RU2558931C2 - Способы предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение предоставляет способ предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством. Способ включает: (a) лизирование опухолевых клеток, взятых от трижды негативной опухоли молочной железы, для получения клеточного экстракта; (b) определение уровня экспрессии VEGFR2 в клеточном экстракте; и (c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2 в клеточном экстракте, полученном на стадии (b), с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2. Наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 предсказывает ответ на терапию противоопухолевым средством, где противоопухолевое средство представляет собой комбинацию бевацизумаба (Авастин^®), карбоплатина и паклитакселя. 15 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 пр.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США №61/294,433, поданной 12 января 2010, предварительной заявке США №61/325,624, поданной 19 апреля 2010, предварительной заявке США №61/328,602, поданной 27 апреля 2010, и предварительной заявке США №61/351,838, поданной 4 июня 2010, раскрытия которых включаются в описание путем отсылки полностью во всех отношениях.

Уровень техники

Процесс сигнальной трансдукции в клетках обуславливает целый ряд биологических функций, включая деление и смерть клеток, обмен веществ (метаболизм), активацию иммунных клеток, нейропередачу и сенсорное восприятие, и многие другие. Следовательно, нарушение нормальной сигнальной трансдукции в клетках может приводить к целому ряду болезненных состояний, таких как диабет, сердечная недостаточность, аутоиммунные реакции и рак.

Одним хорошо охарактеризованным путем сигнальной трансдукции является МАР-киназный путь (митоген-активируемый протеинкиназный путь), отвечающий за передачу сигнала от эпидермального фактора роста (EGF) для стимулирования пролиферации клеток (см. Фигуру 1 РСТ публикации №WO 2009/108637, раскрытие которой включается в описание путем отсылки полностью во всех отношениях). EGF связывается тирозинкиназой, связанной с трансмембранным рецептором, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), который активируется при связывании с EGF. Связывание EGF с EGFR вызывает тирозинкиназную активность цитоплазматического домена рецептора. Одним результатом этой киназной активности является аутофосфорилирование остатков тирозина EGFR. Фосфорилированные остатки тирозина на активированном EGFR обеспечивают сайты «стыковки» (докинга) для связывания содержащих домен SH2 адапторных белков, таких как GRB2. Функционируя в качестве адаптора, GRB2 дополнительно связывается с гуанин-нуклеотид заменяющим фактором, SOS, с помощью SH3 домена, находящегося на GRB2. Образование комплекса EGFR-GRB2-SOS приводит к SOS-активации фактора обмена гуанин-нуклеотида, что способствует удалению GDP от Ras. После удаления GDP, Ras связывает GTP и становится активированным.

После активации Ras связывается с и активирует протеинкиназную активность RAF-киназы, серин-треонин-специфичссюой протеинкиназы. За этим следует активация протеинкиназного каскада, приводящего к пролиферации клеток. В общих чертах, затем RAF-киназа фосфорилирует и активирует МЕК, другую серин-треониновую киназу. Активированная МЕК фосфорилирует и активирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). В число мишеней для дальнейшего фосфорилирования МАРК входит 40S рибосомальная протеинкиназа S6 (RSK). МАРК-фосфорилирование RSK приводит к активации RSK, которая в свою очередь фосфорилирует рибосомальный белок S6. Другой известной мишенью МАРК является протоонкоген, ген с-Мус, необходимый для пролиферации клеток, который является мутированным в целом ряде видов рака. МАРК также фосфорилирует и активирует другую протеинкиназу MNK, которая в свою очередь фосфорилирует транскрипционный фактор CREB. Косвенно МАРК также регулирует транскрипцию гена Fos, кодирующего еще один транскрипционный фактор, вовлеченный в пролиферацию клеток. Изменяя уровни и активность таких транскрипционных факторов, МАРК преобразовывает первоначальный внеклеточный сигнал от EGF в измененную транскрипцию генов, которые важны для продвижения по клеточному циклу.

Учитывая центральную роль, которую играют пути сигнальной трансдукции в клеточном росте, не удивительно, что многие виды рака возникают как результат мутаций и других изменений в компонентах сигнальной трансдукции, что приводит к неправильной активации путей клеточной пролиферации. Например, сверхэкспрессия или сверхактивность EGFR может быть связана с целым рядом раковых заболеваний, включая мультиформную глиобластому, рак толстой кишки и рак легкого. Это вызвало развитие противораковых видов терапии, направленных против EGFR, включая гефитиниб и эрлотиниб для лечения рака легкого и цетуксимаб для колоректального рака.

Цетуксимаб является примером ингибитора в виде моноклональных антител, которые связываются с внеклеточным лиганд-связывающим доменом EGFR, таким образом предотвращая связывание лигандов, активирующих EGFR-тирозинкиназу. В противоположность этому, гефитиниб и эрлотиниб представляют собой небольшие молекулы, ингибирующие EGFR-тирозинкиназу, расположенную внутри клетки. В отсутствие киназной активности, EGFR не может подвергаться аутофосфорилированию по остаткам тирозина, которое является предварительным условием для связывания ниже расположенных адапторных белков, таких как GRB2. В результате остановки (сбоя) сигнального каскада в клетках, рост которых зависит от этого пути, уменьшается опухолевая пролиферация и миграция.

Кроме того, другие исследования показали, что около 70% меланом человека и более мелкие фракции других опухолей имеют точечную мутацию (V599E) в гене Raf, приводящую к постоянной активации МАРК-пути (см., например, Davies et al., Nature, 417:949-954 (2002)). Такие результаты говорят о том, что мутации в определенных путях сигнальной трансдукции могут быть характерными для отдельных типов опухолей, и что такие специфические, измененные пути сигнальной трансдукции могут быть перспективными мишенями для химиотерапевтического вмешательства.

Принимая во внимание тот факт, что разные виды лечения рака, в частности химиотерапия рака, могут действовать или прямо или косвенно путем или блокировки или активации клеточных путей сигнальной трансдукции, вовлеченных в пролиферацию или смерть клетки, соответственно, активность данного пути сигнальной трансдукции в конкретной форме рака может служить в качестве подходящего индикатора эффективности разных видов лечения рака. Соответственно, в дополнение к удовлетворению других потребностей, настоящее изобретение предоставляет способы предсказания и оценки эффективности предполагаемой противоопухолевой терапии для отдельного пациента. По существу, настоящее изобретение предоставляет способы, помогающие врачу в выборе подходящей терапии рака в правильной дозе и в правильное время для каждого пациента.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение предоставляет композиции и способы определения состояния (статуса) (например, уровней экспрессии и/или активации) компонентов путей сигнальной трансдукции в опухолевых клетках (например, клетках трижды негативного рака молочной железы). Сведения о состоянии экспрессии и/или активации компонентов путей сигнальной трансдукции, полученные из осуществления на практике настоящего изобретения, могут использоваться для диагностирования рака, прогноза и при планировании противоопухолевой терапии.

В определенных аспектах настоящее изобретение предоставляет молекулярные маркеры (биомаркеры), что способствует определению или предсказанию, может ли определенный вид рака реагировать или предположительно благоприятно реагировать на одно или более противоопухолевых средств, таких как, например, комбинация бевацизумаба (Авастина^®), карбоплатина и паклитакселя (например, Абраксан^® или nabP) ("триплетная терапия"). Как описывается здесь, было неожиданно обнаружено, что такие биомаркеры как VEGFR2, c-KIT, HER1 и IGF-1R являются особенно пригодными при определении или предсказании чувствительности, эффективности или ответа опухолевых клеток, таких как клетки трижды негативного рака молочной железы, на противоопухолевую терапию, например триплетную терапию.

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ определения чувствительности клеток трижды негативной опухоли к терапии противоопухолевым средством, причем способ включает:

(a) лизирование клеток опухоли для получения клеточного экстракта;

(b) определение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте; и

(c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте, полученном на стадии (b) с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R,

при этом наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2, низкого уровня экспрессии c-KIT, высокого уровня экспрессии HER1 и/или низкого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте по сравнению с эталонным уровнем экспрессии указывает, что клетка опухоли является чувствительной к противоопухолевому средству.

В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть полезны для облегчения или оказания содействия при определении или предсказании чувствительности клеток трижды негативной опухоли к терапии противоопухолевым средством. В других вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть полезны для улучшения определения или предсказания чувствительности клеток трижды негативной опухоли к терапии противоопухолевым средством.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством, причем способ включает:

(a) лизирование опухолевых клеток, взятых от трижды негативной опухоли молочной железы, для получения клеточного экстракта;

(b) определение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте; и

(c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте, полученном на стадии (b), с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R,

при этом наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2, низкого уровня экспрессии c-KIT, высокого уровня экспрессии HER1 и/или низкого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте по сравнению с эталонным уровнем экспрессии предсказывает ответ на терапию противоопухолевым средством.

В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть полезны для облегчения или оказания содействия при определении или предсказании ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством. В других вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть полезны для улучшения определения или предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ контролирования ответа на терапию противоопухолевым средством у субъекта, имеющего трижды негативный рак молочной железы и получающего противоопухолевое средство, причем способ включает:

(a) лизирование опухолевых клеток, взятых от трижды негативной опухоли молочной железы, для получения клеточного экстракта;

(b) определение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте;

(c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте, полученном на стадии (b), с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2, с-К1Т, HER1 и/или IGF-1R или уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R во время терапии на более раннем сроке; и

(d) установление, должно ли продолжаться лечение противоопухолевым средством или его следует скорректировать, исходя из сравнения на стадии (с).

В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут быть полезны для облегчения или оказания содействия при контролировании ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством. В других вариантах осуществления, способы настоящего изобретения могут использоваться для улучшения контролирования ответа трижды негативного рака молочной железы на лечение противоопухолевым средством. В некоторых вариантах осуществления корректировка терапии на стадии (d) включает изменение последующей дозы противоопухолевого средства или выбор альтернативного противоопухолевого средства.

Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятны квалифицированному специалисту в данной области техники из следующего подробного описания и фигур.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 показывает схему типичного чипа в формате слайда для исследования уровней общего и фосфорилированного HER1 и HER2.

Фигура 2 представляет схему характерного метода анализа «сближения» для обнаружения фосфорилированного HER1. GO, глюкозоксидаза; HRP, пероксидаза хрена.

Фигура 3 представляет схему Совместного усиленного ферментом иммуноанализа (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive ImmunoAssay (CEER)), также известного как иммуноанализ совместного «сближения» (Collaborative proximityJmmunoAssay (COPIA)). Когда белки-мишени связываются со специфическими захватывающими антителами, нанесенными на поверхность нитроцеллюлозы, после инкубирования с клеточным лизатом, несвязанные белки, не являющиеся мишенями, удаляются со слайда. Один вид детекторных антител к альтернативному эпитопу на "захваченном" белке-мишени является конъюгированным с GO. Связывание других конъюгированных с HRP детекторных антител, специфических к фосфорилированным сайтам на белке-мишени (Р), или другом неперекрывающемся эпитопе (р), завершает образование иммунокомплекса, необходимого для порождения сигнала и последующего усиления сигнала, опосредованного тирамидом, через «образование ферментного канала» GO-HRP в присутствии глюкозы. Захватывающие и детекторные антитела были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму конкуренцию между ними (т.е. все антитела могут одновременно связывать свой соответствующий эпитоп на белке сигнальной трансдукции).

Фигура 4 показывает титрационные кривые, полученные в результате CEER для ERBB2-T и ERBB2-P. Эти значения используются в качестве стандартов для получения количественных значений для клинических образцов.

Фигура 5 показывает определение t-ERBB2 в клетках ВТ474. Анализ ERBB2-CEER проводили с использованием клеточных лизатов, приготовленных из клеток ВТ474. Анализ полноразмерного p185-ERBB2 проводили на лизатах, содержащих ~25 ВТ474 клеток, а уровень t-ERBB2 был определен при исследовании клеточных лизатов, приготовленных из ~250 клеток ВТ474 после иммуномагнитного удаления p185-ERBB2.

Фигура 6 показывает экспрессию и фосфорилирование t-ERBB2s в опухолях пациентов. ERBB2, t-ERBB2, фосфорилированный t-ERBB2. Показан порядок размещения проб. CEER не только дает возможность различения экспрессии полноразмерного и укороченного ERBB2 в клинических образцах, но также предоставляет ценную информацию об уровне фосфорилирования в количественном выражении.

Фигура 7 показывает типичный пример IP-Вестерн анализа ERBB2 в клинических образцах. Для иммунопреципитации ERBB2 рецепторов использовали анти-ICD-ERBB2 антитела, а последующий Вестерн-блот-анализ был проведен с использованием вторичных анти-ICD-ERBB2 антител, чтобы различить полноразмерный t-ERBB2 от полноразмерного p185-ERBB2.

Фигура 8 показывает, что в 174 образцах ВСА наблюдалась экспрессия и активация разнообразных белков пути.

Фигура 9 показывает пример анализа профиля функционального пути с помощью CEER на образце пункционной биопсии трижды негативного рака молочной железы по сравнению с контрольными клетками рака молочной железы T47D и эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC).

Фигура 10 показывает результаты сравнения выживаемости без прогрессирования (PFS) между группами образцов с «высоким» и «низким» значениями каждого маркера.

Фигура 11 показывает результаты другого сравнения PFS между группами образцов с «высоким» и «низким» значениями каждого маркера.

Фигура 12 показывает, что измерение уровней экспрессии и c-KIT и VEGFR2 увеличивает прогностическую ценность выяснения ответа на триплетную терапию при TNMBC.

Фигура 13 показывает, что измерение уровней экспрессии и VEGFR2 и HER1 увеличивает прогностическую ценность выяснения ответа на триплетную терапию при TNMBC.

Фигура 14 показывает корреляцию между увеличением уровней (А) общего VEGFR2, (В) общего c-KIT и (С) общего HER1 и ответом на триплетную терапию.

Фигуры и таблицы из РСТ публикации №WO 2010/132723 включаются путем отсылки полностью во всех смыслах.

Подробное описание изобретения

I. Введение

Как описано выше, активирование путей сигнальной трансдукции, вовлеченных в клеточную пролиферацию, и инактивирование путей, вовлеченных в клеточную смерть,

являются неограничивающими примерами молекулярных признаков, характеризующих различные типы рака. Во многих случаях активность определенных путей сигнальной трансдукции и их компонентов может служить «молекулярным портретом» данного типа рака. Подобные активированные компоненты могут дополнительно обеспечивать подходящие мишени для терапевтического вмешательства. Таким образом, знание уровня активности определенной системы сигнальной трансдукции в раковой клетке до, во время или после лечения дает врачу высокозначимую информацию, которую можно использовать для выбора соответствующего курса лечения. Более того, непрерывное контролирование путей сигнальной трансдукции, которые являются активными в раковых клетках, по мере продвижения лечения может предоставить врачу дополнительную информацию об эффективности лечения, побуждая врача или продолжать определенный курс лечения или переключиться на другой курс лечения, например, в том случае, когда раковые клетки становятся резистентными к лечению по причине дополнительных отклонений, которые активизируют или тот же самый или другой путь сигнальной трансдукции.

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способы и композиции для обнаружения состояния экспрессии и/или активации одной или некоторого количества не поддающихся регулированию молекул сигнальной трансдукции в опухолевой ткани или в неопухолевых клетках, таких как редкие циркулирующие клетки солидной опухоли, с помощью специфического мультиплексного высокопроизводительного анализа. Изобретение также предоставляет способы и композиции для выбора подходящей терапии (отдельных лекарственных средств или комбинаций лекарственных средств) с целью подавить или выключить не поддающийся регулированию сигнальный путь. Таким образом, изобретение может использоваться для облегчения планирования персонализированных методов лечения раковых пациентов.

В некоторых вариантах осуществления возможность обнаружить и распознать опухолевые клетки в кровотоке посредством определения активности путей сигнальной трансдукции на уровне одиночных клеток является важным преимуществом настоящего изобретения. Во многих случаях опухолевые клетки обнаруживаются в крови пациентов с ранними стадиями рака как "микрометастазы" (диссеминированные опухолевые клетки), а также при метастатических формах рака. Число опухолевых клеток в крови будет зависеть от стадии и типа опухоли. Как правило, на первичных опухолях биопсия всегда проводится, в то время как большинство метастатических опухолей не подвергается изучению с помощью биопсии, что делает молекулярный анализ таких опухолей очень трудным. В процессе метастазирования наиболее агрессивные опухолевые клеток покидают первичную опухоль и путешествуют по кровеносной и лимфатической системе до достижения отдаленного местоположения. Таким образом, циркулирующие опухолевые клетки из крови представляют собой самую агрессивную и однородную популяцию опухолевых клеток. Однако количество метастатических опухолевых клеток в крови часто является очень низким, варьируя от одной до нескольких тысяч клеток на миллилитр крови. Возможность выделить и проанализировать пути сигнальной трансдукции по таким редким клеткам и использовать эту информацию для более эффективного лечения рака является одной из целей настоящего изобретения.

В отдельных вариантах осуществления мультиплексный иммуноанализ с высокой пропускной способностью настоящего изобретения (например, Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER)), также известный как иммуноанализ совместного «сближения» (COPIA)) может обнаружить уровень экспрессии и/или активации одной или более молекул сигнальной трансдукции в клетках, полученных из опухолевой ткани (например, из образцов FNA), или в циркулирующих клетках солидной опухоли на уровне одиночной клетки. Фактически, молекулы сигнальной трансдукции, такие как EGFR, могут быть обнаружены с чувствительностью около 100 зептомолей и линейным динамическим диапазоном примерно от 100 зептомолей до 100 фемтомолей. По существу, обнаружение на уровне одиночной клетки уровней экспрессии и/или активации одного или нескольких сигнальных трансдукторов в опухолевых клетках облегчает прогнозирование и диагностику рака, а также разработку персонализированных, нацеленных методов лечения.

Что касается исследования рака молочной железы, существующие в настоящее время варианты тестирования являются неудовлетворительными, потому что лечение и первичных и метастатических опухолей у пациентов с раком молочной железы основывается на одноразовой диагностике по биопсийному образцу, взятому на ранней стадии болезни. В частности, терапевтическое вмешательство в отношении и ранних и метастатических стадий рака молочной железы основывается только на первоначальном диагнозе по биопсийному образцу, взятому на ранней стадии болезни, вследствие невозможности получения биопсийного образца от пациента с метастатическим раком. Однако опухоли молочной железы развиваются в зависимости от времени и лечения, так что контролирование с течением времени (временной мониторинг) опухолей молочной железы имеет решающее значение для оптимального ведения пациентов с раком молочной железы. Например, изменение состояния активации одной или более рецепторных тирозинкиназ из семейства ErbB (HER) может влиять на выбор терапии при рецидиве. Действительно, несоответствие в статусе HER-2 между первичным и метастатическим раком является обычным явлением, потому что примерно у 37% всех пациентов с раком молочной железы статус изменяется от HER-2-негативной первичной опухоли до HER-2-позитивного метастатического рака. В дополнение к этому, у пациентов может уже быть резистентность de novo или может развиться приобретенная резистентность к гормональной терапии вследствие активации HER-1 и/или HER-2. В некоторых случаях у пациентов может наблюдаться резистентность de novo или может развиться приобретенная резистентность к ErbB-таргентным видам терапии вследствие наличия опухолевых клеток, экспрессирующих p95HER-2. Существующим в настоящее время способам не хватает чувствительности и специфичности и они не могут использоваться для мониторинга пациентов во время терапии, кроме того, они не используют анализ профиля метаболического пути для проведения индивидуализированного лечения. В связи с этим существует неудовлетворенная клиническая потребность в методах анализа, оказывающих помощь клиницисту в назначении соответствующего лечения в оптимальное время.

В отличие от доступных в настоящее время средств тестирования рака молочной железы способы настоящего изобретения делают возможным мониторинг (контролирование) пациентов с раком молочной железы на протяжении всех стадий болезни путем обеспечения "биопсии в реальном времени" солидных опухолей молочной железы при использовании таких образцов, как тонкоигольные пунктаты (FNAs) из опухоли, и/или циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) из крови. В качестве неограничивающего примера методы анализа рака молочной железы, описанные здесь, могут использоваться при постановке первоначального диагноза рака молочной железы у пациента на ранней стадии болезни. Выбор подходящей терапии рака руководствуется анализом профиля уровней экспрессии и/или активации одного или более специфических сигнальных путей в присутствии противоопухолевых средств или при их отсутствии с помощью методов одиночного обнаружения и двойного обнаружения «сближения» (например, CEER), описанных здесь. Кроме того, способы настоящего изобретения могут использоваться для того, чтобы контролировать прогрессирование и/или регрессию болезни, так как терапевтическое вмешательство может основываться на образцах, взятых на любой стадии болезни и проанализированных с помощью методов одиночного обнаружения и двойного обнаружения «сближения» (например, CEER), описанных здесь. По существу, предсказание, определение и/или выбор подходящих способов лечения ранних и метастатических стадий рака молочной железы руководствуется диагностикой в режиме реального времени и анализом статуса экспрессии и/или активации специфических молекул сигнальной трансдукции.

Способы настоящего изобретения специально направлены на решение ключевых проблем при лечении рака и обеспечивают более высокий стандарт лечения пациентов с раком молочной железы (например, пациентов с трижды негативным метастатическим раком молочной железы (TNMBC)), потому что они: (1) обеспечивают повышенную чувствительность (например, обнаружение отдельной клетки может достигаться обнаружением всех и/или фосфорилированных молекул сигнальной трансдукции, таких как HER1 (EGFR), VEGFR2 и/или c-KIT); (2) обеспечивают повышенную специфичность (например, анализ «сближения» трех антител повышает специфичность обнаружения всех и/или фосфорилированных молекул сигнальной трансдукции); (3) дают возможность анализа профиля метаболического пути (например, статус экспрессии и/или активации одной или более молекул сигнальной трансдукции может определяться в FNA или CTCs, полученных от пациентов); и (4) устраняют любые ограничения, связанные с получением образцов от пациента (например, анализ может проводиться на незначительном количестве опухолевых клеток). Несмотря на то, что в новых, описанных здесь методах анализа может использоваться любой образец, особенно пригодными являются CTCs, так как они представляют самые агрессивные опухолевые клетки, и известно, что каждая опухоль распространяет CTCs, причем они могут быть единственным источником резидуальных опухолей или труднодоступных метастатических опухолей и обнаруживаются в крови. По существу, в определенных вариантах осуществления способы настоящего изобретения делают возможным последовательное (серийное) взятие образцов тканей опухоли молочной железы, что дает в результате ценную информацию об изменениях, происходящих в опухолевых клетках в зависимости от времени и лечения, и предоставляет клиницистам средства контролирования быстро развивающегося заболевания.

