方式中，特异于细胞外结构域(ECD)结合区域的多个珠粒包含链霉抗生物素-生物素对，其中生物素与珠粒连结，并且生物素与抗体连结(例如，其中抗体特异于全长受体的ECD结合区域)。

在一些备选的实施方式中，第一不依赖活化状态的抗体可被信号扩增对的第一成员标记，以及第二不依赖活化状态的抗体可被协助性基元标记。

本文描述的接近检验典型地是基于抗体的阵列，其包含捕获抗体浓度范围内的一种或多种不同的捕获抗体，它们在不同的可寻址的位置偶联于固体支持物的表面。用于本发明的合适的固体支持物的例子见上文所述。

优选选择捕获抗体、不依赖活化状态的抗体和活化状态依赖性抗体以最小化它们之间关于待分析物结合的竞争(即，所有抗体可同时结合它们相应的信号转导分子)。

在一些实施方式中，用于检测一种或更多种分析物的活化水平的不依赖活化状态的抗体，或者，用于检测一种或更多种分析物的表达水平的第一不依赖活化状态的抗体，还包含可检测的基元。在此类情况下，可检测的基元的量与细胞提取物中一种或更多种分析物的量相关联。可检测的基元的例子包括但不限于，荧光标记、化学反应性标记、酶标记、放射活性标记等等。优选地，可检测的基元是荧光团，例如Alexa

染料(例如Alexa

647)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、OregonGreen^TM；罗丹明、得克萨斯红、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、CyDye^TM氟石(例如Cy2、Cy3、Cy5)等等。可使用本领域公知的方法，将可检测的基元直接或间接偶联至不依赖活化状态的抗体。

在某些情况下，用于检测一种或更多种分析物的活化水平的不依赖活化状态的抗体，或者，用于检测一种或更多种分析物的表达水平的第一不依赖活化状态的抗体，被协助性基元直接标记。可使用本领域公知的方法，将协助性基元偶联至不依赖活化状态的抗体。用于本发明的合适的协助性基元包括任何能产生氧化剂的分子，所述氧化剂经通道运送至(即，被指导至)接近(即，空间相近或紧邻)协助性基元的另一分子并和其反应(即，结合、被......结合、或与......形成复合体)。协助性基元的例子包括但不限于，酶，例如葡糖氧化酶，或催化涉及分子氧(O₂)作为电子受体的氧化/还原反应的任何其它酶，和光敏剂，例如亚甲基蓝、玫瑰红(rose bengal)、卟啉、方酸盐(squarate)染料、酞菁染料等等。氧化试剂的非限制性例子包括过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧和在氧化/还原反应中转移氧原子或获得电子的任何其它化合物。优选地，在存在合适的底物(例如葡萄糖、光等等)时，协助性基元(例如葡糖氧化酶、光敏剂等等)产生氧化剂(例如过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧等等)，当两种基元互相接近时，所述氧化剂经通道运送至信号扩增对的第一成员(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、被保护性基团保护的半抗原、被与酶抑制剂的硫醚连接失活的酶，等等)并与其反应。

在某些其它情况下，用于检测一种或更多种分析物的活化水平的不依赖活化状态的抗体，或者，用于检测一种或更多种分析物的表达水平的第一不依赖活化状态的抗体，被协助性基元间接标记，这经由与不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸连接子和与协助性基元缀合的互补性寡核苷酸连接子之间的杂交来进行。可使用本领域公知的方法将寡核苷酸连接子偶联至协助性基元或不依赖活化状态的抗体。在一些实施方式中，与协助性基元缀合的寡核苷酸连接子与和不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸连接子具有100％互补性。在其它一些实施方式中，寡核苷酸连接子对包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个错配区域，例如，在严格杂交条件下杂交时。本领域技术人员将认识到，特异于不同分析物的不依赖活化状态的抗体可与相同寡核苷酸连接子缀合或可与不同寡核苷酸连接子缀合。

与协助性基元或与不依赖活化状态的抗体缀合的寡核苷酸连接子的长度可变动。通常，连接子序列长度为至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100个核苷酸。典型地，产生随机核酸序列用于偶联。作为非限制性的例子，可将寡核苷酸连接子的文库设计为具有三个有区别的连续结构域：间隔子结构域；标识结构域和缀合结构域。优选地，寡核苷酸连接子被设计为用于有效偶联，而不破坏它们缀合的协助性基元或不依赖活化状态的抗体的功能。

寡核苷酸连接子序列可被设计为在多种检验条件下防止或最小化任何二级结构形成。典型地，针对连接子内的每种片段，仔细地监测熔融温度，以允许它们参与总体检验流程。通常，连接子序列的片段的熔融温度的范围为1-10℃之间。用于测定给定离子浓度下熔融温度、二级结构和发卡结构的计算机算法(例如OLIGO 6.0)被用于分析每种连接子内的三种不同结构域中的每种。还可针对其结构特征和其对其它缀合的寡核苷酸连接子序列的相容性，来分析整个组合的序列，例如，它们是否将在严格杂交条件下与互补寡核苷酸连接子杂交。

寡核苷酸连接子的间隔子区域提供了对缀合结构域和寡核苷酸交联位点的足够分隔。缀合结构域功能在于将经互补性寡核苷酸连接子序列标记的分子经由核酸杂交连接至缀合结构域。核酸介导的杂交可在抗体-分析物(即，抗原)复合体形成之前或之后进行，这提供更灵活的检验形式。与很多直接的抗体缀合方法不同，将相对小的寡核苷酸与抗体或其它分子连接对于抗体针对其靶分析物的特异性亲和性具有最小的影响，或者对缀合的分子的功能具有最小的影响。

在一些实施方式中，寡核苷酸连接子的标识序列结构域可用于复杂的多重蛋白质检验。多种抗体可与具有不同标识序列的寡核苷酸连接子缀合。在多重免疫检验中，经适当的探针标记的报道子寡核苷酸序列可用于在多重检验形式中检测抗体和它们的抗原之间的交叉反应性。

可使用若干不同的方法将寡核苷酸连接子与抗体或其它分子缀合。例如，可使用5’或3’端的硫醇基团来合成寡核苷酸连接子。可使用还原剂(例如TCEP-HCl)来去保护硫醇基团，可通过使用脱盐旋转柱(spincolumn)来纯化得到的连接子。可使用异源双功能交联剂，例如SMCC，将得到的经去保护的寡核苷酸连接子缀合至抗体或其它类型的蛋白质的伯胺。或者，可用水溶性的碳二亚胺EDC来处理寡核苷酸上的5’-磷酸酯基团(以形成磷酸酯)，以及随后将其偶联至含胺分子。在某些情况下，3’-核糖残基上的二醇可被氧化为醛基团，然后使用还原性胺化将其缀合至抗体或其它类型的蛋白质的胺基团。在某些其它情况下，可用3’或5’端的生物素修饰来合成寡核苷酸连接子，并将其缀合至经链霉抗生物素标记的分子。

可使用本领域已知的多种技术中的任何来合成寡核苷酸连接子，例如Usman等，J.Am.Chem.Soc.，109：7845(1987)；Scaringe等，Nucl.Acids Res.，18：5433(1990)；Wincott等，Nucl.Acids Res.，23：2677-2684(1995)；和Wincott等，Methods Mol.Bio.，74：59(1997)中描述的那些。通常，寡核苷酸的合成使用常见的核酸保护和偶联集团，例如，5’-端的二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)和3’-端的亚磷酰胺。用于寡核苷酸合成的合适的试剂、用于核酸去保护的方法以及用于核酸纯化的方法是本领域技术人员已知的。

在某些情况下，用于检测一种或更多种分析物的活化水平的活化状态依赖性抗体，或者，用于检测一种或更多种分析物的表达水平的第二不依赖活化状态的抗体，被信号扩增对的第一成员直接标记。可使用本领域公知的方法，将信号扩增对成员偶联至活化状态依赖性抗体，以检测活化水平，或偶联至第二不依赖活化状态的抗体，以检测表达水平。在某些其它情况下，用信号扩增对的第一成员间接标记活化状态依赖性抗体或第二不依赖活化状态的抗体，这经由和活化状态依赖性抗体或第二不依赖活化状态的抗体缀合的结合对第一成员与和信号扩增对第一成员缀合的结合对第二成员之间的结合来实现。可使用本领域公知的方法，将结合对成员(例如，生物素/链霉抗生物素)偶联至信号扩增对成员或偶联至活化状态依赖性抗体或第二不依赖活化状态的抗体。信号扩增对成员的例子包括但不限于，过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯化物过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜酸粒细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等等。信号扩增对成员的其它例子包括被保护基团保护的半抗原和被与酶抑制剂的硫醚连接失活的酶。

