CN102811726A - 通过由提取自趋磁细菌并经受交变磁场的磁小体的各种链所产生的热的释放诱导的癌症或肿瘤的治疗 - Google Patents

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Abstract

在本发明中，我们描述了一种用于在有需求的受试者中通过产生热来治疗肿瘤或肿瘤细胞或癌症的方法。热是由提取自全趋磁细菌并经受交变磁场的磁小体的链所产生的。这些磁小体的链产生高效的抗肿瘤活性，而从链上释放的磁小体或保留在全细菌中的磁小体产生弱的或没有抗肿瘤活性。向细菌的生长培养基中引入各种化学品比如螯合剂和/或过渡金属改善磁小体的链的加热性质。此外，也表明将磁小体的链插入至脂质囊泡中以便有助于它们在体内旋转以及因此改善它们的加热能力。这些囊泡可以含有抗肿瘤制剂以及磁小体的链。在这种情况下，通过加热囊泡，药物在肿瘤中释放。

Description

通过由提取自趋磁细菌并经受交变磁场的磁小体的各种链所产生的热的释放诱导的癌症或肿瘤的治疗
技术领域
本发明涉及细胞或组织，尤其是肿瘤或肿瘤细胞的体内热治疗，其使用通过磁性元素经受交变磁场原位产生的热。本发明尤其涉及使用过热（hyperthermia）或热消融（thermoablation）的热治疗。本公开中所述的磁性元素类型是通过生物方法合成的氧化铁纳米颗粒的链。
背景技术
本发明描述了一种热疗，其可用于破坏癌症、肿瘤、或肿瘤细胞。热由细菌磁小体的链产生，磁小体提取自趋磁细菌。热疗中所用的磁小体的链可以通过在各种如下条件下培养细菌来获得：
（1）趋磁细菌（如ATCC 700274）培养于标准生长培养基（如ATCC培养基1653，或者和ATCC培养基1653相似的适于生长ATCC 700274株的生长培养基）中。
（2）趋磁细菌培养于生长培养基，其含有标准生长培养基比如（1）中提及的以及优选地含有添加剂，添加剂为过渡金属。过渡金属的实例，可以使用的，是钴、镍、铜、锌、锰和铬。
（3）趋磁细菌培养于生长培养基，其含有标准生长培养基比如（1）中提及的以及优选地含有添加剂，添加剂为螯合剂。通过螯合剂，意味着优选有机化合物，其是能够与源自铁或任何其它过渡金属之一的阳离子形成复合物的单齿（monodentate）或多齿配体（polydentate ligand）。
（4）趋磁细菌培养于生长培养基，其含有标准ATCC生长培养基比如（1）中提及的以及（2）和（3）中提及的两种添加剂。
添加剂在细菌生长培养基中的存在产生改善的磁小体加热效率（在溶液中和体内）。通过在（1）至（4）中所述的四种不同生长培养基之一中合成细菌所获得的提取的磁小体的链还可以包囊于脂质囊泡中（存在或不存在活性成分（principle））并这样用于热疗。
最近，很大努力专注于合成磁性纳米颗粒，当给它们施加振荡磁场时（Duguet等人，Nanomed.,2006,1,157-168）能够诱导热的产生，使用磁场可以易于操作。这些特征产生这样的想法，磁性纳米颗粒可能通过过热或热消融有助于破坏或消除肿瘤，或磁性纳米颗粒可用于在身体的特定区域释放药物。这种研究领域经常特指交变磁场（AMF）过热，由于其要求应用交变磁场来诱导通过纳米颗粒产生热。在之前的工作中，已经使用化学合成的纳米颗粒诱导热，主要是超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPION）的形式，其混合于溶液中或与细胞混合或施用至活的有机体中。还在动物模型上以及临床上在人类上评价了这些加热的纳米颗粒的抗肿瘤活性。之前进行的工作的综述体现在此后列出的参考文献中（Bae等人，J.ControlledRelease,2007,122,16-23；Ciofani等人，Med.Hypotheses,2009,73,80-82；De Nardo,Clin.Cancer Res.,2005,11,7087s-7092s；De Nardo等人，J.Nucl.Med.,2007,48,437-444；Higler等人，Radiology,2001,218,570-575；Ito等人，Cancer.Sci.,2003,94,308-313；Ito等人，J.Biosci.Bioeng.,2003,96,364-369；Ito等人，Cancer Lett,2004,212,167-175；Ito等人，Cancer