CN109789204A - 基于her2和her3通路亚型选择乳癌患者药物疗法的方法 - Google Patents

基于her2和her3通路亚型选择乳癌患者药物疗法的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对包含酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂的疗法反应的方法。该方法包括测定各种信号转导分子的表达水平和/或活化水平，所述信号转导分子如截短HER2蛋白、全长HER2蛋白、HER3蛋白、PI3K蛋白等。确定对酪氨酸激酶抑制剂疗法或生物制剂疗法反应的可能性包括比较一种或多种信号转导分子的表达水平和/或活化水平与一种或多种特定信号转导分子的参考表达/活化水平。

Description

基于HER2和HER3通路亚型选择乳癌患者药物疗法的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月31日提交的美国临时申请No.62/343,555的优先权，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
背景技术
HER2过表达发生在大约25％的乳癌中，导致增加的细胞增殖并且与不良的临床结果相关。曲妥珠单抗是一种针对HER2蛋白细胞外结构域的重组人源化单克隆抗体，其被开发用于阻断HER2信号传导通路，并且已经显示出显著改善在患有转移性和早期HER2阳性乳癌的女性中的化疗功效。NSABP B-31和NCCTG N9831研究的联合分析显示，在患有HER2阳性、可手术的乳癌的女性中，将曲妥珠单抗并入阿霉素和环磷酰胺(AC)→紫杉醇的辅助治疗方案，无病生存率(DFS)提高52％。BCIRG 006研究显示，通过将曲妥珠单抗加入AC→多西紫杉醇的顺序治疗方案，DFS事件的风险也有类似的降低。辅助或新辅助化疗(HERA试验)完成后给予曲妥珠单抗也提供了改善的结果。基于这些结果，连续AC之后紫杉烷与曲妥珠单抗的同时启动已经成为美国用于可手术的HER2阳性乳癌在初次手术后的标准治疗。
人表皮生长因子受体是HER受体激酶家族的成员，其包括四种受体：EGFR/HER1/ErbB1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3和HER4/ErbB4。所有四种受体都由细胞外结合结构域、单个跨膜区和调节结构域组成。HER1、HER2和HER4具有细胞内酪氨酸激酶结构域，HER3没有。HER2无配体，但其作为共同受体起作用，并且实际上是其他ErbB家族成员的优选配偶体。异二聚体HER2：HER3具有最有效的下游信号传导。配体结合诱导多种组合的ErbB受体同二聚体和异二聚体的形成，导致细胞质激酶结构域的活化。这转而促进特定酪氨酸残基的磷酸化，导致多种信号传导通路的刺激。
由于过表达或通过配体介导的刺激，ErbB受体可能发生过度活化。认为在HER2的结构域IV结合的曲妥珠单抗具有多种可能的机制，通过这些机制其可发挥其抗增殖和治疗功能，包括通过阻断HER2与HER1或HER3的二聚化依赖性活化和通过阻断HER2-Src相互作用抑制配体非依赖性HER2同二聚化的信号传导功能。由于曲妥珠单抗是一种完整的单克隆抗体，该分子的Fcγ部分可通过其与免疫效应细胞(如巨噬细胞、NK细胞或细胞毒性T细胞)上的Fcγ受体结合(engage)的能力而在体内活性中发挥重要作用，以引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。最近的临床发现是Fcγ受体多态性可能是乳癌患者中曲妥珠单抗反应的决定因素，并支持ADCC在基于曲妥珠单抗疗法中的潜在作用。
患有转移性HER2阳性疾病的患者最终将对基于曲妥珠单抗的疗法产生抗性。提出了多种对曲妥珠单抗的抗性的机制，包括来自通过调蛋白诱导的配体刺激的上游信号传导的PI3K过度活化、替代的生长因子受体异二聚化如HER2：HER3、以及降低与免疫效应细胞结合的Fcγ受体的多态性。帕妥珠单抗是另一种HER2的抗体，其与结构域II结合并防止HER2：HER3的异二聚化。在先前曲妥珠单抗期间进展的HER2阳性转移性乳癌患者中，帕妥珠单抗和曲妥珠单抗(n＝66)的II期试验的总反应率为24％，完全反应率为7.6％。无进展生存期的中值为5.5个月。在转移性疾病的III期研究(n＝808)中，与单独的曲妥珠单抗和多西紫杉醇相比，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗加多西紫杉醇的双重抑制导致改善的无进展生存期(12.4个月与18.5个月，HR 0.62，p<0.001)。
在NeoSphere研究(n＝417)中，评估了患有局部晚期和炎性乳癌女性手术前的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(单独或组合或添加多西紫杉醇)。病理完全反应(pCR)如下：曲妥珠单抗加多西紫杉醇(TH)，29％；曲妥珠单抗、帕妥珠单抗加多西紫杉醇(THP)，46％；曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(HP)，17％；帕妥珠单抗加多西紫杉醇(TP)，24％。THP的病理性CR显著高于TH(p＝0.014)，而TH的病理性CR显著高于HP(p＝0.020)。总之，这些研究的解释表明HER通路的更完全阻断导致更高的pCR。
阻断下游信号传导的另一种可能方式是用小分子抑制剂如拉帕替尼或奈拉替尼抑制二聚体如HER1：1，HER1：2，HER1：3和HER2：3的酪氨酸激酶活性。已证明拉帕替尼具有作为HER2阳性转移性和局部晚期乳癌患者的一线疗法的活性，总反应率为24％。拉帕替尼的批准是基于其与卡培他滨组合用于患有进展性、局部晚期或转移性HER2阳性乳癌女性的活性，这些女性先前用蒽环类药物、紫杉烷和曲妥珠单抗治疗。蒽环类药物、紫杉烷和曲妥珠单抗的治疗方案显示总反应率为22％，其中TTP中值从单独使用卡培他滨的4.4个月改善至使用卡培他滨加拉帕替尼的8.4个月(HR，0.49；95％CI，0.34至0.71；p＝0.00004，对数秩，单侧)。
NeoALLTO试验将患者(n＝450)随机分为拉帕替尼加紫杉醇、曲妥珠单抗加紫杉醇、拉帕替尼和曲妥珠单抗加紫杉醇共存。在拉帕替尼和曲妥珠单抗加紫杉醇共存组中，由于GI毒性，拉帕替尼的剂量从1000mg/天降至750mg/天。在组合组中，该研究符合其主要终点(primary endpoint)，pCR(乳腺)为51.3％，而单独的曲妥珠单抗和拉帕替尼组分别为29.5％和24.7％。新辅助、HER2阳性患者的Geparquinto研究(n＝620)比较了表阿霉素、环磷酰胺、随后是多西紫杉醇(EC-DOC)与曲妥珠单抗或拉帕替尼二者之一。pCR率(乳腺中无侵袭性疾病)支持曲妥珠单抗组，50％与35％(p<0.05)。值得注意的是，由于在磨合期的毒性降低了拉帕替尼的剂量，并且更多患者停止对拉帕替尼的靶向疗法。
在2008年的圣安东尼奥乳癌研讨会上提出的另一项研究中，报道了来自两组HER2阳性、局部晚期疾病但没有先前治疗的患者的结果。对40名患者进行的第一项研究每周使用曲妥珠单抗x 3个周期，随后每3周使用曲妥珠单抗和多西紫杉醇的组合x 4个周期。pCR率为34％。在49名患者的第二组中，拉帕替尼作为单一药剂以每日1500mg的全剂量给予，持续6周，随后是曲妥珠单抗/多西紫杉醇x 4个周期。该组中的pCR率为68％。该研究包括显示为具有低PTEN表达和PI3激酶突变的患者的生物标志物的激发性分析。曲妥珠单抗组中的pCR率为18％，而拉帕替尼的pCR率为87％，表明作用机制不同。对曲妥珠单抗抗性的潜在机制包括：HER2细胞外结构域的切割，其产生对曲妥珠单抗反应较低的强致癌受体(p95HER2)；异常的PTEN功能；尽管HER2信号传导中断，但通过EGFR活化的异二聚体的继续活化和与EGFR异二聚化。
拉帕替尼和奈拉替尼均与pan ErbB受体酪氨酸激酶的ATP位点结合，并防止下游信号传导通路的磷酸化和活化。在BT474细胞系中，奈拉替尼(HKI-272)有效抑制MAPK和AKT信号转导通路的磷酸化，而曲妥珠单抗不能完全抑制HER2受体磷酸化或下游信号传导事件。在过表达HER2的肿瘤异种移植中，已观察到奈拉替尼以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长
即使在单独的II期研究中，拉帕替尼和奈拉替尼在可比较患者中的总反应率表明奈拉替尼作为单疗法在曲妥珠单抗难治性患者(反应率为5.1％与26％)和未接受曲妥珠单抗的患者(反应率为24％对56％)中的有效功效。总之，数据显示治疗乳癌患者的疗法选择具有挑战性。因此，本领域需要改进的选择乳癌患者药物疗法的方法。
发明内容
在一个方面，本发明提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应的方法。该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平；(c)分别比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平；和(d)基于细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平分别与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平相比较的差异，确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
根据以下详细说明和附图，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图的简要说明
图1提供了实施例1中描述的临床研究的设计。
图2A和2B提供了关于在CEER研究中分析的肿瘤样品(图2A)和信号转导分子(图2B)的信息。
图3A-3C显示了来自患有IIB至III期乳癌患者的基线肿瘤样品中HER2表达的分布。这些患者也是HER阳性。图3A表示线性标度上的数据。图3B表示自然对数标度上的数据。图3C提供了分位数和四分位数的分布。
图4A和4B显示了存在病理完全反应与基线肿瘤样品中HER2表达的分布之间的相关性。
图5A-5C显示在对奈拉替尼无反应者、对奈拉替尼反应者、对曲妥珠单抗无反应者和对曲妥珠单抗反应者的基线肿瘤样品中的p95HER2表达的水平。图5A表示作为p95HER2蛋白表达水平与细胞角蛋白表达水平的比率的p95HER2表达水平(奈拉替尼无反应者与奈拉替尼反应者之间的p值＝0.006；奈拉替尼反应者与曲妥珠单抗无反应者之间的p值＝0.027)。图5B提供所分析的每组中75％四分位数、中值和25％四分位数的比率。图5C显示所分析组中总p95HER2蛋白中值水平的倍数变化百分比。
图6A-6C显示在对奈拉替尼无反应者、对奈拉替尼反应者、对曲妥珠单抗无反应者和对曲妥珠单抗反应者的基线肿瘤样品中的全长HER2蛋白的水平。图6A表示作为HER2蛋白的表达水平与细胞角蛋白的表达水平的比率的总HER2蛋白水平(奈拉替尼无反应者与奈拉替尼反应者之间的p值＝0.027；奈拉替尼反应者与曲妥珠单抗无反应者之间的p值＝0.032)。图6B提供所分析的每组中75％四分位数、中值和25％四分位数的比率。图6C显示所分析组中总HER2蛋白中值水平的倍数变化百分比。
图7A-7C显示在对奈拉替尼无反应者、对奈拉替尼反应者、对曲妥珠单抗无反应者和对曲妥珠单抗反应者的基线肿瘤样品中的活化HER2蛋白的水平。图7A表示作为HER2蛋白的活化水平与细胞角蛋白的表达水平的比率的活化HER2蛋白水平(奈拉替尼反应者与曲妥珠单抗无反应者之间的p值＝0.07)。图7B提供所分析的每组中75％四分位数、中值和25％四分位数的比率。图7C显示所分析的组中活化HER2蛋白的中值水平的倍数变化百分比。
图8A-8C显示在对奈拉替尼无反应者、对奈拉替尼反应者、对曲妥珠单抗无反应者和对曲妥珠单抗反应者的基线肿瘤样品中的活化HER3蛋白的水平。图8A表示作为HER3蛋白的活化水平与细胞角蛋白的表达水平的比率的活化HER3蛋白水平(奈拉替尼无反应者与曲妥珠单抗反应者之间的p值＝0.025；奈拉替尼反应者与曲妥珠单抗反应者之间的p值＝0.07；曲妥珠单抗无反应者与曲妥珠单抗反应者之间的p值＝0.11)。图8B提供所分析的每组中75％四分位数、中值和25％四分位数的比率。图8C显示所分析的组中活化HER3蛋白的中值水平的倍数变化百分比。
图9A-9C显示在对奈拉替尼无反应者、对奈拉替尼反应者、对曲妥珠单抗无反应者和对曲妥珠单抗反应者的基线肿瘤样品中的活化PI3K蛋白的水平。图9A表示作为PI3K蛋白的活化水平与细胞角蛋白的表达水平的比率的活化PI3K蛋白水平(奈拉替尼反应者与曲妥珠单抗反应者之间的p值＝0.07)。图9B提供所分析的每组中75％四分位数、中值和25％四分位数的比率。图9C显示所分析的组中活化PI3K蛋白的中值水平的倍数变化百分比。
图10显示在对奈拉替尼无反应者、对奈拉替尼反应者、对曲妥珠单抗无反应者和对曲妥珠单抗反应者的基线肿瘤样品中的活化HER2蛋白、活化ERK蛋白、活化RSK蛋白、活化HER3蛋白、活化AKT蛋白、活化PRAS40蛋白和活化RPS6蛋白的水平。
图11A-11C显示来自无反应者和反应者的基线肿瘤样品中截短HER2蛋白的表达水平和HER3蛋白的活化水平可以组合成用于治疗选择的预测模型。图11A显示可以基于包含表达水平和活化水平数据的算法将反应者和无反应者分类为两个独立且不同的组。图11B显示反应者和无反应者仅包括HER2阳性乳癌患者。图11C显示预测模型的灵敏度和特异性。
具体实施方式
I引言
本文提供了一种可以帮助乳癌患者治疗选择的方法。还提供了通过向可能对TKI反应的患者施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)来治疗乳癌的方法。类似地，提供了通过向可能对生物制剂反应的患者施用生物制剂来治疗乳癌的方法。
II.定义
除非另有说明，否则如本文所用，以下术语具有归于其的含义。
术语“酪氨酸激酶抑制剂”或“TKI”是指抑制(例如，阻断、破坏或失活)酪氨酸激酶(例如，受体酪氨酸激酶或非受体酪氨酸激酶)的活性的任何小分子化合物或生物药物。例如，抑制剂可以直接结合(例如，复合)酪氨酸激酶，并中断(例如，阻断)位于酪氨酸激酶下游的信号转导通路。
术语“生物制剂(biologic)”、“生物药物”或“生物学药物”是指在生物学来源(例如人、动物、微生物等)中制造、从其提取、从其衍生、或从其部分合成的治疗剂或药物。生物制剂的非限制性实例包括血液及其组分、过敏原提取物、人细胞和组织、疫苗、抗体、重组多肽，重组多核苷酸、基因疗法、细胞疗法等。可用于治疗癌症的生物制剂包括靶向癌症疗法如人源化抗体、单克隆抗体、免疫疗法等。