在接近性通道运送(proximity channeling)的一个例子中，协助性基元是葡糖氧化酶(GO)，并且信号扩增对的第一成员是辣根过氧化物酶(HRP)。当GO与底物(例如葡萄糖)接触时，其产生氧化剂(即，过氧化氢(H₂O₂))。如果HRP在与GO接近的经通道运送之内，GO产生的H₂O₂被经通道运送至HRP，并与HRP复合，以形成HRP-H₂O₂复合体，在存在信号扩增对的第二成员(例如，化学发光底物，例如鲁米诺或异鲁米诺，或发荧光底物，例如酪胺(例如生物素-酪胺)、高香草酸或4-羟基苯基乙酸)的情况下，其产生经扩增的信号。在接近检验中使用GO和HRP的方法被描述于例如Langry等，U.S.Dept.of Energy ReportNo.UCRL-ID-136797(1999)中。当生物素-酪胺被用作为信号扩增对的第二成员时，HRP-H₂O₂复合体氧化酪胺，产生反应性酪胺基，其共价结合相近的亲核残基。活化的酪胺可被直接检测，或添加信号检测试剂后检测，所述试剂例如是经链霉抗生物素标记的荧光团或经链霉抗生物素标记的过氧化物酶和发色试剂的组合。适用于本发明的荧光团的例子包括但不限于，Alexa

染料(例如Alexa

555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon Green^TM；罗丹明、得克萨斯红、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、CyDye^TM氟石(例如Cy2、Cy3、Cy5)等等。可使用本领域公知的方法，将链霉抗生物素标记直接或间接偶联至荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的发色试剂的非限制性例子包括3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、3，3’-二氨基联苯胺(DAB)、2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或卟啉原。

在接近性经通道运送的另一例子中，协助性基元是光敏剂，并且信号扩增对的第一成员是用多种半抗原标记的大分子，所述半抗原被防止半抗原结合特异性结合配偶体(例如配体、抗体等等)的保护性基团保护。例如，信号扩增对成员可以是用经保护的生物素、香豆素和/或荧光素分子标记的葡聚糖分子。合适的保护基团包括但不限于，苯氧基-、analino-、链烯基-(olefin-)、硫醚基-和硒醚基(selenoether)-保护基团。适用于本发明的接近检验的额外光敏剂和被保护的半抗原分子被描述于美国专利No.5,807,675中。当光敏剂被光激发时，其产生氧化剂(即，单线态氧)。如果半抗原分子在与光敏剂接近的经通道运送之内，光敏剂产生的单线态氧就被经通道运送到半抗原的保护基团上的硫醚，并与其反应，以产生羰基(酮或醛)和亚磺酸，由此从半抗原释放保护基团。然后未受保护的半抗原可被获取以特异性结合信号扩增对的第二成员(例如，可产生可检测信号的特异性结合配偶体)。例如，当半抗原是生物素时，特异性结合配偶体可以是经酶标记的链霉抗生物素。示例性的酶包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、HRP等等。洗涤以除去未结合的试剂之后，可通过添加酶的可检测(例如荧光、化学发光、发色等等)底物来产生可检测的信号，并使用本领域已知的合适方法和仪器来检测。或者，可使用酪胺信号扩增来扩增可检测的信号，并且可直接检测活化的酪胺，或者添加上文所述的信号检测试剂后来检测活化的酪胺。

在接近性经通道运送的又一例子中，协助性基元是光敏剂，并且信号扩增对的第一成员是酶-抑制剂复合体。酶和抑制剂(例如经膦酸标记的葡聚糖)通过可切割的连接子(例如硫醚)连接到一起。当光敏剂被光激发时，其产生氧化剂(即，单线态氧)。如果酶-抑制剂复合体在接近光敏剂的经通道运送之内，光敏剂产生的单线态氧被经通道运送至可切割的连接子并与其反应，由此从酶释放抑制剂，由此活化酶。加入酶底物，以产生可检测的信号，或者，加入扩增试剂，以产生经扩增的信号。

在接近性经通道运送的另一例子中，协助性基元是HRP，信号扩增对的第一成员是如上文所述的经保护的半抗原或酶-抑制剂复合体，并且保护基团包含对烷氧基苯酚。添加苯二胺和H₂O₂产生反应性的苯二亚胺(phenylene diimine)，其经通道运送至被保护的半抗原或酶-抑制剂复合体，并且与对烷氧基苯酚保护基团反应，以产生暴露的半抗原或反应性的酶。按照上文所述产生并检测经扩增的信号(见例如美国专利Nos.5,532,138和5,445,944)。

用于进行本文所述的接近检验的示例性方案被提供于PCT公开No.WO2009/108637的实施例4，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。

在另一实施方式中，本发明提供了用于进行上文所述的接近检验的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)被限制于固体支持物上的一种或多种捕获抗体的稀释系列；以及(b)一种或多种检测抗体(例如用于检测活化水平的不依赖活化状态的抗体和活化状态依赖性抗体的组合，和/或用于检测表达水平的第一和第二不依赖活化状态的抗体的组合)。在一些情况下，试剂盒还可含有关于使用所述试剂盒以检测细胞(例如肿瘤细胞)的一种或多种信号转导分子的表达和/或活化状况的方法的说明。试剂盒还可含有与进行本发明的特别的方法相关的上文所述的额外试剂，例如，信号扩增对的第一和第二成员、酪胺信号扩增试剂、用于协助性基元的底物、洗涤缓冲液等等。

VII.抗体的生产

针对根据本发明的免疫检验来分析肿瘤细胞中信号转导分子的表达和活化水平尚未能商业获得的抗体的产生和选择可以若干方法来完成。例如，一种方法是使用本领域已知的表达和纯化方法来表达和/或纯化目的多肽(即抗原)，而另一方法是使用本领域已知的固相肽合成来合成目的多肽。见例如Guide to Protein Purification，Murray P.Deutcher，ed.，Meth.Enzymol.，Vol.182(1990)；Solid Phase Peptide Synthesis，Greg B.Fields，ed.，Meth.Enzymol.，Vol.289(1997)；Kiso等，Chem.Pharm.Bull.，38：1192-99(1990)；Mostafavi等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1：255-60，(1995)；和Fujiwara等，Chem.Pharm.Bull.，44：1326-31(1996)。经纯化或合成的多肽然后可被注射至例如小鼠或兔，以产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员将认识到，可获得很多流程来生产抗体，例如，Antibodies，A Laboratory Manual，Harlow and Lane，Eds.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)中描述的。本领域技术人员还将知道，还可通过多种流程，从遗传信息来制备模拟(例如，保留其功能性结合区域)抗体的结合片段或Fab片段。见例如AntibodyEngineering：A Practical Approach，Borrebaeck，Ed.，Oxford UniversityPress，Oxford(1995)；和Huse等，J.Immunol.，149：3914-3920(1992)。

本领域技术人员将认识到，可采取很多手段，用于生产抗体或结合片段，以及针对对多种目的多肽的亲和性和特异性进行筛选和选择，但是这些手段不改变本发明的范围。

关于多克隆抗体、单克隆抗体、人化抗体、人抗体、双特异性抗体、它们的片段，以及纯化抗体的方法的更详细的描述见PCT公开WO2010/132723，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。

VIII.施用的方法

根据本发明的方法，本文描述的抗癌药物通过本领域已知的任何方便的手段施用给受试者。本发明的方法可用于选择合适的抗癌药物或抗癌药物的组合，以治疗受试者中的肿瘤，例如乳腺肿瘤，例如三阴性转移性乳腺肿瘤。本发明的方法还可用于预测肿瘤(例如乳腺肿瘤，例如三阴性转移性乳腺肿瘤)对使用抗癌药物或抗癌药物的组合的治疗的应答。此外，本发明的方法可用于测定肿瘤细胞(例如三阴性肿瘤细胞，例如来自三阴性转移性乳腺肿瘤的)对使用抗癌药物或抗癌药物的组合的治疗的灵敏性。本领域技术人员将知道，本文描述的抗癌药物可单独施用，或者作为与传统化疗、放疗、激素疗法、免疫疗法和/或手术的组合治疗性手段的部分施用。