Immunol.Immun.,2006,55,320-328；Johannsen等人，Int.J.Hyperthermia,2005,21,637-647；Johannsen等人，Int.J.Hyperthermia,2007,52,1653-1662；Jordan等人，Int.J.Hyperthermia,1993,9,51-68；Kawai等人，Prostate,2005,64,373-381；Kawai等人，Prostate,2008,68,784-792；Kikumori等人，Breast Cancer Res.Treat,2009,113,435-441,Maier-Hauff等人，J.Neurooncol.,2007,81,53-60；
Figure BDA00001844721300021
等人，Environ.Health Persp.,2005,113,823-839；Ponce等人，Int.J.Hyperthermia,2006,22,205-213；Tai等人，Nanotechnology,2009,20,135101；Thisen等人，Int.J.Hyperthermia,2008,24,467-474）。
此时，有至少三个公司开发这样的癌症治疗，其使用当暴露于交变磁场时磁性纳米颗粒产生的热。这些公司是Sirtex（澳大利亚公司）、Magforce（德国公司）和Aspen Medisys（美国公司，之前的Aduro Biotech和Triton Biosystem）。由这些公司已经发表的模式描述了使用化学合成磁性纳米颗粒产生的热用于癌症治疗的各种途径（Sirtex：US2006167313或WO 2004/064921；Triton Biosystems现在的Aspen Medisys、LLC：US2003/0028071；Magforce：US2008/0268061）。
尽管在纳米颗粒癌症治疗领域取得了显著的进展，有关化学合成的纳米颗粒在身体中的存在所诱导的毒性的关注提升了（Habib等人，J.Appl.Phys.,2008,103,07A307-1-07A307-3）。为了将临床治疗期间引起的潜在副反应降低到最小，施用的纳米颗粒的量需要尽可能小，而仍然保留它们希望的作用。对此，磁性纳米颗粒要产生足够大的热量，即显著的特定吸收率（SAR）。
因此，需要具有比通常用化学合成纳米颗粒获得的更高的加热能力的磁性纳米颗粒。这将可用于降低加热生物组织或细胞所需的磁性材料的量。这可以通过使用具有大体积或具有高磁晶各向异性的纳米颗粒来实现（Hergt等人，J.Phys.Condens.Matter,2006,18,S2919-S2934）。
还需要开发可以具有这种良好性质以及靶向组织或细胞的能力的磁性纳米颗粒。
某种程度上由于它们体积大，当它们经历振荡磁场时，由趋磁细菌合成的磁小体比化学合成的纳米颗粒产生更大量的热。这已经由混合于溶液中的细菌磁小体所显示（Hergt等人，J.Phys.Condens.Matter,2006,18,S2919-S2934；Hergt等人，J.Magn.Magn.Mater.,2005,293,80-86；Timko等人，J.Mag.Mag.Mat.,2009,321,1521-1524）。在以上的参考文献中，用于进行实验的细菌磁小体类型尚未明确鉴别。
磁小体是由趋磁细菌合成的氧化铁磁铁矿（Fe3O4）或硫化铁胶黄铁矿（greigite）（FeS4）的细胞内、膜结合的、纳米大小的单磁畴（single-magnetic-domain）晶体。由磁铁矿组成的磁小体从细菌提取之后，可以氧化成磁赤铁矿。磁小体在细菌内通常以链的形式排列，但是个体磁小体也可以找到。细菌似乎使用磁小体在地球的地磁场中来导航并帮助它们定位和维持它们的最佳生长和生存条件（Bazylinski等人,Nat.Rev.Microbiol.,2004,2,217-230）。已经显示磁小体和磁小体磁铁矿晶体用于一些科学的、商业的和健康的应用。例如，它们可用于检测单核苷酸多态性，用于提取DNA或用于检测磁性地生物分子相互作用。它们还可用于免疫分析和受体结合分析或细胞分离中（Arakaki等人,J.R.Soc.Interface,2005,5,977-999）。已经表明细菌磁小体可插入至脂质体中用于药物递送的目的（专利号US6251365B1）。然而，在这种模式下很少给出实验证据，以及这种脂质体的加热能力尚未证明或表明。细菌磁小体和阿霉素形成的复合物的抗癌活性已被实验证明（Sun等人，Cancer Lett,2007,258,109-117）。在这种情况下，抗癌活性是由于阿霉素的存在，而不是由于热诱导的治疗。到底，细菌磁小体还没有被验证可用于肿瘤或癌细胞的体外或体内热治疗。