术语“新辅助疗法”是指在手术前施用的术前或初级疗法。
术语“分析物”是指任何感兴趣的分子，通常是大分子，如多肽，测定其存在、量(表达水平)、活化状态或水平和/或同一性。非限制性分析物包括信号转导分子，其包括实施过程的蛋白质和其他分子，通过该过程细胞将细胞外信号或刺激转化为细胞内反应，通常包括有序的生化反应顺序。在某些情况下，分析物是肿瘤细胞的细胞组分，优选HER1、HER2和/或HER3信号传导通路的分子和与癌症相关的其他信号传导通路的分子。
术语“信号转导分子”或“信号转导”包括实施过程的蛋白和其他分子，通过该过程细胞将细胞外信号或刺激转化为细胞内反应，通常包括有序的生化反应顺序。信号转导分子的实例包括但不限于受体酪氨酸激酶如EGFR(例如，EGFR/HER-1/ErbB1、HER-2/Neu/ErbB2、HER-3/ErbB3、HER-4/ErbB4)，VEGFR-1/FLT-1,VEGFR-2/FLK-1/KDR,VEGFR-3/FLT-4,FLT-3/FLK-2,PDGFR(例如PDGFRA、PDGFRB),c-KIT/SCFR,INSR(胰岛素受体),IGF-IR,IGF-IIR,IRR(胰岛素受体相关受体),CSF-1R,FGFR 1-4,HGFR 1-2,CCK4,TRK A-C,MET,RON,EPHA 1-8,EPHB 1-6,AXL,MER,TYRO3,TIE 1-2,TEK,RYK,DDR 1-2,RET,c-ROS,V-钙黏素,LTK(白细胞酪氨酸激酶),ALK(间变性淋巴瘤激酶),ROR 1-2,MUSK,AATYK 1-3,RTK 106和受体酪氨酸激酶的截短形式，如p95ErbB2；非受体酪氨酸激酶，如BCR-ABL,Src,Frk,Btk,Csk,Abl,Zap70,Fes/Fps,Fak,Jak,Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号传导级联组分，如Akt,MAPK/ERK,MEK,RAF,PLA2,MEKK,JNKK,JNK,p38,Shc(p66),PI3K,Ras(例如,K-Ras,N-Ras,H-Ras),Rho,Rac1,Cdc42,PLC,PKC,p70S6激酶,p53,细胞周期蛋白D1,STAT1,STAT3,PIP2,PIP3,PDK,mTOR,BAD,p21,p27,ROCK,IP3,TSP-1,NOS,PTEN,RSK 1-3,JNK,c-Jun,Rb,CREB,Ki67和桩蛋白；核激素受体如雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，雄激素受体，糖皮质激素受体，盐皮质激素受体，维生素A受体，维生素D受体，类视黄醇受体，甲状腺激素受体和孤儿受体；核受体共活化因子和抑制因子，如分别在乳癌-1(AIB1)中扩增和核受体共阻遏蛋白1(NCOR)；及其组合。
在分析物或生物标志物的上下文中，术语“活化水平”是指特定信号转导分子或分析物被活化(例如，磷酸化、泛素化和/或复合)的水平程度。
在分析物或生物标志物的上下文中，术语“表达水平”是指特定信号转导蛋白的量或水平。
术语“样品”包括从患者获得的任何生物样本。样品包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如外周血单核细胞)、唾液、尿液、粪便(即排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、乳头吸出液、淋巴(例如，淋巴结的播散性肿瘤细胞)、细针吸出液、任何其他体液、组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤的活检物(例如，穿刺活检物)及其细胞提取物。在一些实施方案中，样品是全血或其级分组分，如血浆、血清或细胞沉淀。在某些情况下，通过使用本领域已知的任何技术从全血或其细胞级分中分离实体瘤的循环细胞并制备该循环细胞的细胞提取物来获得样品。在其他实施方案中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织样品，例如来自乳房的实体瘤。
术语“受试者”或“患者”通常包括人，但也可包括其他动物，如，例如其他灵长类动物、啮齿动物、犬、猫、马、绵羊、猪等。
在分析物的上下文中，短语“高1倍”或“高100％倍数变化”是指分析物的水平(例如，表达水平或活化水平)是参考水平的两倍。
III.实施方案的详细描述
本文提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应的方法。该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平；(c)分别比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平；和(d)基于细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平分别与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平相比较的差异，确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
在一些实施方案中，用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应的方法包括：(a)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平；(b)分别比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平；和(c)基于细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平分别与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平相比较的差异，确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。在某些情况下，通过裂解从人受试者样品中获得的乳癌细胞产生细胞提取物。
在一些实施方案中，乳癌是HER2阳性的局部晚期乳癌。
在一些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是pan-HER抑制剂或双重HER1/HER2抑制剂。pan-HER抑制剂可选自奈拉替尼(neratinib)、阿法替尼(afatinib)、达克替尼(dacomitinib)、波齐替尼(poziotinib)及其组合。双重HER1/HER2抑制剂选自拉帕替尼(lapatinib)、AZD8931、BIBW 2992及其组合。在一些情况下，生物制剂选自单克隆抗体、亲合体(affibody)、前体(probody)、双抗体(diabody)、双重抗体、其片段及其组合。单克隆抗体可以是抗HER2抗体或抑制HER二聚化的抗体。单克隆抗体可以是抗HER2抗体。在一些情况下，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。抑制HER二聚化的抗体可以是帕妥珠单抗。
在一些实施方案中，该疗法用作新辅助疗法。新辅助疗法可进一步包括紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺或其组合。
在本公开的一个方面，当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
在一些实施方案中，截短HER2蛋白的参考表达水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或在对生物制剂反应的人受试者中截短HER2蛋白的中值表达水平。细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平可比可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应的受试者中的截短HER2蛋白的中值表达水平高约3倍至约5倍。
在其他实施方案中，细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平是细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白(CK)。在一些情况下，当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平(对应于相对CK表达水平约为0.44的比率)时，人受试者将可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
在具体的实施方案中，本公开提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法，该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平；(c)比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平与本文所述的截短HER2蛋白的参考表达水平(例如，与中值表达水平或比率比较)；(d)当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者；和(e)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂(例如，作为新辅助疗法)。
在一些实施方案中，用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法，该方法包括：(a)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平；(b)比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平与本文所述的截短HER2蛋白的参考表达水平(例如，与中值表达水平或比率比较)；(c)当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者；和(d)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂(例如，作为新辅助疗法)。在某些情况下，通过裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞产生细胞提取物。
在一些实施方案中，该方法还包括测定细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平。
在本公开的另一个方面，当细胞提取物中的全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
在一些情况下，全长HER2蛋白的参考表达水平是对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达水平。在一些实施方案中，当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平比全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
在其他情况下，全长HER2蛋白的参考表达水平是对生物制剂无反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达水平。在一些实施方案中，当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平比全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍时，人受试者可能对生物制剂的治疗反应。
在一些实施方案中，细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平是细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白(CK)。在一些实施方案中，当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平(对应于相对CK的表达水平为约38.7的比率)时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。在其他实施方案中，当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平在全长HER2蛋白的参考表达水平(对应于相对CK的表达水平为约5.6至约38.7的比率)之间时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。在某些情况下，当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平低于全长HER2蛋白的参考表达水平(对应于相对CK的表达水平为约5.6的比率)时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法无反应。
在特定实施方案中，本公开提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法，该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平；(c)比较细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平与本文所述的全长HER2蛋白的参考表达水平(例如，与中值表达水平或比率比较)；(d)当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法的反应者；(e)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂和/或生物制剂(例如，作为新辅助疗法)。