在某些实施方式中，抗癌药物包含抗信号剂(即，细胞生长抑制药)，例如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂(即细胞毒性药)；激素性治疗剂；放疗剂；疫苗；和/或具有降低或终止异常细胞(例如癌细胞)不受控制的生长的任何其它化合物。在一些实施方式中，用一种或更多种抗信号剂、抗增殖剂和/或激素性治疗剂组合至少一种化疗剂来处理受试者。示例性的单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、抗增殖剂、化疗剂、激素性治疗剂、放疗剂和疫苗如上文所述。

在一些优选的实施方式中，抗癌药物是贝伐单抗

卡铂和紫杉醇的组合(“三联疗法”))。在一些情况下，紫杉醇是纳米颗粒清蛋白结合的(nab)紫杉醇(

或nabP)。在其它一些实施方式中，抗癌药物包含：iniparib(BSI 201；4-碘-3-硝基苯甲酰胺)，NK012(释放SN-38的纳米设备，通过将SN-38与嵌段共聚物PEG-PGlu共价连结、之后在水性介质中两亲性嵌段共聚物进行自装配而构建的)，glembatumumab vedotin(也已知为CDX-011或CR011-vcMMAE；与靶向表达跨膜糖蛋白NMB的癌细胞的单甲基auristatin E(MMAE)相连的人单克隆抗体glembatumumab(CR011))，或它们的组合。在一种特定的实施方式中，抗癌药物是iniparib(PARP抑制剂)，吉西他滨

和卡铂的组合。

在一些实施方式中，本文描述的抗癌药物可与传统免疫治疗剂联合施用，所述传统免疫治疗剂包括但不限于，免疫刺激剂(例如，卡介菌(BCD)、左咪唑、白介素-2、α-干扰素等等)，免疫毒素(例如抗CD33单克隆抗体-卡奇霉素缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素缀合物等等)和放射免疫疗法(例如与¹¹¹In、⁹⁰Y或¹³¹I等缀合的抗-CD20单克隆抗体等等)。

可根据需要使用合适的药物赋形剂来施用抗癌药物，并且可经由任何可接受的施用模式来进行。因此，施用可以是，例如，口服、经颊、舌下、齿龈、经颚、静脉内、局部、皮下、经皮(transcutaneous)、透皮(transdermal)、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、膀胱内、鞘内、伤口内、鼻内、直肠、阴道或通过吸入。“联合施用”表示抗癌药物在第二药物(例如，另外的抗癌药物，可用于降低与抗癌药物疗法相关的副作用的药物，放疗剂，激素性治疗剂，免疫治疗剂等等)施用的同时、恰好之前或恰好之后被施用。

可重复施用治疗有效量的抗癌药物，例如至少2、3、4、5、6、7、8或更多次，或者可通过连续输注来施用剂量。剂量可采取固体、半固体、冻干粉末或液体剂量形式，例如，片剂、丸剂、团剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液、乳液、栓剂、保留灌肠(retention enemas)、乳膏、油膏、洗剂、凝胶、气溶胶、泡沫或类似物，优选地，以适用于简单施用精确剂量的单位剂量形式。

在本文中使用时，术语“单位剂量形式”指适用作为用于人受试者和其它哺乳动物的单位性剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算以产生合意的启动、可承受性(tolerability)和/或治疗效果的预定量的抗癌药物和/或药物赋形剂(例如安瓿)。此外，可制备更为浓缩的剂量形式，然后可从其生产更多稀释单位剂量形式。更为浓缩的剂量形式因此将含有实质上超过抗癌药物量的例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍。

用于制备此类剂量形式的方法是本领域技术人员已知的(见例如R_EMINGTON’S P_{HARMACEUTICAL} S_CIENCES，18_TH E_D.，Mack PublishingCo.，Easton，PA(1990))。剂量形式典型地包括传统药物载剂或赋形剂，并且可额外包括其它医用试剂、载剂、佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等等。可通过本领域公知的方法，针对特定剂量形式和施用途径，定制合适的赋形剂(见例如上文的R_EMINGTON’S P_{HARMACEUTICAL}S_CIENCES)。

合适的赋形剂的例子包括但不限于，乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素和聚丙烯酸，例如卡波普类(Carbopols)，例如卡波普941(Carbopol 941)、卡波普980(Carbopol980)、卡波普981(Carbopol 981)等等。剂量形式可额外包括润滑剂，例如云母、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，例如甲基-、乙基-、和丙基-羟基-苯甲酸酯(即，对羟苯甲酸酯类)；pH调节剂，例如无机酸和有机酸和碱；加甜剂；以及调味剂。剂量形式还可包含生物可降解的聚合物珠粒、葡聚糖和环糊精包合配合物(inclusioncomplexes)。

为进行口服施用，治疗有效剂量可以是片剂、胶囊、乳液、悬浮液、溶液、糖浆、喷雾、锭剂、粉末和持续释放配方的形式。用于口服施用的合适赋形剂包括药物级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等等。

在一些实施方式中，治疗有效剂量采用丸剂、片剂或胶囊的形式，因此，剂量形式可含有与抗癌药物一起的下述中的任何：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等等；崩解剂，例如淀粉或其衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等等；以及粘合剂，例如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素和它们的衍生物。抗癌药物还可被配制为例如处于聚乙二醇(PEG)载剂中的栓剂。

可通过将抗癌药物以及任选地一种或更多种可药用佐剂溶于或悬浮于载剂(例如水性盐溶液(例如0.9％w/v氯化钠)、水性右旋糖、甘油、乙醇等等)中，以形成溶液或悬浮液(例如，用于口服、局部或静脉内施用的)来制备。抗癌药物还可被配制进保留灌肠中。

为进行局部施用，治疗有效剂量可以是乳液、洗剂、凝胶、泡沫、乳膏、胶冻(jellies)、溶液、悬浮液、软膏和透皮贴片的形式。为通过吸入进行施用，抗癌药物可作为干粉或以液体形式经由喷雾器递送。为进行肠胃外施用，治疗有效剂量可以是无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。优选地，可注射溶液被配制为从大约4.5至大约7.5的pH。

治疗有效剂量还可以以冻干形式提供。此类剂量形式可包括缓冲液，例如碳酸氢盐，用于在施用之前重构，或者缓冲液可被包括进冻干剂量形式中，用于用例如水重构。冻干的剂量形式还可包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干剂量形式可被提供于注射器中，任选地，与用于重构的缓冲液组合被包装，使得经重构的剂量形式可立即施用给受试者。

还可以以周期性时间间隔来监测受试者，以评估某治疗方案的效力。例如，某些信号转导分子的表达和/或活化水平可基于使用本文所述的一种或多种抗癌药物的治疗的治疗效果而改变。可监测受试者，以评估应答和理解某些药物或治疗在个体化手段中的效果。此外，最初应答于特别的抗癌药物或抗癌药物组合的受试者可能变得对药物或药物组合不起反应，这表明这些受试者具有发展出的获得性耐药性。这些受试者可中断目前的疗法，并根据本发明的方法处方备选的治疗。

在某些方面，本文描述的方法可与在多种种群中预测乳腺癌预后和/或复发的可能性的基因表达标志物的组联合。这些基因的组可用于鉴定出不太可能经历复发并且不太可能受益于辅助化疗的个体。表达的组可用于鉴定出可安全避免辅助化疗而不会负面影响无疾病和总生存率的结果的个体。合适的系统包括但不限于Oncotype DX^TM(其是来自GenomicHealth，Inc.的21个基因的组)；

(其是来自Agendia的70个基因的组)和来自Veridex的76个基因的组。

此外，在某些其它方面，本文描述的方法可与针对未知原发性的癌症(CUP)鉴定原始肿瘤的基因表达标志物的组联合使用。这些基因的组可用于鉴定出将受益于给予最初被诊断为乳腺癌的患者一致的疗法的转移性癌症患者。合适的系统包括但不限于，Aviara CancerTYPE ID检验(其是测量92个基因以鉴定出针对39种肿瘤类型的原发起始位点的基于RT-PCT的表达检验)；以及

原始组织测试(Tissue of OriginTest)(其在微阵列上测量超过1600种基因的表达，并将肿瘤的基因表达“标识”与15种已知组织类型的那些相比较)。