Суммируя, способы настоящего изобретения преимущественно обеспечивают правильный выбор и мониторинг раковых пациентов (например, TNMBC пациентов), которые вероятнее всего получат пользу от таргентной терапии, посредством осуществления исследования метаболического профиля опухолевых клеток с помощью мультиплексного, основанного на антителах способа одиночного обнаружения или анализа «сближения».

II. Определения

При использовании в описании следующие термины имеют значения, приписанные им, если не указано иное.

Термин "рак" включает любую болезнь из класса болезней, характеризующихся неконтролируемым ростом аберрантных (отклоняющихся от нормы) клеток. Термин включает все известные виды рака и неопластические заболевания, характеризуются ли они как злокачественные, доброкачественные, мягких тканей, или солидные, и рак на всех стадиях, включая пред- и постметастатические стадии рака. Примеры разных типов рака включают, но не ограничиваются этим, рак молочной железы; рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого); рак желудочно-кишечного тракта и пищеварительной системы, такой как колоректальный рак, желудочно-кишечные стромальные опухоли, желудочно-кишечные карциноидные опухоли, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак анального канала, рак желчного протока, рак тонкого кишечника и рак желудка; рак пищевода; рак желчного пузыря; рак печени; рак поджелудочной железы; рак аппендикса; рак яичника; рак почки (например, почечно-клеточная карцинома); рак центральной нервной системы; рак кожи; лимфому; хориокарциному; рак головы и шеи; остеогенную саркому и рак крови. При использовании в описании "опухоль" включает одну или более раковых клеток. В одном предпочтительном варианте осуществления опухоль молочной железы происходит от субъекта с инвазивной формой или формой in situ протоковой карциномы или лобулярной (дольковой) карциномы. В другом предпочтительном варианте осуществления опухоль молочной железы происходит от субъекта с рецидивным или метастатическим раком молочной железы.

Термин "аналит" включает любую представляющую интерес молекулу, как правило, макромолекулу, такую как полипептид, присутствие которой, ее количество (уровень экспрессии), состояние активации и/или идентичность определяется. В некоторых случаях аналит является молекулой сигнальной трансдукции, например, такой как HER1 (EGFR), VEGFR2 или c-KIT.

Термин "молекула сигнальной трансдукции" или "сигнальный трансдуктор" включает белки и другие молекулы, осуществляющие процесс, с помощью которого клетка превращает внеклеточный сигнал или раздражитель (стимул) в ответ, как правило, включающий упорядоченные последовательности биохимических реакций внутри клетки. Примеры молекул сигнальной трансдукции включают, но не ограничиваются этим, рецепторные тирозинкиназы, такие как EGFR (например, EGFR/HERl/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (например, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (инсулиновый рецептор), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (рецептор, подобный инсулиновому рецептору), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYR03, TIE 1-2, ТЕК, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-кадхерин, LTK (тирозинкиназу лейкоцитов), ALK (киназу анапластической лимфомы), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3 и RTK 106; («укороченные» формы рецепторных тирозинкиназ, такие как «укороченные» рецепторы HER2 с отсутствующими амино-концевыми внеклеточными доменами (например, p95ErbB2 (p95m), р110, р95 с, p95n, и т.д.); димеры рецепторных тирозинкиназ (например, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4 и т.д.); нерецепторные тирозинкиназы, такие как BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack и LIMK; компоненты сигнального тирозинкиназного каскада, такие как АКТ (например, AKT1, AKT2, AKT3), МЕК (МАР2К1), ERK2 (МАРК1), ERK1 (MAPK3), PI3K (например, PIK3CA (p110), PIK3R1 (р85)), PDK1, PDK2, гомолог фосфатазы и тензина (PTEN), SGK3, 4Е-ВР1, P70S6K (например, р70 S6 сплайс-вариант киназы альфа I), протеинтирозинфосфатазы (например, РТР1 В, PTPN13, BDP1 и т.д.), RAP, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, р38, She (р66), Ras (например, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Racl, Cdc42, PLC, PKC, p53j циклин D1, STAT1, STAT3, фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат (P→IP2), фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат (PIP3), mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, GSK-3β, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67 и паксиллин; ядерные рецепторы гормонов, такие как рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), андрогеновый рецептор, глюкокортикоидный рецептор, минералкортикоидный рецептор, рецептор витамина А, рецептор витамина D, ретиноидный рецептор, рецептор тиреоидного гормона и орфановые («сиротские») рецепторы; коактиваторы и репрессоры ядерных рецепторов, такие как амплифицированный в раке молочной железы рецептор коактиватора-1 (AIB1) и ядерный рецептор-корепрессор 1 (NCOR), соответственно; и их комбинации.

Термин "состояние активации" имеет в виду, что какая-либо отдельная молекула сигнальной трансдукции является активированной. Подобным образом, термин "уровень активации" относится к степени, в какой отдельная молекула сигнальной трансдукции является активированной. Состояние или уровень активации в большинстве случаев соответствует статусу фосфорилирования, убиквитинирования и/или комплексообразования или уровню одной или более (например, множества) молекул сигнальной трансдукции. Неограничивающие примеры состояний активации (перечисленные в скобках) включают: HER 1 /EGFR (EGFRvIII, фосфорилированный (р-) EGFR, EGFR:She, убиквитинированнный (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 («укороченный» ErbB2), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET, c-Met:HGF комплекс); AKT1 (p-AKTl); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERKl); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDK1); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BP1); PIK3R1 (p-PIK3R1); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFRl, VEGFR1:PLCγ, VEGFR1:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCγ, VEGFR2:Src, VEGFR2:гепарин сульфат, VEGFR2:VE-кадхерин); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIE1 (p-TIE1); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3β (p-GSK-3β); NFKB (p-NFKB), 1KB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD: 14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT1 (p-STATl); STAT3 (p-STAT3); FAK (p-FAK); RB (p-RB); Ki67; р53 (р-р53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); паксиллин (р-паксиллин); GRB2 (p-GRB2), She (p-Shc), Ras (p-Ras), GAB1 (p-GABl), SHP2 (p-SHP2), GRB2 (p-GRB2), CRKL (p-CRKL), PLCγ (p-PLCγ), PKC (например, p-PKCα, p-PKCβ, p-PKCδ), аддуцин (р-аддуцин), RBI (p-RBl) и PYK2 (p-PYK2).

При использовании в описании термин "серийное разведение" включает последовательность уменьшающихся концентраций отдельного образца (например, клеточного лизата) или реагента (например, антитела). Как правило, серийное разведение получают путем смешивания измеренного количества образца или реагента в исходной концентрации с разбавителем (например, буфером для разбавления) для получения более низкой концентрации образца или реагента, и повторения этого процесса достаточное количество раз, чтобы получить желаемое количество последовательных разведений. Образец или реагент может быть последовательно разбавлен, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 или 1000 раз для получения серийного разведения, содержащего, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 уменьшающихся концентраций образца или реагента. Например, 2-кратное серийное разведение захватывающего антитела при исходной концентрации 1 мг/мл можно получить, смешав некоторое количество исходной концентрации захватывающего антитела с равным количеством буфера для разведения, чтобы получить концентрацию захватывающего антитела 0,5 мг/мл, и повторяя этот процесс, чтобы получить концентрации захватывающего антитела 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,0625 мг/мл, 0,0325 мг/мл и т.д.

Термин "высший динамический диапазон" при использовании в описании относится к способности метода анализа определять отдельный аналит как минимум в одной клетке или вплоть до тысяч клеток. Например, описанные здесь методы иммуноанализа, обладают высшим динамическим диапазоном, так как преимущественно с их помощью можно обнаружить отдельную интересующую молекулу сигнальной трансдукции примерно в количестве клеток от 1 до 10000 (например, около 1,5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 или 10000 клеток) при использовании серийного разведения концентраций захватывающего антитела.

Термин "образец" при использовании в описании включает любой биологический образец, взятый у пациента. Образцы включают, без ограничения, цельную кровь, плазму, сыворотку, красные клетки крови (эритроциты), белые клетки крови (например, мононуклеарные клетки периферической крови), смывную жидкость протоков, аспират из соска, лимфу (например, диссеминированные опухолевые клетки лимфатического узла), пунктат костного мозга, слюну, мочу, стул (т.е. кал), мокроту, смыв из бронхов, слезную жидкость, тонкоигольный аспират (например, собранный с помощью периареолярной тонкоигольной аспирационной биопсии), любую другую жидкость организма, образец ткани (например, опухолевой ткани), такой как биопсийный образец опухоли (например, образец, полученный с помощью пункционной биопсии) или лимфатического узла (например, образец биопсии сигнального лимфатического узла), образец ткани (например, опухолевой ткани), например, полученной при хирургическом удалении опухоли, и клеточные экстракты. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец цельной крови или ее фракционного компонента, такого как плазма, сыворотка или клеточный осадок. В некоторых случаях образец получают путем выделения циркулирующих клеток солидной опухоли из цельной крови или ее клеточной фракции с помощью любого метода, известного в данной области техники. В других вариантах осуществления образец представляет собой зафиксированный в формалине и залитый парафином (FFPE) образец опухолевой ткани, например, из солидной опухоли молочной железы.

"Биопсия" относится к процессу извлечения образца ткани с целью диагностической или прогностической оценки и к самому образцу ткани. В отношении способов и композиций настоящего изобретения может применяться любой метод биопсии, известный в данной области техники. Используемый метод биопсии, в числе прочих факторов, будет зависеть от типа ткани, которую нужно оценить, размера и типа опухоли (т.е. солидная или суспензионная (т.е. кровь или асцит)). Типичные методы биопсии включают эксцизионную биопсию, инцизионную биопсию, пункционную биопсию (например, толстоигольную биопсию, тонкоигольную пункционно-аспирационную биопсию и т.д.), хирургическую биопсию и биопсию костного мозга. Методы биопсии обсуждаются, например, в работе Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al, eds., 16th ed., 2005, Chapter 70, и на протяжении Part V. Специалисту в данной области техники понятно, что методы биопсии могут осуществляться с целью распознавания раковых и/или предраковых клеток в данном образце ткани.

При использовании в описании термин "циркулирующие клетки" включает вне-опухолевые клетки, которые метастазировали или микрометастазировали из солидной опухоли. Примеры циркулирующих клеток включают, но не ограничиваются этим, циркулирующие опухолевые клетки, раковые стволовые клетки и/или клетки, мигрирующие в опухоль, (например, циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники, циркулирующие эндотелиальные клетки, циркулирующие проангиогенные миелоидные клетки, циркулирующие дендритные клетки и т.д.). Циркулирующие клетки можно выделить из взятых у пациента образцов любой доступной биологической жидкости (например, цельной крови, сыворотки, плазмы, мокроты, бронхиального смыва, мочи, аспирата из соска, лимфы, слюны, тонкоигольного пунктата и т.д.). В определенных случаях образцы цельной крови разделяются на плазменную или сывороточную фракцию и клеточную фракцию (т.е. клеточный осадок). Клеточная фракция обычно содержит эритроциты, лейкоциты и/или циркулирующие клетки солидной опухоли, такие как циркулирующие опухолевые клетки (CTCs), циркулирующие эндотелиальные клетки (CECs), циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники (CEPCs), раковые стволовые клетки (CSCs), диссеминированные опухолевые клетки лимфатического узла и их комбинации. Плазменная или сывороточная фракция обычно содержит, в числе прочего, нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК) и белки, высвобожденные циркулирующими клетками солидной опухоли.

В большинстве случаев циркулирующие клетки выделяют из образца, взятого у пациента, с помощью одного или более методов разделения, включая, например, иммуномагнитное разделение (см., например, Racila et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4589-4594 (1998); Bilkenroth et al., Int. J. Cancer, 92:577-582 (2001)), the CellTracks^® System by Immunicon (Huntingdon Valley, PA), микрожидкостное разделение (см., например, Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobioscl, 3:251-256 (2004); Lin et al., Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), флуоресцентную сортировку клеток FACS (см., например, Mancuso et al., Blood, 97:3658-3661 (2001)), центрифугирование в градиенте плотности (см., например, Baker et al., Clin. Cancer Res., 13:4865-4871 (2003)) и методы истощения (элиминации) (см., например, Meye et al., Int. J. Oncol, 21:521-530 (2002)).

Молекулы сигнальной трансдукции, представляющие интерес, как правило, выделяют сразу после того, как выделены циркулирующие клетки, чтобы сохранить их состояние активации in situ, предпочтительно в пределах около 24, 6 или 1 часа, и более предпочтительно в пределах около 30, 15 или 5 минут. Выделенные клетки также могут быть проинкубированы с одним или более факторами роста, обычно в наномолярной или микромолярной концентрациях, в течение примерно 1-30 минут, чтобы оживить или стимулировать активацию молекул сигнальной трансдукции (см., например, Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)). Например, чтобы оценить предполагаемую противоопухолевую терапию для отдельного пациента, выделенные клетки можно проинкубировать с одним или более противоопухолевыми средствами в разных дозах. Затем может быть проведено стимулирование факторами роста в течение нескольких минут (например, около 1-5 минут) или в течение нескольких часов (например, около 1-6 часов). Различающаяся активация сигнальных путей с или без противоопухолевых средств может оказать помощь в выборе подходящего лечения рака в надлежащей дозе для каждого отдельного пациента. Кроме того, циркулирующие клетки могут быть выделены из образца пациента во время лечения противоопухолевым средством и простимулированы одним или более факторами роста, чтобы определить, следует ли проводить изменение терапии.

Термин "субъект" или "пациент" или "индивидуум" обычно включает людей, однако также может включать других животных, например приматов, грызунов, собак, кошек, лошадей, свиней и тому подобных.

Чип или микрочип включает определенный набор и/или серию разведений «захватывающих» антител, иммобилизованных или закрепленных на твердой подложке, например, такой как стекло (например, предметное стекло), пластик, чипы, стерженьки, фильтры, гранулы (например, магнитные гранулы, полистироловые гранулы и т.д.), бумаге, мембране (например, из нейлона, нитроцеллюлозы, поливинилиденфторида (PVDF), и т.д.), волоконно-оптических жгутах или любом другом подходящем субстрате. Как правило, захватывающие антитела иммобилизуют на твердой подложке посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий (например, ионных связей, гидрофобных взаимодействий, водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, диполь-дипольных связей). В некоторых случаях захватывающие антитела включают захватывающие последовательности, которые взаимодействуют с захватывающими агентами, связанными с твердой подложкой. Чипы, использованные в описанных здесь методах анализа, как правило, содержат множество разных захватывающих антител и/или концентраций захватывающего антитела, которые соединяются с поверхностью твердой подложки в различных известных /имеющих адрес местоположениях.

Термин "захватывающее антитело" включает иммобилизованное антитело, являющееся специфическим для (т.е. которое связывается, является связанным или образует комплекс с) одного или более представляющих интерес аналитов в образце, таком как клеточный экстракт. В отдельных вариантах осуществления захватывающее антитело удерживается на твердой подложке чипа. Подходящие захватывающие антитела для связывания любой из целого ряда молекул сигнальной трансдукции на твердой подложке являются доступными от компаний Upstate (Temecula, СА), Biosource (Camarillo, СА), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), and BD Biosciences (San Jose, CA).

Термин "детекторное антитело" при использовании в описании включает антитело, содержащее обнаружимую метку, которая является специфической для (т.е. которая связывается, является связанной или образует комплекс с) одного или более интересующих аналитов в образце. Термин также включает антитело, являющееся специфическим для одного или более аналитов, представляющих интерес, с которым антитело может связываться при помощи других частиц, содержащих обнаружимую метку. Примеры обнаружимых меток включают, но не ограничиваются этим, биотин/страптавидиновые метки, нуклеиновокислотные (например, олигонуклеотидные) метки, химически реакционноспособные метки, флуоресцентные метки, ферментные метки, радиоактивные метки и их комбинации. Подходящие детекторные антитела для определения состояния активации и/или общего количества любой из целого ряда молекул сигнальной трансдукции являются доступными от компаний Upstate (Temecula, СА), Biosource (Camarillo, СА), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, МО) и BD Biosciences (San Jose, CA). В качестве неограничивающего примера, фосфо-специфические антитела к различным фосфорилированным формам молекул сигнальной трансдукции, таким как EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, АКТ, МАРК, PTEN, Raf и МЕК, доступны от компании Santa Cruz Biotechnology.

Термин "антитело, зависящее от состояния активации," включает детекторное антитело, являющееся специфическим по отношению к (т.е. которое связывается, является связанным или образует комплекс с) определенному состоянию активации одного или более интересующих аналитов в образце. В предпочтительных вариантах осуществления антитело, зависящее от состояния активации, обнаруживает состояние фосфорилирования, убиквитинирования и/или комплексообразования одного или более аналитов, таких как одна или более молекул сигнальной трансдукции. В некоторых вариантах осуществления фосфорилирование членов EGFR семейства рецепторных тирозинкиназ и/или образование гетеродимерных комплексов между членами семейства EGFR определяется с использованием антител, зависящих от состояния активации. В отдельных вариантах осуществления, антитела, зависящие от состояния активации, являются пригодными для обнаружения одного или более сайтов фосфорилирования в одной или более из следующих молекул сигнальной трансдукции (сайты фосфорилирования соответствуют положению аминокислоты в последовательности человеческого белка): EGFR/HER1/ErbB1 (например, тирозин (Y) 1068); ErbB2/HER2 (например, Y1248); ErbB3/HER3 (например, Y1289); ErbB4/HER4 (например, Y1284); c-Met (например, Y1003, Y1230, Y1234, Y1235, и/или Y1349); SGK3 (например, треонин (Т) 256 и/или серии (S) 422); 4Е-ВР1 (например, Т70); ERK1 (например, Т185, Y187, Т202, и/или Y204); ERK2 (например, Т185, Y187, Т202, и/или Y204); МЕК (например, S217 и/или S221); PIK3R1 (например, Y688); PDK1 (например, S241); P70S6K (например, Т229, Т389, и/или S421); PTEN (например, S380); AKT1 (например, S473 и/или Т308); АКТ2 (например, S474 и/или Т309); AKT3 (например, S472 и/или Т305); GSK-3β (например, S9); NFKB (например, S536); 1KB (например, S32); BAD (например, S112 и/или S136); mTOR (например, S2448); Rsk-1 (например, Т357 и/или S363); Jnk (например, Т183 и/или Y185); Р38 (например, Т180 и/или Y182); STAT3 (например, Y705 и/или S727); FAK (например, Y397, Y576, S722, Y861, и/или S910); RB (например, S249, Т252, S612, и/или S780); RB1 (например, S780); аддуцин (например, S662 и/или S724); PYK2 (например, Y402 и/или Y881); PKCα (например, S657); PKCα/β (например, Т368 и/или Т641); PKCδ (например, Т505); р53 (например, S392 и/или S20); CREB (например, S133); c-Jun (например, S63); c-Src (например, Y416); и паксиллин (например, Y31 и/или Y118).

Термин "антитело, независящее от состояния активации," включает детекторное антитело, являющееся специфическим по отношению к (т.е. которое связывается, является связанным или образует комплекс с) одному или более представляющим интерес аналитам в образце независимо от их состояния активации. Например, антитело, независящее от состояния активации, может определять и фосфорилированные и нефосфорилированные формы одного или более аналитов, таких как одна или более молекул сигнальной трансдукции.

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" включает дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды и их полимеры или в одноцепочечной или в двухцепочечной форме, такие как, например, ДНК и РНК. Нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги или остатки с модифицированным остовом или связи, являющиеся синтетическими, природными и не встречающимися в природе, и имеющими свойства связывания, сходные с эталонной нуклеиновой кислотой. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфотиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2'-O-метилрибонуклеотиды и пептиднуклеиновые кислоты (PNAs). Если специально не установлено, термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, имеющие свойства связывания, сходные с эталонной нуклеиновой кислотой. Если не указано иное, отдельная нуклеиновокислотная последовательность, кроме того, полностью включает их консервативно модифицированные варианты и комплементарные последовательности, а также полностью указанную последовательность.

Термин "олигонуклеотид" включает одноцепочечный олигомер или полимер РНК, ДНК, гибрид РНК/ДНК и/или его миметик. В некоторых случаях олигонуклеотиды состоят из природных (т.е. немодифицированных) нуклеиновых оснований, сахаров и межнуклеозидных (в остове) связей. В некоторых других случаях олигонуклеотиды содержат модифицированные нуклеиновые основания, сахара и/или межнуклеозидные связи.

При использовании в описании термин "мотив ошибочного спаривания" или "участок ошибочного спаривания" относится к части олигонуклеотида, которая не обладает 100% комплементарностью со своей комплементарной последовательностью. Олигонуклеотид может иметь, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять, шесть или более участков ошибочно спаренных оснований. Участки ошибочно спаренных оснований могут быть смежными или могут разделяться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более нуклеотидами. Мотивы или участки ошибочно спаренных оснований могут включать один нуклеотид или могут включать два, три, четыре, пять или более нуклеотидов.