在一些实施方案中，用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法包括：(a)测定细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平；(b)比较细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平与本文所述的全长HER2蛋白的参考表达水平(例如，与中值表达水平或比率比较)；(c)当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法的反应者；(d)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂和/或生物制剂(例如，作为新辅助疗法)。在某些情况下，通过裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞产生细胞提取物。
在一些实施方案中，该方法还包括测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平。
在本公开的其他方面，当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。全长HER2蛋白的参考活化水平可以是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者、和/或在对生物制剂反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值活化水平。在某些情况下，当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平比全长HER2蛋白的中值活化水平高约3倍至约7倍时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
在一些实施方案中，细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平是细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白(CK)。在一些情况下，当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平(对应于相对CK的表达水平为约3.1的比率)时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。在其他情况下，当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平低于全长HER2蛋白的参考活化水平(对应于相对CK的表达水平为约0.3的比率)时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法无反应。
在具体的实施方案中，本公开提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法，该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平；(c)比较细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平与本文所述的全长HER2蛋白的参考活化水平(例如，与中值活化水平或比率比较)；(d)当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者；和(e)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂(例如，作为新辅助疗法)。
在一些实施方案中，用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法包括：(a)测定细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平；(b)比较细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平与本文所述的全长HER2蛋白的参考活化水平(例如，与中值活化水平或比率比较)；(c)当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者；和(d)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂(例如，作为新辅助疗法)。在某些情况下，通过裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞产生细胞提取物。
在一些实施方案中，该方法还包括测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平。
在本公开的一些方面，当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。HER3蛋白的参考活化水平可以是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或在对生物制剂反应的人受试者中HER3蛋白的中值活化水平。在一些情况下，当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平比HER3蛋白的中值活化水平高约1倍至约3.5倍时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
在本公开的其他方面，当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能将对生物制剂疗法反应。HER3蛋白的参考活化水平可以是人受试者中HER3蛋白的中值活化水平，该人受试者对生物制剂无反应、该人受试者对酪氨酸激酶抑制剂无反应、和/或该人受试者对酪氨酸激酶抑制剂反应。在一些情况下，细胞提取物中HER3蛋白的活化水平比HER3蛋白的中值活化水平低约1倍至约3.5倍。
在一些情况下，细胞提取物中HER3蛋白的活化水平可以是细胞提取物中HER3蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。在某些情况下，对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。在一些实施方案中，当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平(对应于相对CK表达水平的约0.2的比率)时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。在其他实施方案中，当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平(对应于相对CK表达水平约0.2的比率)时，人受试者可能将对生物制剂疗法反应。
在具体的实施方案中，本公开提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法，该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中HER3蛋白的活化水平；(c)比较细胞提取物中HER3蛋白的活化水平与本文所述的HER3蛋白的参考活化水平(例如，与中值活化水平或比率比较)；(d)当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者，或者当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是生物制剂疗法的反应者；和(e)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂(例如，作为新辅助疗法)。
在一些实施方案中，用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法包括：(a)测定细胞提取物中HER3蛋白的活化水平；(b)比较细胞提取物中HER3蛋白的活化水平与本文所述的HER3蛋白的参考活化水平(例如，与中值活化水平或比率比较)；(c)当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是用酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者，或当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是对生物制剂疗法的反应者；和(d)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂(例如，如新辅助疗法)。在某些情况下，通过裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞产生细胞提取物。
在一些实施方案中，该方法还包括测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、和/或PI3K蛋白的活化水平。
在本公开的一些方面，当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。全长PI3K蛋白的参考活化水平可以是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中和/或在对生物制剂反应的人受试者中PI3K蛋白的中值活化水平。在一些情况下，细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平比PI3K蛋白的中值活化水平高约0.5倍至约3.5倍。
在本公开的其他方面，当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能将对生物制剂疗法反应。全长PI3K蛋白的参考活化水平可以是人受试者中PI3K蛋白的中值活化水平，该人受试者对生物制剂无反应、该人受试者对酪氨酸激酶抑制剂无反应、和/或该人受试者对酪氨酸激酶抑制剂反应。在一些情况下，细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平比PI3K蛋白的中值活化水平低约0.5倍至约3.5倍。
在一些实施方案中，细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平可以是细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白(CK)。在一些情况下，当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平(对应于相对CK表达水平约0.04的比率)时，人受试者可能将对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
在具体实施方案中，本公开提供了用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法，该方法包括：(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；(b)测定细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平；(c)比较细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平与本文所述的PI3K蛋白的参考活化水平(例如，与中值活化水平或比率比较)；(d)当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者，或者当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是生物制剂疗法的反应者；和(e)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂(例如，作为新辅助疗法)。
在一些实施方案中，用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应并用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂治疗人受试者的方法包括：(a)测定细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平；(b)比较细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平与本文所述的PI3K蛋白的参考活化水平(例如，与中值活化水平或比率比较)；(c)当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者，或者当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，确定人受试者可能是生物制剂疗法的反应者；和(d)向人受试者反应者施用有效量的酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂(例如，作为新辅助疗法)。在某些情况下，通过裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞产生细胞提取物。
在一些实施方案中，该方法还包括测定细胞提取物中的截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平和/或HER3蛋白的活化水平。
在本文提供的方法中，可以测定截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平和全长HER2蛋白的活化水平。或者，测定全长HER2蛋白的表达水平和HER3蛋白的活化水平。
在一些实施方案中，该方法还包括测定细胞提取物中一个或多个额外的信号转导分子的表达水平和/或活化水平。一个或多个额外的信号转导分子可选自AKT、PRAS40、ERK1(MAPK3)、ERK2(MAPK1)、RSK及其组合。
在一些实施方案中，样品是乳腺肿瘤组织、全血、血清或血浆样品。乳腺肿瘤组织样品可以是穿刺活检样品。在某些实施方案中，该方法还包括从人受试者获得样品。
可以用协同酶增强反应免疫测定法(CEER)测定截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、全长HER3蛋白的活化水平和/或全长PI3K蛋白的活化水平。该方法可以进一步包括向人受试者施用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂。
A.定量细胞提取物中分析物的表达水平和/或活化水平