最后，两项最近的研究简要地解决了细菌磁小体在大鼠中的潜在毒性所引起的问题，并没有报告任何毒性的迹象（Sun等人，J.Nanosci.Nanotechnol.,2009,9,1881-1885；Sun等人，Sun等人，Nanotoxicology,2010,4,271-283）。
发明内容
不同类型的细菌磁小体（以或不以链的形式组织的，以及包含在细菌中的或从细菌中提取的）当暴露于交变磁场中可以高效的在溶液中产生热。然而，如在本公开中所证明的，只有以链的形式组织的并且从趋磁细菌中分离的磁小体产生高效的抗肿瘤活性。事实上，还研究了包含在全AMB-1趋磁细菌中的细菌磁小体以及个体磁小体（从细菌中提取的并用十二烷基硫酸钠（SDS）和热处理的）。尽管它们在溶液中的良好加热性质，然而这两种类型的细菌磁小体和本发明磁小体的链相比，似乎没有或更少产生体内抗肿瘤活性。细菌磁小体以链形式的组织对热疗效率的影响是本发明的突出贡献。
本发明涉及组织或细胞（尤其是肿瘤或肿瘤细胞）的体内治疗，其使用分离和提取自全趋磁细菌的磁小体的链原位产生的热。可以治疗的肿瘤类型优选实体肿瘤。这些链可以就这样使用或包囊在囊泡中使用。通过使磁小体的链经受交变磁场（也称为振荡磁场）来产生热。
本发明还涉及磁小体的链通过热疗用于治疗肿瘤，优选实体肿瘤。链可以就这样使用或包囊在囊泡中使用。
本发明还涉及磁小体的链用作药物，尤其是作为抗肿瘤治疗的药物。链可以就这样使用或包囊在囊泡中使用。
本发明还涉及磁小体的链作为体内加热尤其是活组织或活细胞的手段的用途。
本发明还涉及磁小体的链作为通过加热方法能够治疗肿瘤和/或肿瘤细胞的药物的用途。
实施方式和特征的如下描述适用于磁小体的链的治疗方法和用途。
重要的是要指出，本发明涉及向有需求的患者施用磁小体的链。然而，有可能在有机体中施用之后，少量磁小体的链是变化的；这些磁小体的链的变化产生比所施用的链更长或更短的链的形成，并且不太可能以个体磁小体的形式出现。
治疗期间施用的磁小体是磁小体的链的形式。根据定义，这些磁小体的链分离自趋磁细菌。这意味着它们不包含在细菌中。优选地，链提取自用于它们的生产的细菌并分离自细胞碎片。这些磁小体的链含有优选2至30个之间的磁小体，典型地4至20个之间的磁小体。属于这些链的大多数磁小体具有结晶学方向并优选还便于在链延伸的方向上进行轴定向的（axes orientated），其通常是[111]（Alphandéry等人，ACS Nano.,2009,3,1539-1547）。因此，磁小体的链具有磁各向异性，其比个体磁小体的强。因此，避免了磁小体的链的强烈聚集。当含有典型地4至20个之间的磁小体的若干磁小体的链相互作用时，其导致更长的磁小体的链的形成，典型地含有4个以上至20个的磁小体。磁小体的链的长度优选1200纳米以下，更优选600纳米以下，最优选300纳米以下。磁小体的链中的排列产生若干性质，这有利于体内加热。由于它们在链中的排列，磁小体不易于聚集，并且还具有稳定的磁矩。这些性质都有助于磁小体的链的旋转，因此通过这种机制产生热。磁小体在链中的排列还提供了与真核细胞的相互作用，由于它们聚集水平低这是有利的。这种相互作用导致磁小体的链在真核细胞中的内在化（internalization）。例如，如在实施例4中更详细描述的，当磁小体的链与细胞混合而施加交变磁场时，相当大比例的细胞成为磁性的。在一个实施方式中，当施加交变磁场时，磁小体的链穿透到真核细胞中，从而使得通过细胞内过热的机制破坏细胞。这种机制潜在地比细胞外过热更加高效，因为它从内部破坏细胞。另一方面，当在个体磁小体存在下混合细胞而施加交变磁场时获得非常小比例的磁性细胞，这表明个体磁小体仍然在真核细胞外，产生更低效率的细胞破坏机制。
磁小体定义为由磁铁矿、磁赤铁矿或者磁赤铁矿和磁铁矿之间的中间体的组合物制得的磁性氧化铁纳米颗粒。磁小体的特征还在于存在围绕它们的生物膜。在磁小体膜的表面存在氨基基团使得能和各种生物活性大分子偶联，并产生生物相容性（Xiang等人，Lett.Appl.Microbiol.,2007,6,75-81；Sun等人，Cancer Lett.,2007,258,109-117；Sun等人，Biotech.Bioeng.,2008,101,1313-1320）。