Фраза "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, при которых олигонуклеотид будет гибридизоваться с его комплементарной последовательностью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными при различных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизируются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот смотри в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). В большинстве случаев жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5-10°С меньше, чем температура плавления (T_m) для конкретной последовательности при заданной ионной силе и рН. T_m представляет собой температуру (при заданной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зонда, комплементарного целевой последовательности, гибридизуется с целевой последовательностью в состоянии равновесия (когда целевые последовательности присутствуют в избытке при T_m, 50% зондов гибридизуются в равновесии). Жесткие условия также могут достигаться в случае добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал составляет, по меньшей мере, двукратную фоновую, предпочтительно 10-кратную фоновую гибридизацию.

Термины "по существу идентичные" или "существенная идентичность" в случае двух или более нуклеиновых кислот относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют точно определенный процент нуклеотидов, являющихся одинаковыми, (т.е. по меньшей мере, около 60%, предпочтительно, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичность в пределах указанной области) при сравнении и выравнивании для выяснения максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области, что определяется с помощью алгоритма сравнения последовательностей или с помощью выравнивания вручную и визуального контроля. Если указано в контексте, это определение также относится к комплементарной последовательности. Предпочтительно, существенная идентичность имеется в пределах области, составляющей, по меньшей мере, около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или 100 нуклеотидов в длину.

Термин "инкубирование" используется как синоним с термином "контактирование" и "подвергание воздействию" и не подразумевает каких-либо специальных требований к времени и температуре, если специально не указано иное.

"Рецепторные тирозинкиназы" или "RTKs" включают семейство из пятидесяти шести (56) белков, имеющих трансмембранный домен и тирозинкиназный мотив. RTKs функционируют в сигнальной системе клетки и передают сигналы, регулирующие рост, дифференцировку, адгезию, миграцию и апоптоз. Мутационная активация и/или сверхэкспрессия рецепторных тирозинкиназ трансформирует клетки и часто играет критическую роль в развитии раковых заболеваний. RTKs становятся мишенями различных молекулярных таргентных (нацеленных) препаратов, таких как трастузумаб, цетуксимаб, гефитиниб, эрлотиниб, сунитиниб, иматиниб, нилотиниб и т.п. Одним из хорошо охарактеризованных путей сигнальной трансдукции является МАР-киназный путь, ответственный за перенос сигнала от эпидермального фактора роста (EGF) для стимулирования клеточной пролиферации.

Термин "выживаемость без прогрессирования" или "PFS" включает продолжительность времени на протяжении и после лечения болезни (например, рака), в течение которого пациент живет при наличии болезни без дополнительных симптомов болезни.

Термин "трижды негативный" в контексте настоящего изобретения включает опухолевую клетку (например, циркулирующую опухолевую клетку), опухоль или рак, такой как трижды негативный метастатический рак молочной железы (TNMBC), в котором отсутствует обнаружимая экспрессия рецептора эстрогена (ER), рецептора прогетерона (PR) или рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2).

III. Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение предоставляет способы определения статуса (например, уровней экспрессии и/или активации) компонентов путей сигнальной трансдукции в опухолевых клетках, полученных из опухолевой ткани, или циркулирующих клетках солидной опухоли, с помощью описанного здесь анализа, такого как специфический мультиплексный высокопроизводительный анализ «сближения». Кроме того, настоящее изобретение предоставляет способы подбора подходящих методов терапии для понижающего регулирования одного или более путей сигнальной трансдукции с нарушенной регуляцией. Таким образом, определенные варианты осуществления изобретения могут использоваться для облегчения планирования персонализированных методов лечения на основе конкретного молекулярного портрета, который можно получить с помощью анализа всех и/или активированных белков сигнальной трансдукции в опухоли данного пациента (например, с трижды негативным раком молочной железы).

В определенных аспектах настоящее изобретение предоставляет молекулярные маркеры (биомаркеры), способствующие определению или предсказанию, может ли определенный вид рака реагировать или предположительно благоприятно реагировать на одно или более противоопухолевых средств, таких как, например, комбинация бевацизумаба (Авастина^®), карбоплатина и паклитакселя (например, Абраксан^® или nabP) ("триплетная терапия"). В определенных вариантах осуществления измерение уровня экспрессии и/или активации, по меньшей мере, одного, двух или более (например, всех) из числа VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R является особенно полезным для выбора подходящего противоопухолевого средства и/или установления или предсказания эффективности или ответа на него в клетках, например в клетках трижды негативной опухоли.

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ определения чувствительности клеток трижды негативной опухоли к терапии противоопухолевым средством, причем способ включает:

(a) лизирование клеток опухоли для получения клеточного экстракта;

(b) определение уровня экспрессии одного или более аналитов, выбранных из группы, состоящей из VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте; и

(c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте, полученном на стадии (b) с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R,

при этом наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2, низкого уровня экспрессии c-KIT, высокого уровня экспрессии HER1 и/или низкого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте по сравнению с эталонным уровнем экспрессии указывает, что клетка опухоли является чувствительной к противоопухолевому средству.

В некоторых вариантах осуществления наличие от умеренного до высокого уровня экспрессии VEGFR2, от умеренного до высокого уровня экспрессии c-KIT, от низкого до умеренного уровня экспрессии HER1 и/или от умеренного до высокого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте по сравнению с эталонным уровнем экспрессии указывает, что опухолевая клетка является резистентной к противоопухолевому средству. В одном отдельном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации (сочетания) аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2 и c-KIT в клеточном экстракте. В другом отдельном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2 и HER1 в клеточном экстракте. В еще одном конкретном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2, c-KIT и HER1 в клеточном экстракте. В дополнительном отдельном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2, c-KIT, HER1 и IGF-1R в клеточном экстракте. В определенных случаях способ настоящего изобретения дополнительно включает определение уровня активации, по меньшей мере, одного, двух или более (например, всех) из числа VEGFR2, c-KIT, HER1, IGF-1R и/или АКТ в клеточном экстракте. В других случаях способ дополнительно включает контактирование опухолевой клетки с противоопухолевым средством до стадии (а).

В других вариантах осуществления опухолевая клетка представляет собой клетку рака молочной железы. В некоторых случаях опухолевая клетка представляет собой клетку, полученную из тонкоигольного пунктата (FNA) опухоли, такой как трижды негативный рак молочной железы, или циркулирующую опухолевую клетку (СТС), полученную из образца жидкости организма. В большинстве случаев опухолевую клетку выделяют из образца, включая цельную кровь, сыворотку, плазму или опухолевую ткань. В отдельных вариантах осуществления образец получают от субъекта с трижды негативным метастатическим раком молочной железы (TNMBC).

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством, причем способ включает:

(a) лизирование опухолевых клеток, взятых от трижды негативной опухоли молочной железы, для получения клеточного экстракта;

(b) определение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте; и

(c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R в клеточном экстракте, полученном на стадии (b), с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R,

при этом наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2, низкого уровня экспрессии c-KIT, высокого уровня экспрессии HER1 и/или низкого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте по сравнению с эталонным уровнем экспрессии предсказывает ответ на терапию противоопухолевым средством.

В некоторых вариантах осуществления наличие от умеренного до высокого уровня экспрессии VEGFR2, от умеренного до высокого уровня экспрессии c-KIT, от низкого до умеренного уровня экспрессии HER1 и/или от умеренного до высокого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте предсказывает отсутствие ответа на лечение противоопухолевым средством. В одном отдельном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2 и c-KIT в клеточном экстракте. В другом отдельном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2 и HER1 в клеточном экстракте. В еще одном варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2, c-KIT и HER1 в клеточном экстракте. В дополнительных отдельных вариантах осуществления способ включает определение уровня экспрессии комбинации аналитов, содержащей, в основном состоящей из или состоящей из VEGFR2, c-KIT, HER1 и IGF-1R в клеточном экстракте. В некоторых случаях способ настоящего изобретения дополнительно включает определение уровня активации, по меньшей мере, одного, двух или более (например, всех) из числа VEGFR2, c-KIT, HER1, IGF-1R и/или АКТ в клеточном экстракте. В других случаях способ дополнительно включает инкубирование опухолевой клетки, полученной из трижды негативного рака молочной железы, с противоопухолевым средством до стадии (а).

В других вариантах осуществления опухолевая клетка представляет собой клетку, полученную из тонкоигольного пунктата (FNA) опухоли, такой как трижды негативный рак молочной железы, или циркулирующую опухолевую клетку (СТС), полученную из образца жидкости организма. В большинстве случаев опухолевую клетку выделяют из образца, включая цельную кровь, сыворотку, плазму или опухолевую ткань. В отдельных вариантах осуществления образец получают от субъекта с трижды негативным метастатическим раком молочной железы (TNMBC).

В некоторых случаях наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 является предсказывающим более длительную выживаемость без прогрессирования (PFS). В других случаях наличие низкого уровня экспрессии с-KIT является предсказывающим более длительную PFS. В дополнительных случаях наличие высокого уровня экспрессии HER1 является предсказывающим более длительную PFS. В следующих случаях наличие низкого уровня экспрессии IGF-1R является предсказывающим более длительную PFS. В отдельных случаях наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 в совокупности с наличием низкого уровня экспрессии c-KIT и/или высокого уровня экспрессии HER1 является предсказывающим более длительную PFS по сравнению с уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT или HER1 по отдельности.

В определенных вариантах осуществления способы настоящего изобретения (например, способы определения чувствительности трижды негативной опухолевой клетки к лечению противоопухолевым средством и предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на лечение противоопухолевым средством) могут дополнительно включать стадию (d) предоставления результата сравнения, полученного на стадии (с), пользователю (например, клиницисту, такому как онколог или врач общей практики) в доступном для чтения оформлении. В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения могут дополнительно включать отправление (передачу) или сообщение результата сравнения, полученного на стадии (с), клиницисту, например онкологу или врачу общей практики. В других случаях способы настоящего изобретения могут дополнительно включать документирование или хранение результата сравнения, полученного на стадии (с), в компьютерной базе данных или другой подходящей машине или устройстве для хранения информации, например в лаборатории.

В отдельных вариантах осуществления уровень экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R определяется по обнаружению уровней общего белка VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R, например, с помощью иммуноанализа с использованием специфических к аналиту антител. Общий уровень экспрессии и/или статус может быть определен с помощью любого из целого ряда методов. В качестве неограничивающих примеров уровень экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R может быть определен с помощью метода одиночного обнаружения или метода обнаружения двойного «сближения», как описано здесь. В предпочтительных вариантах осуществления метод обнаружения двойного «сближения» представляет собой Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER).

В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии (например, общей) и/или уровень активации (например, фосфорилирования) одного или более аналитов выражается в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ), соответствующих интенсивности сигнала отдельного интересующего аналита, который определяется с помощью CEER, например. В других вариантах осуществления количественный анализ уровня экспрессии и/или уровня активации одного или более аналитов производится посредством калибровки или нормирования значения ОЕФ, которое определяется с помощью анализа «сближения», например CEER, по отношению к стандартной кривой, полученной для определенного, представляющего интерес аналита. В некоторых случаях значение ОЕФ может быть вычислено, исходя из стандартной кривой.

В дополнительных вариантах осуществления уровень экспрессии й/или уровень активации одного или более аналитов выражается как "низкий", "умеренный" или "высокий", что соответствует увеличению интенсивности сигнала отдельного интересующего аналита, который определяется, например, с помощью анализа «сближения», такого как CEER. В некоторых случаях необнаруживаемый или минимально обнаруживаемый уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита, который определяется, например, с помощью анализа «сближения», такого как CEER, может выражаться как "необнаружимый". В других случаях низкий уровень, экспрессии или активации отдельного интересующего аналита, который определяется с помощью анализа «сближения», например CEER, может выражаться как "низкий". В других случаях умеренный уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита, который определяется с помощью анализа «сближения», например CEER, может выражаться как "умеренный". В других случаях уровень от умеренного до высокого экспрессии или активации отдельного интересующего аналита, определенный с помощью анализа «сближения», такого как CEER, может быть выражен как уровень "от умеренного до высокого". В дополнительных случаях очень высокий уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита, определенный с помощью анализа «сближения», такого как CEER, может быть выражен как "высокий".

В отдельных вариантах осуществления эталонный уровень экспрессии и/или уровень активации отдельного интересующего аналита вычисляется, исходя из одной или более стандартных кривых, полученных от образца, например, линии опухолевых клеток. В качестве неограничивающего примера, для каждого метода анализа, используемого для определения уровня экспрессии или уровня активации отдельного интересующего аналита, можно получить сигмоидальные стандартные кривые, если исходить из одной или нескольких концентраций (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи и т.д.) серийно разведенных клеточных лизатов, приготовленных из линии опухолевых клеток. В предпочтительных вариантах осуществления клетки опухолевой линии экспрессируют один или более представляющих интерес аналитов, например, VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R. Каждую кривую можно получить в виде графика зависимости интенсивности сигнала от log концентрации производных единиц, a CU (расчетная единица) может быть вычислена, исходя из стандартной кривой. Пример 7 предоставляет более подробное описание количественного определения уровней экспрессии и/или уровней активации отдельного интересующего аналита по стандартной кривой, полученной для отдельного аналита.

В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии или уровень активации отдельного интересующего аналита, в тех случаях, когда выражается как "низкий", "умеренный" или "высокий", может соответствовать уровню экспрессии или активации, который составляет, по меньшей мере, около 0; 5,000; 10,000; 15,000; 20;000; 25,000; 30,000; 35,000; 40,000; 45,000; 50,000; 60,000; 70;000; 80,000; 90,000; 100,000 ОЕФ; или более, например, по сравнению с эталонным уровнем экспрессии и/или активации отдельного интересующего аналита в отрицательном контроле (например, IgG контроле), на стандартной кривой, полученной для представляющего интерес аналита (например, стандартной кривой, полученной от линии опухолевых клеток), в положительном контроле, таком как pan-СК контроль, в присутствии противоопухолевого средства и/или при отсутствии противоопухолевого средства. В некоторых случаях корреляция является аналит-специфической. В качестве неограничивающего примера, "низкий" уровень экспрессии или активации, определенный, например, при использовании анализа «сближения», такого как CEER, может соответствовать 10000 OEOs экспрессии или активации для одного аналита и 50,000 OEOs для другого аналита по сравнению с уровнем эталонной экспрессии или активации.

В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита может соответствовать уровню экспрессии или активации, называемому "низким", "умеренным" или "высоким", который является относительным по отношению к эталонному уровню экспрессии или уровню активации отдельного интересующего аналита, например, при сравнении с отрицательным контролем, таким как IgG контроль, при сравнении со стандартной кривой, полученной для интересующего аналита (например, стандартной кривой, полученной от линии опухолевых клеток), при сравнении с положительным контролем, таким как рап-CK контроль, при сравнении с уровнем экспрессии или активации, определенным в присутствии противоопухолевого средства, и/или при сравнении с уровнем экспрессии или активации, определенным при отсутствии противоопухолевого средства. В некоторых случаях корреляция является аналит-специфической. В качестве неограничивающего примера, "низкий" уровень экспрессии или активации, определенный, например, при использовании анализа «сближения», такого как CEER, может соответствовать 2-кратному увеличению экспрессии или активации одного аналита и 5-кратному увеличению другого аналита по сравнению с уровнем эталонной экспрессии или активации.

В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита может соответствовать уровню экспрессии или активации, который является сравнимым с эталонным уровнем экспрессии и/или уровнем активации отдельного интересующего аналита в отрицательном контроле (например, IgG контроле), на стандартной кривой, полученной для интересующего аналита (например, стандартной кривой, полученной от линии опухолевых клеток), в положительном контроле, таком как pan-CK контроль, в присутствии противоопухолевого средства и/или при отсутствии противоопухолевого средства.

В определенных вариантах осуществления считается, что в образце присутствует более высокий уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита (например, в клеточном экстракте), когда уровень экспрессии или активации является, по меньшей мере, примерно в 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100-раз выше (например, примерно в 1.5-3, 2-3, 2-4, 2-5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20 или 5-50-раз выше), чем эталонный уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита в отрицательном контроле (например, IgG контроле), на стандартной кривой, полученной для интересующего аналита (например, стандартной кривой, полученной от линии опухолевых клеток), в положительном контроле (например, pan-СК контроле), в присутствии противоопухолевого средства и/или при отсутствии противоопухолевого средства.

В других вариантах осуществления считается, что в образце присутствует более низкий уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита (например, в клеточном экстракте), когда уровень экспрессии или активации является, по меньшей мере, примерно в 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100-раз ниже (например, примерно в 1.5-3, 2-3, 2-4, 2-5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20 или 5-50-раз ниже), чем эталонный уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита в отрицательном контроле (например, IgG контроле), на стандартной кривой, полученной для интересующего аналита (например, стандартной кривой, полученной от линии опухолевых клеток), в положительном контроле (например, pan-СК контроле), в присутствии противоопухолевого средства и/или при отсутствии противоопухолевого средства.

В дополнительных вариантах осуществления эталонный уровень экспрессии или активации отдельного интересующего аналита представляет собой предельное значение. В некоторых случаях предельное значение включает число, выбранное на основе популяционного анализа отдельного интересующего аналита, который используется для сравнения уровня экспрессии или активации аналита в клеточном экстракте. В качестве неограничивающего примера, предельное значение можно получить путем разделения значений уровня экспрессии или активации отдельного интересующего аналита в популяции индивидуумов на группы "высокое" и "низкое" и отбора значений, находящихся на или около умеренных значений уровня экспрессии или активации этого аналита в популяции. Уровень экспрессии или активации интересующего аналита в клеточном экстракте можно сравнить с предельным значением и определить как являющейся "высоким" или "низким" уровнем экспрессии или активации, исходя из того, является ли уровень экспрессии или активации аналита в клеточном экстракте выше (например, "высокий") или ниже (например, "низкий") предельного значения. Пример 5 предоставляет один характерный вариант осуществления вычисления, отбора и использования предельных значений в соответствии со способами настоящего изобретения. В других вариантах осуществления предельное значение можно получить из стандартной кривой, полученной для отдельного интересующего аналита (например, стандартной кривой, полученной от линии опухолевых клеток), и сравнения с уровнем экспрессии и активации этого аналита в клеточном экстракте. Специалистам в данной области техники ясно, что предельное значение может определяться в зависимости от потребностей пользователя и свойств анализируемой популяции.

В некоторых вариантах осуществления противоопухолевое средство включает одно или более средств, затрагивающих функцию аномально экспрессированных и/или активированных компонентов пути сигнальной трансдукции в раковых клетках. Неограничивающие примеры таких средств включают средства, перечисленные ниже в Таблице 1 РСТ публикации №WO 2010/132723, раскрытие которой включено в описание путем отсылки полностью и во всех смыслах.

В определенных вариантах осуществления противоопухолевое средство включает противосигнальное средство (т.е. цитостатическое средство), такое как моноклональное антитело или ингибитор тирозинкиназы; антипролиферативное средство, химиотерапевтическое средство (т.е. цитотоксическое средство); гормональное терапевтическое средство; радиотерапевтическое средство; вакцину; и/или любое другое соединение, обладающее способностью уменьшать или отменять неконтролируемый рост аберрантных клеток, таких как раковые клетки. В некоторых вариантах осуществления выделенные клетки обрабатывают одним или более противосигнальными средствами, антипролиферативными средствами и/или гормональными терапевтическими средствами в комбинации, по меньшей мере, с одним химиотерапевтическим средством.

Примеры противосигнальных средств, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают, без ограничения, моноклональные антитела, такие как трастузумаб (Герцептин^®), пертузумаб (2С4), алемтузумаб (Кэмпас^®), бевацизумаб (Авастин®), цетуксимаб (Эрбитукс^®), гемтузумаб (Милотарг^®), панитумумаб (Вектибикс™), ритуксимаб (Ритуксан^®) и тозитумомаб (BEXXAR®); ингибиторы тирозинкиназ, такие как гефитиниб (Пресса^®), сунитиниб (Сутент^®), эрлотиниб (Тарцева^®), лапатиниб (GW-572016; Тикерб^®), канертиниб (CI 1033), семаксиниб (SU5416), ваталаниб (PTK787/ZK222584), сорафениб (BAY 43-9006; Нексавар^®), иматиниб мезилат (Гливек^®), лефлуномид (SU101), вандетаниб (ZACTIMA™; ZD6474), пелитиниб, СР-654577, СР-724714, HKI-272, PKI-166, АЕЕ788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327 и JNJ-26483327; и их комбинации.

Примеры антипролиферативных средств включают ингибиторы mTOR, такие как сиролимус (рапамицин), темсиролимус (CCI-779), эверолимус (RAD001), BEZ235 и XL765; ингибиторы АКТ, такие как 1b6-гидроксиметил-хиро-инозитол-2-(R)-2-O-метил-3-О-октадецил-sn-глицерокарбонат, 9-метокси-2-метилэллипттициниум ацетат, 1,3-дигидро-1-(1-((4-(6-фенил-1Н-имидазо[4,5-g]хиноксалин-7-ил)фенил)метил)-4-пиперидинил)-2Н-бензимидазол-2-он, 10-(4'-(N-диэтиламино)бутил)-2-хлорфеноксазин, 3-формилхромон тиосемикарбазон (комплекс Cu(II)Cl₂), API-2, 15-тег пептид, полученный из аминокислот 10-24 протоонкогена TCL1 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004), KP372-1, и соединения, описанные в Kozikowski et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003) и Kau et al., Cancer Cell, 4:463-476 (2003); ингибиторы PI3K, такие как PX-866, вортманнин, LY 294002, кверцетин, тетродотоксин цитрат, тиоперамид малеат, GDC-0941 (957054-30-7), IC87114, PI-103, PIK93, BEZ235 (NVP-BEZ235), TGX-115, ZSTK474, (-)-дегуелин, NU 7026, мирицетин, тандутиниб, GDC-0941 бисмезилат, GSK690693, KU-55933, MK-2206, OSU-03012, перифозин, трицирибин, XL-147, PIK75, TGX-221, NU 7441, PI 828, XL-765 и WHI-P 154; ингибиторы МЕК, такие как PD98059, ARRY-162, RDEA119, U0126, GDC-0973, PD184161, AZD6244, AZD8330, PD0325901 и ARRY-142886; и их комбинации.