IX.实施例

下述实施例被用于阐述但不用于限制要求保护的发明。

就所有目的而言，来自PCT公开No.WO 2010/132723的实施例通过引用以其整体并入本文。

实施例1示例性的接近检验玻片形式

本实施例阐述了本发明的接近检验的一种优选的实施方式，其也作为协同酶增强反应性免疫检验(Collaborative Enzyme EnhancedReactive ImmunoAssay，CEER)已知。本实施方式的接近检验使用基于抗体微阵列的平台，所述平台测量循环中的肿瘤细胞(CTCs)和/或组织样品(例如FNAs)中靶蛋白的表达和活化。作为非限制性的例子，本实施方式的接近检验可用于分析一种或多种靶蛋白(例如HER1)在CTCs或肿瘤组织中的蛋白质表达水平和/或活化状况。在一些情况下，本实施方式的接近检验利用通过涂布有抗Ep-CAM抗体的磁性珠粒使用CTC-Profiler(Veridex)分离自大约7.5ml全血的CTCs。然后在对随后的ErbB通路表达和/或活化进行免疫分析之前，用生长因子(例如EGF+Heregulin)刺激经分离的CTCs。在其它一些情况下，本实施方式的接近检验利用包括新鲜冷冻的转移性活检的肿瘤组织样品(例如三阴性乳腺癌样品)。

在某些情况下，本实施方式的接近检验使用玻片形式，并且包括多种校准物(calibrators)和对照。图1显示了对用于分析总的和磷酸化的HER1和HER2水平的示例性玻片形式的阵列设计。每块玻片上有16个垫片(pad)，其具有每个垫片上300个点的空间。使用接触式微阵列印刷机来在16个垫片的硝酸纤维素玻片上印制。每个点包括示踪染料和以系列稀释以三份重复印制的特异性捕获抗体(Ab)或对照。捕获Abs以1mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml被印制。经纯化的IgG作为定向参照被印制于总的检验和磷检验中。BSA-磷作为试剂对照被印制。在8个垫片上进行分析校准反应，在2个垫片上进行内部品质对照反应。每个玻片允许进行至多4种未知的患者样品。总靶蛋白或磷酸化的活化蛋白质的表达可被报道进计算单元(Cu)，这是基于从表达目的蛋白质的阳性细胞系的稀释裂解物的标准曲线进行的计算的单元。针对每种样品使用两块分开的玻片；一块玻片用于检测从全血分离的细胞中靶蛋白的表达(“总检验玻片”)，以及另一块用于检测磷酸化，以检测靶蛋白活化的程度(“磷检验玻片”)。

在一种实施方式中，在EDTA管中收集来自患者和正常对照个体的全血。为预防抽血期间任何皮肤细胞的污染，我们的流程规定采集的血的前3mL被弃去(或者收集在CellSave管中用于CTC计数以及使用CellSearch试剂盒的视觉免疫染色)。然后使用两个额外的EDTA管，用于在每个管中收集7.5mL全血。然后使用自动磁性细胞分离设备(VeridexAutoPrep)，从每个管中分离CTCs。合并富集的样品，并用生长因子对其加以刺激。然后裂解活化的细胞，其被立即进行处理，或者贮藏于-80℃用于之后的免疫分析。在另一实施方式中，获得来自肿瘤组织(例如新鲜冷冻的转移性活检)的细胞，对其加以裂解，以产生细胞提取物，然后立即处理，或贮藏于-80℃用于之后的免疫分析。

通过在免疫微阵列表面上孵育细胞裂解物中的蛋白质靶和捕获抗体，来启动本实施方式的接近检验。细胞裂解物中的任何HER1或其它RTK或信号转导通路蛋白被结合至它们相应的捕获抗体，随后通过两种额外的检测抗体形成独特的免疫复合体。检测抗体之一与葡糖氧化酶(GO)缀合，并且在存在葡萄糖时产生H₂O₂。当第二HRP缀合的检测抗体被结合接近于免疫复合体内时，产生阳性信号。随后的酪胺介导的信号扩增过程增强了检验的灵敏性。蛋白质检验的特异性被三种特异性Abs对不同表位的同时结合增强，并且由于扩增灵敏性可高至单个细胞的水平。图2显示了用于检测磷酸化的HER1的示例性接近检验的示意图。

本文描述的微阵列平台提供了多重的益处。扩展检验的能力使得能进行高含量分析，其中测量来自可获得性有限的样品的多种受体和信号分子。微阵列是可扩展的，其具有实现临床有用的诊断性检验所需的通量的潜力。

实施例2EGFR和VEGFR2表达预测在三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)中针对Nab-紫杉醇(nabP)/卡铂(C)/贝伐单抗(B)化疗的应答

背景

具有三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)的患者(其中它们的癌症展示出没有雌激素、孕酮或人表皮生长因子受体2(HER2)受体的表达)面临不良的预后(Dent，R.等，Clin Cancer Res.13(15 Pt 1)：4429-4434(2007))。改进的疗法和预测性的标志物是情况下所需的。

B(贝伐单抗；)和C(卡铂)组合在很多实体瘤(包括TNMBC)中有活性。nab-紫杉醇(nabP；

)潜在地靶向SPARC，这是肿瘤分泌的与清蛋白结合的蛋白质。

基于紫杉烷和铂的化疗在对转移性乳腺癌的一线治疗中具有显著的活性，并且组合给予时特别有效(Perez，E.A.，Oncologist9(5)：518-527(2004)；Perez，E.A.等，Oncology 69(2)：117-121(2005)；O’Shaughnessy J.，Oncologist 10(Suppl 3)：20-29(2005))。

纳米颗粒清蛋白结合的(nab)紫杉醇较之标准紫杉醇而言具有改进的效力和可承受性(Gradishar，W.J.等，J Clin Oncol.23(31)：7794-7803(2005))。

在铂药剂中，卡铂看起来具有和顺铂相似的效力，但是比顺比更易被承受(当与紫杉烷组合时)，其具有非血液毒性的低风险，虽然有时血液毒性风险较高(Gainford，C.等，Proc Am Soc Clin Oncol.19：113，Abstract 439(2000)；Perez，E.A.等，Cancer 88(1)：124-131(2000)；Perez，E.A.等，Oncology 69(2)：117-121(2005))。当卡铂与紫杉醇而不与多西他赛组合时，中性白细胞减少症的发生率减少(Perez，E.A.等，Cancer88(1)：124-131(2000)；Perez，E.A.等，Oncology 69(2)：117-121(2005))。

贝伐单抗是单克隆抗体，其靶向血管内皮生长因子(VEGF)，以抑制血管形成。向基于紫杉烷的化疗中添加贝伐单抗在具有转移性乳腺癌的女性中显著改进了治疗应答速率和无进展生存期(PFS)(Miller，K.D.等，N Engl J Med.357(26)：2666-2676(2007)；Miles，D.W.等，Cancer Res.69(24S)：495s，Abstract 41(2009)；Robert，N.J.等，J Clin Oncol.27(15suppl)：42s，Abstract 1005(2009))。

目的

本研究使用了未受治疗的TNMBC的登记转移性活检(bxs)，以(1)描述TNMBC中的信号通路的表达/活化，和(2)将TNMBC中这些表达模式与应答关联起来。

方法

用在试验启动时获得的新鲜冷冻的转移性活检，评估信号通路蛋白质(例如HER1(EGFR)、HER2、HER3、胰岛素样生长因子受体1(IGF1-R)、c-KIT、c-MET、PI3K、AKT、MAPK和/或VEGFR2)的表达和活化。使用接近检验平台(例如CEER)来测定复杂通路蛋白表达和活化。对数排序检验被用于测试无进展生存期(PFS)和通路蛋白的蛋白质表达或活化之间的关系。用于本研究的肿瘤组织样品获得自进行中的名为“A Phase II Study ofCarboplatin and Bevacizumab[triplet therapy]in‘Triple Negative’(Demonstrating No Expression forEstrogen，Progesterone，or Her2Receptors)Metastatic Breast Cancer”的临床试验，其具有下述ClinicalTrials.gov标识符：NCT00479674，就所有目的而言，该文本的公开内容通过引用以其整体并入本文。

结果

总EGFR表达于11/18(61％)个活检中，但是仅在3/18(17％)中是被活化的。PI3K和AKT分别在11/18(61％)和8/18(44％)的患者中过表达，并且在6/18(33％)的活检中共表达。在17个转移性活检中，有较高的总EGFR表达(33周对22周，p＝0.14)以及更低的VEGFR2表达(33周对18周，p＝0.16)。所有测量都是通过CEER进行。