在一个实施方式中，属于链的磁小体被生物膜所包围。磁小体可以通过生物丝彼此结合，根据A.Komeili,Ann.Rev.Biochem.2007,76,351-366仅部分得知丝的结构。
在一个实施方式中，磁小体是趋磁细菌生物合成的，趋磁细菌比如趋磁螺菌（Magnetospirillum magneticum）AMB-1株、趋磁球菌（Magnetotactic coccus）MC-1株、三个兼性厌氧弧菌(anaerobic vibrios)MV-1、MV-2和MV-4株、趋磁磁螺（Magnetospirillum magnetotacticum）MS-1株、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense）MSR-1株、兼性厌氧趋磁螺菌属、趋磁螺菌（Magnetospirillum magneticum）MGT-1株以及专性厌氧菌、脱硫弧菌属（Desulfovibrio magneticus）RS-1。
包含在磁小体的链中的个体磁小体的大小或平均大小可能会依赖于尤其是细菌株、细菌生长培养基和/或细菌的生长条件的不同而不同。最频繁地，磁小体是单畴纳米颗粒（即它们仅具有一个磁畴），其具有介于约10nm至约120nm之间、优选10nm至70nm之间、最可能地30nm至50nm之间的大小。磁小体大小分布取决于细菌株和细菌生长条件可以非常显著的不同。在AMB-1种中，磁小体的大部分具有介于30nm至50nm之间的大小。当一种或更多种添加剂（比如本发明描述的那些）存在下进行磁小体生产时，可以获得大小上的增加。治疗期间温度达到时，大的磁小体的大小导致亚铁磁的行为。还产生热稳定的磁矩。因此，磁小体在有机体中的运动可以潜在地通过施加外部磁场得到控制。由于其稳定的磁矩，磁小体比目前用于医学应用的更小的超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPION）应当产生更好的磁响应（magnetic response），其中SPION具有热不稳定的磁矩。作为大的单畴纳米颗粒的磁小体，当其混悬于溶液中并暴露于交变磁场时，还比大多化学合成的纳米颗粒（通常以SPION的形式）具有更好的加热特性。
在一个实施方式中，当趋磁细菌在最佳条件下生长时，磁小体具有窄的大小分布。
在一个实施方式中，使用各种强度的磁场（0.05-1T）、大小选择色谱技术（使用例如Sephacryl S1000型的柱）或离心技术可以进行大小选择的步骤，使能够排除上清液中剩余的最小磁小体。使用具有介于给定范围的大小的磁小体例如还可以有助于将它们引入给定大小的囊泡。
在一个具体实施方式中，本发明的方法使用包囊在囊泡，尤其是脂质囊泡，中的磁小体的链。磁小体的链的包囊产生改善的加热性质，并且通过防止磁小体的链和有机体之间的直接接触还降低了毒性风险。磁小体的链的体内旋转可通过其包囊在脂质囊泡或相似的结构类型中得以改善。
在一个实施方式中，脂质囊泡是小的单层囊泡（SUV，直径<100nm），其含有减量的磁小体的小链。与更大的囊泡相比，SUV具有多种优势。例如，它们较少被巨噬细胞识别（Genc等人，Langmuir,2009,25,12604-12613）。
在另一个实施方式中，脂质囊泡是大的单层囊泡（LUV，直径介于100nm和1μm之间），或巨大的单层囊泡（GUV，直径>1μm）。对于静脉注射更优选LUV。在LUV或GUV的情况下，磁小体吸收能力显著大于SUV的，因此加热效率更高。
在一个实施方式中，脂质囊泡是脂质体，其是多层的。
在一个实施方式中，脂质囊泡由具有中性电荷的单一脂质组成，比如DOPC（1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）、DMPC（二豆蔻磷脂酰胆碱）、DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）、DSPC（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）、DMPE（二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺）或DPPE（二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺）。