Неограничивающие примеры naH-HER-ингибиторов включают PF-00299804, нератиниб (HKI-272), АС480 (BMS-599626), BMS-690154, PF-02341066, НМ781-36 В, CI-1033, BIBW-2992 и их комбинации.

Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают лекарственные средства на основе платины (например, оксалиплатин, цисплатин, карбоплатин, спироплатин, ипроплатин, сатраплати и т.д.), алкилирующие средства (например, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан, мехлоретамин, урамистин, тиотепа, нитрозомочевина и т.д.), антиметаболиты (например, 5-фторурацил, азатиоприн, 6-меркаптопурин, метотрексат, лейковорин, капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин (Гемзар^®), пеметрексед (ALIMTA^®), ралтитрексед и т.д.), растительные алкалоиды (например, винкристин, винбластин, винорельбин, видезин, подофиллотоксин, паклитаксель (Таксол^®), доцетаксель (Таксотер^®) и т.д.), ингибиторы топоизомеразы (например, иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид (VP 16), этопозида фосфат, тенипозид и т.д.), противоопухолевые антибиотики (например, доксорубицин, адриамицин, дауномицин, эпируьицин, актиномицин, блеомицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин и т.д.), их фармацевтически приемлемые соли, их стереоизомеры, их производные, их аналоги и их комбинации.

Примеры гормональных терапевтических средств включают, без ограничения, ингибиторы ароматазы (например, аминоглютетимид, анастрозол (Аримидекс^®), летрозол (Фемара^®), ворозол, эксеместан (Аромазин^®), 4-андростен-3,6,17-трион (6-ОХО), 1,4,6-андростатриен-3,17-дион (ATD), форместан (Лентарон^®) и т.д.), селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (например, базедоксифен, кломифен, фулвестрант, лазофоксифен, ралоксифен, тамоксифен, торемифен и т.д.), стероиды (например, дексаметазон), финастредин и агонисты гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH), такие как госерелин, их фармацевтически приемлемые соли, стереоизомеры, производные, аналоги и комбинации.

Неограничивающие примеры противораковых вакцин, пригодных в настоящем изобретении, включают ANYARA от Active Biotech, DCVax-LB от Northwest Biotherapeutics, EP-2101 от IDM Pharma, GV1001 от Pharmexa, IO-2055 от Idera Pharmaceuticals, INGN 225 от Introgen Therapeutics и Стимувакс от Biomira/Merck.

Примеры радиотерапевтических средств включают, но не ограничиваются этим, радионуклиды, такие как ⁴⁷Sc, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁸⁶Y, ⁸⁷Y, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ¹¹¹In, ^1,7mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ^I86Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹ At и ²¹²Bi, необязательно конъюгированные с антителами к опухолевым антигенам.

В предпочтительных вариантах осуществления противоопухолевое средство представляет собой комбинацию бевацизумаба (Авастина^®), карбоплатина и паклитакселя ("триплетная терапия"). В некоторых случаях паклитаксель представляет собой альбумин-связанный (nab) паклитаксель в виде наночастиц (Абраксан^® или nabP). В других вариантах осуществления противоопухолевое средство включает одно или более из следующего: бевацизумаб (Авастин^®), карбоплатин, паклитаксель (например, nabP), инипариб (BSI 201; 4-иодо-3-нитробензамид), NK012 (высвобождающее SN-38 наноустройство, созданное путем ковалентного присоединения SN-38 к блок-сополимеру PEG-PGlu, а затем самосборки амфифильных блок-сополимеров в водной среде), глембатумумаб ведотин, (также известный как CDX-011 или CROll-vcMMAE; человеческое моноклональное антитело глембатумумаб (CR011), связанное с монометил ауристатином Е (ММАЕ), который нацеливается на раковые клетки, экспрессирующие трансмембранный гликопротеин NMB), или их комбинации. В одном отдельном варианте осуществления противоопухолевое средство представляет собой комбинацию инипариба (ингибитора PARP), гемцитабина (Gemzar^®) и карбоплатина.

В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают определение уровня экспрессии и/или активации одной или более дополнительных молекул сигнальной трансдукции в клеточном экстракте. Неограничивающие примеры дополнительных молекул сигнальной трансдукции, которые могут быть детально исследованы в отношении уровней экспрессии (например, общего количества) и/или уровней активации (например, фосфорилирования) в образце, таком как клеточный экстракт, включают рецепторные тирозинкиназы, нерецепторные тирозинкиназы, компоненты тирозинкиназного сигнального каскада, ядерные рецепторы гормонов, ядерные рецепторы коактиваторов, ядерные рецепторы репрессоров и их комбинации. Характерные примеры молекул и путей сигнальной трансдукции, которые могут быть детально исследованы с использованием настоящего изобретения, включают указанные в Таблице 2 РСТ публикации №WO 2010/132723, раскрытие которой включается в описание путем отсылки полностью и во всех смыслах. В отдельных вариантах осуществления одну или более дополнительных молекул сигнальной трансдукции выбирают из группы, состоящей из HER2, p95HER2, HER3, HER4, PI3K, АКТ, МЕК, PTEN, SGK3, 4Е-ВР1, ERK2 (МАРК1), ERK1 (MAPK3), PDK1, P70S6K, GSK-30, She, с-МЕТ, VEGFR1, VEGFR3, димера рецептора и их комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение дополнительно включает определение уровня экспрессии (например, общего) и/или уровня активации (например, фосфорилирования) одного или более (например, по меньшей мере, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или более) дополнительных аналитов в клеточном экстракте. В некоторых вариантах осуществления один или более (например, по меньшей мере, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35,40, 45, 50 или более) дополнительных аналитов включает одну или более молекул сигнальной трансдукции, выбранных из группы, состоящей из рецепторных тирозинкиназ, нерецепторных тирозинкиназ, компонентов тирозинкиназного сигнального каскада, ядерных рецепторов гормонов, ядерных рецепторов коактиваторов, ядерных рецепторов репрессоров и их комбинаций.

В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение дополнительно включает определение уровня экспрессии (например, общего) и/или уровня активации (например, фосфорилирования) одной или любой комбинации из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или более следующих добавочных аналитов в клеточном экстракте: HER2, p95HER2, HER3, HER4, PI3K, АКТ, МЕК, PTEN, SGK3, 4Е-ВР1, ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PDK1, P70S6K, GSK-3β, She, с-МЕТ, VEGFR1, VEGFR3, PDK2, Raf, SRC, NFkB-IkB, mTOR, EPH-A, EPH-B, EPH-C, EPH-D, FLT-3, TIE-1, TIE-2, c-FMS, Abl, FTL 3, RET, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, ER, PR, NCOR, AIB1, RON, PIP2, PIP3, p27, протеинтирозинфосфатаз (например, PTP1B, PTPN13, BDP1 и т.д.), димеров рецепторов и их комбинаций.

IV. Конструкция антительных чипов

В некоторых аспектах уровень экспрессии или состояние активации одного или более (например, множества) аналитов (например, молекул сигнальной трансдукции) в клеточном экстракте из опухолевых клеток, таких как клетки рака молочной железы, определяется с использованием чипов, основанных на антителах, содержащих серию разведений захватывающих антител, закрепленных на твердой подложке. Чипы обычно содержат множество различных захватывающих антител в диапазоне концентраций захватывающих антител, которые соединяются с поверхностью твердой подложки в различных имеющих адрес местоположениях. В одном варианте осуществления чип содержит захватывающие антитела для определения и/или количественного определения экспрессии и/или активации, по меньшей мере, одного или более из числа VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R, и один или более контролей, таких как, например, отрицательный контроль (например, контроль IgG), стандартная кривая полученная для интересующего аналита и/или положительный контроль (например, pan-CK контроль).

В одном отдельном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет адресуемый чип, имеющий высший динамический диапазон, содержащий множество серий разведений иммобилизованных на твердой подложке захватывающих антител, в котором захватывающие антитела в каждой серии разведений являются специфическими для одного или более аналитов, соответствующих компоненту пути сигнальной трансдукции и другим целевым белкам. В различных аспектах этот вариант осуществления включает чипы, содержащие компоненты путей сигнальной трансдукции, характерные для определенных опухолей, например, путей сигнальной трансдукции, активных в клетках рака молочной железы. Таким образом, настоящее изобретение может успешно применяться на практике, когда каждая молекула сигнальной трансдукции или другой представляющий интерес белок с возможным нарушением экспрессии или активации, вызывающим рак молочной железы, предоставляется на одном чипе. В некоторых аспектах компоненты данного пути сигнальной трансдукции, активного в определенной опухолевой клетке, выстраиваются в ряд в линейной последовательности, соответствующей последовательности, в которой информация передается путем сигнальной трансдукции в клетке. Примеры таких чипов описаны здесь, а также показаны на Фигурах 5-9 РСТ публикации №WO2009/108637, раскрытие которой включено в описание путем отсылки полностью и во всех смыслах. Захватывающие антитела, специфические к одному или более компонентам данного пути сигнальной трансдукции, активного в определенной опухолевой клетке, также могут быть размещены случайным образом, чтобы свести к минимуму какие-либо поверхносто-связанные артефакты.

Твердая подложка может содержать любой подходящий субстрат для иммобилизации белков. Примеры твердой подложки включают, но не ограничиваются этим, стекло (например, предметное стекло), пластик, чипы, стерженьки, фильтры, гранулы, бумагу, мембраны, волоконно-оптические жгуты, гели, металл, керамику и т.п. Для использования в качестве твердых подложек в наборах настоящего изобретения пригодны мембраны, например, нейлоновые (Biotrans™, ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA); Zeta-Probe^®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)), нитроцеллюлозные (Protran^®, Whatman Inc. (Florham Park, NJ)) и PVDF (Immobilon™, Millipore Corp.(Billerica, MA)). Предпочтительно, иммобилизованные антитела фиксируются на предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозным полимером, например, FAST^® Slides, коммерчески доступные от компании Whatman Inc. (Florham Park, NJ).

Желательно учитывать особенные аспекты твердой подложки, включая способность связывать большие количества захватывающих антител и способность связывать захватывающее антитело с минимальной денатурацией. Другой аспект заключается в том, что твердая подложка должна демонстрировать минимальное "растекание" при нанесении на подложку растворов антител, содержащих захватывающие антитела. Твердая подложка с минимальным растеканием позволяет наносить на подложку небольшие аликвоты раствора захватывающих антител, чтобы давать в результате небольшие, определяемые пятна захватывающих антител.

Захватывающие антитела, как правило, прямо или непрямо (например, через захватывающие последовательности) закрепляются на твердой подложке посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий (например, ионных связей, гидрофобных взаимодействий, водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, диполь-дипольных связей). В некоторых вариантах осуществления захватывающие антитела ковалентно прикрепляются к твердой подложке с помощью гомобифункциональных или гетеробифункциональных реагентов (кросслинкеров) при использовании стандартных методов и условий «сшивания». Подходящие кросслинкеры коммерчески доступны от таких продавцов, как, например, Pierce Biotechnology (Rockford, IL).

Способы изготовления чипов, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, любой метод, используемый для создания белковых или нуклеиновокислотных чипов. В некоторых вариантах осуществления захватывающие антитела наносятся на чип с помощью микроспоттера, который в большинстве случаев представляет собой роботизированный принтер, оснащенный шплинтами, толстыми короткими иглами или струйной печатью. Подходящие роботизированные системы для получения чипов с антителами, описанными здесь, включают PixSys 5000 robot (Cartesian Technologies; Irvine, CA) с толстыми короткими иглами ChipMaker2 (TeleChem International; Sunnyvale, CA), а также другие роботизированные принтеры, доступные от BioRobics (Woburn, MA) и Packard Instrument Co. (Meriden, CT). Предпочтительно, на чип наносится, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5 или 6 повторов каждого разведения захватывающих антител.

Другой способ изготовления чипов, пригодных для применения в настоящем изобретении, включает размещение известного объема разведения захватывающих антител на твердой подложке в определенное выбранное место на чипе путем контактирования с капиллярным дозирующим устройством при условиях, эффективных для того, чтобы определенный объем жидкости оставался на подложке. Для создания заполненного чипа этот процесс повторяется, причем в каждом выбранном местоположении набора используются подобранные разбавления захватывающих антител. Способ может применяться на практике для составления множества таких чипов, при этом раствор наносится на выбранное местоположение на каждой из множества твердых подложек при каждом повторном цикле. Дополнительное описание такого способа можно найти, например, в патенте США №5,807,522.

В определенных случаях для изготовления чипов с антителами может быть использовано устройство, предназначенное для печати на бумаге. Например, желательный раствор захватывающих антител можно загрузить в печатающую головку струйного принтера и нанести на подходящую твердую подложку (см., например, Silzel et al., Clin. Chem., 44:2036-2043 (1998)).

В некоторых вариантах осуществления чип, приготовленный на твердой подложке, имеет плотность, по меньшей мере, около 5 пятен/см², и предпочтительно, по меньшей мере, около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130,140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 или 9000 или 10,000 пятен/см².

В некоторых случаях каждое пятно на твердой подложке представляет другое захватывающее антитело. В других конкретных случаях несколько пятен на твердой подложке представляют одно и то же захватывающее антитело, например, как в случае серии разведений, содержащей серию понижающихся концентраций захватывающего антитела.

Дополнительные примеры способов изготовления и создания наборов антител на твердых подложках описываются в патентах США №6,197,599, 6,777,239, 6,780,582, 6,897,073, 7,179,638 и 7,192,720; патентных публикациях США №20060115810, 20060263837, 20060292680 и 20070054326; и Varnum et al., Methods Mol. Biol, 264:161-172 (2004).

Методы сканирования чипов с антителами известны в данной области и включают, без ограничения, любые методы, используемые для сканирования белковых или нуклеиновокислотных чипов. Сканеры для микрочипов, пригодные для использования в настоящем изобретении, доступны от компаний PerkinElmer (Boston, MA), Agilent Technologies (Palo Alto, CA), Applied Precision (Issaquah, WA), GSI Lumonics Inc. (Billerica, MA) и Axon Instruments (Union City, CA). В качестве неограничивающего примера, можно использовать GSI ScanArray3000 для обнаружения флуоресценции вместе с программным обеспечением ImaGene для количественного анализа.

V. Метод одиночного обнаружения

В некоторых вариантах осуществления метод обнаружения уровня экспрессии и/или активации одного или более представляющих интерес аналитов (например, одной или более молекул сигнальной трансдукции) в клеточном экстракте, например экстракте из опухолевых клеток, представляет собой мультиплексный, высокопроизводительный анализ с использованием двух антител, имеющий высший динамический диапазон. В качестве неограничивающего примера, два антитела, использованные в этом методе анализа, могут включать: (1) захватывающее антитело, специфическое к конкретному представляющему интерес аналиту; и (2) детекторное антитело, специфическое к активированной форме аналита (т.е. антитело, зависящее от состояния активации). Антитело, зависящее от состояния активации, способно обнаружить, например, состояние фосфорилирования, убиквитинирования и/или комплексообразования аналита.

Альтернативно, детекторное антитело включает антитело, независящее от состояния активации, которое обнаруживает общее количество аналита в клеточном экстракте. Как правило, антитело, независящее от состояния активации, способно обнаружить и активированную и неактивированную формы аналита.

В одном конкретном варианте осуществления метод обнаружения двумя антителами уровня экспрессии или активации интересующего аналита включает:

(i) инкубирование клеточного экстракта с одной или несколькими сериями разведения захватывающих антител для образования множества захваченных аналитов;

(ii) инкубирование множества захваченных аналитов с детекторными антителами, специфическими к соответствующему аналиту, для образования множества обнаружимых захваченных аналитов, при этом детекторные антитела содержат антитела, зависящие от состояния активации, для обнаружения уровня активации (например, фосфорилирования) аналита или антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровня экспрессии (например, общего количества) аналита;

(iii) инкубирование множества обнаружимых захваченных аналитов с первым и вторым членами пары, усиливающей сигнал, для того, чтобы вызвать усиленный сигнал; и

(iv) обнаружение усиленного сигнала, полученного от первого и второго членов пары, усиливающей сигнал.

В описанных здесь методах анализа с применением двух антител, как правило, используются антительные чипы, содержащие множество различных захватывающих антител в некотором диапазоне концентраций, при этом захватывающие антитела соединяются с поверхностью твердой подложки в разных, имеющих адрес местоположениях. Примеры твердых подложек, подходящих для использования в настоящем изобретении, описаны выше.

Захватывающие антитела и детекторные антитела предпочтительно выбирают так, чтобы свести к минимуму конкуренцию между ними в отношении связывания аналита (т.е. и захватывающее, и детекторное антитела могут одновременно связывать соответствующие молекулы сигнальной трансдукции).

В одном варианте осуществления детекторные антитела содержат первый член пары связывания (связующей пары) (например, биотин), а первый член пары, усиливающей сигнал, содержит второй член пары связывания (например, стрептавидин). Члены пары связывания могут прямо или непрямо связываться с детекторными антителами или с первым членом пары, усиливающей сигнал, при использовании методов, хорошо известных в данной области техники. В определенных случаях первый член пары, усиливающей сигнал, представляет собой пероксидазу (например, пероксидазу хрена (HRP), каталазу, хлорпероксидазу, цитохром с пероксидазу, эозинофильную пероксидазу, глутатионпероксидазу, лактопероксидазу, миелопероксидазу, тиреоидную пероксидазу, деодиназу и т.д.), а второй член пары, усиливающей сигнал, представляет собой тирамидный реагент (например, биотин-тирамид). В этих случаях усиленный сигнал получается в результате пероксидазного окисления тирамидного реагента с получением активированного тирамида в присутствии пероксида водорода (Н₂О₂).

Активированный тирамид определяется непосредственно или после добавления реагента, обнаруживающего сигнал, такого как, например, флуорофор, меченый стрептавидином, или комбинации пероксидазы, меченой стрептавидиом, и хромогенного реагента. Примеры флуорохромов, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, краситель Alexa Fluor^® (например, Alexa Fluor^® 555), флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), Oregon Green™; родамин, техасский красный, тетрародамин изотиоцианат (TRITC), CyDye™ fluor (например, Су2, Су3, Су5) и т.п. Стептавидиновая метка может быть соединена прямо или непрямо с флуорохромом или пероксидазой с помощью методов, хорошо известных в данной области. Неограничивающие примеры хромогенных реагентов, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ), 3,3'-диаминобензидин (DAB), 2,2'-азидо-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту) (ABTS), 4-хлор-1-нафтол (4CN) и/или порфириноген.

Характерный протокол проведения описанного здесь анализа с использованием двух антител предоставляется в Примере 3 РСТ публикации №WO 2009/108637, раскрытие которой включено в описание путем отсылки полностью во всех отношениях.

В другом варианте осуществления подхода с использованием двух антител настоящее изобретение предоставляет способ определения уровня экспрессии или активации укороченного рецептора, данный способ включает:

(i) инкубирование клеточного экстракта с множеством гранул, специфических к участку связывания внеклеточного домена (ECD) полноразмерного рецептора;

(ii) удаление множества гранул из клеточного экстракта, вследствие этого удаление полноразмерного рецептора, для получения клеточного экстракта, свободного от полноразмерного рецептора;

(iii) инкубирование клеточного экстракта, свободного от полноразмерного рецептора, с серией разведений одного или множества захватывающих антител, специфических к участку связывания внутриклеточного домена (ICD) полноразмерного рецептора для образования множество захваченных укороченных рецепторов;

(iv) инкубирование множества захваченных укороченных рецепторов с детекторными антителами, специфическими к участку связывания ICD полноразмерного рецептора, для образования множества обнаружимых захваченных укороченных рецепторов, причем детекторные антитела включают антитела, зависящие от активации, для обнаружения уровня активации (например, фосфорилирования) укороченного рецептора или антитела, независящие от активации, для обнаружения уровня экспрессии (например, общего количества) укороченного рецептора;

(v) инкубирование множества обнаружимых захваченных укороченных рецепторов с первым и вторым членами пары, усиливающей сигнал, для того, чтобы вызвать усиленный сигнал; и

(iv) обнаружение усиленного сигнала, полученного от первого и второго членов пары, усиливающей сигнал.

В определенных вариантах осуществления «укороченный» рецептор представляет собой p95HER2, а полноразмерный рецептор представляет собой HER2. В других вариантах осуществления множество гранул, специфических к участку связывания внеклеточного домена (ECD), содержит пару стрептавидин-биотин, в которой биотин прикрепляется к грануле, а также биотин прикрепляется к антителу (при этом антитело, например, является специфическим к участку связывания ECD полноразмерного рецептора).

Фигура 14А РСТ публикации №WO 2009/108637, раскрытие которой включено в описание путем отсылки полностью во всех отношениях, показывает, что покрывающие гранулы антитела, направленные к внеклеточному домену (ECD) соответствующего рецептора, связываются с полноразмерным рецептором (например, HER2), но не укороченным рецептором (например, p95HER2), с целью удаления полноразмерного рецептора из анализа. Фигура 14В РСТ публикации №WO 2009/108637 показывает, что после этого укороченный рецептор (например, p95HER2), связавшийся с захватывающим антителом, может быть обнаружен с помощью детекторного антитела, специфического к внутриклеточному домену (ICD) полноразмерного рецептора (например, HER2). Детекторное антитело может быть непосредственно конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Затем можно провести усиление сигнала тирамидом (TSA), чтобы получить обнаружимый сигнал. Уровень экспрессии или состояние активации укороченного рецептора (например, p95HER2) может быть детально исследовано, например, с целью установления его общей концентрации или состояния фосфорилирования, состояния убиквитинирования и/или состояния комплексообразования.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения описанного выше анализа с использованием двух антител, содержащие: (а) серию разведений одного или множества захватывающих антител, закрепленных на твердой подложке; и (b) одного или множества детекторных антител (например, антител, зависящих от состояния активации, и/или антител, независящих от состояния активации). В некоторых случаях наборы могут дополнительно включать инструкции, касающиеся использования набора для определения уровней экспрессии и/или состояний активации одной или множества молекул сигнальной трансдукции в клетках, таких как опухолевые клетки. Наборы также могут содержать любые дополнительные реагенты, описанные выше, имеющие отношение к выполнению специальных методов настоящего изобретения, такие как, например, первый и второй члены пары, усиливающей сигнал, реагенты, усиливающие сигнал тирамида, буферы для промывки и т.д.