结论

nab-紫杉醇/卡铂/贝伐单抗提供了针对TNMBC的被良好承受和有效的疗法。总EGFR的过表达和较低的VEGFR2水平为TNMBC中对三联疗法的应答提供了预测性的值。实时转移性活检表明在原发性和转移性肿瘤之间存在重要改变，并且这些改变在定义针对TNMBC的应答的预测性标志物中高度有影响。

实施例3复杂通路描绘，以预测三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)中对含有卡铂(C)/贝伐单抗(B)的疗法的应答

背景：在TNMBC中需要改进的疗法和预测性标志物。B(阿瓦斯汀)和C(卡铂)组合在很多实体瘤(包括TNBC)中有活性。该研究使用了归档的原发性和未受治疗的TNMBC转移性活检(bxs)，(1)以测定VEGFR2在原发性和TNMBC中的表达水平，(2)以描述TNMBC中多种信号通路蛋白的表达/活化，以及(3)将TNMBC中这些表达模式与应答关联起来。

方法：收集三阴性乳腺癌核心活检标本，并适当地贮藏于-80℃。应用新颖的免疫检验方法，以调查1000ng至5000ng冷冻组织中信号蛋白表达和活性的水平。CEER平台(aka COPIA)是多重免疫微阵列平台，其利用独特的免疫复合体的形成，所述免疫复合体需要针对经通道运送事件的两种检测抗体的共定位，用于信号产生/扩增，这导致产生极其高的分析灵敏性和特异性。

结果：本研究在每种标本中鉴定了程度变动的CK值(从大约3至1000个肿瘤细胞/1000ng至5000ng的细胞裂解物)。在这些TNMBCs中，HER2表达水平在低至中度(0至2+，IHC等同)的范围内，并在18种样品的17种中被发现。18种样品中的一种具有实质上高水平的HER2表达(IHC 3+水平)。标本的50％没有显示出HER2磷酸化，而另外50％显示出变动水平的活化的HER2。还在这些样品中分析了HER1、HER3、IGF1-R、c-KIT、c-MET、PI3K、Shc、VEGFR2和AKT表达/活化的普及程度。

结论：实时转移性活检表明，在原发性和转移性肿瘤之间有重要的改变，并且这些改变在对应答的预测性标志物的鉴定中高度有影响。总的和活化的EGFR的过表达，以及较低的VEGFR2水平为对TNMBC中三联疗法(B+C+Nab-紫杉醇)的应答提供了预测性的值。因为疾病情况经常移动，监测转导通路蛋白中的改变将有用于疗法调节。

实施例4乳腺癌患者中多种信号通路蛋白的功能描绘

摘要

原发性或获得性耐药性的机制之一是缺乏氨基末端细胞外结构域的截短的HER2/ERBB2受体(“t-ERBB2”)的多种形式的表达。t-ERBB2同工型的非限制性例子包括p110、p95HER2(p95m)、p95c和p95n。用于描绘原发性和转移性肿瘤中具有转活性潜力的HER2受体和其它受体酪氨酸激酶(RTKs)的多种形式的方法可向移动中的疾病病理提供有价值的知识。本实施例描述了在具有多种ER/PR/HER2状况的230个乳腺癌中针对它们的表达和活化对信号转导通路蛋白的组的成功描绘。特别地，使用本文描述的新颖的接近介导的免疫微阵列方法，来调查人乳腺肿瘤样品中总的和磷酸化的t-ERBB2种类的水平。本实施例显示，在强ERBB2阳性肿瘤中检测到了t-ERBB2同工型(31个样品中的16个，52％)，以及在38个样品中的10个中磷酸化(32％)。

导论

已经报道了针对曲妥珠单抗耐药性的若干机制。主要地，已经频繁报道了其它RTKs(例如IGF1-R)的活化和HER2的截短形式的积累，等等。特别地，HER2的氨基末端截短的羧基末端片段(合称为p95HER2)被频繁发现于表达HER2的乳腺癌细胞系和肿瘤中。多种信号转导通路中的串扰(cross-talk)和反馈环为肿瘤提供了某些治疗压力或通路沉溺(addiction)下的逃逸机制，并且需要复杂的诊断工具来进行“通路网络分析”。基于通过针对数种选择的生物标志物进行目前基于IHC/FISH的技术获得的临床信息做出的治疗决定对于治疗具有迅速进化中的异源疾病的患者无效。本实施例展示，检测抗体的不同构型允许对截短的靶(例如p95HER2)与其全长副本(例如HER2)进行差异检测。具体地，本实施例阐述了新颖的、高灵敏性和特异性的抗体微阵列形式(协同酶增强反应性免疫检验(Collaborative Enzyme Enhanced Reactive ImmunoAssay，CEER))用于在转移性肿瘤的快速冷冻组织和细针抽吸物二者中对人样品中总的和磷酸化的t-ERBB2种类的水平进行定量的用途。本实施例还展示了对HER2、p95HER2、HER1、HER3和IGF1R以及下游信号转导蛋白PI3K、Shc和c-MET的功能性状况(表达和活化)的分析。

方法

多重微阵列印制：使用非接触印刷机(Nanoplotter，GeSiM)，将捕获抗体(Abs)印制到硝酸纤维素涂布的玻片(

GraceBio-Labs)上。点直径为大约175μm，经印制的玻片于4℃被放置于干燥腔中。每个点包括示踪染料和特异性捕获Abs。大约500pL的捕获Abs被以三份重复和1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL的系列稀释浓度印制。经纯化的小鼠IgGs作为阴性对照被印制。每张玻片含有用于产生标准曲线的细胞系对照，以对每张玻片上运行的样品进行精确定量。在每张玻片上运行内部品质对照样品，以确保产生自每阵列-玻片的数据的品质。

抗体缀合和纯化：用双功能性交联剂琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，活化靶特异性和Abs和对应的检测剂酶，并将其偶联至葡聚糖，以制造抗体-葡聚糖-酶聚合物缀合物。使用尺寸排除柱，通过HPLC纯化缀合物。通过竞争性ELISA检测经纯化的缀合物中的Ab活性，并通过特异于每种检测酶的功能检验来检测酶活性。

协同酶增强反应性免疫检验(Collaborative Enzyme EnhancedReactive ImmunoAssay，CEER)：如图3所示，存在于组织裂解物中的靶蛋白与硝酸纤维素表面上印制的特异性捕获抗体结合，未结合的非靶蛋白被从玻片移除。与葡糖氧化酶(GO)缀合的、针对捕获的靶蛋白上备选表位的一种检测抗体和与HRP缀合的、特异于靶蛋白上的磷酸化位点或另一非重叠表位的另一检测抗体之间的酶促相互作用导致信号产生以及随后的酪胺介导的信号扩增。特别地，用TBST(50mM Tris/150mM NaCl/0.1％Tween-20，pH 7.2-7.4)对免疫微阵列玻片漂洗2次，用80μLWhatman封闭缓冲液于室温下封闭1小时，然后用TBST洗2次。80μL稀释缓冲液(2％BSA/0.1％Triton X-100/TBS，pH 7.2-7.4)中经系列稀释的细胞裂解物对照和样品被加入至亚阵列，并针对玻片上的标准命名，然后在室温孵育1小时。孵育后，对玻片洗4次，每次3分钟。检测Abs加入至80μL反应缓冲液，并在室温下孵育2小时。通过用TBST洗涤除去未结合的二级检测Abs后，加入80μL生物素-酪胺(乙醇中400μg/mL，Perkin Elmer Life Science)(5μg/ml，50mM葡萄糖/PBS中)，并在黑暗中孵育15分钟。通过用TBST洗4次(每次3分钟)来停止GO-HRP作为通道的酪胺介导的信号扩增过程。通过添加0.5μg/ml(1∶4000稀释)处于2％BSA/0.1％Triton/TBS中的链霉抗生物素(SA)-Alexa647(PBS中，Invitrogen)进行40分钟，检测生物素-酪胺的局部沉积。孵育完成后，用TBST洗玻片4次，干燥，并放在黑暗中，直到在微阵列扫描仪上扫描。

tErbB2(例如p95HER2)富集：使用经磁性标记的特异于ErbB2的细胞外结构域(ECD)的抗体，从细胞裂解物移出全长p185-ErbB2受体。得到的没有p185-ErbB2的细胞裂解物含有缺乏ECD的t-ERBB2受体蛋白，进行后续分析，以定量t-ERBB2表达和活化的水平。