本发明的受试者可以是患有乳癌的人受试者。乳癌的类型可以是原位导管癌、浸润性导管癌、三阴性乳癌、炎性乳癌(局部晚期乳癌)、转移性癌、髓样癌、小管癌、粘液癌、乳腺Paget病或其他类型乳癌。在一些情况下，受试者患有0期(非浸润性乳癌)、I期(早期或浸润性乳癌)、I期或II期(早期或非浸润性乳癌)、II期或III期(局部晚期乳癌)、或IV期(晚期乳癌)乳癌。在一些实施方案中，人受试者患有HER2阳性乳癌。这些受试者具有携带HER2基因突变的乳癌细胞，所述HER2基因突变导致HER2蛋白的过表达。
乳癌细胞可以从取自受试者的样品中获得。可以使用一种或多种分离方法从样品中分离乳癌细胞，所述分离方法包括例如免疫磁分离(参见，例如，Racila等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589-4594(1998)；Bilkenroth等人,Int.J.Cancer,92:577-582(2001))、微流体分离(参见，例如，Mohamed等人,IEEE Trans.Nanobiosci.,3:251-256(2004)；Lin等人,Abstract No.5147,97th AACR Annual Meeting,Washington,D.C.(2006))、FACS(参见，例如Mancuso et al.,Blood,97:3658-3661(2001))、密度梯度离心(参见，例如，Baker等人,Clin.Cancer Res.,13:4865-4871(2003))和消耗方法(参见，例如，Meye等人,Int.J.Oncol.,21:521-530(2002))。乳癌细胞可以是循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，从受试者获得的样品是乳腺肿瘤组织样品、血液样品、血清样品或血浆样品。在其他情况下，乳癌细胞可以从肿瘤的穿刺活检获得。可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法裂解分离的乳癌细胞以产生细胞提取物。
可以检测或测量HER1信号传导通路、HER2信号传导通路、HER3信号传导通路或与癌症相关的其他信号传导通路的一种或多种分析物的表达水平和/或活化水平。在一些实施方案中，测定截短HER2蛋白(例如，p95HER2蛋白)的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、HER3蛋白的表达水平、PI3K蛋白的表达水平、ERK1(MAPK3)蛋白的表达水平、ERK2(MAPK1)蛋白的表达水平、RSK蛋白的表达水平、AKT蛋白的表达水平、PRAS40蛋白的表达水平及其任意组合。在其他实施方案中，测定截短HER2蛋白(例如，p95HER2蛋白)的活化水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平、PI3K蛋白的活化水平、ERK1(MAPK3)蛋白的活化水平、ERK2(MAPK1)蛋白的活化水平、RSK蛋白的活化水平、AKT蛋白的活化水平、PRAS40蛋白的活化水平及其任意组合。可以定量本文所述的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多种分析物(信号转导分子)的表达水平。在一些情况下，定量本文所述的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多种分析物(信号转导分子)的活化水平。在其他情况下，测量1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多种分析物的表达水平，和1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多种相同或不同分析物的活化水平。
检测本文所述的任何一种分析物的表达和/或活化水平的方法包括免疫测定法(例如，酶联免疫吸附测定法)、质谱、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫组织化学、蛋白印迹、激酶活性测定法和其他蛋白质活性测定法。在一些实施方案中，使用协同酶增强反应免疫测定法(CEERTM)测定表达和/或活化水平。示例性CEERTM测定法的描述可见于，例如，美国专利号8,609,349；8,658,388；9,250,243；9,274,116和9,285,369；Lim等人,Proteome Sci,2011,9:75；和Lee等人,PLoS One,2013,8(1):e54644。
使用CEERTM检测截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的表达水平、HER3蛋白的活化水平、PI3K蛋白的表达水平和/或PI3K蛋白的活化水平。在一些实施方案中，也可以使用这样的测定法测定AKT、PRAS40、ERK1、ERK2、RSK及其任何组合的表达水平和/或活化水平。
B.预测对含有酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法可能的反应者或无反应者
为了确定受试者是否可能对包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或生物制剂的药物疗法反应(例如，可能具有临床反应)，比较分析物(如截短HER2蛋白(p95HER2蛋白)、全长HER2蛋白、HER3蛋白、PI3K蛋白、ERK1(MAPK3)蛋白、ERK2(MAPK1)蛋白、RSK蛋白、AKT蛋白、PRAS40蛋白和RPS6蛋白)的表达水平与相应蛋白的参考表达水平。例如，比较p95HER2蛋白的参考表达水平与源自受试者样品的细胞提取物中的p95HER2蛋白的表达水平。在一些实施方案中，预测对药物疗法的反应基于比较分析物的活化水平(例如，磷酸化水平)与相应蛋白的参考活化水平，所述分析物如全长HER1蛋白、截短HER2蛋白(p95HER2蛋白)、全长HER2蛋白、HER3蛋白、PI3K蛋白、ERK1(MAPK3)蛋白、ERK2(MAPK1)蛋白、RSK蛋白、AKT蛋白、PRAS40蛋白、RPS6蛋白。例如，可以比较HER2蛋白的参考活化水平(例如，活化HER2蛋白的参考水平)与源自受试者样品的细胞提取物中HER2蛋白的活化水平。可以在以下之间进行比较：测定的截短HER2蛋白的表达水平和截短HER2蛋白的参考表达水平；测定的全长HER2蛋白的表达水平和全长HER2蛋白的参考表达水平；测定的HER3蛋白的表达水平和HER3蛋白的参考表达水平；测定的PI3K蛋白的表达水平和PI3K蛋白的参考表达水平；测定的ERK1蛋白的表达水平和ERK1蛋白的参考表达水平；测定的ERK2蛋白的表达水平和ERK2蛋白的参考表达水平，测定的RSK蛋白的表达水平和RSK蛋白的参考表达水平；测定的RPS6蛋白的表达水平和RPS6蛋白的参考表达水平；测定的AKT蛋白的表达水平和AKT蛋白的参考表达水平；测定的PRAS40蛋白的表达水平和PRAS40蛋白的参考表达水平；测定的截短HER2蛋白的活化水平和截短HER2蛋白的参考活化水平；测定的全长HER2蛋白的活化水平和全长HER2蛋白的参考活化水平；测定的HER3蛋白的活化水平和HER3蛋白的参考活化水平；测定的PI3K蛋白的活化水平和PI3K蛋白的参考活化水平；测定的ERK1蛋白的活化水平和ERK1蛋白的参考活化水平；测定的ERK2蛋白的活化水平和ERK2蛋白的参考活化水平；测定的RSK蛋白的活化水平和RSK蛋白的参考活化水平；测定的RPS6蛋白的活化水平和RPS6蛋白的参考活化水平；测定的AKT蛋白的活化水平和AKT蛋白的参考活化水平；和/或测定的PRAS40蛋白的活化水平和PRAS40蛋白的参考活化水平。
在一些实施方案中，当受试者对疗法反应的可能性大于50％时，例如，对疗法反应的可能性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％时，受试者可能将对包含酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂的药物疗法反应。在其他实施方案中，当受试者对疗法反应的可能性小于50％时，例如，对疗法反应的可能性小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％时，受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂的药物疗法无反应。在某些实施方案中，对疗法的反应对应于实现临床反应，如乳腺和淋巴结中的病理完全反应(pCRBN)。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中截短HER2蛋白(p95HER2蛋白)的表达水平高于p95HER2蛋白的参考表达水平，则预测受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法反应。在一些情况下，参考表达水平是一个或多个受试者群体中p95HER2蛋白的中值表达水平，所述受试者群体包括接受包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法并且对该疗法没有阳性或临床反应的人受试者、接受包含生物制剂的疗法并且对该疗法没有阳性反应或临床反应的人受试者、以及接受包含生物制剂的疗法并且对该疗法具有阳性反应或临床反应的人受试者。
在一些情况下，p95HER2蛋白的较高表达水平可以比截短HER2蛋白的中值表达水平高约3倍至约5倍，例如高约3倍、高约3.5倍、高约4倍、高约4.5倍、或高约5倍。在其他情况下，p95HER2的较高表达水平比p95HER2蛋白的中值表达水平高约1倍至约10倍，例如，高约1倍、高约1.5倍、高约2倍、高约2.5倍、高约3倍、高3.5倍、高约4倍、高约4.5倍、高约5倍、高约5.5倍、高约6倍、高约6.5倍、高约7倍、高7.5倍、高约8倍、高约8.5倍、高约9倍、高9.5倍或高约10倍。
从受试者样品产生的细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平可以表示为该细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平相对于对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白，或可以是用作测定法对照蛋白的任何蛋白质。在一些情况下，如果p95HER2与细胞角蛋白的表达水平的比率高于p95HER2与细胞角蛋白的表达水平的参考比率，则受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法反应。在某些情况下，参考比率约为0.44。因此，如果受试者的p95HER2蛋白的表达水平(表示为p95HER2表达与CK表达的比率)高于0.44，例如0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.8、0.9或更高，则预测受试者是酪氨酸激酶抑制剂疗法的反应者。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平，则预测受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂的疗法反应。
在一些实施方案中，全长HER2的参考表达水平是施用酪氨酸激酶抑制剂疗法并且对其没有反应的人受试者群体中全长HER2蛋白的中值表达水平。在一些情况下，当测定的全长HER2蛋白的表达水平比施用酪氨酸激酶抑制剂疗法并且对其没有反应的人受试者群体中全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍或更高，例如高约2.5倍、高约3.0倍、高约3.5倍、高约4.0倍、高约4.5倍、高约5.0倍、或更高，则受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法反应。在其他情况下，全长HER2蛋白的更高表达水平是比施用酪氨酸激酶抑制剂疗法并且对其没有反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达高约2.0倍至高约5.0倍，例如，高约2.0倍至高约5.0倍、高约3.0倍至高约5.0倍、高约2.0倍至高约4.0倍、高约2.0倍至高约3.0倍、高约3.0倍至高约4.0倍、高约4.0倍至高约5.0倍、高约2.0倍、高约2.5倍、高约3.0倍、高约3.5倍、高约4.0倍、高约4.5倍、或高约5.0倍。
在其他实施方案中，全长HER2的参考表达水平是施用包含生物制剂的疗法并且对其没有反应的人受试者群体中全长HER2蛋白的中值表达水平。在一些情况下，当测定的全长HER2蛋白的表达水平比施用生物制剂疗法并且对其没有反应的人受试者群体中全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍或更高，例如约2.5倍、约3.0倍、约3.5倍、约4.0倍、约4.5倍、约5.0倍或更高时，则受试者可能对包含TKI的疗法反应。在其他情况下，如果受试者的全长HER2蛋白的表达水平比施用生物制剂疗法并且对其没有反应的人受试者群体中全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.0倍至高约5.0倍，例如高约2.0倍至高约5.0倍、高约3.0倍至高约5.0倍、高约2.0倍至高约4.0倍、高约2.0倍至高约3.0倍、高约3.0倍至高约4.0倍、高约4.0倍至高约5.0倍、高约2.0倍、高约2.5倍、高约3.0倍、高约3.5倍、高约4.0倍、高约4.5倍、或高约5.0倍，则受试者可能对包含TKI的疗法反应。
在一些实施方案中，从受试者样品产生的细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平是该细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白(CK)，或可以是用作测定法对照蛋白的任何蛋白质。在一些情况下，如果全长HER2蛋白的表达水平与细胞角蛋白的表达水平的比率高于约38.7，则受试者可能对包含TKI的疗法反应。例如，预测全长HER2表达水平(表示为HER2表达水平与CK表达水平的比率)高于约38.7，例如约38.8、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65或更高的受试者对酪氨酸激酶抑制剂反应。
在其他情况下，当受试者的全长HER2蛋白的表达水平与细胞角蛋白的表达水平的比率为约5.6至约38.7，例如5.6约至约38.7时、约8.0至约38.0、约10.0至约30.0、约15.0至约30.0、约20.0至约30.0、约25.0至约38.7、约5.6至约10.0、约5.6、约10.0、约15.6、约20.0、约25.6、约30.0、约35.6、约38.7等时，受试者可能对包含生物制剂的疗法反应。