在另一个实施方式中，脂质囊泡由中性脂质（比如上面提及的那些）混合上带电荷的脂质组成，带电荷的脂质比如DOPG（1,2-二油酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]）、DPPG（二棕榈酰磷脂酰甘油）。带有各种电荷的脂质混合在一起以便优化囊泡的表面电荷。事实上，后者是用囊泡包囊磁小体的链以及囊泡在细胞中内在化的重要参数（Martina等人，J.Am.Chem.Soc.,,2005,127,10676；Tai等人，Nanotechnology,2009,20,13501）。
该方法旨在提供体内热疗，包括过热和热消融。
在一个实施方式中，本发明的所述方法显示了通过将肿瘤中的温度提高至生理温度（37℃）以上的~10℃以内来部分或全部破坏肿瘤细胞或肿瘤的一种途径，通常称为过热的技术。在一个优选实施方式中，肿瘤中的温度过热期间达到介于约37℃至约45℃之间，优选约40℃至约45℃之间，更优选在约43℃。
在另一个实施方式中，本发明方法显示了通过将肿瘤中的温度提高至生理温度（37℃）以上的大于~10℃来破坏肿瘤细胞或肿瘤的一种途径，通常称为热消融的技术。温度在热消融期间达到介于约45℃至约100℃之间，更优选约45℃至约70℃之间。
在一个优选实施方式中，温度在热消融期间达到介于约45℃至约55℃之间，更优选约50℃至约55℃之间，最优选在约53℃、54℃或55℃。
由于非常局部地（纳米尺度）产生热，治疗期间可以局部地达到相对高的温度。
上述的温度是肿瘤、肿瘤组织和/或它们的环境中达到的温度。肿瘤细胞内（即，在内在化的磁小体的附近）的温度可以更高。
本发明的一个目的是用于部分或全部破坏肿瘤细胞或肿瘤的方法。当向它们施加本发明所述的热处理时，可以杀死肿瘤细胞或失去它们无限复制的能力。由于肿瘤细胞比健康细胞对热更加易感（见例如，Overgaard等人，Cancer,1977,39,2637-2646），本公开中所述的热疗可以选择性地破坏肿瘤细胞。
本发明的方法描述了一种诱导肿瘤细胞和/或肿瘤的部分或全部破坏的热治疗。热治疗通过施加交变磁场产生。这种磁场通过磁小体的链（有或没有包囊在囊泡中）诱导热的产生。
在一个实施方式中，治疗期间施加的交变磁场特征在于频率介于约50kHz至约1000kHz之间，优选在约100kHz至约500kHz之间，更优选在约100kHz至约200kHz之间。
在另一个实施方式中，磁场特征在于强度介于约0.1mT至约200mT之间，优选约1mT至约100mT之间，更优选约10mT至约60mT之间，典型地约10mT至约50mT之间。
通过这样的变得对有机体有毒的值来确定磁场强度的最大值（即本质上它产生傅科电流）。如果显示它们是无毒的话，有可能强度高于200mT的磁场可用于治疗。
在另一个实施方式中，本发明方法的特征在于施加磁场的时间长短。时间长短可能在约1秒至约6小时之间，优选约1分钟至约1小时之间，优选0.5至30分钟之间，最优选1分钟至30分钟之间。
热治疗优选应用于麻醉的患者。因此，进行治疗期间的时间可能等于或短于麻醉的时间长短。例如，如果一个患者麻醉期间在6小时以上，热治疗可以因此潜在地进行持续6小时以上。
在另一个实施方式中，本发明方法特征在于治疗期间所用的磁小体的量。磁小体的这种量与包含在磁小体的链的混悬液中的氧化铁的量有关。通过测量磁小体的链的混悬液中存在的氧化铁的量估计这种量，其中混悬液被注射。其介于约0.001mg至约100mg氧化铁之间，优选约0.01mg至约100mg氧化铁之间，更优选约0.01mg至约10mg氧化铁之间，更优选0.1至10mg氧化铁之间，典型地0.1至1mg氧化铁之间。需要注射的磁小体的量实质上取决于待治疗的肿瘤的体积、治疗期间要求的温度和注射方法。最大的肿瘤体积和最高的肿瘤温度要求施用最大量的磁小体。此外，如果静脉（或从肿瘤位置的外部）施用磁小体，可能比如果直接施用至肿瘤内或靠近肿瘤需要更多的磁小体链。
在另一个实施方式中，根据靶向的肿瘤以及施用的磁小体的链的混悬液的浓度，可以以不同的速度进行磁小体的链的施用。例如，磁小体的链的混悬液直接施用至脑肿瘤中可能比静脉注射或者比注射至位于皮肤表面的肿瘤中要求更慢的注射速度。更浓缩的磁小体的链的混悬液的注射比较低浓度的磁小体的链的混悬液的注射要求更慢的注射速度。注射速度优选介于0.1μl/分钟至1升/分钟之间，更优选介于1μl/分钟至100ml/分钟之间，最优选1μl/分钟至10ml/分钟之间，其中所示的体积是施用的磁小体的链的混悬液的体积。