临床样品：快速冷冻的乳腺癌组织购自ILSBio。所有患者都是具有II或III期导管癌的高加索裔。ErbB2-IHC状况是对所有样品均可获得的。在100μL裂解缓冲液中裂解快速冷冻的组织样品。将裂解的样品放到冰上30分钟，并离心。通过BCA蛋白检验试剂盒(Pierce)测定上清液的蛋白质浓度，在后续分析之前得到的裂解物贮藏于-80℃。从具有进展性的、可测量的转移性IIIB期或IV期的乳腺癌患者(他们将要开始全身疗法)收集FNA样品。患者具有经组织学或细胞学验证的侵入性乳腺癌。使用G23号针头收集FNA样品。将FNA样品立即注射进含有裂解缓冲液的收集管中，并连夜运输用于后续分析。

IP-Western杂交印迹：将细胞裂解物与缀合有针对ERBB2的ICD的抗体的磁性珠粒一起在摇动槽中于4℃孵育过夜。将经免疫磁性富集的裂解物重新悬浮于含有β-巯基乙醇的样品缓冲液中，煮沸5分钟，冷却至室温，并装载到NuPage(Invitrogen)4-12％凝胶上。完成后，将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后洗涤，并用5％奶blotto封闭，并在使用NBT/BCIP进行的检测过程之前与1°然后2°Abs一起孵育。

CEER数据分析：在三个光电倍增器(PMT)增益调整处对每张玻片进行扫描，以增加有效动态范围。针对三份重复印制的重复点，对经背景校正的信号强度进行平均。从每份样品减去各试剂空白的相对荧光值。使用若干品质标准，对来自进一步分析的数据进行过滤，包括对点足迹的限制、针对点重复的变化系数(coefficient of variation for spotreplicates)、总垫片背景和试剂空白的强度。对于每种检验中，从经系列稀释的、从BT474细胞制备的细胞裂解物产生标准曲线。将数据拟合至作为捕获抗体浓度和PMT的函数获得的五个参数等式。每条曲线被绘制为对数信号强度(测量为相对荧光单位(RFU)vs.对数浓度，并且参照标准细胞系BT474)的函数。来自每种稀释和增益(gain)的各预测被平均为单种、最终预测。

结果

t-ERBB2在人细胞和肿瘤中的表达。为评估ERBB2同工型在人细胞和肿瘤样品中的活化和水平，利用CEER，这是新颖的基于抗体捕获和接近的免疫微阵列平台(图3)。CEER要求靶特异性的捕获抗体与两种额外的检测抗体之间的免疫复合体的形成。检测抗体之一与葡糖氧化酶(GO)缀合，另一种与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。检测抗体可与两种表位结合(其确定靶表达水平)，或与捕获的蛋白质和另一备选表位的磷酸化结构域结合(其确定靶活化水平)。当底物例如葡萄糖提供给免疫复合体中的GO时，其产生过氧化氢(H₂O₂)，其可被经通道运送至共定位的HRP，由此增强分析灵敏性。因为检验构造(configuration)需要多种捕获/检测抗体之间成功的免疫复合体形成，该平台提供了在多种靶蛋白上同时进行分析所需的特异性。如图4所示，该方法能以单数位的分析灵敏性检测BT474细胞系中总的和磷酸化的ERBB2。对有和没有除去全长p185-ERBB2的BT474细胞的差异性ERBB2图谱(具有ERBB2-ECD和ERBB2-ICT捕获)的比较显示，该ERBB2扩增的细胞系中(具有大约1.2X10⁶ERBB2/细胞)有大约4.4％的t-ERBB2(或～52800tERBB2受体/细胞)(图5)。

使用免疫组织学分析，针对ERBB2水平，对来自74名患者的冷冻的乳腺肿瘤样品进行计分，然后使用CEER进行分析(表3)。74份样品中，24份是ERBB2低/阴性(通过IHC打分为0-1)，19份具有中度ERBB2表达(分数＝2)，剩下的31份具有ERBB2的高表达(分数＝3)。通过CEER分析，如预期那样，ERBB2低或阴性的肿瘤没有表达显著水平的截短的ERBB2。每种样品中ERBB2和t-ERBB2和磷酸化的t-ERBB2的水平(以参照BT474细胞的RTK分子/细胞显示)被概括于表2中。但是，10％(2/19)的中度ERBB2阳性肿瘤表达t-ERBB2，以及52％(16/31)的强ERBB2阳性肿瘤表达t-ERBB2。此外，在中度ERBB2阳性肿瘤(10％，19份样品中的2份)和高ERBB2肿瘤(32％，31中的10)二者中t-ERBB2同工型被磷酸化。存在具有显著水平的tERBB2磷酸化和仅中度水平的t-ERBB2的样品(20300和24913)，这可能是因为t-ERBB2可通过与其它RTK的相互作用活化。肿瘤CEER-ERBB2图谱和对ERBB2的IP-Western分析的例子分别提供于图6(样品在表2中下划线列出)和图7(样品在表2中加框列出)中。此外，来自8名乳腺癌患者的转移位点的FNA被分析。具有ERBB2阳性疾病的三份样品显示程度变动的t-ERBB2和磷酸化的t-ERBB2(表3)，而来自ERBB2阴性癌症的样品不显示t-ERBB2表达。在扩展的RTK描绘上，在8C3-005-006中检测到IGF1R和c-MET表达，并且这可能是ERBB2阳性FNA样品中虽然t-ERBB2水平较低而pt-ERBB2的水平较高的原因。

表1人乳腺肿瘤中t-ERBB2的表达和磷酸化

表2乳腺癌组织的ERRR2描绘

针对下划线的样品图6中显示示例性的CEER阵列图像，以及图7中显示了针对加框样品的IP-Western杂交印迹。通过比较样品的输入量和标准BT474细胞的等同量来测定RTK/细胞的值。

表3针对FNA样品的t-ERBB2分新

样品ID	t-ERBB2(RTK/细胞)	pt-ERBB2(pRTK/细胞)
			8C3-002-001	57,341	3,062
8C3-005-006	26,989	5,309
			8C3-005-007	50,741	5,204

观察到174份BCA样品中宽广范围的通路蛋白表达和活化，如图8所示。针对每种标志物具有最高信号的样品用最深的颜色示出。CEER-HER2显示出与IHC-HER2状况的高关联性。CEER和IHC之间不一致的HER2状况通过IP-Western来解决，其显示出＞98％的关联性。HER3-P水平显示出与HER3-T和PI3K活化的高度关联性。cMET图谱也显示出与PI3K活化的强烈关联性。具有非过表达但是有显著水平的HER2的BCA组织中27％(12/45是IHC的2+)和21％(11/53是IHC的0/1+)显示出表达的HER2受体中超过5％的磷酸化。

结论

HER2及其变体形式以及其它RTK的状况提供了关于由于原发性或获得性耐药性而不应答于曲妥珠单抗的HER2阳性BCA患者的潜在机制的关键信息。本文中描述的CEER分析可用于针对其信号转导蛋白对BCA患者进行图谱描绘，以选择有效的靶向疗法。

实施例5复杂通路图谱描绘，以预测三阴性转移性乳腺癌(TNMBC)中对疗法的应答

TNBC中需要改进的疗法和预测性标志物。本研究使用了来自经B(

[贝伐单抗])、C(卡铂)和nabP

(“三联疗法”)治疗的三阴性乳腺癌患者的核心活检标本，以(1)测定TNMBC中多种信号通路蛋白(例如VEGFR2、c-KIT、HER1等等)的表达和活化水平，和(2)将TNMBC中这些表达和活化模式与应答关联起来。

在用B(

[贝伐单抗])、C(卡铂)和nabP

开始治疗之前收集从患者获得的三阴性乳腺癌核心活检样品(n＝17)，并将它们适当地冷冻于-80℃。应用新颖的免疫检验方法，来调查1000ng至5000ng的冷冻组织中信号蛋白的表达和活化水平。本文描述的协同酶增强反应性免疫检验(Collaborative Enzyme Enhanced ReactiveImmunoAssay，CEER)(也被称为协同接近免疫检验(COllaborativeProximity ImmunoAssay，COPIA)是多重免疫微阵列平台，其利用独特的免疫复合体的形成，所述免疫复合体需要针对经通道运送事件的两种检测抗体的共定位，用于信号产生/扩增，这导致产生极其高的分析灵敏性和特异性。图9提供了通过CEER在三阴性乳腺癌核心活检样品上描绘的功能通路图谱的例子(较之对照T47D乳腺癌细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)而言)。特别地，通过CEER来评价TNMBC中的下述信号通路蛋白的表达和活化：EGFR(HER1)、HER2、HER3、c-Met、IGF-1R、c-KIT、PI3K、SHC、AKT和VEGFR2。