在其他情况下，当受试者的全长HER2蛋白的表达水平与细胞角蛋白的表达水平的比率低于约5.6，例如，约5.4、约5.3、约5.2、约5.1、约5.0、约4.9、约4.8、约4.7、约4.6、约4.5、约4.4、约4.3、约4.2、约4.1、约4.0、约3.9、约3.8、约3.7、约3.6、约3.5或更低时，受试者可能对包含TKI或生物制剂的疗法无反应。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中的全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平，则可预测受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法反应。HER2蛋白的参考活化水平可以是接受包含酪氨酸激酶抑制剂治疗并且对其没有反应的人受试者群体中HER2蛋白的中值活化水平。或者，HER2蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂治疗并对其起反应的人受试者群体中HER2蛋白的中值活化水平。在其他情况下，HER2蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂并且对其无反应的人受试者群体中HER2蛋白的中值活化水平。在一些实施方案中，如果受试者的细胞提取物中HER2蛋白的活化水平高于接受包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法并且对该疗法没有阳性或临床反应的人受试者群体中全长HER2蛋白的中值活化水平，则预测受试者对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。在其他实施方案中，如果HER2蛋白的活化水平高于接受包含生物制剂的疗法并且对该疗法没有阳性反应或临床反应的人受试者群体中HER2蛋白的中值活化水平，则受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂起反应。在其他实施方案中，如果HER2蛋白的活化水平高于接受包含生物制剂的疗法并且对该疗法具有阳性反应或临床反应的人受试者群体中的HER2蛋白的中值活化水平，则受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂反应。
HER2的更高活化水平可以比HER2的中值活化水平高约3倍至约7倍，例如约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约4倍至约7倍、约5倍至约7倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约6倍、或约6倍至约7倍。在其他情况下，HER2蛋白的更高(升高或增加)活化水平比HER2的中值活化水平高约3倍至约7倍，例如，高约3倍、高约3.5倍、高约4倍、高约4.5倍、高约5倍、高约5.5倍、高约6倍、高约6.5倍、或高约7倍。
在一些实施方案中，由受试者样品产生的细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平是该细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白，或可以是用作测定法对照蛋白的任何蛋白质。在一些情况下，如果受试者的HER2活化水平与细胞角蛋白表达水平的比率高于3.1的参考比率(对应于HER2的参考活化水平比细胞角蛋白的参考表达水平)，则受试者可能对包含TKI的疗法反应。换句话说，当受试者的全长HER2蛋白的活化水平与细胞角蛋白的表达水平的比率高于约3.1，例如约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.2、约4.4、约4.6、约4.8、约5.0、约5.2、约5.4、约5.6、约5.8、约6.0、约6.2、约6.4、约6.6、约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6或更高时，则受试者可能是TKI的反应者。在其他情况下，如果受试者的HER2活化水平与细胞角蛋白的表达水平的比率低于约0.3的参考比率，则受试者可能对TKI或生物制剂的疗法没有反应。该受试者的全长HER2蛋白的活化水平(对应于比率)可低于约0.3，例如约0.29、约0.28、约0.27、约0.26、约0.25、约0.24、约0.23、约0.22、约0.21、约0.20、约0.19、约0.18、约0.17、约0.16、约0.15或更低。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平，则可预测受试者可能对包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法反应。HER3蛋白的参考活化水平可以是接受包含酪氨酸激酶抑制剂疗法并且对其没有反应的人受试者群体中HER3蛋白的中值活化水平。或者，HER3蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂的疗法并对其反应的人受试者群体中HER3蛋白的中值活化水平。在其他情况下，HER3蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂的疗法并且对其无反应的人受试者群体中HER3蛋白的中值活化水平。
在一些实施方案中，与中值活化水平相比，HER3蛋白的更高活化水平是比HER3的中值活化水平高约1倍至约3.5倍，例如，高约1倍至约3.5倍、高约1倍至约3倍、高约1倍至约2倍、高约2倍至约3.5倍、或高约3倍至约3.5倍。在其他情况下，HER3蛋白的更高(升高或增加)的活化水平比HER3中值活化水平高约1倍至约3.5倍，例如，高约1倍、高约1.5倍、高约2倍、高约2.5倍、高约3倍、或高约3.5倍。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平，则可以预测受试者可能对包含生物制剂的疗法反应。HER3蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂的疗法并且对其没有反应的人受试者群体中HER3蛋白的中值活化水平。或者，HER3蛋白的参考活化水平可以是接受包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法并对其反应的人受试者群体中HER3蛋白的中值活化水平。在其他情况下，HER3蛋白的参考活化水平可以是接受包含酪氨酸激酶抑制剂的疗法且无反应的人受试者群体中HER3蛋白的中值活化水平。
在一些实施方案中，与中值活化水平相比，HER3蛋白的更低活化水平为比HER3的中值活化水平低约1倍至约3.5倍，例如，低约1倍至约3.5倍、低约1倍至约3倍、低约1倍至约2倍、低约2倍至约3.5倍、或低约3倍至约3.5倍。在一些情况下，HER3蛋白的更低(降低或减少)的活化水平为比HER3中值活化水平低约1倍至约3.5倍，例如，低约1倍、低约1.5倍、高约2倍、低约2.5倍、低约3倍、或低约3.5倍。
在一些实施方案中，从受试者样品产生的细胞提取物中HER3蛋白的活化水平是该细胞提取物中HER3蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白，或可以是用作测定法对照蛋白的任何蛋白质。在一些情况下，如果受试者的HER3活化水平与细胞角蛋白表达水平的比率高于0.2(或HER3蛋白的参考活化水平相对于细胞角蛋白的参考表达水平的参考比率)，则受试者可能对包含TKI的疗法反应。TKI反应者的活化HER3蛋白与细胞角蛋白表达的比率高于约0.2，例如，约0.25、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2或更高。在其他情况下，如果HER3活化水平与细胞角蛋白表达水平的比率低于0.2(或HER3蛋白的参考活化水平与细胞角蛋白的参考表达水平的参考比率)，则受试者可能对包含生物制剂的疗法反应。生物制剂反应者的活化HER3蛋白与细胞角蛋白表达的比率低于约0.2，例如，约0.19、约0.18、约0.17、约0.16、约0.15、约0.14、约0.13、约0.12、约0.11、约0.10、约0.09、约0.08、约0.07、约0.06、约0.05或更低。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平，则可以预测受试者可能对包含TKI的疗法反应。PI3K蛋白的参考活化水平可以是接受包含TKI的疗法并且对其无反应的人受试者群体中PI3K蛋白的中值活化水平。或者，PI3K蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂的疗法并对其反应的人受试者群体中PI3K蛋白的中值活化水平。在其他情况下，PI3K蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂并且对其无反应的人受试者群体中PI3K蛋白的中值活化水平。
在一些实施方案中，与中值活化水平相比，PI3K蛋白的更高活化水平是比PI3K的中值活化水平高约0.5倍至约3.5倍，例如，高约0.5倍至约3.5倍、高约0.5倍至约3倍、高约0.5倍至约2倍、高约0.5倍至约1.5倍、高约0.5倍至约1倍、高约1倍至约3.5倍、高约2倍至约3.5倍、高约3倍至约3.5倍、高约1倍至约2倍、或高约2倍至约3倍。在其他情况下，PI3K蛋白的更高(升高或增加)的活化水平比PI3K中值活化水平高约0.5倍至约3.5倍，例如，高约0.5倍、高约1倍、高约1.5倍、高约2倍、高约2.5倍、高约3倍、或高约3.5倍。
如果从受试者样品产生的细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平，则可以预测受试者可能对包含生物制剂的疗法反应。PI3K蛋白的参考活化水平可以是接受包含生物制剂的疗法并且对其没有反应的人受试者群体中PI3K蛋白的中值活化水平。或者，PI3K蛋白的参考活化水平可以是接受包含TKI的疗法并对其反应的人受试者群体中PI3K蛋白的中值活化水平。在其他情况下，PI3K蛋白的参考活化水平可以是接受包含TKI的疗法并且对其无反应的人受试者群体中PI3K蛋白的中值活化水平。
在一些情况下，如果受试者细胞提取物中活化的PI3K水平比活化的PI3K中值水平低约0.5倍至约3.5倍，例如低约0.5倍至约3.5倍、低约1.0倍至约3.5倍、低约1.5倍至约3.5倍、低约2.0倍至约3.5倍、低约2.5倍至约3.5倍、低约0.5倍至约3.0倍、低0.5倍至2.5倍、低0.5倍至约2.0倍、低0.5倍至约1.5倍、低0.5倍至约1.0倍、低0.5倍、低1.0倍、低1.5倍、低2.0倍、低2.5倍、低3.0倍或低3.5倍，则受试者可能对生物制剂反应。
在一些实施方案中，从受试者样品产生的细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平是PI3K蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。对照蛋白可以是细胞角蛋白，或可以是用作测定法对照蛋白的任何蛋白质。在一些情况下，如果受试者的PI3K活化水平与细胞角蛋白表达水平的比率高于0.04(或PI3K蛋白的参考活化水平相对于细胞角蛋白的参考表达水平的参考比率)，则受试者可能对包含TKI的疗法反应。TKI反应者的活化PI3K蛋白与细胞角蛋白表达的比率高于约0.04，例如，约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.20、约0.30、约0.40、约0.50、约0.60或更高。
在其他情况下，如果PI3K的活化水平与细胞角蛋白的表达水平的比率低于约0.04(或PI3K蛋白的参考活化水平与细胞角蛋白的参考表达水平的参考比率)，则受试者可能对包含生物制剂的疗法反应。生物制剂反应者的活化PI3K蛋白与细胞角蛋白表达的比率低于约0.04，例如，约0.039、约0.030、约0.020、约0.010、约0.009或更低。
C.统计学分析
在一些实施方案中，使用对特定疗法具有已知结果的反应者和无反应者的回顾性群组建立治疗选择模型。统计学算法可用于反应者和无反应者的回顾性数据。在一些情况下，应用逻辑回归分析来确定回顾性群组中描述的一种或多种分析物的统计学相关参考水平、阈值水平或截止水平。此外，治疗选择模型可以与逻辑回归机器学习算法组合或使用。
在某些情况下，统计学算法或统计学分析是学习统计学分类系统。在一个方面，可以用已知样品训练算法，然后用已知身份的样品进行验证。如本文所使用的，术语“学习统计学分类系统”包括能够适应复杂数据组(例如，感兴趣的标志物组和/或IBS相关症状列表)并基于这样的数据组做出决定的机器学习算法技术。学习统计学分类系统可以选自随机森林(RF)、分类和回归树(C&RT)、提升树、神经网络(NN)、支持向量机(SVM)、一般卡方自动交互检测模型、交互树、多重适应回归样条、机器学习分类及其组合。优选地，学习统计学分类系统是基于树的统计学算法(例如，RF、CART等)和/或NN(例如，人工NN等)。在美国专利申请公开No.2008/0085524、2011/0045476和2012/0171672中描述了学习统计学分类系统的附加实施例。
在某些情况下，统计学算法是单一学习统计学分类系统。优选地，单一学习统计学分类系统包括基于树的统计学算法，如RF或CART。作为非限制性示例，单一学习统计学分类系统可用于基于预测或可能性值以及本文所述一个或多个分析物的表达和/或活化水平、单独或与疾病终点(例如，乳腺和淋巴结中的病理完全反应)的存在或不存在相结合，将样品分类为治疗反应者样品或治疗无反应者样品。使用单一学习统计学分类系统通常将样品分类为反应者样品，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总准确度至少约为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。因此，将样品分类为治疗反应者样品或无反应者样品可用于帮助患有乳癌的受试者选择治疗。