在另一个实施方式中，磁小体的链的混悬液的浓度典型地介于1μg/ml至100mg/ml之间，优选10μg/ml至50mg/ml之间，其中这种浓度代表包含在混悬液中的氧化铁（优选磁赤铁矿）的量。在另一个实施方式中，磁小体的链和溶剂混合，溶剂稳定磁小体的链。可以调整混悬液的pH和/或可以将阳离子和/或阴离子添加到含有磁小体的链的混悬液中来稳定混悬液。
在另一个实施方式中，重复向患者施用磁小体的链。重复的次数取决于一次所施用的磁小体的量。如果一次仅施用少量的磁小体的链，施用步骤可能重复若干次直至希望的磁小体的量施用至患者。
在另一个实施方式中，重复以施加交变磁场为起始的热治疗。施用给定量的磁小体的链之后采用的连续热治疗称为热循环。用于每个热循环的磁小体给定量可能如上所解释的通过单次施用或通过若干次连续施用进行施用。一个热循环中的不同热治疗通过休息时间彼此分开。休息时间可能等于1秒或1秒以上，优选等于1分钟或1分钟以上，更优选等于10分钟或10分钟以上，优选等于（30分钟）或30分钟以上。
在一个实施方式中，一个热循环中的不同热治疗通过比以上提及的休息时间更长的休息时间彼此分开。休息时间可能介于1天至15天之间。
在一个实施方式中，热循环重复1至648000次，尤其是1至1000次，更尤其是1至100次，典型地1至10次。648000次的最高重复率是通过如下假设估计的：在15天的期间内，在一个很短的时间内（通常约一秒）进行治疗，用很短的休息时间（通常约一秒钟的休息时间）分隔各治疗。治疗的重复次数取决于治疗的时间长短。优选治疗越长，需要的重复越少，假设治疗的其它参数（比如施加的磁场的强度或频率）是不变的。
根据本发明，疗程（cession）包括向患者施用给定量的磁小体的链以及通过施加磁场产生热的程序（以及如此后所述的其它可选程序）。在相同的患者上进行不同的疗程。这些疗程可通过足够长的时间长短彼此分开。这种时间的长短可等于1天或1天以上，优选等于15天或15天以上，更优选地等于1个月或1个月以上。
为了优化热疗的效率，需要调整以下参数，即治疗期间所用的磁小体的链的量、施加的磁场的频率和/或强度、治疗时间的长短、一个“疗程”期间治疗重复的次数以及“疗程”的数目。这些参数可能依赖于所靶向的肿瘤的特定性质，即例如取决于其大小、其对热疗的耐受及其粘度。对于具有大体积和/或高温度耐受和/或高粘度的肿瘤，可考虑增加注射的磁小体的量和/或施加的磁场的强度/频率和/或治疗的重复次数。在这种情况下，也可考虑将细菌磁小体包囊在囊泡中来有助于热的产生。在一个实施方式中，调整热疗的参数来优化待治疗的肿瘤的治疗的效率。
在另一个实施方式中，这些参数的值还取决于需要治疗的肿瘤的量和转移的存在。对于处于晚期癌症状态的患者，即具有转移和/或相当量的肿瘤，所需的磁小体的链的量将比单个肿瘤的更高。不提高磁小体的施用量，还可考虑治疗期间增加治疗时间的长短、增加施加的磁场的强度（以达到更高的温度）或增加重复的治疗次数。
本方法目的在于治疗癌症，更优选地实体肿瘤。可以用这种热疗类型进行治疗的癌症的实例包括前列腺癌（Kawai等人，Prostate,2008,68,784-792）、食道癌、胰腺癌、乳腺癌（Kikumori等人，Breast Cancer Res.Treat.,2009,113,435-441）、脑癌（Thiesen等人，Int.J.Hyperthermia,2008,24,467-474）以及皮肤癌（Ito等人，Cancer Sci.,2003,94,308-313）。
本发明的另一个目的在于用于生产磁小体的链的方法，其中趋磁细菌培养于含有至少一种铁源（比如奎尼酸铁溶液）和添加剂（比如，除铁以外的其它过渡金属和/或如此处限定的螯合剂）的生长培养基中。作为一个实例，生长培养基含有实施例1中所提及的成分。在特异条件下，这些添加剂产生磁小体大小方面和/或在磁小体的链的长度方面的增加。因此当它们暴露于交变磁场时，它们增强磁小体的链的加热能力。
在一个实施方式中，趋磁细菌培养于含有标准趋磁细菌生长培养基（比如针对AMB-1种的实施例1中所述的）和添加剂（其是一种过渡金属，比如例如钴、镍、铜、锌、锰、铬或两种或更多种这些金属的混合物）的生长培养基中。