还测定了无进展生存期(PFS)。对于每种标志而言，基于分离点值，将样品分为“高”和“低”组。例如，分离点值可被选择为处于或接近中位数，以平衡组的大小(例如，8＝低，9＝高)。使用参变量t检验来将蛋白质表达和活化与PFS关联起来。针对低(例如低于中位数)相对高(例如高于中位数)的组，比较PFS。图10阐述了针对每种标志物在针对低和高的样品组的PFS之间进行的此类比较的结果。特别地，图10中的表显示，低c-KIT或低VEGFR2表达较之更高水平的该标志物而言与显著更长期的PFS相关(低总c-KIT水平为42.1周PFS，而高总c-KIT水平为20.7周；低总VEGFR2水平为39.9周的PFS，而高总VEGFR2水平为20.9周的PFS)。图10中的表还显示低IGF-1R活化、低c-KIT活化、低IGF-1R表达和低HER1活化较之更高水平的该标志物而言每种都与更长期的PFS相关。此外，图10中的表显示高HER1表达较之该标志物较低水平而言与更长期的PFS相关(高总HER1水平为36.8周的PFS，而低总HER1水平为23.4周的PFS)。图11中的表阐述了使用非参变量Wilcoxon排序总和测试进行的相似分析，其将蛋白质表达和活化与PFS关联起来。低c-KIT或VEGFR2表达再次显示出较之该标志的更高水平而言与显著更长期的PFS相关。

图12显示，测量c-KIT和VEGFR2二者的表达水平，增加了测定TNMBC中对三联疗法的应答的预测性值。特别地，低c-KIT和VEGFR2表达水平的组合(“均不高”)被发现较之其中一种或两种标志物高的样品(“一高”或“均高”)而言与显著更长期的PFS相关。

图13显示，测量VEGFR2和HER1二者的表达水平，增加了测定TNMBC中对三联疗法的应答的预测性值。特别地，高HER1和低VEGFR2表达水平的组合(“均不差”)被发现较之其中HER1表达低和/或VEGFR2表达高的样品(“一差”或“均差”)而言与显著更长期的PFS相关。

图14阐述了(A)总VEGFR2、(B)总c-KIT和(C)总HER1的增加的水平与对三联疗法的应答之间的关联，这通过PFS的长度来表明。特别地，较低的总VEGFR2或c-KIT水平与TNMBC中对三联疗法的应答相关，同时较高的HER1水平与TNMBC中对三联疗法的应答相关。

总结之，本实施例展示了下述：(1)针对c-KIT和IGF-1R两者，在活化的(磷)和总的水平之间具有关联；(2)低VEGFR2或c-KIT表达水平能预示应答；(3)高EGFR(例如，应当对基于铂的疗法应答)表达水平与应答相关联，而高P-EGFR水平则不；(4)通常，如果通路活性(例如P-c-KIT、p-IGF-1R、p-EGFR、p-AKT和其它)低(例如，非高增殖性肿瘤)，则患者对卡铂、Nab-紫杉醇和阿瓦斯汀的三联疗法具有更高的PFS；以及(5)关于组合治疗剂，向总c-KIT或EGFR表达添加总VEGFR2表达导致产生更好的预测值。

实施例6肿瘤组织收集和加工

可从具有癌症的患者获得肿瘤组织或FNA样品，以使用本文描述的接近检验(例如CEER)进行信号转导通路考察。例如，可通过切片或进行冷冻FNA流程，从冷冻的组织获得用于通路分析的样品。在某些情况下，在冷冻的标本上进行组织切片，用于之后的情况分析。在某些其它情况下，进行相对不侵入性的FNA流程，以从临床环境中的患者(和异种移植物)获得样品。

可通过下述方法来收集冷冻的组织样品：

先择#1组织切片收集

1.在干冰上保持塑料称重盘，其中进行样品切割。

a.为冷却材料，将保险刀片或显微切片机的刀片、细镊子和经预标记的样品收集管放在干冰上。

2.从-80℃冷冻室取出冷冻的人类癌组织，立即将样品转移到干冰上。

3.将冷冻的组织放到干冰上的称重盘上，使用保险刀片或显微切片机的刀片，切冷冻组织的小片(10μm切片x3)，并使用预冷却的镊子将组织转移至经预冷却和预标记的样品收集管。

4.关盖，并放在干冰上。

5.首先将收集的标本放进双层塑料袋，然后放进具有足够量干冰的Styrofoam容器(主容器)。

a.使用至少6-8磅干冰。在夏季的月份里使用更多。

注意：在咨询运输公司后将确定干冰的精确量。

b.咨询运输公司关于国际运输过程的必要许可和文件。

c.不使用湿冰或冷却剂(即冷冻包装)。

6.确定请求单和样品列表放在盒子里，但在双层袋的外面。

7.安全密封容器，并且标记“冷冻组织-请勿解冻”。

选择#2从冷冻的组织进行FNA制备：

1.从-80℃冷冻室取出冷冻的人类癌组织，立即将样品管转移到干冰上。

2.为FNA流程准备样品应当被放到湿冰上10分钟，以软化组织。

3.应当通过使23号或25号的针头透过软化的冷冻组织5至10次，来进行FNA样品收集。将剩余样品管放回到干冰上。

4.用酒精擦拭FNA样品收集管帽。

5.应当通过直接注射进含有100μl“protein later solution”的收集管(Prometheus Laboratories；San Diego，CA)中来收集冷冻的FNA组织。通过温和混合内含物，分散收集的组织材料。

6.用一只手紧紧拿住FNA收集管，并且进行迅速手指弹击(～15x)，以确保整个(through)细胞裂解(如果可能的话，振荡混合10秒)。

7.首先将收集的标本放进双层塑料袋，然后放进具有冷冻包装的Styrofoam容器(主容器)。

a.咨询运输公司关于国际运输过程的必要许可和文件。

8.确定请求单和样品列表放在盒子里，但在双层袋的外面。

9.安全密封容器，并且标记“生物标本”。

实施例7用于对癌细胞中信号转导通路蛋白进行定量的数据分析

本实施例阐述了针对为特定目的分析物产生的标准曲线来对生物样品(例如血或肿瘤组织)中一种或多种分析物(例如一种或多种信号转导蛋白)的表达和/或活化水平进行的定量。

在一些实施方式中，以三个光电倍增器(PMT)增益调节，扫描每块CEER玻片，以改进灵敏性，以及降低饱和的影响。使用PerkinElmer ScanArray Express软件进行点发现和信号定量。针对每个点的标志符从GenePix Array List(.gal)文件输入。将玻片上针对每种临床样品的去标识的研究特异性数字包括进得到的数据组。

在其它一些实施方式中，针对三份重复印制的重复点，对经背景校正的信号强度进行平均。从每份样品减去各试剂空白的相对荧光值。使用若干品质标准，对来自进一步分析的数据进行过滤，包括对点足迹的限制、针对点重复的变化系数(coefficient of variation)、总垫片背景和试剂空白的强度。

对于每种检验，从经系列稀释的、从细胞系制备的细胞裂解物的多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种等等)浓度产生“S”形标准曲线，所述细胞系例如MD-468(HER1阳性)、SKBr3(HER2阳性)、BT474(HER2和p95HER2阳性)、HCC827(c-MET和HER1阳性)、用IGF刺激的T47D(IGF1R阳性)和/或用HRG刺激的T47D(HER3阳性)。每条曲线被绘制为信号强度对来自对数浓度的单位CU(计算单位)的函数。可通过非线性回归将数据拟合至五个参数等式(5PL)(Ritz，C.and Streibig，J.C.，J.Statistical Software，12，1-22(2005))，同时拟合捕获抗体的全部三种稀释。使用R，开源统计学软件包(DevelopmentCore Team，R：A language and environment for statistical computing.RFoundation for Statistical Computing，Vienna，Austria.ISBN3-900051-07-0，URL http://www.R-project.org.R(2008))来进行拟合。为避免数学模型的过度参数化以及由此改进精确度，可限制四个参数，同时可针对各拐点对每种稀释求解。该过程可针对45、50和60的每种PMT增益调节重复。这导致每检验从捕获抗体的三种稀释和三种PMT扫描产生九条标准曲线。检验中的内置冗余允许一种或多种稀释/扫描组合消失，如果标准曲线的拟合具有低于0.95的R²并且由此改进随后的预测的话。