在某些其他情况下，统计学算法是至少两个学习统计学分类系统的组合。在一些情况下，学习统计学分类系统的组合包括RF和NN，例如，串行或并行使用。作为非限制性示例，RF可以首先用于基于诊断标志物谱、单独或与症状谱组合生成预测或可能性值，然后可以使用NN基于预测或可能性值以及相同或不同的分析物谱或谱的组合将样品分类为反应者样品或无反应者样品。在某些情况下，混合RF/NN学习统计学分类系统将样品分类为反应者样品，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总准确度至少约为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在示例性实施方案中，统计学算法是随机森林分类或随机森林分类和神经网络分类的组合。
在一些情况下，可以使用处理算法来处理从使用学习统计学分类系统或多个系统获得的数据。例如，这种处理算法可以选自多层感知器、反向传播网络和Levenberg-Marquardt算法。在其他情况下，可以如以并行或串行方式使用这种处理算法的组合。
在某些情况下，统计学算法或统计学分析是四分位数分析。在某些情况下，四分位数分析将分析物的表达水平或活化水平转换为四分位数得分。作为非限制性示例，可以基于通过对所检测的分析物组合的四分位数得分求和得到的四分位数总和得分(QSS)来确定人受试者是否将是特定疗法的反应者或无反应者。
在四分位数分析中，存在将数据范围划分为四个相等部分的三个数字(值)。第一四分位数(也称为“下四分位数”)是位于该数字以下存在25％的底部数据的数字。第二四分位数(“中值”)在中间位置划分范围，在其以下具有50％的数据。第三四分位数(也称为“上四分位数”)在其以下有75％的数据，而在其之上具有25％的顶部数据。作为非限制性实例，可以将四分位数分析应用于本文所述的分析物的表达水平或活化水平，使得第一四分位数中的分析物水平(<25％)指定为值1，第二四分位数中的分析物水平(25-50％)指定为值2，第三四分位数中的分析物水平(51％-<75％)指定为值3，第四四分位数中的分析物水平(75％-100％)指定为值4。
可以使用来自治疗反应者和治疗无反应者的一组样品来训练和测试本文描述的各种统计学方法和模型。本领域技术人员将知道其他技术和药物选择标准用于获得可用于训练和测试本文所述的统计学方法和模型中的一组患者样品。
D.施用含有酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂的疗法
本文提供了向可能对疗法反应的受试者施用包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗法的方法。TKI的非限制性实例包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂，如奈拉替尼、阿法替尼BIBW 2992、达克替尼(dacomitinib)、波齐替尼(poziotinib)、拉帕替尼(GW-572016；)，AZD8931(sapaitinib)、吉非替尼舒尼替尼厄洛替尼卡奈替尼(CI 1033)、semaxinib(SU5416)、瓦他拉尼碱(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006；)、甲磺酸伊马替尼来氟米特(SU101)、凡德他尼(ZACTIMATM；ZD6474)；及其组合。TKI可以抑制受体酪氨酸激酶、截短的受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、其异二聚体、其同二聚体或其任何组合。在一些实施方案中，TKI是pan-HER抑制剂，如但不限于，奈拉替尼、阿法替尼达克替尼、波齐替尼、AC480或其任何组合。在其他实施方案中，TKI是双重HER1/HER2抑制剂，如但不限于拉帕替尼、AZD8931、BIBW 2992或其任何组合。
本文提供了向可能对疗法反应的受试者施用包含生物制剂(抗癌生物制剂)的疗法的方法。用于治疗乳癌的生物制剂的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、亲合体、前体、双抗体、双重抗体、双特异性抗体、其片段及其组合。亲合体包括工程化的蛋白质，其可以高结合亲和力结合靶蛋白或肽，从而模拟单克隆抗体的活性。前体是指工程化的蛋白水解活化的抗体(Desnoyers等人,Science Translational Medicine,2013,5(207):207ra144；Polu and Louwman,Expt Opin Biol Ther,2014,14(5):1049-53)。双抗体包括但不限于小的工程化二价和双特异性抗体片段(Perisic,Structure,1994,2(12):1217-26)。在一些实施方案中，用于治疗乳癌的生物制剂是抗HER2单克隆抗体，如曲妥珠单抗。在其他实施方案中，生物制剂是抑制HER二聚化的抗体，如帕妥珠单抗。
包含TKI或生物制剂的疗法可以作为新辅助疗法施用。因此，TKI或生物制剂可以在接受手术之前施用于患有乳癌的受试者。在一些情况下，TKI或生物制剂在治疗方案中施用，所述治疗方案还包括紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺或其组合。
IV.实施例
提供以下实施例以说明但不限制要求保护的发明。
实施例1：HER2和HER3信号传导通路生物标志物可以预测乳癌肿瘤对抗癌药物如酪氨酸激酶抑制剂和抗癌生物制剂的反应。
该实施例说明HER2和HER3信号传导通路的一种或多种信号转导分子的表达水平和/或活化水平可用于确定患者是否可能对用于治疗乳癌的酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂反应。还描述了支持这种方法的研究结果。
在II期、多中心随机研究中，用奈拉替尼与每周的紫杉醇加或不加曲妥珠单抗组合、随后是阿霉素和环磷酰胺(AC)作为新辅助疗法治疗患有HER2阳性、局部晚期乳癌的女性。对照组患者接受新辅助曲妥珠单抗与每周紫杉醇组合、然后是AC。图1提供了临床研究的示意图。
组1中的患者在28天周期的第1、8和15天接受施用的4个周期的紫杉醇80mg/m2。曲妥珠单抗与紫杉醇同时开始并且每周给予，总共16个剂量(4mg/kg负荷剂量，然后每周2mg/kg)。在紫杉醇/曲妥珠单抗之后，每21天施用标准AC(60/600mg/m2IV阿霉素/环磷酰胺)，持续4个周期。
组2中的患者在28天周期的第1、8和15天接受施用的4个周期的紫杉醇80mg/m2。在紫杉醇的第1天开始每天一次口服奈拉替尼240mg，并持续至紫杉醇最后一个周期的第28天。每21天施用标准AC，持续4个周期，然后在紫杉醇/奈拉替尼疗法后施用。
第3组中的患者在28天周期的第1、8和15天接受施用的4个周期的紫杉醇80mg/m2，其中曲妥珠单抗与紫杉醇同时开始，每周给予，总共16个剂量(4mg/kg负荷剂量，然后每周2mg/kg)。在紫杉醇的第1天开始每天一次口服奈拉替尼200mg，并持续至紫杉醇最后一个周期的第28天。紫杉醇/曲妥珠单抗/奈拉替尼疗法后每21天施用标准AC，持续4个周期。
在所有组中，在化疗方案之间和手术之前通过触诊评估临床反应。收集这些患者的临床数据和病理完全反应(pCR)的状态。
在治疗随机化之前和研究疗法开始之前，获得来自参与CEER研究的受试者的三个新鲜肿瘤样品。在研究疗法开始之前还收集血液样品。分析来自总共42名患者的样品(图2A)。根据3+的免疫组织化学得分和/或阳性的FISH得分，这些患者患有可手术的乳癌(IIB-IIIC期)并且HER2阳性。收集这些患者的临床数据和pCR结果的状态。
在本研究中，通过CEERTM分析从研究患者获得的基线样品中特定生物标志物的表达水平和/或活化水平。例如，在样品中定量HER2蛋白的总表达水平、p95HER2蛋白的总表达水平、p95HER2蛋白的总表达水平、HER3蛋白的总表达水平、PI3K蛋白的总表达水平、IGF1R蛋白的总表达水平、cMET蛋白的总表达水平、HER2蛋白的活化水平、p95HER2蛋白的活化水平、p95HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平、PI3K蛋白的活化水平、IGF1R蛋白的活化水平、cMET蛋白的活化水平、AKT蛋白的活化水平、PRAS40蛋白的活化水平、RPS6蛋白的活化水平、ERK1蛋白的活化水平、MEK1蛋白的活化水平、RSK蛋白的活化水平、和细胞角蛋白(CK或panCK)的总表达水平(图2B)。数据显示HER2阳性肿瘤样品中HER2蛋白的广泛表达水平。
图3A中提供了样品中HER2表达水平(总HER2水平与CK水平的比率)的分布。相同的数据在图3B中以自然对数标度呈现。根据分位数和中值的分布的统计学分析显示在图3C中。样品中基线HER2表达的最大水平为250；中值水平为15；最低水平为0.3。对于跨越75％-100％分位数的顶部四分位数，HER2的表达水平范围为38-250。对于跨越0％-25％分位数的最低四分位数，该水平为0.3-4.4。
图4A将HER2蛋白的表达水平与患者的临床结果相关联(例如，病理完全反应的存在与如HER2靶向治疗的治疗)。当施用HER2靶向治疗时，约60％的HER2阳性患者(42名患者中的24名)在乳腺和淋巴结中未实现病理完全反应(pCRBN)(图4B)。被认为是无反应者的患者(未实现pCRBN的那些患者)相对于所有分析的患者具有低水平的HER2表达。
数据显示对靶向多种HER信号传导通路的酪氨酸激酶抑制剂(即奈拉替尼)反应的患者患有HER2信号传导通路的信号转导分子的表达水平和/或活化水平升高的肿瘤。与奈拉替尼的无反应者相比，奈拉替尼的反应者具有更高水平的截短HER2的肿瘤(图5A、5B和5C)。因此，具有高水平p95HER2或p95HER2蛋白表达与CK蛋白表达的比率大于0.44的患者可能对奈拉替尼或其他酪氨酸激酶抑制剂反应。预测比率小于0.44或具有中等/低水平的p95HER2蛋白表达的患者是奈拉替尼的无反应者。图5C显示治疗组(对奈拉替尼的反应者和无反应者，以及对曲妥珠单抗的反应者和无反应者)的中值之间截短HER2蛋白水平的倍数变化百分比(％)。与其他治疗组相比，奈拉替尼反应者的p95HER2表达高3倍至5倍。
与奈拉替尼的无反应者相比，奈拉替尼的反应者还具有高水平的全长HER2蛋白的肿瘤(图6A、6B和6C)。这些反应者的全长HER2蛋白与CK蛋白表达的比率大于38.7。图6C显示治疗组(对奈拉替尼的反应者和无反应者，以及对曲妥珠单抗的反应者和无反应者)的中值之间的全长HER2蛋白水平的倍数变化％。奈拉替尼反应者的全长HER2蛋白表达比其他组高2.5倍。这些TKI反应者具有最高HER2蛋白水平的肿瘤(或相当于大于38.7的比率)。具有中等水平HER2蛋白或全长HER2蛋白与CK蛋白表达的比率在5.61和38.7之间的肿瘤患者对曲妥珠单抗反应，并且对奈拉替尼无反应。具有低水平HER2蛋白或全长HER2蛋白与CK蛋白表达的比率小于5.61的肿瘤患者对曲妥珠单抗或奈拉替尼无反应。
具有高活化水平的HER2蛋白或活化的HER2水平与CK的表达水平的比率大于3.08的患者对奈拉替尼反应(图7A、7B和7C)。预测具有在基线(在接受药物治疗之前)表达高水平HER2蛋白的肿瘤的患者对TKI如奈拉替尼反应。在每个治疗组(奈拉替尼组或曲妥珠单抗组)中，反应者的基线HER2中值表达水平高于无反应者。
该研究还显示一些患者表现出对生物制剂曲妥珠单抗反应的肿瘤。这些肿瘤的特征在于，与对奈拉替尼反应并且具有高水平HER2表达的那些肿瘤相比，具有中等水平的HER2表达(图6A)。
具有低水平活化的HER3蛋白或活化的HER3水平与CK的表达水平的比率小于0.2的患者肿瘤对曲妥珠单抗治疗反应。具有高水平活化的HER3蛋白(比率大于0.2)的患者对曲妥珠单抗无反应(图8A、8B和8C)。与无反应者相比，TKI的反应者也具有更高水平的活化HER3蛋白。
曲妥珠单抗治疗的反应者具有低水平的活化PI3K蛋白或活化的PI3K水平与CK的表达水平的比率小于0.04。这支持公布的数据，显示高活化的PI3K水平导致对曲妥珠单抗的抗性。具有高水平活化的PI3K的肿瘤对奈拉替尼反应(图9A、9B和9C)。
对其他HER信号转导分子(包括活化的AKT、活化的PRAS40、活化的ERK和活化的RSK)的分析显示，与曲妥珠单抗无反应者和奈拉替尼无反应者相比，曲妥珠单抗的反应者表达低水平的这些分子(图10)。
可以将多个信号传导分子的表达水平和/或活化水平组合成统计学模型，以确定哪些患者是特定疗法(例如奈拉替尼或曲妥珠单抗)的反应者或无反应者。该统计学模型可用于预测未接受治疗的患者对治疗反应的可能性。图11A、11B和11C显示截短HER2蛋白的表达水平与HER3蛋白的活化水平组合，并使用算法转化以将对曲妥珠单抗的反应者和无反应者分开。图11A显示无反应者具有低于所选截止值(0.60；CEER阴性)的谱或得分，并且反应者是CEER阳性或具有大于截止值的谱或得分。在该数据的示例性统计学模型中，用于确定治疗反应的方法具有59％的特异性和92％的灵敏度。
V.示例性实施方案
根据当前公开的主旨提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
1.一种用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应的方法，所述方法包括：
(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；
(b)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平；
(c)比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平、和/或PI3K蛋白的参考活化水平，和
(d)根据细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平相比较的差异，确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
2.根据实施方案1的方法，其中乳癌是HER2阳性、局部晚期乳癌。
3.根据实施方案1或2的方法，其中酪氨酸激酶抑制剂是pan-HER抑制剂或双重HER1/HER2抑制剂。
4.根据实施方案3的方法，其中所述pan-HER抑制剂选自奈拉替尼、阿法替尼、达克替尼、波齐替尼及其组合。
5.根据实施方案3的方法，其中所述双重HER1/HER2抑制剂选自拉帕替尼、AZD8931、BIBW 2992及其组合。
6.根据实施方案1至5中任一项的方法，其中所述生物制剂选自单克隆抗体、亲合体、前体、双抗体、双重抗体、其片段、及其组合。
7.根据实施方案6的方法，其中所述单克隆抗体是抗HER2抗体或抑制HER二聚化的抗体。
8.根据实施方案7的方法，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