在一个实施方式中，磁小体和过渡金属如钴的掺加（doping）通过在趋磁细菌生长培养基中加入约0.02μΜ至1mM，优选0.02μΜ至200μΜ，优选1μΜ至100μΜ，优选2至20μΜ过渡金属（如钴）溶液来进行。按照与Staniland等人所用方法的相同的方法，这种溶液可以是例如加入至趋磁细菌标准生长培养基（如AMB-1种（ATCC 70027）的培养基）中的奎尼酸钴溶液（S.Staniland等人，Nature Nanotech.2008,3,158-162）。在钴（如奎尼酸钴）或另一种过渡金属存在时，甚至当钴掺加的百分比在2%以下时，合成的趋磁细菌具有改进的磁性质（S.Staniland等人，Nature Nanotech.2008,3,158-162）。在以上Staniland等人的研究中，对于全趋磁细菌而非提取自趋磁细菌的磁小体的链，观察到当钴存在时磁性质的变化。以链的形式排列的且提取自趋磁细菌的Co掺加的磁小体的磁性质的改善，导致改善的加热能力，是本发明的贡献。对于化学合成的纳米颗粒，为了观察到磁性质的大的变化，大于约10%的Co掺加的百分比通常是必要的（A.Franco等人，J.Mag.Mag.Mat,2008,320,709-713；R.Tackett等人，J.Mag.Mag Mat,2008,320,2755-2759）。这表明，和未掺加的磁小体相比，甚至对于低百分比的钴掺加，Co掺加的磁小体可以具有改善的加热能力。
在另一个实施方式中，在螯合剂存在时培养趋磁细菌。没有得到充分的理论解释，认为螯合剂结合源自用作添加剂的铁或其他过渡金属的阳离子，并因此改善铁和/或其他过渡金属在趋磁细菌中的渗透。这种方法产生具有改善的加热性质的磁小体。
在一个实施方式中，含有约0.02μΜ至1mM，优选0.02μΜ至400μΜ，优选0.02至200μΜ，优选1μΜ至100μΜ，最优选2至20μΜ铁螯合剂的混悬液添加到生长培养基中。
在一个实施方式中，螯合剂是含有一种或更多种羧酸官能团或者柠檬酸官能团的分子，其中羧酸官能团比如ALA（硫锌酸）、钙黄绿素、羧基荧光素（carboxyfluoresceine）、地拉罗司、吡啶二酸、DTPA（二乙烯三胺五乙酸)、EDTA（乙二胺四乙酸）、叶酸或维生素B9、乳酸、罗丹明B、羧甲基葡聚糖（聚合物）、吡啶二酸或草酸、柠檬酸或柠檬酸官能团；其中柠檬酸官能团比如BAPTA（氨基苯氧基乙烷四乙酸）、CDTA（环己烷-1,2-二胺四乙酸）、EDDHMA（乙二胺二(o-羟基-p-甲苯基)乙酸）、CaNa2-EDTA、EDTCA（乙二胺四乙酸加上十六烷基三甲基溴化铵（Cetavlon），一种铵表面活性剂）、EDDA（乙二胺-N,N'-二乙酸）、EDDHA（乙二胺N,N'-双(2-羟基苯乙酸)）、EGTA（乙二醇-双-(β-氨基-乙醚)N,N,N',N'-四-乙酸）、HEDTA（N-(2-羟乙基)-乙二胺三乙酸）、HEEDTA（羟基-2-乙二胺三乙酸）、NTA（次氮基三乙酸酯/盐）或酚酸。
在另一个实施方式中，螯合剂是含有一种或多种醇官能团或者一种或多种氨基醇官能团或者一种或多种氨基羧酸或酮官能团的分子，其中醇官能团比如儿茶酚或其衍生物；其中氨基醇官能团比如多巴胺、去铁酮、去铁胺（deferoxamine）、去铁胺（desferrioxamine）；其中氨基羧酸或酮官能团比如阿霉素、咖啡因、D-青霉胺、吡咯喹啉、HEIDA（羟基乙基亚氨基N,N二烯酸）。
在一个实施方式中，螯合剂是含有膦酸酯/盐或膦酸官能团的分子，其中膦酸酯/盐或膦酸官能团比如AEPN（2-氨基乙基膦酸）、AMP（氨基三(亚甲基膦酸)、ATMP（氨基三(亚甲基膦酸)、CEPA（2-羧乙基膦酸）、DMMP（甲基膦酸二甲酯）、DTPMP（二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)）、EDTMP（乙二胺四(亚甲基膦酸)）、HEDP（1-羟基乙叉-1,1-二膦酸）、HDTMP（己二胺四(亚甲基膦酸)）、HPAA（2-羟基膦酰基羧酸）、PBTC（膦酰基丁烷-三羧酸）、PMIDA（N-(膦酰基甲基)亚氨基二乙酸）、TDTMP（四亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)）、ADP（腺苷二磷酸）或1-{12-[4-(二吡咯亚甲基二氟化硼)丁醇]氨基}十二酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸酯、一种L-α-磷脂酸的钠盐、一种1-棕榈酰-2-(二吡咯亚甲基二氟化硼)十一酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸的钠盐）。