VI. Метод двойного обнаружения «сближения»

В некоторых вариантах осуществления метод обнаружения уровня экспрессии и/или активации одного или более представляющих интерес аналитов (например, одной или более молекул сигнальной трансдукции) в экстракте клеток, например, опухолевых клеток, представляет собой мультиплексный высокопроизводительный анализ «сближения» (т.е. с использованием трех антител), имеющий высший динамический диапазон. В качестве неограничивающего примера, три антитела, используемые в анализе «сближения», могут включать: (1) захватывающее антитело, специфическое к конкретному интересующему аналиту; (2) детекторное антитело, специфическое к активированной форме аналита (т.е. антитело, зависящее от состояния активации) и (3) детекторное антитело, определяющее общее количество аналита (т.е. антитело, независящее от состояния активации). Антитело, зависящее от состояния активации, способно определить, например, состояние фосфорилирования, убиквитинирования и/или комплексообразования аналита, в то время как антитело, независящее от состояния активации, способно определить общее количество (т.е. и активированную и неактивированную формы) аналита.

В одном конкретном варианте осуществления анализ «сближения» для установления уровня активации или статуса аналита, представляющего интерес, включает:

(i) инкубирование клеточного экстракта с одной или несколькими сериями разведения захватывающих антител для образования множества захваченных аналитов;

(ii) инкубирование множества захваченных аналитов с детекторными антителами, содержащими одно или множество антител, независящих от состояния активации, и одно или множество антител, зависящих от состояния активации, специфических к соответствующим аналитам, для образования множества обнаружимых захваченных аналитов,

причем антитела, независящие от состояния активации, помечены содействующей частицей, а антитела, зависящие от состояния активации, помечены первым членом пары, усиливающей сигнал, при этом содействующая частица порождает окисляющий агент, который направляется к и реагирует с первым членом пары, усиливающей сигнал;

(iii) инкубирование множества обнаружимых захваченных аналитов со вторым членом пары, усиливающей сигнал, для того, чтобы вызвать усиленный сигнал; и

(iv) обнаружение усиленного сигнала, полученного от первого и второго членов пары, усиливающей сигнал.

В другом конкретном варианте осуществления анализа «сближения» для установления уровня активации или статуса аналита, представляющего интерес, то есть укороченного рецептора, включает:

(i) инкубирование клеточного экстракта с множеством гранул, специфических к участку связывания внеклеточного домена (ECD) полноразмерного рецептора;

(ii) удаление множества гранул из клеточного экстракта, таким образом удаление полноразмерного рецептора, для получения клеточного экстракта, лишенного полноразмерного рецептора;

(iii) инкубирование клеточного экстракта, лишенного полноразмерного рецептора, с одним или множеством захватывающих антител, специфических к участку связывания внутриклеточного домена (ICD) полноразмерного рецептора, для образования множества захваченных укороченных рецепторов;

(iv) инкубирование множества захваченных укороченных рецепторов с детекторными антителами, содержащими одно или множество антител, независящих от состояния активации, и одно или множество антител, зависящих от состояния активации, специфических к ICD участку связывания полноразмерного рецептора для образования множества обнаружимых захваченных укороченных рецепторов,

причем антитела, независящие от состояния активации, помечены содействующей частицей, а антитела, зависящие от состояния активации, помечены первым членом пары, усиливающей сигнал, при этом содействующая частица порождает окисляющий агент, который направляется к и реагирует с первым членом пары, усиливающей сигнал;

(v) инкубирование множества обнаружимых захваченных укороченных рецепторов со вторым членом пары, усиливающей сигнал, для того, чтобы вызвать усиленный сигнал; и

(vi) обнаружение усиленного сигнала, полученного от первого и второго членов пары, усиливающей сигнал.

В определенных вариантах осуществления «укороченный» рецептор представляет собой p95HER2, а полноразмерный рецептор представляет собой HER2. В других вариантах осуществления множество гранул, специфических к участку связывания внеклеточного домена (ECD), содержит пару стрептавидин-биотин, причем биотин прикрепляется к грануле, а кроме того, биотин прикрепляется к антителу (при этом антитело, например, является специфическим к участку связывания ECD полноразмерного рецептора).

В альтернативных вариантах осуществления антитела, зависящие от состояния активации, могут быть помечены содействующей частицей, а антитела, независящие от состояния активации, могут быть помечены первым членом пары, усиливающей сигнал.

В качестве неограничивающего примера, три антитела, использованные в анализе «сближения», могут включать: (1) захватывающее антитело, специфическое к конкретному интересующему аналиту; (2) первое детекторное антитело, определяющее общее количество аналита (т.е. первое антитело, независящее от состояния активации) и (3) второе детекторное антитело, определяющее общее количество аналита (т.е. второе антитело, независящее от состояния активации). В предпочтительных вариантах осуществления первое и второе антитела, независящие от состояния активации, распознают разные (например, различные) эпитопы на аналите.

В одном конкретном варианте осуществления анализ «сближения» для установления уровня экспрессии интересующего аналита включает:

i) инкубирование клеточного экстракта с одной или множеством серий разведения захватывающих антител для образования множества захваченных аналитов;

(ii) инкубирование множества захваченных аналитов с детекторными антителами, содержащими одно или множество первых и вторых антител, независящих от состояния активации, специфических к соответствующим аналитам, для образования множества обнаружимых захваченных аналитов,

причем первые антитела, независящие от состояния активации, помечены содействующей частицей, а вторые антитела, независящие от состояния активации, помечены первым членом пары, усиливающей сигнал, при этом содействующая частица порождает окисляющий агент, который направляется к и реагирует с первым членом пары, усиливающей сигнал;

(iii) инкубирование множества обнаружимых захваченных аналитов со вторым членом пары, усиливающей сигнал, для того, чтобы вызвать усиленный сигнал; и

(vi) обнаружение усиленного сигнала, полученного от первого и второго членов пары, усиливающей сигнал.

В другом конкретном варианте осуществления анализ «сближения» для установления уровня экспрессии аналита, представляющего интерес, а именно укороченного рецептора, включает:

(i) инкубирование клеточного экстракта с множеством гранул, специфических к участку связывания (ECD) внеклеточного домена полноразмерного рецептора;

(ii) удаление множества гранул из клеточного экстракта, и таким образом удаление полноразмерного рецептора, для получения клеточного экстракта, лишенного полноразмерного рецептора;

(iii) инкубирование клеточного экстракта, лишенного полноразмерного рецептора, с одним или множеством захватывающих антител, специфических к участку связывания (ICD) внутриклеточного домена полноразмерного рецептора, для образования множества захваченных укороченных рецепторов;

(iv) инкубирование множества захваченных укороченных рецепторов с детекторными антителами, содержащими одно или множество первых и вторых антител, независящих от состояния активации, специфических к ICD участку связывания полноразмерного рецептора, для образования множества обнаружимых захваченных укороченных рецепторов,

причем первые антитела, независящие от состояния активации, помечены содействующей частицей, а вторые антитела, независящие от состояния активации, помечены первым членом пары, усиливающей сигнал, при этом содействующая частица порождает окисляющий агент, который направляется к и реагирует с первым членом пары, усиливающей сигнал;

(v) инкубирование множества обнаружимых захваченных укороченных рецепторов со вторым членом пары, усиливающей сигнал, для того, чтобы вызвать усиленный сигнал; и

(vi) обнаружение усиленного сигнала, полученного от первого и второго членов пары, усиливающей сигнал.

В определенных вариантах осуществления «укороченный» рецептор представляет собой p95HER2, а полноразмерный рецептор представляет собой HER2. В других вариантах осуществления множество гранул, специфических к участку связывания внеклеточного домена (ECD), содержит пару стрептавидин-биотин, в которой биотин прикрепляется к грануле, а также биотин прикрепляется к антителу (при этом антитело, например, является специфическим к участку связывания ECD полноразмерного рецептора).

В альтернативных вариантах осуществления первые антитела, независящие от состояния активации, могут быть помечены первым членом пары, усиливающей сигнал, а вторые антитела, независящие от состояния активации, могут быть помечены содействующей частицей.

В описанных здесь методах анализа «сближения», как правило, используются чипы, основанные на антителах, содержащие одно или множество различных захватывающих антител в некотором диапазоне концентраций, при этом захватывающие антитела соединяются с поверхностью твердой подложки в разных, имеющих адрес местоположениях. Примеры твердых подложек, подходящих для использования в настоящем изобретении, описаны выше.

Захватывающие антитела, антитела, независящие от состояния активации, и антитела, зависящие от состояния активации, предпочтительно выбирают так, чтобы свести к минимуму конкуренцию между ними при связывании аналита (т.е. все антитела могут одновременно связывать соответствующие молекулы сигнальной трансдукции).

В некоторых вариантах осуществления антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней активации одного или более аналитов или, альтернативно, первые антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней экспрессии одного или более аналитов дополнительно содержат обнаружимую частицу. В таких случаях, количество обнаружимых частиц соответствует количеству одного или более аналитов в клеточном экстракте. Примеры обнаружимых частиц включают, но не ограничиваются этим, флуоресцентные метки, химически реакционноспособные метки, ферментные метки, радиоактивные метки и т.п. Предпочтительно, обнаружимая частица является флуорохромом, таким как краситель Alexa Fluor^® (например, Alexa Fluor^® 647), флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), Oregon Green™; родамин, техасский красный, тетрародамин изотиоцианат (TRITC), CyDye™ fluor (например, Су2, Су3, Су5) и т.п. Обнаружимая частица может прямо или непрямо соединяться с антителами, независящими от состояния активации, с помощью методов, хорошо известных в данной области техники.

В определенных случаях антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней активации одного или более аналитов или, альтернативно, первые антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней активации одного или более аналитов непосредственно помечают содействующей частицей. Содействующая частица может соединяться с антителами, независящими от состояния активации, при использовании методов, хорошо известных в данной области техники. Подходящие содействующие частицы для применения в настоящем изобретении включают любую молекулу, способную порождать окисляющий агент, который направляется к (т.е. устремляется к) и вступает в реакцию с (т.е. связывает, связывается или образует комплекс с) другой молекулой при «сближении» (т.е. пространственно попадает в положение «около» или «близко») с содействующей частицей. Примеры «облегчающих частиц» включают, без ограничения, глюкозооксидазу или любой другой фермент, катализирующий реакцию окисления/восстановления, в которой участвует молекулярный кислород (O₂) в качестве акцептора электронов, и фотосенсибилизаторы, такие как метиленовый синий, бенгальский розовый, порфирины, скваратные красители, фталоцианины и т.п. Неограничивающие примеры окисляющих агентов включают пероксид водорода (Н₂О₂), синглетный кислород и любое другое соединение, которое переносит атомы кислорода или получает электроны в реакции окисления/восстановления. Предпочтительно, в присутствии подходящего субстрата (например, глюкозы, света и т.д.), содействующая частица (например, глюкозооксидаза, фотосенсибилизатор и т.д.) порождает окисляющий агент (например, пероксид водорода (Н₂О₂), синглетный кислород и т.д.), который направляется к и вступает в реакцию с первым членом пары, усиливающей сигнал, (например, пероксидазой хрена (HRP), гаптеном, защищенным защитной группой, ферментом, инактивированным тиоэфирной связью с ингибитором фермента, и т.д.), когда две частицы находятся поблизости друг к другу («сближение»).

В некоторых случаях антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней активации одного или более аналитов или, альтернативно, первые антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней активации одного или более аналитов непрямо помечают содействующей частицей путем гибридизации между олигонуклеотидным линкером, конъюгированным с антителами, независящими от состояния активации, и комплементарным олигонуклеотидным линкером, конъюгированным с содействующей частицей. Олигонуклеотидные линкеры можно соединить с содействующей частицей или с антителами, независящими от состояния активации, с помощью методов, хорошо известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидный линкер, конъюгированный с содействующей частицей, имеет 100% комплементарность с олигонуклеотидным линкером, конъюгированным с антителом, независящим от состояния активации. В других вариантах осуществления олигонуклеотидная линкерная пара содержит, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять, шесть или более "участков ошибочного спаривания", например, после гибридизации в жестких условиях. Специалисту в данной области техники ясно, что антитела, независящие от состояния активации, специфические к различным аналитам, могут быть конъюгированными или с одним и тем же олигонуклеотидным линкером, или разными олигонуклеотидными линкерами.

Длина олигонуклеотидных линкеров, конъюгированных с содействующей частицей или антителами, независящими от состояния активации, может варьировать. В общем, линкерная последовательность может составлять, по меньшей мере, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или 100 нуклеотидов в длину. Как правило, для соединения делают произвольные нуклеиновокислотные последовательности. В качестве неограничивающего примера, может быть создана библиотека олигонуклеотидных линкеров с тремя различными смежными доменами: спейсерным доменом, характерным доменом и доменом конъюгации. Предпочтительно, олигонуклеотидные линкеры создаются так, чтобы получить эффективное соединение без нарушения функции содействующей частицы или антител, независящих от состояния активации, с которыми они соединяются.

Последовательности олигонуклеотидных линкеров могут быть разработаны так, чтобы предотвратить или свести к минимуму любое образование вторичных структур при различных условиях анализа. Как правило, температуры плавления тщательно контролируются для каждого сегмента в линкере, чтобы они участвовали во всех процессах анализа. В целом, диапазон температур плавления сегмента линкерной последовательности составляет примерно 1-10°С. При исследовании каждого из трех различных доменов в каждом линкере можно использовать вычислительный алгоритм (например, OLIGO 6.0) для определения температуры плавления, вторичной структуры и шпилечной структуры при определенных концентрациях ионов. Полные объединенные последовательности также могут быть исследованы в отношении их структурной характеристики и их соизмеримости с другими конъюгированными последовательностями олигонуклеотидных линкеров, например, будут ли они гибридизоваться в жестких условиях гибридизации с комплементарным олигонуклеотидным линкером.

Спейсерный участок олигонуклеотидного линкера обеспечивает достаточное отделение домена конъюгации от места сшивания олигонуклеотида. Домен конъюгации служит для соединения молекул, помеченных комплементарной последовательностью олигонуклеотидного линкера, с доменом конъюгации посредством нуклеиновокислотной гибридизации. Гибридизация, опосредованная нуклеиновыми кислотами, может осуществляться или до или после образования комплекса антитело-аналит (т.е. антигена), что обеспечивает более гибкий формат анализа. В отличие от многих прямых методов конъюгирования антител, соединение относительно небольших олигонуклеотидов с антителами или другими молекулами оказывает минимальное влияние на специфическое сродство антител к аналиту-мишени или на функцию конъюгированных молекул.

В некоторых вариантах осуществления последовательность характерного домена олигонуклеотидного линкера может использоваться в сложных мультиплексных белковых анализах. С олигонуклеотидными линкерами с различными характерными последовательностями могут быть конъюгированы разнообразные антитела. В мультиплексном иммуноанализе для обнаружения перекрестной реактивности между антителами и их антигенами могут использоваться репортерные олигонуклеотидные последовательности, меченые подходящими зондами.

Олигонуклеотидные линкеры можно конъюгировать с антителами или другими молекулами при помощи нескольких разных методов. Например, олигонуклеотидные линкеры могут быть синтезированы с тиольными группами или на 5' или на 3' конце. Защита тиольной группы может быть снята с помощью восстановителей (например, ТСЕР-НС1), а полученные линкеры можно очистить при помощи обессоленной спин-колонки. Полученные в результате незащищенные олигонуклеотидные линкеры можно конъюгировать с первичными аминами антител или другими типами белков с использованием гетеробифункциональных кросс-линкеров, таких как SMCC. Альтернативно, 5'-фосфатные группы на олигонуклеотидах можно обработать водорастворимым карбодиимидом EDC для образования фосфатных эфиров и дальнейшего соединения с амин-содержащими молекулами. В некоторых случаях диол на 3'-остатке рибозы можно окислить до альдегидных групп и затем конъюгировать с аминными группами антител или другими типами белков с помощью восстановительного аминирования. В некоторых других случаях олигонуклеотидный линкер может быть синтезирован одновременно с модификацией биотина или на 3' или на 5' конце и конъюгирован с молекулами, мечеными стрептавидином.

Олигонуклеотидные линкеры можно синтезировать с помощью целого ряда методов, известных в данной области техники, например, описанных в Usman et al., J. Am. Chem. Soc, 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); и Wincott et al, Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). В общем, при синтезе олигонуклеотидов применяется общая защита нуклеиновых кислот и соединительные группы, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидиты на 3'-конце. Подходящие реагенты для синтеза олигонуклеотидов, методы снятия защитных групп с нуклеиновых кислот и способы очистки нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области техники.

В некоторых случаях антитела, зависящие от состояния активации, для обнаружения уровней активации одного или более аналитов или, альтернативно, вторые антитела, независящие от состояния активации, для обнаружения уровней экспрессии одного или более аналитов непосредственно метят первым членом пары, усиливающей сигнал. Член пары, усиливающей сигнал, может быть соединен с антителами, зависящими от состояния активации, предназначенными для обнаружения уровней активации или вторыми антителами, независящими от состояния активации, для обнаружения уровней экспрессии с помощью методов, хорошо известных в данной области техники. В некоторых других случаях антитела, зависящие от состояния активации, или вторые антитела, независящие от состояния активации, непосредственно метят первым членом пары, усиливающей сигнал, посредством связывания первого члена пары связывания, конъюгированного с антителами, зависящими от состояния активации, или вторыми антителами, независящими от состояния активации, со вторым членом пары связывания, конъюгированным с первым членом пары, усиливающей сигнал. Члены пары связывания (например, биотин/стрептавидин) могут быть соединены с членом пары, усиливающей сигнал, или с антителами, зависящими от состояния активации, или вторыми антителами, независящими от состояния активации, с помощью методов, хорошо известных в данной области техники. Примеры членов пары, усиливающей сигнал, включают, но не ограничиваются этим, пероксидазы, такие как пероксидаза хрена (HRP), каталаза, хлорпероксидаза, цитохром С-пероксидаза, эозинофильная пероксидаза, глутатионпероксидаза, лактопероксидаза, миелопероксидаза, тиреоидная пероксидаза, деодиназа и т.п. Другие примеры членов пары, усиливающей сигнал, включают гаптены, защищенные защитными группами, и ферменты, инактивированные тиоэфирной связью с ингибитором фермента.

В одном примере канализирования при сближении содействующая частица представляет собой глюкозооксидазу (GO), а первый член пары, усиливающей сигнал, представляет собой пероксидазу хрена (HRP). Когда GO контактирует с субстратом, например, глюкозой, образуется окисляющий агент (т.е. пероксид водорода (Н₂О₂)). Если HRP находится на канализирующем расстоянии от GO, порожденный глюкозооксидазой Н₂О₂ направляется к HRP и образует с ним комплекс HRP-H₂O₂, который в присутствии второго члена пары, усиливающей сигнал, например, хемилюминесцентного субстрата, такого как люминол или изолюминол или флуорогенного субстрата, такого как тирамид (например, биотин-тирамид), гомованилиновой кислоты или 4-гидроксифенил уксусной кислоты порождает усиленный сигнал. Методы применения GO и HRP в анализе «сближения» описаны, например, в работе Langry et al., U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID-136797 (1999). Когда в качестве второго члена пары, усиливающей сигнал, используется биотин-тирамид, комплекс HRP-H₂O₂ окисляет тирамид, в результате этого образуется реакционноспособный тирамидный радикал, который ковалентно связывает близлежащие нуклеофильные остатки. Активированный тирамид обнаруживается непосредственно или обнаруживается после добавления реагента, обнаруживающего сигнал, такого как, например, флуорохром, меченый стрептавидином, или комбинация пероксидазы, меченой стрептавидином, и хромогенного реагента. Примеры флуорохромов, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, краситель Alexa Fluor^® (например, Alexa Fluor^® 555), флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), Oregon Green™; родамин, техасский красный, тетрародамин изотиоцианат (TRTTC), CyDye™ fluor (например, Су2, Су3, Су5) и т.п. Стептавидиновая метка может быть прямо или непрямо соединена с флуорохромом или пероксидазой с помощью методов, хорошо известных в данной области. Неограничивающие примеры хромогенных реагентов, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ), 3,3'-диаминобензидин (DAB), 2,2'-азидо-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту) (ABTS), 4-хлор-1-нафтол (4CN) и/или порфириноген.