CU计算(基于标准曲线)-可将来自每条标准曲线的各预测(例如3种捕获抗体稀释和3种PMT增益调节扫描)组合进单的、最终预测。对于每种预测而言，计算标准曲线上的点的斜率。用x轴上的对数单位取斜率，即，斜率的分母的单位是对数计算单位(CU)。第二，计算预测的加权平均，权重是从斜率确定的。具体来说，加合权重，对每个点给予权重(等于其斜率除以总斜率)。可针对对已知对照的预测，证实每种检验。

本申请文件中提到的所有公开文本和专利申请都通过引用并入本文，就像每篇单独的公开文本或专利申请被特别地、单独地指出通过引用并入本文一样。虽然为理解清楚的目的，已通过阐述和实施例的方式，以一定的详细程度对前述发明进行了描述，但考虑到本发明的教导，本领域普通技术人员将易于清楚，可对其进行某些改变和改良，而不偏离所附权利要求的宗旨或范围。

Claims (47)

1.用于测定三阴性肿瘤细胞对使用抗癌药物的疗法的灵敏性的方法，所述方法包括：

(a)裂解肿瘤细胞，产生细胞提取物；

(b)测定所述细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的所述细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-IR的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平相比较，

其中较之所述参照表达水平而言所述细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HER1表达的高水平和/或IGF-1R表达的低水平的存在指示所述肿瘤细胞对所述抗癌药物敏感。

2.权利要求1的方法，其中所述抗癌药物选自单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素性治疗剂、放疗剂、疫苗及其组合构成的组。

3.权利要求1的方法，其中所述抗癌药物是贝伐单抗

卡铂和紫杉醇的组合。

4.权利要求3的方法，其中所述紫杉醇是纳米颗粒清蛋白结合的(nab)紫杉醇。

5.权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述参照表达水平是从产生自癌细胞系的标准曲线计算的。

6.权利要求5的方法，其中所述标准曲线产生自多种浓度的、从所述癌细胞系制备的经系列稀释的细胞提取物。

7.权利要求5或6的方法，其中所述癌细胞系表达VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R。

8.权利要求1至7中任意一项的方法，其中较之所述参照表达水平而言所述细胞提取物中VEGFR2表达的中等至高水平、c-KIT表达的中等至高水平、HER1表达的低至中等水平和/或IGF-1R表达的中等至高水平的存在指示所述肿瘤细胞对所述抗癌药物有耐药性。

9.权利要求1至8中任意一项的方法，其中所述方法包括测定所述细胞提取物中VEGFR2和c-KIT和/或HER1的表达水平。

10.权利要求1至9中任意一项的方法，其中所述方法还包括测定所述细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1、IGF-1R和/或AKT的活化水平。

11.权利要求1至10中任意一项的方法，其中所述方法还包括测定所述细胞提取物中一种或多种额外的信号转导分子的表达和/或活化水平。

12.权利要求11的方法，其中所述一种或多种额外的信号转导分子选自由HER2、p95HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、P70S6K、GSK-3β、Shc、c-MET、VEGFR1、VEGFR3、受体二聚体及它们的组合构成的组。

13.权利要求1至12中任意一项的方法，其中所述肿瘤细胞是乳腺癌细胞。

14.权利要求1至13中任意一项的方法，其中所述肿瘤细胞是循环中的肿瘤细胞或从肿瘤获得的细针抽吸物(FNA)细胞。

15.权利要求1至14中任意一项的方法，其中所述肿瘤细胞是从样品中分离的。

16.权利要求15的方法，其中所述样品从具有三阴性转移性乳腺癌的受试者获得。

17.权利要求15或16的方法，其中所述样品是全血、血清、血浆或肿瘤组织样品。

18.权利要求1至17中任意一项的方法，其中所述方法还包括将肿瘤细胞与抗癌药物在步骤(a)之前接触。

19.权利要求1至18中任意一项的方法，其中所述方法还包括步骤(d)：以可读形式向使用者提供步骤(c)中获得的比较结果。

20.权利要求1至19中任意一项的方法，其中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平是通过检测VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的总蛋白水平测定的。

21.权利要求1至20中任意一项的方法，其中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平是用接近双重检测检验来测定的。

22.权利要求21的方法，其中所述接近双重检测检验是协同酶增强反应性免疫检验(CEER)。

23.用于预测三阴性乳腺肿瘤对使用抗癌药物的疗法的应答的方法，所述方法包括：

(a)裂解从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞，以产生细胞提取物；

(b)测定所述细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平；以及

(c)将步骤(b)中测定的所述细胞提取物中的VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平与VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的参照表达水平相比较，

其中较之所述参照表达水平而言细胞提取物中VEGFR2表达的低水平、c-KIT表达的低水平、HER1表达的高水平和/或IGF-1R表达的低水平的存在预示对使用抗癌药物的疗法的应答。

24.权利要求23的方法，其中所述抗癌药物选自单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素性治疗剂、放疗剂、疫苗及其组合构成的组。

25.权利要求23的方法，其中所述抗癌药物是贝伐单抗卡铂和紫杉醇的组合。

26.权利要求25的方法，其中所述紫杉醇是纳米颗粒清蛋白结合的(nab)紫杉醇。

27.权利要求23至26中任意一项的方法，其中所述参照表达水平是从产生自癌细胞系的标准曲线计算的。

28.权利要求27的方法，其中所述标准曲线产生自多种浓度的、从所述癌细胞系制备的经系列稀释的细胞提取物。

29.权利要求27或28的方法，其中所述癌细胞系表达VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R。

30.权利要求23至29中任意一项的方法，其中所述细胞提取物中VEGFR2表达的中等至高水平、c-KIT表达的中等至高水平、HER1表达的低至中等水平和/或IGF-1R表达的中等至高水平的存在预示缺乏对使用所述抗癌药物的疗法的应答。

31.权利要求23至30中任意一项的方法，其中所述方法包括测定所述细胞提取物中VEGFR2和c-KIT和/或HER1的表达水平。

32.权利要求23至31中任意一项的方法，其中所述方法还包括测定所述细胞提取物中VEGFR2、c-KIT、HER1、IGF-1R和/或AKT的活化水平。

33.权利要求23至32中任意一项的方法，其中所述方法还包括测定所述细胞提取物中一种或多种额外的信号转导分子的表达和/或活化水平。

34.权利要求33的方法，其中所述一种或多种额外的信号转导分子选自由HER2、p95HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2(MAPK1)、ERK1(MAPK3)、PDK1、P70S6K、GSK-3β、Shc、c-MET、VEGFR1、VEGFR3、受体二聚体及它们的组合构成的组。

35.权利要求23至34中任意一项的方法，其中所述肿瘤细胞是循环中的肿瘤细胞或从三阴性乳腺肿瘤获得的细针抽吸物(FNA)细胞。

36.权利要求23至35中任意一项的方法，其中所述肿瘤细胞是从样品中分离的。

37.权利要求36的方法，其中所述样品从具有三阴性转移性乳腺癌的受试者获得。

38.权利要求36或37的方法，其中所述样品是全血、血清、血浆或肿瘤组织样品。

39.权利要求23至38中任意一项的方法，其中VEGFR2表达的低水平的存在预示更长期的无进展生存期(PFS)。

40.权利要求23至39中任意一项的方法，其中c-KIT表达的低水平的存在预示更长期的PFS。

41.权利要求23至40中任意一项的方法，其中HER1表达的高水平的存在预示更长期的PFS。

42.权利要求23至41中任意一项的方法，其中较之VEGFR2、c-KIT或HER1单独的表达水平而言VEGFR2表达的低水平的存在组合c-KIT表达的低水平和/或HER1表达的高水平的存在预示更长期的PFS。

43.权利要求23至42中任意一项的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)之前将从三阴性乳腺肿瘤获得的肿瘤细胞与抗癌药物一起孵育。

44.权利要求23至43中任意一项的方法，其中所述方法还包括步骤(d)：以可读形式向使用者提供步骤(c)中获得的比较结果。

45.权利要求23至44中任意一项的方法，其中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平是通过检测VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的总蛋白水平测定的。

46.权利要求23至45中任意一项的方法，其中VEGFR2、c-KIT、HER1和/或IGF-1R的表达水平是用接近双重检测检验来测定的。

47.权利要求46的方法，其中所述接近双重检测检验是协同酶增强反应性免疫检验(CEER)。

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