9.根据实施方案7的方法，其中抑制HER二聚化的抗体是帕妥珠单抗。
10.根据实施方案1至9中任一项的方法，其中所述疗法用作新辅助疗法。
11.根据实施方案10的方法，其中所述新辅助疗法还包括紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺或其组合。
12.根据实施方案1至11中任一项的方法，其中当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
13.根据实施方案12的方法，其中截短HER2蛋白的参考表达水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中和/或在对生物制剂反应的人受试者中的截短HER2蛋白的中值表达水平。
14.根据实施方案13的方法，其中当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平比截短HER2蛋白的中值表达水平高约3倍至约5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
15.根据实施方案12的方法，其中细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平是细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。
16.根据实施方案15的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
17.根据实施方案16的方法，其中当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述截短HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平约为0.44的比率。
18.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
19.根据实施方案18的方法，其中全长HER2蛋白的参考表达水平是对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达水平。
20.根据实施方案19的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平比全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
21.根据实施方案18的方法，其中全长HER2蛋白的参考表达水平是对生物制剂无反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达水平。
22.根据实施方案21的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平比全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
23.根据实施方案18的方法，其中细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平是细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。
24.根据实施方案23的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
25.根据实施方案24的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述全长HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平为约38.7的比率。
26.根据实施方案24的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平在全长HER2蛋白的参考表达水平之间时，人受试者可能对生物制剂疗法反应，其中所述全长HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平为约5.6至约38.7的比率。
27.根据实施方案24的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平低于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法无反应，所述全长HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平为约5.6的比率。
28.根据实施方案1至27中任一项的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
29.根据实施方案28的方法，其中全长HER2蛋白的参考活化水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或对生物制剂反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值活化水平。
30.根据实施方案29的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平比全长HER2蛋白的中值活化水平高约3倍至约7倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
31.根据实施方案28的方法，其中细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平是细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。
32.根据实施方案31的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
33.根据实施方案32的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述全长HER2蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约3.1的比率。
34.根据实施方案33的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平低于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法无反应，所述全长HER2蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平约为0.3的比率。
35.根据实施方案1至34中任一项的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
36.根据实施方案35的方法，其中HER3蛋白的参考活化水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或在对生物制剂反应的人受试者中HER3蛋白的中值活化水平。
37.根据实施方案36的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平比HER3蛋白的中值活化水平高约1倍至约3.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
38.根据实施方案1至34中任一项的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
39.根据实施方案38的方法，其中HER3蛋白的参考活化水平是在对生物制剂无反应的人受试者中、在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、和/或在对酪氨酸激酶抑制剂反应的人受试者中HER3蛋白的中值活化水平。
40.根据实施方案39的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平比HER3蛋白的中值活化水平低约1倍至约3.5倍时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
41.根据实施方案35或38的方法，其中细胞提取物中HER3蛋白的活化水平是细胞提取物中HER3蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。
42.根据实施方案41的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
43.根据实施方案42的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述HER3蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.2的比率。
44.根据实施方案42的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应，所述HER3蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.2的比率。
45.根据实施方案1至44中任一项的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
46.根据实施方案45的方法，其中PI3K蛋白的参考活化水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或在对生物制剂反应的人受试者中PI3K蛋白的中值活化水平。
47.根据实施方案46的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平比PI3K蛋白的中值活化水平高约0.5倍至约3.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
48.根据实施方案1至44中任一项的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
49.根据实施方案48的方法，其中PI3K蛋白的参考活化水平是在对生物制剂无反应的人受试者中、在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、和/或在对酪氨酸激酶抑制剂反应的人受试者中PI3K蛋白的中值活化水平。
50.根据实施方案49的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平比PI3K蛋白的中值活化水平低约0.5倍至约3.5倍时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
51.根据实施方案45或48的方法，其中细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平是细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。
52.根据实施方案51的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
53.根据实施方案52的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述PI3K蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.04的比率。
54.根据实施方案52的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应，所述PI3K蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.04的比率。
55.根据实施方案1的方法，其中测定截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平和全长HER2蛋白的活化水平。
56.根据实施方案1的方法，其中测定全长HER2蛋白的表达水平和HER3蛋白的活化水平。
57.根据实施方案1至56中任一项的方法，其中所述方法还包括测定细胞提取物中一种或多种另外的信号转导分子的表达水平和/或活化水平。
58.根据实施方案57的方法，其中所述一种或多种另外的信号转导分子选自AKT、PRAS40、ERK1(MAPK3)、ERK2(MAPK1)、RSK及其组合。
58.根据实施方案1至58中任一项的方法，其中样品是乳腺肿瘤组织、全血、血清或血浆样品。
60.根据实施方案59的方法，其中乳腺肿瘤组织样品是穿刺活检样品。61.根据实施方案1至60中任一项的方法，其中用协同酶增强反应免疫测定法(CEER)测定截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平、和/或PI3K蛋白的活化水平。
62.根据实施方案1至61中任一项的方法，其中所述方法还包括向人受试者施用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂。
尽管出于清楚理解的目的通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。另外，本文提供的每篇参考文献通过引用整体并入，其程度如同每篇参考文献通过引用单独并入。

Claims (62)

1.一种用于确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应的方法，所述方法包括：
(a)裂解从人受试者的样品中获得的乳癌细胞，以产生细胞提取物；
(b)测定细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平；
(c)比较细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平、和/或PI3K蛋白的参考活化水平，和
(d)根据细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平和/或PI3K蛋白的活化水平与截短HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考表达水平、全长HER2蛋白的参考活化水平、HER3蛋白的参考活化水平和/或PI3K蛋白的参考活化水平相比较的差异，确定患有乳癌的人受试者是否将对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