В другом примере канализирования при сближении содействующая частица представляет собой фотосенсибилизатор, а первый член пары, усиливающей сигнал, представляет собой большую молекулу, меченую несколькими гаптенами, которые защищены защитными группами, предотвращающими связывание гаптенов с партнерами специфического связывания (например, лигандом, антителом и т.д.). Например, член пары, усиливающей сигнал, может быть молекулой декстрана, меченого защищенным биотином, кумарином и/или молекулой флуоресцеина. Подходящие защитные группы включают, но не ограничиваются этим, феноксизащитные группы, анилиновые, олефиновые, тиоэфирные и селеноэфирные защитные группы. Дополнительные фотосенсибилизаторы и защищенные гаптеном молекулы, пригодные для применения при анализе «сближения» настоящего изобретения, описаны в патенте США №5,807,675. Когда фотосенсибилизатор возбуждается светом, он порождает окисляющий агент (т.е. синглетный кислород). Если молекулы гаптена находятся на канализирующем расстоянии от фотосенсибилизатора, порождаемый фотосенсибилизатором синглетный кислород направляется к и вступает в реакцию с тиоэфирами на защитных группах гаптенов с образованием карбонильных групп (кетонов или альдегидов) и сульфиновой кислоты, высвобождая защитные группы из гаптенов. После этого незащищенные гаптены становятся доступными для специфического связывания со вторым членом пары, усиливающей сигнал (например, партнером специфического связывания, который может порождать обнаружимый сигнал). Например, в том случае, когда гаптен является биотином, партнером специфического связывания может быть меченый стрептавидином фермент. Примеры ферментов включают щелочную фосфатазу, Р-галактозидазу, HRP и т.д. После промывки с целью удаления несвязанных реагентов обнаружимый сигнал может быть вызван добавлением обнаружимого (например, флуоресцентного, хемилюминесцентного, хромогенного и т.д.) субстрата фермента и установлен с помощью подходящих методов и приборов, известных в данной области техники. Альтернативно, обнаружимый сигнал может быть усилен с помощью тирамидного усиления сигнала, а активированный тирамид может быть определен непосредственно или после добавления реагента, обнаруживающего сигнал, описанного выше.

В еще одном примере канализирования при сближении содействующая частица представляет собой фотосенсибилизатор, а первый член пары, усиливающей сигнал, представляет собой комплекс фермент-ингибитор. Фермент и ингибитор (например, декстран, меченый фосфокислотой) соединяются вместе посредством расщепляемого линкера (например, тиоэфира). Когда фотосенсибилизатор возбуждается светом, он порождает окисляющий агент (т.е. синглетный кислород). Если комплекс фермент-ингибитор находится на канализирующем расстоянии от фотосенсибилизатора, порождаемый фотосенсибилизатором синглетный кислород направляется к и вступает в реакцию с расщепляемым линкером, освобождая фермент от ингибитора и таким образом активируя фермент.Чтобы вызвать обнаружимый сигнал, добавляют субстрат для фермента или, альтернативно, добавляют усиливающий реагент, чтобы вызвать усиленный сигнал.

В дополнительном примере канализирования при сближении содействующая частица представляет собой HRP, первый член пары, усиливающей сигнал, представляет собой защищенный гаптен или комплекс фермент-ингибитор, как описано выше, а защитные группы содержат р-алкокси-фенол. Добавление фенилендиамина и Н₂О₂ дает реакционноспособный фенилендиимин, который направляется к защищенному гаптену или комплексу фермент-ингибитор и вступает в реакцию с р-алкокси-фенольными защитными группами с образованием экспонированных гаптенов или химически активного фермента. Генерируется усиленный сигнал, который обнаруживают, как описано выше (см., например, патенты США №5,532,138 и 5,445,944).

Характерный протокол проведения описанного здесь анализа «сближения» предоставляется в Примере 4 РСТ публикации №WO2009/108637, раскрытие которой включено в описание путем отсылки полностью во всех отношениях.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения описанного выше анализа «сближения», содержащие: (а) серию разведений одного или множества захватывающих антител, закрепленных на твердой подложке; и (b) одно или множество детекторных антител (например, комбинацию антител, независящих от состояния активации, и антител, зависящих от состояния активации, для обнаружения уровней активации и/или комбинацию первого и второго антител, независящих от состояния активации, для определения уровней экспрессии). В некоторых случаях наборы могут дополнительно включать инструкции, касающиеся использования набора для определения статуса экспрессии и/или активации одной или множества молекул сигнальной трансдукции в клетках, например опухолевых клетках. Наборы также могут содержать любые дополнительные реагенты, описанные выше, имеющие отношение к выполнению специальных методов настоящего изобретения, такие как, например, первый и второй члены пары, усиливающей сигнал, реагенты, усиливающие сигнал тирамида, буферы для промывки и т.д.

VII. Получение антител

Получение и подбор антител, еще не доступных коммерчески, для исследования уровней экспрессии и активации молекул сигнальной трансдукции в опухолевых клетках в соответствии с иммуноанализами настоящего изобретения может осуществляться несколькими путями. Например, один путь заключается в том, чтобы экспрессировать и/или очистить представляющий интерес полипептид (т.е. антиген), используя экспрессию белка и методы очистки, известные в данной области техники, другой путь заключается в том, чтобы синтезировать представляющий интерес полипептид с помощью методов твердофазного пептидного синтеза, известных в данной области. Смотри, например, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol, Vol.182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol, Vol.289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull, 38:1192-99 (1990); Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1:255-60, (1995); и Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull, 44:1326-31 (1996). Затем очищенный или синтезированный полипептид можно ввести, например, мышам или кроликам с целью получения моноклональных или поликлональных антител. Специалисту в данной области техники известно, что для получения антител существует много способов, например, такие, которые описаны в Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Специалисту в данной области техники также ясно, что фрагменты связывания или Fab-фрагменты, имитирующие антитела (например, сохраняющие функциональные участки связывания антител), также можно получить с помощью различных методик, использующих генетическую информацию. Смотри, например, Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); и Huse et al., J. Immunol, 149:3914-3920 (1992).

Квалифицированным специалистам в данной области техники понятно, что может использоваться много подходов при получении антител или фрагментов связывания, а также при скрининге и выборе в отношении аффинности и специфичности к различным представляющим интерес полипептидам, однако эти подходы не изменяют рамки настоящего изобретения.

Более подробное описание поликлональных антител, моноклональных антител, гуманизированных антител, человеческих антител, бисферических антител, их фрагментов и методов очистки антител можно найти в РСТ публикации №WO 2010/132723, раскрытие которой включено в описание путем отсылки полностью и во всех смыслах.

VIII. Способы введения

Согласно способам настоящего изобретения, описанные здесь противоопухолевые средства вводятся субъекту любым удобным способом, известным в данной области техники. Способы настоящего изобретения могут быть использованы для выбора приемлемого противоопухолевого средства или комбинации противоопухолевых средств для лечения опухолей, например, опухоли молочной железы, такой как трижды негативный метастатический рак молочной железы, у субъекта. Способы настоящего изобретения также могут быть использованы для предсказания ответа опухоли, например, такой опухоли молочной железы, как трижды негативный метастатический рак молочной железы, на лечение противоопухолевым средством или комбинацией противоопухолевых средств. Дополнительно, способы настоящего изобретения могут быть использованы для определения чувствительности опухолевой клетки, такой как трижды негативная опухолевая клетка, например, происходящая из трижды негативного метастатического. рака молочной железы, к лечению противоопухолевым средством или комбинацией противоопухолевых средств. Специалисту в данной области техники ясно, что противоопухолевые средства в этом описании могут вводиться отдельно или в составе комбинированной терапии в сочетании с традиционной химиотерапией, радиотерапией, гормональной терапией, иммунотерапией и/или хирургической операцией.

В определенных вариантах осуществления противоопухолевое средство является противосигнальным средством (т.е. цитостатическим средством), таким как моноклональное антитело или ингибитор тирозинкиназы; антипролиферативным средством; химиотерапевтическим средством (т.е. цитотоксическим средством); гормональным терапевтическим средством; радиотерапевтическим средством; вакциной; и/или любым другим соединением, обладающим способностью уменьшать или отменять неконтролируемый рост аберрантных клеток, таких как раковые клетки. В некоторых вариантах осуществления субъект подвергается лечению одним или более противосигнальными средствами, антипролиферативными средствами и/или гормональными терапевтическими средствами в комбинации, по меньшей мере, с одним химиотерапевтическим средством. Типичные моноклональные антитела, ингибиторы тирозинкиназ, антипролиферативные средства, химиотерапевтические средства, гормональные терапевтические средства, радиотерапевтические средства и вакцины описаны выше.

В предпочтительных вариантах осуществления противоопухолевое средство представляет собой комбинацию бевацизумаба (Авастин^®), карбоплатина и паклитакселя ("триплетная терапия"). В ряде случаев, паклитаксель представляет собой альбумин-связанный (nab) паклитаксель в виде наночастиц (Абраксан^® или nabP). В других вариантах осуществления противоопухолевое средство включает в себя инипариб (BSI 201; 4-йодо-3-нитробензамид), NK012 (высвобождающее SN-38 наноустройство, созданное путем ковалентного присоединения SN-38 к блок-сополимеру PEG-PGlu, а затем самосборки амфифильных блок-сополимеров в водной среде), глембатумумаб ведотин, (также известный как CDX-011 или CR011-vcMMAE; человеческое моноклональное антитело глембатумумаб (CR011), связанное с монометилауристатином Е (ММАЕ), которое нацеливается на раковые клетки, экспрессирующие трансмембранный гликопротеин NMB) или их комбинации. В одном отдельном варианте осуществления противоопухолевое средство представляет собой комбинацию инипариба (ингибитора PARP), гемцитабина (Gemzar^®) и карбоплатина.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь противоопухолевые средства могут вводиться совместно с обычными иммунотерапевтическими средствами, включая, но не ограничиваясь этим, иммуностимуляторы (например, бациллы Кальметта-Гирена (БЦЖ), левамизол, интерлейкин-2, альфа-интерферон и т.д.), иммунотоксические средства (например, конъюгат анти-CD33 моноклонального антитела и калихеамицина, коньюгат анти-CD22 моноклонального антитела и эндотоксина Pseudomonas, и т.д.) и радиоиммунотерапию (например, анти-CD20 моноклональные антитела, конъюгированные с ¹¹¹In, ⁹⁰Y или ¹³¹I и т.д.).

Противоопухолевые средства при необходимости могут вводиться вместе с приемлемым фармацевтическим эксципиентом и любым подходящим способом. Так, введение может быть, например, оральным, пероральным, внутриротовым, подъязычным, на десну, на небо, внутривенным, местным, подкожным, чрескожным, трансдермальным, внутримышечным, внутрисуставным, парентеральным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочковым, интракраниальным, внутрибрюшинным, внутрипузырным, подоболочечным, интраназальным, ректальным, вагинальным или с введением с помощью ингаляции. Термин «совместное введение» означает, что противоопухолевое средство вводится в одно и то же время, непосредственно перед или сразу после введения второго лекарственного средства (например, другого противоопухолевого препарата, средства, применяемого для уменьшения побочных эффектов, связанных с лечением противоопухолевым препаратом, радиотерапевтического средства, гормонального терапевтического средства, иммунотерапевтического средства и т.д.).

Терапевтически эффективное количество противоопухолевого средства может быть введено повторно, например, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более раз, или доза может быть введена путем непрерывного вливания. Лекарственная форма может быть твердой, полужидкой, иметь форму лиофилизированного порошка или жидкую форму, такую как, например, таблетки, пилюли, гранулы, капсулы, порошки, растворы, суспензии, эмульсии, суппозитории, удерживающие клизмы, кремы, мази, лосьоны, гели, аэрозоли, пены или тому подобное, предпочтительно в стандартной лекарственной форме, пригодной для несложного введения точных дозировок.

При использовании в описании термин "стандартная лекарственная форма" относится к физически отдельным единицам, пригодным в качестве единичных дозировок для людей и других млекопитающих, при этом каждая единица содержит установленное количество противоопухолевого средства, рассчитанное для получения желаемого начала воздействия, переносимости и/или терапевтических эффектов в сочетании с приемлемым фармацевтическим эксципиентом (например, ампула). В дополнение к этому, могут быть приготовлены более концентрированные лекарственные формы, из которых затем могут быть получены более разбавленные стандартные лекарственные формы. Таким образом, более концентрированные лекарственные формы будут содержать существенно большее количество противоопухолевого средства, например, по меньшей мере, в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз.

Способы приготовления таких лекарственных форм известны специалистам в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). Как правило, лекарственные формы включают общепринятый фармацевтический носитель или эксципиент и могут дополнительно включать другие лекарственные средства, носители, адъюванты, разбавители, средства, усиливающие проникновение в ткани, солюбилизаторы и т.п. С помощью хорошо известных в данной области способов подходящие эксципиенты могут быть специально приспособлены для определенной лекарственной формы и способа введения (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, выше).

Примеры подходящих эксципиентов включают, но не ограничиваются этим, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмалы, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинаты, трагакантовую камедь, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, физиологический раствор, сироп, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и полиакриловые кислоты, такие как карбополы, например, Карбопол 941, Карбопол 980, Карбопол 981 и т.д. Лекарственные формы могут дополнительно включать смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат магния, и минеральное масло; увлажняющие вещества; эмульгирующие вещества; суспендирующие средства; консервирующие вещества, такие как метил-, этил-, и пропилгидроксибензоаты (т.е. парабены); регулирующие рН средства, такие как неорганические и органические кислоты и основания; подсластители и ароматизирующие вещества. Лекарственные формы могут также включать биодеградируемые полимерные гранулы, декстран, и циклодекстриновые комплексы включения.

Терапевтически эффективная дозировка для перорального введения может иметь форму таблеток, капсул, эмульсий, суспензий, растворов, сиропов, спреев, пастилок, порошков и композиций с замедленным высвобождением. Приемлемые эксципиенты для перорального введения включают фармацевтические категории маннитола, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, желатина, сахарозы, карбоната магния и т.п.

В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная дозировка имеет форму пилюль, таблеток или капсул и, таким образом, лекарственная форма может содержать вместе с противоопухолевым средством любое из следующего: разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальцийфосфат и т.п.; разрыхлитель, такой как крахмал или его производные; смазывающее средство, такое как стеарат магния и т.п.; и связывающее средство, такое как крахмал, гуммиарабик, поливинилпирролидон, желатин, целлюлоза и их производные. Противоопухолевое средство также может быть введено в состав суппозитория, заключенного, например, в носитель из полиэтиленгликоля (PEG).

Жидкие лекарственные формы могут быть приготовлены путем растворения или диспергирования противоопухолевого средства и необязательно одного или более фармацевтически приемлемых адъювантов (вспомогательных средств) в носителе, таком как, например, водный солевой раствор (например, 0,9% вес/об. хлорид натрия), водный раствор декстрозы, глицерол, этанол и т.п., с образованием раствора или суспензии, например, для орального, местного или внутривенного введения. Противоопухолевое средство также может быть введено в состав удерживающей клизмы.

Терапевтически эффективная дозировка для местного введения может иметь форму эмульсий, лосьонов, гелей, пен, кремов, желе, растворов, суспензий, мазей и чрескожных пластырей. Для введения противоопухолевого средства путем ингаляции в виде сухого порошка или жидкой формы может использоваться аэрозольный аппарат.Терапевтически эффективная дозировка для парентерального введения может иметь форму стерильных инъецируемых растворов и стерильно упакованных порошков. Предпочтительно, значение рН инъецируемых растворов составляет примерно от 4,5 до 7,5.

Кроме того, терапевтически эффективная дозировка может предоставляться в лиофилизированной форме. Такие лекарственные формы могут включать буфер, например, бикарбонатный, для восстановления (перевода в жидкую форму) перед введением, или буфер может быть включен в лиофилизированную дозу для восстановления путем добавления воды, например. Лиофилизированная лекарственная форма может дополнительно включать подходящее сосудосуживающее средство, например эпинефрин. Лиофилизированная лекарственная форма может предоставляться в шприце, необязательно упакованном вместе с буфером для перевода в жидкую форму, с тем, чтобы восстановленная лекарственная форма могла быть незамедлительно введена субъекту.

Кроме того, периодически можно проводить мониторинг с целью оценки эффективности определенного терапевтического режима для субъекта. Например, уровни экспрессии и/или активации определенных сигнальных молекул могут меняться в зависимости от терапевтического эффекта лечения одним или более противоопухолевыми средствами, описанными здесь. Можно проводить мониторинг субъекта для того, чтобы оценить ответ и разобраться в эффектах определенных лекарственных средств или способов лечения при персонализированном подходе. Кроме того, субъекты, первоначально отвечавшие на специфическое противоопухолевое средство или комбинацию противоопухолевых средств, могут становиться невосприимчивыми к лекарственному средству или комбинации лекарственных средств, что указывает на развитие у этих субъектов приобретенной лекарственной резистентности. Текущее лечение этих субъектов может быть прервано и назначено альтернативное лечение в соответствии со способами настоящего изобретения.

В некоторых аспектах описанные здесь способы могут использоваться совместно с панелями маркеров генной экспрессии, которые предсказывают вероятность рака молочной железы и/или рецидива в различных популяциях. Эти генные панели могут быть пригодны для выявления индивидуумов, у которых маловероятен случай рецидива, и таким образом, едва ли можно получить пользу от адьювантной химиотерапии. Экспрессионные панели могут использоваться для установления индивидуумов, которые могут безопасно уклониться от адьювантной химиотерапии без отрицательного влияния на результат безрецидивной и общей выживаемости. Приемлемые системы включают, но не ограничиваются, Oncotype DX™, который представляет собой набор из 21 гена от компании Genomic Health, Inc.; MammaPrint,^® который представляет собой набор из 70 генов от компании Agendia; и набор из 76 генов от компании Veridex.

В дополнение к этому, в некоторых других аспектах описанные здесь способы могут быть использованы совместно с наборами маркеров генной экспрессии, которые устанавливают первичные опухоли в отношении раков с неизвестной первичной локализацией (CUP). Эти генные панели можно использовать для выявления пациентов с метастатическим раком, которые могут получить пользу от терапии, совместимой с лечением, назначенным пациентам с первоначальным диагнозом рака молочной железы. Подходящие системы включают, но не ограничиваются, анализ экспрессии с помощью Aviara CancerTYPE ID, основанный на RT-PCR, оценивающий 92 гена для установления первичной локализации 39 типов опухолей; и Pathwork^® Tissue от компании Origin Test, который оценивает экспрессию более чем 1600 генов с помощью микрочипа и сравнивает профиль экспрессии генов в опухоли с профилем в 15 известных типах тканей.

IX. Примеры

Следующие примеры предлагаются для иллюстрации, но не для ограничения заявленного изобретения.

Примеры из РСТ публикации №WO 2010/132723 включаются в описание путем отсылки полностью и во всех смыслах.

Пример 1. Пример анализа «сближения» на чипе

Этот пример иллюстрирует один предпочтительный вариант осуществления анализа «сближения» изобретения, также известный как Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER). При анализе «сближения» в этом варианте осуществления используется микрочип на основе антител, с помощью которого измеряют экспрессию и активацию белков-мишеней в циркулирующих опухолевых клетках (CTCs) и/или образцах ткани (например, FNAs). В качестве неограничивающего примера, метод анализа «сближения» этого варианта осуществления может использоваться для исследования уровня экспрессии белка и/или состояния активации одного или более белков-мишеней, таких как HER1 в CTCs или в опухолевой ткани. В некоторых случаях при анализе «сближения» в этом варианте осуществления используются CTCs, выделенные примерно из 7,5 мл цельной крови с помощью магнитных частиц, покрытых анти-Ер-САМ антителами, при помощи CTC-Profiler (Veridex). После этого выделенные CTCs могут быть простимулированы факторами роста (например, EGF+херегулин) перед иммуноанализом последующего ErbB пути экспрессии и/или активации. В других случаях при анализе «сближения» в этом варианте осуществления используются образцы опухолевой ткани, включая свежезамороженный метастатический материал биопсии, например, образцы трижды негативного рака молочной железы.

В некоторых случаях при анализе «сближения» в этом варианте осуществления используется формат слайдов и множество калибровочных стандартов и контролей. Фигура 1 показывает схему чипов, реализованных в формате слайдов для исследования уровней общего и фосфорилированного HER1 и HER2. На каждом слайде имеется 16 панелей с вместительностью 300 пятен на каждой панели. Для нанесения пятен (образцов) на 16-панельные нитроцеллюлозные слайды использовали контактный микроматричный принтер. Каждое пятно содержит краситель-«свидетель» и или специфическое захватывающее антитело (Ab) или контроли в серийных разведениях, нанесенные в трех экземплярах. Захватывающие Abs наносятся в концентрации 1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл. Очищенный IgG наносили как эталонный образец в обоих видах анализа, и в Общем и в Фосфо. BSA-фосфо наносили в качестве контроля для реагентов. Расчетные реакции калибровки проводили на 8 панелях, а внутренний контроль качества реакции на 2 панелях. Каждый слайд дает возможность обработки до 4 образцов от неизвестных пациентов. Экспрессия общих белков-мишеней или фосфорилированных активированных белков может выражаться в расчетных единицах (CU), полученных из вычислений на основе стандартных кривых разбавленного лизата, полученного из положительных клеточных линий, экспрессирующих интересующий белок. Для каждого образца используется два отдельных слайда; один слайд для обнаружения экспрессии белков-мишеней в клетках, выделенных из цельной крови ("слайд общего анализа") и другой для обнаружения фосфорилирования с целью установления степени активации белков-мишеней ("слайд фосфо-анализа").

В одном варианте осуществления в пробирки с ЭДТА отбирали образцы цельной крови пациентов и контрольные образцы от нормальных индивидуумов. Для того чтобы предотвратить любое загрязнение клетками кожи во время взятия крови, в методиках оговаривалось, что первые отобранные 3 мл крови выбрасывается (или их собирали в CellSave пробирки для подсчета СТС и визуального иммуноокрашивания с помощью набора CellSearch kit). Затем в две дополнительные пробирки с ЭДТА отобрали по 7,5 мл цельной крови в каждую пробирку. Затем выделяли CTCs из каждой пробирки с помощью автоматического устройства для разделения клеток с помощью магнитных частиц (Veridex AutoPrep). Обогащенные образцы объединяли и стимулировали факторами роста. После этого активированные клетки лизировали и сразу обрабатывали или хранили при -80°С для последующего иммуноанализа. В другом варианте осуществления из опухолевой ткани, такой как свежезамороженные метастатические образцы биопсии, извлекают клетки, лизируют их для получения клеточного экстракта и затем сразу обрабатывают или хранят при -80°С для последующего иммуноанализа.

Анализ «сближения» в этом варианте осуществления начинается с инкубирования белков-мишеней в клеточных лизатах с захватывающими антителами на поверхности иммунологических микрочипов. HER1 или другие RTK или белки путей сигнальной трансдукции в клеточных лизатах связываются с соответствующими им захватывающими антителами, а потом после добавления двух дополнительных детекторных антител образуются уникальные иммунокомплексы. Одно из детекторных антител конъюгировано с глюкозооксидазой (GO) и в присутствии глюкозы порождает Н₂О₂. Когда второе HRP-конъюгированное детекторное антитело связывается поблизости в иммуно-комплекс, генерируется положительный сигнал. Последующий процесс усиления сигнала, опосредованный тирамидом, увеличивает чувствительность анализа. Специфичность обнаружения белка увеличивается посредством одновременного связывания трех антител, специфических к различным эпитопам, а чувствительность может быть на уровне отдельной клетки благодаря усилению. Фигура 2 представляет схему характерного метода анализа «сближения» для обнаружения фосфорилированного HER1.

Описанный здесь подход с использованием микрочипов представляет преимущество мультиплексного режима применения. Расширение анализа обеспечивает высокосодержательное исследование с возможностью измерения множества рецепторов и сигнальных молекул в имеющемся в распоряжении ограниченном образце. Возможно наращивание (увеличение масштаба) микрочипа, поэтому он обладает потенциалом для достижения нужной пропускной способности для использования в клинической диагностике.

Пример 2. Экспрессия EGFR и VEGFR2 предсказывает ответ на химиотерапию Nab-паклитакселем (nabP)/Карбоплатином и (С)/Бевацизумабом(В) трижды негативного метастатического рака молочной железы (TNMBC).

Обоснование

Пациенты с трижды негативным метастатическим раком молочной железы (TNMBC), в клетках которого отсутствует экспрессия эстрогена, прогестерона или рецепторов эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), сталкиваются с плохим прогнозом (Dent, R. et al., Clin Cancer Res. 13(15 Pt 1):4429-4434 (2007)). В данном контексте требуется улучшенная терапия и предсказывающие маркеры.

Комбинации В (бевацизумаба; Авастин^®) и С (Карбоплатина) проявляют активность на многих солидных опухолях, включая TNMBC. Nab-паклитаксель (nabP; Абраксан^®) вероятно нацеливается на SPARC, секретируемый опухолями альбумин-связанный белок.

Химиотерапия на основе таксанов и платины демонстрирует значительную активность в качестве первой линии терапии метастатического рака молочной железы и особенно эффективна в виде комбинации (Perez, Е. A., Oncologist 9(5):518-527 (2004); Perez, Е. A. et al., Oncology 69(2): 117-121 (2005); O'Shaughnessy J., Oncologist 10(Suppl 3):20-29 (2005)).

Альбумин-связанный (nab)-паклитаксель в виде наночастиц демонстрирует улучшенную эффективность и переносимость по сравнению со стандартным паклитакселем (Gradishar, W.J. et al., J Clin Oncol. 23(31):7794-7803 (2005)).

Из числа платиновых препаратов подобной эффективностью обладает карбоплатин, при этом он переносится лучше, чем цисплатин, при комбинировании с таксаном, с более низким риском негематологической токсичности, хотя несколько большим риском гематологической токсичности (Gainford, С. et al., Proc Am Soc Clin Oncol. 19:113, Abstract 439 (2000); Perez, E.A. et al., Cancer 88(1): 124-131 (2000); Perez, E.A. et al., Oncology 69(2): 117-121 (2005)). Когда карбоплатин комбинируется с паклитакселем, а не доцетакселем, число случаев нейтропении уменьшается (Perez, Е. А. et al., Cancer 88(1): 124-131 (2000); Perez, E.A. et al., Oncology 69(2):117-121 (2005)).

Бевацизумаб представляет собой моноклональное антитело, нацеленное на фактор роста эндотелиальных сосудов (VEGF), предназначенное для ингибирования ангиогенеза. Добавление бевацизумаба к химиотерапии на основе таксана улучшает степень ответа на терапию и выживаемость без прогрессирования (PFS) у женщин с метастатическим раком молочной железы (Miller, K.D. et al., N EnglJ Med. 357(26):2666-2676 (2007); Miles, D.W. et al., Cancer Res. 69(24S):495s, Abstract 41 (2009); Robert, N.J. et al., J Clin Oncol. 27(15 suppl):42s, Abstract 1005 (2009)).

Цель

В этом исследовании использовали отобранные для клинического исследования образцы биопсии из метастазов (bxs) нелеченого TNMBC для того, чтобы (1) описать экспрессию/активацию сигнальных путей в TNMBC, и (2) установить корреляцию этих примеров экспрессии npnTNMBC с ответом.

Методы

Полученные в начале испытания свежезамороженные образцы биопсии использовали для оценки экспрессии и активации белков сигнальных путей (например, HER1 (EGFR), HER2, HER3, рецептора 1 инсулиноподобного фактора роста (IGF1-R), с-KIT, с-МЕТ, PI3K, АКТ, МАРК и/или VEGFR2). Для определения полного пути экспрессии и активации белка использовали анализ «сближения» CEER. Для определения связи между выживаемостью без прогрессирования (PFS) и экспрессией белка или активацией белковых путей был использован логарифмический ранговый критерий. Образцы опухолевой ткани, использованные в этом исследовании, были получены из продолжающихся клинических испытаний, озаглавленных "Фаза II исследования Абраксана^®, Карбоплатина и Бевацизумаба [триплетная терапия] при трижды негативном (демонстрирующем отсутствие экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона или Her2) метастатическом раке молочной железы" со следующим идентификатором identifier: NCT00479674, раскрытие которого включается в описание путем отсылки полностью во всех отношениях.

Результаты

Общий EGFR был экспрессирован в 11/18 (61%) образцах биопсии, однако был активирован в 3/18 (17%). PI3K и AKT был сверхэкспрессированы у 11/18 (61%) и 8/18 (44%) пациентов, соответственно, и были совместно экспрессированы в 6/18 (33%) образцах биопсии. В 17 метастатических образцах биопсии наблюдалась более высокая общая экспрессия EGFR (33 нед. против 22 недель, р=0,14) и более низкая экспрессия VEGFR2 (33 нед. против 18 недель, р=0,16). Все измерения проводились с помощью CEER.

Заключения

Nab-Паклитаксель/Карбоплатин/Бевацизумаб является хорошо переносимым и эффективным лечением для TNMBC. Сверхэкспрессия общего EGFR и более низкие уровни VEGFR2 имеют прогностическое значение в отношении ответа на триплетную терапию при TNMBC. Проведение метастатической биопсии в реальном времени показывает, что между первичной и метастатической опухолями наблюдаются существенные изменения, и эти изменения являются очень важными при определении прогностических маркеров ответа для TNMBC.

Пример 3. Комплексный анализ профиля путей для предсказания ответа на терапию, включающую Карбоплатин (С)/ Бевацизумаб(В), при трижды негативном метастатическом раке молочной железы (TNMBC).

Обоснование:

Для лечения TNMBC необходимы усовершенствованные способы лечения и прогностические маркеры. Комбинации В (Авастина) и С (Карбоплатина) проявляют активность при многих солидных опухолях, включая TNBC. В этом исследовании использовали архивные первичные образцы биопсии и метастатические биопсийные образцы (bxs) нелеченого TNMBC (1) для определения уровня экспрессии VEGFR2 в первичном и TNMBC, (2) для описания экспрессии/активации различных белков сигнальных путей при TNMBC и (3) нахождения корреляции этих примеров экспрессии при TNMBC с ответом.

Методы: Собрали образцы пункционной биопсии трижды негативного рака молочной железы и соответствующим образом заморозили при -80°С. Для изучения уровней экспрессии и активации сигнальных белков в замороженных образцах тканей от 1000 нг до 5000 нг применялся новый метод иммуноанализа. Платформа CEER (также называемая COPIA) представляет собой мультиплексный иммуно-микрочип, при использовании которого образуется уникальный иммунокомплекс, для чего требуется совместная локализации двух детекторных антител для канализирования при сближении порождающего/усиливающего сигнала, что дает в результате высокую аналитическую чувствительность и специфичность.

Результаты: В этом исследовании были установлены меняющиеся уровни значений СК в каждом образце (приблизительно от 3 до 1000 опухолевых клеток / 1000 нг до 5000 нг клеточного лизата). В этих TNMBCs-образцах уровни экспрессии HER2 находились в пределах от низкого до умеренного (0 до 2+, IHC эквивалент) и были обнаружены в 17 из 18 образцов. В одном из 18 образцов наблюдались высокие уровни экспрессии HER2 (уровень IHC 3+). В 50% образцов не наблюдалось фосфорилирования HER2, тогда как в других 50% наблюдались меняющиеся уровни активированного HER2. Кроме того, в этих образцах анализировали преобладание экспрессии/активации HER1, HER3, IGF1-R, c-KIT, с-МЕТ, PI3K, She, VEGFR2 и АКТ.

Заключение: Проведение метастатической биопсии в реальном времени показывает, что между первичной и метастатической опухолями наблюдаются важные изменения, и эти изменения являются существенными при определении прогностических маркеров ответа. Сверхэкспрессия общего и активированного EGFR и более низкие уровни VEGFR2 имеют прогностическое значение в отношении ответа на триплетную терапию (B+C+Nab-паклитаксель) при TNMBC. Поскольку статус болезни часто изменяется, контролирование (мониторинг) изменений в белках путей трансдукции будет полезным для корректировки лечения.

Пример 4. Функциональный анализ профиля множества белков сигнальных путей у пациентов с раком молочной железы.

Реферат

Одним из механизмов возникновения резистентности de novo или приобретенной резистентности является экспрессия различных форм укороченных HER2/ERBB2 рецепторов ("t-ERBB2") с отсутствующими амино-концевыми внеклеточными доменами. Неограничивающие примеры изоформ t-ERBB2 включают p110, p95HER2 (p95m), р95с и p95n. Методы определения профиля различных форм рецепторов HER2 и других рецепторных тирозинкиназ (RTKs), обладающих потенциалом трансактивации, в первичных и метастатических опухолях могут обеспечить важное понимание смещения патогенеза болезни. Этот пример описывает успешный анализ профиля белков путей сигнальной трансдукции в отношении их экспрессии и активации в 230 случаях рака молочной железы с разным статусом ER/PR/HER2. В частности, уровни общего и фосфорилированных видов t-ERBB2 в образцах рака молочной железы человека были исследованы с помощью нового описанного здесь метода анализа «сближения» с использованием иммуно-микрочипов. Этот пример показывает, что изоформы t-ERBB2 были обнаружены в строго ERBB2-позитивных опухолях (16 из 31 образцов, 52%), а фосфорилированными были в 10 из 38 образцов (32%).

Введение

Было сообщено о нескольких механизмах возникновения резистентности к трастузумабу. В первую очередь в числе других механизмов сообщалось об активации других RTKs (таких как IGF1-R) и накоплении укороченных форм HER2. В частности, укороченные с амино-конца карбоксильные концевые фрагменты HER2, называемые p95HER2, часто обнаруживают в HER2-экспрессирующих линиях клеток рака молочной железы и в опухолях. Взаимное влияние между различными путями сигнальной трансдукции и петлями обратной связи обеспечивает механизм ускользания опухолей под влиянием определенного терапевтического воздействия или привыкание и требует комплексных средств диагностики для проведения "анализа сети путей." Лечение, назначенное на основе клинической информации, полученной с помощью современной технологии на основе IHC/FISH-анализа, выполненного в отношении нескольких выбранных биомаркеров, не будет эффективным при лечении пациентов с быстро развивающейся гетерогенной болезнью. Этот пример показывает, что различные конфигурации детекторных антител дают возможность дифференцированного обнаружения укороченных мишеней (например, p95HER2) и их полноразмерных вариантов (например, HER2). В частности, этот пример иллюстрирует применение нового высокочувствительного и специфического формата микрочипа антител, Совместного усиленного ферментом иммуноанализа (CEER), для количественного определения уровней общего и фосфорилированных видов t-ERBB2 в человеческих образцах, и в свежезамороженной ткани и в тонкоигольных пунктатах метастатических опухолей. Этот пример дополнительно демонстрирует анализ функционального статуса (экспрессии и активации) HER2, p95HER2, HER1, HER3 и IGF1R, а также расположенных ниже по пути сигнальной трансдукции белков PI3K, She и с-МЕТ.

Методы

Изготовление мультиплексного микрочипа: Захватывающие антитела (Abs) наносили на стеклянные слайды, покрытые нитроцеллюлозой (ONCYTE^®, Grace Bio-Labs) с помощью бесконтактных принтеров (Nanoplotter, GeSiM). Диаметр пятна составлял приблизительно 175 мкм, изготовленные слайды держали в дессикаторной камере при 4°С. Каждое пятно содержит краситель-«свидетель» и специфические захватывающие Abs. Приблизительно 500 pL захватывающих антител наносили в трех повторах и при концентрациях серийных разведений 1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл. В качестве отрицательного контроля наносили очищенные мышиные-IgGs. Каждый слайд содержит контроли клеточных линий для получения стандартной кривой для точного количественного определения образцов на каждом слайде. На каждом слайде присутствовали образцы внутренних контролей качества для обеспечения качества данных, полученных от каждого слайд-чипа.

Конъюгация и очистка антител: Мишень-специфические Abs и соответствующие детекторные ферменты были активированы бифункциональным перекрестносшивающим агентом, сукцинимидил-4-(N-мелеимидометил) циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC) и соединены с декстраном для получения конъюгатов антитело-декстран-фермент. Конъюгат очищали с помощью ВЭЖХ с использованием эксклюзионной колонки. Активность Ab в очищенных конъюгатах определяли с помощью конкурентного ELISA, а активность ферментов определяли с помощью функционального анализа, специфического для каждого детекторного фермента.

Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER): Как показано на Фигуре 3, белки-мишени, присутствующие в лизитах тканей, связываются со специфическими захватывающими антителами, нанесенными на нитроцеллюлозную поверхность, а несвязанные белки, не являющиеся мишенями, удаляются со слайда. Ферментное взаимодействие между одним детекторным антителом к альтернативному эпитопу на иммобилизованном белке-мишени, конъюгированном с глюкозооксидазой (GO), и другим детекторным антителом, специфическим к фосфорилированному сайту на белке-мишени или еще одному неперекрывающемуся эпитопу, конъюгированному с HRP, приводит к порождению сигнала и последующему опосредованному тирамидом усилению сигнала. В частности, слайды иммуно-микрочипа, промытые 2 раза TBST (50 мМ Трис/ 150 мМ NaCl/ 0,1% Твин-20, рН 7.2-7.4), блокировали 80 мкл блокирующим буфером Whatman в течение 1 часа при комнатной температуре (RT), а затем два раза промыли TBST. В суб-чипы были добавлены контроли клеточного лизата, серийно разведенные в 80 мкл буфера для разведения (2% BSA/ 0,1% Тритон Х-100/ TBS; рН 7,2-7,4), и образцы, предназначенные для стандартов на слайде, после этого инкубировали в течение 1 часа при RT. После инкубирования слайды промыли 4 раза, в течение 3 минут каждый раз. Детекторные Abs добавили в 80 мкл рабочего буферного раствора и инкубировали в течение 2 часов при RT. После удаления несвязанных вторичных детекторных Abs промывкой с TBST, добавили 80 мкл биотин-тирамида (400 мг/мл в этаноле, Perkin Elmer Life Science) при 5 мкг/мл в 50 мМ глюкоза/PBS и инкубировали в течение 15 минут в темноте. Процесс усиления сигнала, опосредованного тирамидом, при канализировании GO-HRP завершали промывкой с TBST 4 раза по 3 минуты каждая. Локальное отложение биотин-тирамида определяли добавлением стрептавидина (SA)-Alexa647 (в PBS, Invitrogen) при 0,5 мкг/мл (разведение 1:4000) в 2% BSA/ 0,1% Тритон/TBS в течение 40 минут. После завершения инкубации слайды промыли 4 раза TBST, высушили и держали в темноте до сканирования на сканере для микрочипов.

Обогащение tErbB2 (например, p95HER2): Полноразмерные рецепторы р185-ErbB2 удаляли из клеточных лизатов с помощью магнитно-меченых антител, специфических к внеклеточному домену (ECD) ErbB2. Полученный р185-ErbB2-истощенный лизат клеток содержит t-ERBB2 рецепторные белки, утратившие ECD, затем был проведен анализ с целью количественной оценки уровня экспрессии и активации t-ERBB2.

Клинические образцы: свежезамороженные ткани рака молочной железы были куплены от компании ILSBio. Все пациенты были представителями европеоидной расы с протоковой (дуктальной) карциномой на стадии II или III. Во всех образцах наблюдался статус ErbB2-IIIC. Образцы свежезамороженных тканей лизировали в 100 мкл лизирующего буфера. Лизированные образцы держали на льду в течение 30 минут и затем центрифугировали. Концентрации белков в супернатантах определяли с помощью ВСА-набора для определения белков (Pierce), полученные в результате лизаты хранили при -80°С до последующего анализа. FNA образцы брали у пациентов с прогрессирующим, измеряемым метастатическим раком молочной железы на стадии IIIВ или стадии IV, которые ожидали начала системной терапии. Наличие инвазивного рака молочной железы у пациентов было подтверждено гистологически или цитологически. Образцы FNA отбирали, используя иглы размера G23. Образцы FNA сразу помещали во флаконы для сбора образцов, содержащие лизирующий буфер, и транспортировали в течение ночи для последующего анализа.

IP-Вестерн блоттинг: Лизаты клеток инкубировали с магнитными гранулами, конъюгированными с антителами к ICD ERBB2, в течение ночи на шейкере при 4°С. Лизаты, обогащенные иммуно-магнитным способом, ресуспендировали в буфере для образца, содержащем р-меркаптоэтанол, кипятили в течение 5 минут, охладили до RT и загрузили на NuPage (Invitrogen) 4-12% гель. После завершения отделенные белки перенесли на нитроцеллюлозную мембрану, затем промыли, блокировали 5% обезжиренным молоком (milk blotto) и инкубировали с 1°, затем 2° Abs перед процессом обнаружения с помощью NBT/BCIP.

Анализ данных CEER: Каждый слайд сканировали на фотоумножителе (РМТ) при трех настройках усиления для того, чтобы увеличить эффективный динамический диапазон. Интенсивность сигналов, скорректированная по эталонному, усреднялась для повторных пятен, нанесенных трижды. Значение относительной флуоресценции соответствующего «холостого реагента» вычиталось из каждого образца. Использовали несколько критериев качества для того, чтобы отобрать данные из дополнительного анализа, включая ограничение пространства пятна, коэффициент изменения для повторов пятна, общий фон панели и интенсивность «холостого реагента». Для каждого анализа получали стандартную кривую на основе серийного разведения клеточных лизатов, приготовленных из клеток ВТ474. Данные соответствовали пяти параметрам уравнения, выведенным в зависимости от концентрации захватывающих антител и РМТ. Каждая кривая была получена в виде графика зависимости логарифма интенсивности сигнала, измеренного в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ), от логарифма концентрации и отнесена к стандартной клеточной линии, ВТ474. Индивидуальные прогнозы от каждого разведения усредняли для получения единого, окончательного прогноза.

Результаты

Экспрессия t-ERBB2s в клетках человека и опухолях. Для оценки уровней и активации изоформ ERBB2 в клетках человека и образцах опухолей, использовали CEER, новый, основанный на использовании захватывающих антител и анализе «сближения», иммуно-микрочип (Фигура 3). CEER требует образования иммуно-комплекса между мишень-специфическим захватывающим антителом и двумя дополнительными детекторными антителами. Одни из детекторных антител являются конъюгированными с глюкозооксидазой (GO), а другие с пероксидазой хрена (HRP). Детекторные антитела могут связываться или с двумя разными эпитопами (которые определяют уровень целевой экспрессии) или с фосфорилированным доменом на иммобилизованном белке и одним альтернативным эпитопом (который определяет уровень целевой экспрессии). Когда GO в иммунокомплексе соединяется с субстратом, таким как глюкоза, вырабатывается пероксид водорода (Н₂О₂), который направляется к ко-локализованному HRP, усиливая таким образом аналитическую чувствительность. Так как условие анализа требует успешного образования иммунокомплекса между многочисленными захватывающими/детекторными антителами, такой набор обеспечивает специфичность, необходимую для одновременного анализа множества белков-мишеней. Как показано на Фигуре 4, с помощью этого метода можно определить общий и фосфорилированный ERBB2 в клетках линии ВТ474 с однозначной аналитической чувствительностью. Сравнение дифференцированного анализа профиля ERBB2 (с захватом ERBB2-ECD и ERBB2-ICD) ВТ474-клеток при удалении и без удаления полноразмерного p185-ERBB2 показало, что наблюдалось приблизительно 4,4% t-ERBB2 (или ~52800 tERBB2 рецепторов/клетку) в этой линии клеток с ЕШЗВ2-амплификацией приблизительно при 1,2 X 10⁶ ERBB2 рецепторов/клетку (Фигура 5).