2.根据权利要求1的方法，其中乳癌是HER2阳性、局部晚期乳癌。
3.根据权利要求1的方法，其中酪氨酸激酶抑制剂是pan-HER抑制剂或双重HER1/HER2抑制剂。
4.根据权利要求3的方法，其中所述pan-HER抑制剂选自奈拉替尼、阿法替尼、达克替尼、波齐替尼及其组合。
5.根据权利要求3的方法，其中所述双重HER1/HER2抑制剂选自拉帕替尼、AZD8931、BIBW 2992及其组合。
6.根据权利要求1的方法，其中所述生物制剂选自单克隆抗体、亲合体、前体、双抗体、双重抗体、其片段、及其组合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述单克隆抗体是抗HER2抗体或抑制HER二聚化的抗体。
8.根据权利要求7的方法，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
9.根据权利要求7的方法，其中抑制HER二聚化的抗体是帕妥珠单抗。
10.根据权利要求1的方法，其中所述疗法用作新辅助疗法。
11.根据权利要求10的方法，其中所述新辅助疗法还包括紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺或其组合。
12.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
13.根据权利要求12的方法，其中截短HER2蛋白的参考表达水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中和/或在对生物制剂反应的人受试者中的截短HER2蛋白的中值表达水平。
14.根据权利要求13的方法，其中当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平比截短HER2蛋白的中值表达水平高约3倍至约5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
15.根据权利要求12的方法，其中细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平是细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。
16.根据权利要求15的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
17.根据权利要求16的方法，其中当细胞提取物中截短HER2蛋白的表达水平高于截短HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述截短HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平约为0.44的比率。
18.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法反应。
19.根据权利要求18的方法，其中全长HER2蛋白的参考表达水平是对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达水平。
20.根据权利要求19的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平比全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
21.根据权利要求18的方法，其中全长HER2蛋白的参考表达水平是对生物制剂无反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值表达水平。
22.根据权利要求21的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平比全长HER2蛋白的中值表达水平高约2.5倍时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
23.根据权利要求18的方法，其中细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平是细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平与对照蛋白的表达水平的比率。
24.根据权利要求23的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
25.根据权利要求24的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平高于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述全长HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平为约38.7的比率。
26.根据权利要求24的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平在全长HER2蛋白的参考表达水平之间时，人受试者可能对生物制剂疗法反应，其中所述全长HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平为约5.6至约38.7的比率。
27.根据权利要求24的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的表达水平低于全长HER2蛋白的参考表达水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法无反应，所述全长HER2蛋白的参考表达水平对应于相对CK的表达水平为约5.6的比率。
28.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
29.根据权利要求28的方法，其中全长HER2蛋白的参考活化水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或对生物制剂反应的人受试者中全长HER2蛋白的中值活化水平。
30.根据权利要求29的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平比全长HER2蛋白的中值活化水平高约3倍至约7倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
31.根据权利要求28的方法，其中细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平是细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。
32.根据权利要求31的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
33.根据权利要求32的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平高于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述全长HER2蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约3.1的比率。
34.根据权利要求33的方法，其中当细胞提取物中全长HER2蛋白的活化水平低于全长HER2蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂疗法无反应，所述全长HER2蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平约为0.3的比率。
35.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
36.根据权利要求35的方法，其中HER3蛋白的参考活化水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或在对生物制剂反应的人受试者中HER3蛋白的中值活化水平。
37.根据权利要求36的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平比HER3蛋白的中值活化水平高约1倍至约3.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
38.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
39.根据权利要求38的方法，其中HER3蛋白的参考活化水平是在对生物制剂无反应的人受试者中、在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、和/或在对酪氨酸激酶抑制剂反应的人受试者中HER3蛋白的中值活化水平。
40.根据权利要求39的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平比HER3蛋白的中值活化水平低约1倍至约3.5倍时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
41.根据权利要求35或38的方法，其中细胞提取物中HER3蛋白的活化水平是细胞提取物中HER3蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。
42.根据权利要求41的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
43.根据权利要求42的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平高于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述HER3蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.2的比率。
44.根据权利要求42的方法，其中当细胞提取物中HER3蛋白的活化水平低于HER3蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应，所述HER3蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.2的比率。
45.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
46.根据权利要求45的方法，其中PI3K蛋白的参考活化水平是在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、在对生物制剂无反应的人受试者中、和/或在对生物制剂反应的人受试者中PI3K蛋白的中值活化水平。
47.根据权利要求46的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平比PI3K蛋白的中值活化水平高约0.5倍至约3.5倍时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应。
48.根据权利要求1的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
49.根据权利要求48的方法，其中PI3K蛋白的参考活化水平是在对生物制剂无反应的人受试者中、在对酪氨酸激酶抑制剂无反应的人受试者中、和/或在对酪氨酸激酶抑制剂反应的人受试者中PI3K蛋白的中值活化水平。
50.根据权利要求49的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平比PI3K蛋白的中值活化水平低约0.5倍至约3.5倍时，人受试者可能对生物制剂疗法反应。
51.根据权利要求45或48的方法，其中细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平是细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平与对照蛋白的表达水平的比率。
52.根据权利要求51的方法，其中对照蛋白是细胞角蛋白(CK)。
53.根据权利要求52的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平高于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对酪氨酸激酶抑制剂疗法反应，所述PI3K蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.04的比率。
54.根据权利要求52的方法，其中当细胞提取物中PI3K蛋白的活化水平低于PI3K蛋白的参考活化水平时，人受试者可能对生物制剂疗法反应，所述PI3K蛋白的参考活化水平对应于相对CK的表达水平为约0.04的比率。
55.根据权利要求1的方法，其中测定截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平和全长HER2蛋白的活化水平。
56.根据权利要求1的方法，其中测定全长HER2蛋白的表达水平和HER3蛋白的活化水平。
57.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括测定细胞提取物中一种或多种另外的信号转导分子的表达水平和/或活化水平。
58.根据权利要求57的方法，其中所述一种或多种另外的信号转导分子选自AKT、PRAS40、ERK1(MAPK3)、ERK2(MAPK1)、RSK及其组合。
59.根据权利要求1的方法，其中样品是乳腺肿瘤组织、全血、血清或血浆样品。
60.根据权利要求59的方法，其中乳腺肿瘤组织样品是穿刺活检样品。
61.根据权利要求1的方法，其中用协同酶增强反应免疫测定法(CEER)测定截短HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的表达水平、全长HER2蛋白的活化水平、HER3蛋白的活化水平、和/或PI3K蛋白的活化水平。
62.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括向人受试者施用酪氨酸激酶抑制剂或生物制剂。
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