В замороженных образцах рака молочной железы от 74 пациентов были подсчитаны уровни ERBB2 с помощью иммуногистохимического анализа, а затем проанализированы с использованием CEER (Таблица 3). Из 74 образцов 24 были ERBB2-низкими / негативный (счет=0-1 по IHC), 19 имели умеренную ERBB2-3Kcnpeccmo (счет=2), а остальные 31 имели высокую экспрессию ERBB2 (счет=3). Анализ CEER показал, что ни одна из опухолей с низким ERBB2 или негативные опухоли не экспрессировали значительный уровень укороченного ERBB2, как ожидалось. Уровни ERBB2 и t-ERBB2 и фосфорилированного t-ERBB2 в каждом образце (показано в RTK молекул/клетку по отношению к клеткам ВТ474) суммированы в Таблице 2. Однако 10% (2 из 19) умеренно ERBB2-no3HTHBHbix опухолей экспрессировали t-ERBB2, а 52% (16 из 31) сильно ERBB2-позитивных опухолей экспрессировали t-ERBB2. Кроме того, изоформы t-ERBB2 были фосфорилированы в обеих умеренно ERBB2-no3HTHBHbix опухолях (10%, 2 из 19 образцов) и в опухолях с высоким ERBB2 (32%, 10 из 31). Имелись образцы со значительными уровнями фосфорилирования tERBB2 и всего лишь умеренными уровнями t-ERBB2 (20330 и 24913), и это возможно, поскольку t-ERBB2 может быть активирован посредством взаимодействия с другими RTKs. Примеры анализа профиля CEER-ERBB2 и IP-Вестерн анализа ERBB2 предоставлены на Фигуре 6 (подчеркнутые образцы в Таблице 2) и Фигуре 7 (образцы помещены в рамку в Таблице 2), соответственно. Кроме того, были проанализированы FNAs из мест метастазов от 8 пациентов с раком молочной железы. Три образца с Е11 ВВ2-позитивным раком показали меняющуюся степень t-ERBB2 и фосфорилированного 1-ERBB2 (Таблица 3), в то время как образцы от ЕРчВВ2-негативных опухолей не продемонстрировали экспрессию t-ERBB2. При расширенном анализе RTK-профиля экспрессия IGF1R и с-МЕТ была обнаружена в 8С3-005-006, и это может быть причиной более высокого уровня pt-ERBB2, несмотря на более низкий t-ERBB2 среди ЕРВВ2-позитивных образцов FNA.

Таблица 1
Экспрессия и фосфорилирование t-ERBB2 в опухолях молочной железы человека
IHC	ERBB2 счет 0/1	ERBB2 счет 2	ERBB2 счет 3
образец #	24	19	31
COPIA t-ERBB2+	0	2	16
COPIA t-ERBB2-P+	0	2	10
% t-ERBB2+	0%	11%	52%
% t-ERBB2+	0%	11%	32%

Типичные образцы CEER наборов показаны для подчеркнутых образцов на Фигуре 6, а IP-Вестерн блот для помещенных в рамку образцов показан на Фигуре 7. Значения RTK/клетку определяются путем сравнения введенного количества образцов и эквивалентного количества стандартных клеток ВТ474.

Таблица 3
Анализ t-ERBB2 в образцах FNA
ID образца	t-ERBB2 (RTK/клетку)	pt-ERBB2 (pRTK/клетку)
8С3-002-001	57,341	3,062
8С3-005-006	26,989	5,309
8С3-005-007	50,741	5,204

Как видно из Фигуры 8, наблюдалась экспрессия и активация целого ряда белков в 174 ВСА образцах. Образец с самым высоким сигналом для каждого маркера показан самым темным цветом. Была показана высокая корреляция CEER-HER2 со статусом IHC-HER2. Несогласующийся HER2 статус между CEER и ГНС был разрешен с помощью IP-Вестерна и показал корреляцию >98%. Уровень HER3-P показал высокую степень корреляции с активацией HER3-T и PI3K. Профиль сМЕТ также показал сильную корреляцию с активацией PI3K. 27% (12/45 из 2 + по IHC) и 21% (11/53 из 0/1 + по IHC) тканей ВСА с не-сверхэкспрессированными, но значительными уровнями HER2 показали больше чем 5% фосфорилирование экспрессированного рецептора HER2.

Заключение

Статус HER2 и его различных форм, а также других RTKs предоставляет решающую информацию о вероятных механизмах в отношении HER2-позитивных ВСА пациентов, не отвечающих на лечение трастузумабом вследствие первичной или приобретенной резистентности. Описанный здесь метод анализа CEER можно использовать для анализа профиля белков сигнальной трансдукции у ВСА пациентов с целью подбора эффективной таргентной терапии.

Пример 5. Комплексный анализ профиля путей с целью предсказания ответа на терапию трижды негативного метастатического рака молочной железы (TNMBC).

Для лечения TNMBC необходимы усовершенствованные способы лечения и прогностические маркеры. В этом исследовании использовали образцы пункционной биопсии из трижды негативного рака молочной железы пациентов, которых лечили В (Авастин^® [бевацизумаб]), С (Карбоплатин) и nabP (Абраксан^®) ("триплетная терапия"), для того, чтобы (1) определить уровень экспрессии и активации различных белков сигнальных путей при TNMBC (например, VEGFR2, с-КТТ, HER1 и т.д.) и (2) найти корреляцию этих примеров экспрессии и активации при TNMBC с ответом.

Образцы пункционной биопсии трижды негативного рака молочной железы (n=17) получали от пациентов до начала лечения В (Авастин^® [бевацизумаб]), С (Карбоплатин) и nabP (Абраксан^®) и соответствующим образом замораживали при -80°С. Был использован новый метод иммуноанализа для исследования уровней экспрессии и активации сигнальных белков в образцах замороженных тканей от 1000 нг до 5000 нг. Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER), (также известный как иммуноанализ совместного «сближения» (COPIA)), описанный здесь, представляет собой мультиплексный иммуно-микрочип, при использовании которого образуется уникальный иммунокомплекс, для чего требуется совместная локализации двух детекторных антител для канализирования для образования/усиления сигнала, что дает в результате высокую аналитическую чувствительность и специфичность. Фигура 9 предоставляет пример анализа профиля функционального пути с помощью CEER на образце пункционной биопсии трижды негативного рака молочной железы по сравнению с контрольными клетками T47D рака молочной железы и эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC). В частности, была оценена экспрессия и активация следующих белков сигнальных путей при TNMBC с помощью CEER: EGFR (HER1), HER2, HER3, c-Met, IGF-1R, c-KIT, PI3K, SHC, АКТ и VEGFR2.

Кроме того, была определена выживаемость без прогрессирования (PFS). В отношении каждого маркера образцы были разделены на группы "высокий" и "низкий", исходя из предельного значения. Например, предельное значение может быть выбрано на уровне или близко к срединному значению, чтобы уравнять размеры групп (например, 8=низкий, 9=высокий). Для установления корреляции между экспрессией и активацией белка и PFS использовали параметрический тест Стьюдента (t-тест). Была сравнена PFS в группах с "низким" значением (например, ниже умеренного) против "высокого" (например, выше умеренного) значения. Фигура 10 иллюстрирует результаты такого сравнения PFS между низкой и высокой выборками для каждого маркера. В частности, как видно из Таблицы на Фигуре 10, низкая экспрессия c-KIT или VEGFR2 связана со значительно большей продолжительностью PFS по сравнению с более высокими уровнями этого маркера (42,1 недель PFS для низких общих уровней с-KIT против 20,7 недель PFS для высоких общих уровней c-KIT; 39,9 недель PFS для низких общих уровней VEGFR2 против 20,9 недель PFS для высоких общих уровней VEGFR2). Таблица на Фигуре 10 также показывает, что низкая активация IGF-1R, низкая активация c-KIT, низкая экспрессия IGF-1R и низкая активация HER1 были связаны (каждая) с более длинной продолжительностью PFS по сравнению с более высокими уровнями этого маркера. Кроме того, как видно из Таблицы на Фигуре 10, высокая экспрессия HER1 связана с большей продолжительностью PFS по сравнению с более низкими уровнями этого маркера (36,8 недель PFS для высоких общих уровней HER1 против 23,4 недель PFS для низких общих уровней HER1). Таблица на Фигуре 11 иллюстрирует подобный анализ, использующий непараметрический критерий суммы рангов Уилкоксона для установления корреляции экспрессии и активации белка с PFS. Вновь было показано, что низкая экспрессия c-KIT или VEGFR2 связана со значительно большей продолжительностью PFS по сравнению с более высокими уровнями этого маркера.

Фигура 12 показывает, что измерение уровней экспрессии и c-KIT и VEGFR2 увеличивает прогностическое значение определения ответа на триплетную терапию при TNMBC. В частности, было обнаружено, что комбинация низких уровней экспрессии с-KIT и VEGFR2 ("ни одного высокого") связана с существенно большей продолжительностью PFS по сравнению с образцами, в которых один или оба маркера были «высокими» ("Один высокий" или "Оба высокие").

Фигура 13 показывает, что измерение уровней экспрессии и VEGFR2 и HER1 увеличивает прогностическое значение определения ответа на триплетную терапию при TNMBC. В частности, было обнаружено, что комбинация высокого уровня экспрессии HER1 и низкого уровня экспрессии VEGFR2 ("ни одного плохого") связана с существенно большей продолжительностью PFS по сравнению с образцами, в которых экспрессия HER1 была низкой и/или экспрессия VEGFR2 была высокой ("Один плохой" или "Оба плохие").

Фигура 14 иллюстрирует корреляцию между увеличением уровней (А) общего VEGFR2, (В) общего c-KIT и (С) общего HER1 и ответом на триплетную терапию, на что указывает продолжительность PFS. В частности, более низкие общие уровни VEGFR2 или c-KIT были связаны с ответом на триплетную терапию при TNMBC, в то время как более высокие уровни общего HER1 также были связаны с ответом на триплетную терапию при TNMBC.

В заключение, этот пример показывает, что: (1) существует корреляция между активированным (фосфо) и общим уровнями и для c-KIT и IGF-1R; (2) низкие уровни экспрессии VEGFR2 или с-К1Т предсказывают ответ; (3) высокие уровни экспрессии EGFR (например, должны отвечать на варианты лечении, основанные на платине) коррелируют с ответом, тогда как высокие уровни P-EGFR не коррелируют; (4) в общем, если активация пути (например, P-c-KIT, p-IGF-1R, p-EGFR, р-АКТ и другие) является низкой (например, невысоко пролиферативная опухоль), у пациента наблюдается более высокая PFS при проведения триплетной терапии Карбоплатином, Nab-Паклитакселем и Авастином; и (5) в отношении комбинированных методов лечения, добавление общей экспрессии VEGFR2 к общей экспрессии c-KIT или экспрессии EGFR приводит к лучшим прогностическим показателям.

Пример 6. Сбор и обработка опухолевой ткани.

Опухолевую ткань или FNA образцы можно получить от пациентов с раком для исследования путей сигнальной трансдукции с помощью описанного здесь анализа «сближения» (например, CEER). Например, образцы для анализа путей можно получить из замороженных тканей или путем изготовления срезов или с помощью метода замороженных FNA. В определенных случаях изготовление срезов тканей производится из замороженных образцов для последующего анализа профиля. В некоторых других случаях относительно неинвазивная FNA процедура выполняется для получения образцов от пациентов (и ксенотрансплантатов) в клинике.

Замороженные образцы тканей можно собрать с помощью следующих методов:

Вариант #1. Сбор срезов тканей:

1. Поместите пластиковую чашку весов на сухой лед, в нее будет помещен срезанный образец.

a. Для охлаждения материалов держите бритвенное лезвие или лезвие микротома, тонкие пинцеты и предварительно помеченные флаконы для сбора образцов на сухом льду.

2. Выньте замороженную ткань рака человека из -80°С морозилки и перенесите сосуд с образцом на сухой лед.

3. Поместите замороженную ткань на чашку весов на сухом льду, срежьте небольшие кусочки замороженной ткани (срез 10 мкм х 3) с помощью бритвенного лезвия или микротома и перенесите ткань в предварительно охлажденный и предварительно помеченный флакон для сбора образцов, используя предварительно охлажденный пинцет.

4. Закройте крышку и держите на сухом льду.

5. Поместите собранные образцы сначала в двойной пластиковый мешок, а затем в пенополистироловый контейнер (первичный контейнер) с достаточным количеством сухого льда.

b. Используйте, по меньшей мере, 6-8 фунтов сухого льда. В летние месяцы возьмите больше.

Примечание: Точное количество сухого льда будет определено после консультации с транспортной компанией.

c. Проконсультируйтесь с транспортной компанией в отношении необходимых разрешений и документов при международной транспортировке.

d. Не используйте водный лед или хладагенты (т.е. охлаждающие пакеты).

2. Убедитесь, что требование и список образцов помещены в коробку, но находятся снаружи двойного мешка.

3. Надежно запечатайте контейнер и прикрепите этикетку "Замороженная ткань - не согревать".

Вариант #2. Приготовление FNA из замороженных тканей:

1. Выньте замороженную ткань рака человека из -80°С морозилки и перенесите сосуд с образцом на сухой лед.

2. Образцы, приготовленные для FNA процедуры, следует поместить на водяной лед на 10 минут для смягчения ткани.

3. Сбор FNA образца следует осуществлять путем прохождения иглы размером 23 или 25 через смягченную замороженную ткань от 5 до 10 раз. Верните оставшийся образец на сухой лед.

4. Протрите крышку флакона для сбора FNA образца спиртом.

5. Замороженные FNA ткани непосредственно впрыскивают (вводят) в сосуд для сбора, содержащий 100 мкл "protein later solution" (Prometheus Laboratories; San Diego, CA). Распределите собранный тканевой материал, осторожно перемешав содержимое.

6. Держите сосуд с FN А крепко в одной руке и быстро постучите пальцами (~15х), чтобы обеспечить лизис клеток (если возможно, прокрутите на вортексе в течение 10 секунд).

7. Поместите собранные образцы в двойной пластиковый мешок и затем в пенополистироловый контейнер (первичный контейнер) с охлаждающими пакетами.

а. Проконсультируйтесь с транспортной компанией в отношении необходимых разрешений и документов при международной транспортировке.

4. Убедитесь, что требование и список образцов помещены в коробку, но находятся снаружи двойного мешка.

5. Надежно запечатайте контейнер и прикрепите этикетку "Биологический образец".

Пример 7. Анализ данных с целью количественного определения белков путей сигнальной трансдукции в раковых клетках.

Этот пример иллюстрирует количественное определение уровней экспрессии и активации одного или более аналитов, таких как один или более белков сигнальной трансдукции в биологическом образце (например, крови или опухолевой ткани) с помощью стандартной кривой, полученной для определенного интересующего аналита.

В некоторых вариантах осуществления, каждый CEER слайд сканировали на фотоумножителе (РМТ) при трех настройках усиления для того, чтобы увеличить чувствительность и уменьшить влияние насыщения. Для обнаружения пятен и количественного определения сигнала использовали программное обеспечение Perkin Elmer ScanArray Express. Идентификаторы для каждого пятна были взяты из GenePix Array List (.gal) file. Каждый клинический образец на слайде имел специальный деиндентифицирующий номер (не позволяющий установить персональные данные), полученные в результате исследования данные вносились в общий набор данных под этими номерами.

В других вариантах осуществления интенсивность сигналов, скорректированная по эталонному, усреднялась для повторных пятен, нанесенных трижды. Значение относительной флуоресценции соответствующего «холостого реагента» вычиталось из каждого образца. Использовали несколько критериев качества для того, чтобы отобрать данные из дополнительного анализа, включая ограничение пространства пятна, коэффициент изменения для повторов пятна, общий фон панели и интенсивность «холостого реагента».

Для каждого анализа сигмоидальную стандартную кривую можно получить из множества (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи и т.д.) концентраций серийно разведенных клеточных лизатов, приготовленных из таких клеточных линий, как MD-468 (HER1- позитивная), SKBr3 (HER2 - позитивная), ВТ474 (HER2 и p95HER2 - позитивная), НСС827 (с-МЕТ и HER1 - позитивная), T47D, стимулированной IGF, (IGF1R - позитивная) и/или T47D, стимулированной HRG, (HER3 - позитивная). Каждую кривую можно получить в виде графика зависимости интенсивности сигнала от log концентрации производных единиц, CU (расчетная единица). Данные приводились в соответствие с пятью параметрами уравнения (5PL) путем нелинейной регрессии (Ritz, С.and Streibig, J.С., J. Statistical Software, 12, 1-22 (2005)), с одновременной подгонкой (fitting) всех трех разведений захватывающих антител. Подгонку проводили с помощью R, открытого источника статистических программ (Development Core Team, R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-proiect.org. R (2008)). Для того чтобы избежать избытка параметризации математической модели и таким образом повысить точность, можно ограничиться четырьмя параметрами, тогда как каждое разведение может быть вычислено для индивидуальной точки максимальной крутизны. Этот процесс можно повторить для каждой РМТ настройки усиления 45, 50 и 60. При этом получается девять стандартных на анализ, полученных из трех разведений захватывающих антител и трех РМТ-сканов. Внутренняя избыточность в методе анализа давала возможность устранить одну или более комбинаций разведения/скана, если соответствие (fit) стандартной кривой имело R² меньше чем 0,95, и таким образом улучшить последующие предсказания.

Вычисление CU (на основе стандартной кривой) - Отдельные предсказания на основе каждой из стандартных кривых (например, 3 разведений захватывающих антител и 3 настройках РМТ сканирования) можно объединить в единый, окончательный прогноз. Для каждого предсказания вычисляется наклон в точке на стандартной кривой. Этот наклон берется как log единиц на оси х, т.е. единицы в знаменателе наклона представляют собой log расчетных единиц (CU). Во-вторых, средневзвешенная величина предсказаний вычисляется, когда значения определяются из наклона. А именно, значения суммируются, и каждой точке дается значение, равное ее наклону, деленному на общий наклон. Каждый анализ может быть подтвержден по сравнению с предсказаниями для известных контролей.

Все публикации и патентные заявки, приведенные в этом подробном описании, включаются в него путем отсылки, как будто каждая отдельная публикация или патентная заявка были специально и по отдельности указаны, чтобы быть включенными путем отсылки. Несмотря на то, что вышеупомянутое изобретение для ясного понимания довольно подробно описывается посредством иллюстрации и примера, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что в свете идей данного изобретения, могут быть сделаны определенные изменения и модификации без отклонения от объема и сущности прилагаемых пунктов формулы изобретения.

Claims (15)

1. Способ предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством, способ включающий:
(a) лизирование опухолевых клеток, взятых от трижды негативной опухоли молочной железы, для получения клеточного экстракта;
(b) определение уровня экспрессии VEGFR2 в клеточном экстракте; и
(c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2 в клеточном экстракте, полученном на стадии (b), с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2,
согласно которому наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 предсказывает ответ на терапию противоопухолевым средством, где противоопухолевое средство представляет собой комбинацию бевацизумаба (Авастин^®), карбоплатина и паклитакселя.

2. Способ по п.1, согласно которому стадия (b) дополнительно включает определение уровня экспрессии c-KIT, HER1 и/или IGF-1 в клеточном экстракте.

3. Способ по п.2, согласно которому наличие низкого уровня экспрессии c-КIТ, высокого уровня экспрессии HER1 и/или низкого уровня экспрессии IGF-1R в клеточном экстракте по сравнению с эталонным уровнем экспрессии c-KIT, HER1 или IGF-1R указывает, что клетка опухоли является чувствительной к противоопухолевому средству.

4. Способ по п.1, согласно которому паклитаксель является альбумин-связанным паклитакселем в виде наночастиц (nab).
5 Способ по п.1, согласно которому уровень эталонной экспрессии вычисляют, исходя из стандартной кривой, полученной на линии раковых клеток, указанную стандартную кривую необязательно получают, исходя из множества концентраций серийно разведенного клеточного экстракта, приготовленного из линии раковых клеток, указанная линия клеток необязательно экспрессирует VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R.

6. Способ по п.1, согласно которому способ дополнительно включает определение уровня активации VEGFR2, c-KIT, HER1, IGF-1R и/или АКТ в клеточном экстракте.

7. Способ по п.1, согласно которому способ дополнительно включает определение уровня экспрессии и/или активации одной или более дополнительных молекул сигнальной трансдукции в клеточном экстракте.

8. Способ по п.7, согласно которому одну или более дополнительных молекул сигнальной трансдукции выбирают из группы, состоящей из HER2, p95HER2, HER3, HER4, PI3K, AKT, MEK, PTEN, SGK3, 4Е- ВР1, ERK2 (МАРК1), ERK1 (МАРК3), PDK1, P70S6K, GSK-3β, Shc, c-МЕТ, VEGFR1, VEGFR3, димера рецептора и их комбинаций.

9. Способ по п.1, согласно которому опухолевая клетка представляет собой циркулирующую опухолевую клетку или клетку, полученную из тонкоигольного пунктата (FNA) из трижды негативной опухоли молочной железы.

10. Способ по п.1, согласно которому опухолевую клетку выделяют из образца, указанный образец необязательно получают от субъекта с трижды негативным метастатическим раком молочной железы, указанный образец необязательно представляет собой цельную кровь, сыворотку, плазму или образец опухолевой ткани.

11. Способ по п.1, согласно которому наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 предсказывает более продолжительную выживаемость без прогрессирования (PFS).

12. Способ по п.2, согласно которому наличие низкого уровня экспрессии c-KIT и/или наличие высокого уровня экспрессии HER1 предсказывает более продолжительную выживаемость без прогрессирования (PFS).

13. Способ по п.2, согласно которому наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 в сочетании с наличием низкого уровня экспрессии c-KIT и/или высокого уровня экспрессии HER1 предсказывает более продолжительную выживаемость без прогрессирования (PFS) по сравнению с уровнем экспрессии VEGFR2, c-KIT или HER1 по отдельности.

14. Способ по п.1, согласно которому способ включает инкубирование in vitro опухолевой клетки с противоопухолевым средством до стадии (a).

15. Способ по п.1, согласно которому уровень экспрессии VEGFR2 определяют путем обнаружения уровней общего белка VEGFR2 или уровень экспрессии VEGFR2 определяют с помощью двойного обнаружения «сближения», указанный метод двойного обнаружения «сближения» необязательно представляет собой Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER).

16. Способ по любому из пп.2-16, согласно которому уровень экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R определяют путем обнаружения уровней общего белка VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R, и/или уровень экспрессии VEGFR2, c-KIT, HER1 и/или IGF-1R определяют с помощью двойного обнаружения «сближения», где указанный метод двойного обнаружения «сближения» необязательно представляет собой Совместный усиленный ферментом иммуноанализ (CEER).

Images