在另一个实施方式中，螯合剂是含有双、三或四膦酸酯/盐、或双、三或四膦酸官能团的分子，其中官能团比如1-羟基亚甲基-双-膦酸、丙烷三膦酸、(次氮基三(亚甲基))三膦酸、(氧次膦基三(亚甲基))三膦酸。1-羟基亚甲基-双-膦酸的实例包括阿仑膦酸（福善美
Figure BDA00001844721300101
）、帕米膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、奈立膦酸、伊班膦酸（邦罗力
Figure BDA00001844721300102
）、米诺膦酸以及文献中所述的其它化合物（L.Wilder等人，J.Med.Chem.,2002,45,3721-3728；M.Neves,N.Med.Biol.,2002,29,329-338；H.Shinoda等人，Calcif.Tissue Int.,1983,35,87-89；M.A.Merrel,Eur.J.Phramacol.,2007,570,27-37）。对于0.4μΜ或4μΜ奈立膦酸、阿仑膦酸和利塞膦酸引入细菌生长培养基中，此处观察到45nm以上的磁小体的百分比变得比不存在双膦酸时合成的磁小体（的百分比）高。这些条件中合成的磁小体的链因此具有改善的加热性质。
在另一个实施方式中，螯合剂是含有磺酸酯/盐或磺酸官能团或BAL（二巯基丙醇）的分子，比如BPDS（红菲绕啉二磺酸酯/盐或4,7-二(4-磺酸酯/盐)-1,10-菲罗啉）、DMPS（二巯基丙烷磺酸盐或2,3-二巯基-1-丙磺酸钠）、磺酰罗丹明101、DMSA（二巯基琥珀酸）。
螯合剂的其他实例是多齿配体，例如血红蛋白、叶绿素、卟啉和含有卟啉（pyrolic）环的有机化合物。
在另一个实施方式中，趋磁细菌培养于含有螯合剂和过渡金属的生长培养基中。
在优选实施方式中，钴用作过渡金属，优选和选自二膦酸（奈立膦酸、阿仑膦酸或利塞膦酸）、罗丹明或EDTA的螯合剂组合使用。
本发明的治疗方法包括以下步骤：
（i）向哺乳动物提供磁小体的链；
（ii）任选，将磁小体的链靶向于待治疗的组织、肿瘤和/或肿瘤细胞中；
（iii）任选，在待治疗的组织、肿瘤或肿瘤细胞中检测磁小体的链；
（iv）通过施加交变磁场进行加热；
（v）任选，从组织、肿瘤、肿瘤细胞和/或体内除去磁小体的链。
在以下实施方式和优选实施方式中，磁小体的链可以包囊于或不包囊于囊泡中。
步骤（iii）及（iv）也可以以任何顺序进行，例如：
-步骤（iii）然后步骤（iv）；或
-步骤（iv）然后步骤（iii）
步骤（ii）、（iii）和（iv）可同时或相继进行。
步骤（ii）和（iv）可以同时进行。
步骤（iii）和（iv）可以同时进行。
哺乳动物意图表示任何还包括人类的哺乳动物。
在一个实施方式中，步骤（i）的磁小体的链可以是体内存在的磁小体的链，例如第一治疗周期后剩余的。
在另一个实施方式中，步骤（i）之前可以是向哺乳动物施用磁小体的链的步骤（i’）。
在一个实施方式中，以这样的方式进行步骤（i’），即远离待治疗的细胞或组织施用磁小体的链。例如，它们静脉注射至血液中或施用至含有肿瘤的另一个器官中。
在一个实施方式中，以这样的方式进行步骤（i’），即接近待治疗的细胞或组织施用磁小体的链。
在另一个实施方式中，以这样的方式进行步骤（i’），即在待治疗的细胞和/或组织中施用磁小体的链。
磁小体的链的混悬液的施用区域和肿瘤位置之间的距离可依赖是否可能将磁小体直接注射至肿瘤中而不同。例如，肿瘤的可位于太接近重要器官的地方。在这种情况下，将磁小体的链直接注射至肿瘤中将不可能。
本发明的方法，还可能包含靶向待治疗的肿瘤细胞或肿瘤的第二步骤。如果磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）的施用不直接在肿瘤中进行，那么这种步骤尤其重要。当所选的注射类型是静脉内时，经常是这种情况。靶向步骤的目的是使磁小体的链定位至肿瘤细胞和/或肿瘤的环境中和/或肿瘤细胞和/或肿瘤中。
在一个实施方式中，通过使用磁场进行靶向步骤，在肿瘤细胞和/或肿瘤的环境中和/或肿瘤细胞和/或肿瘤中，磁场引导磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）。这种靶向类型称为磁靶向。
在另一个实施方式中，可以遵循两种不同的方法在肿瘤环境中和/或肿瘤本身中磁力地引导磁小体的链。一方面，在患者体外施加磁场，并且调整其方向使得磁小体的链沿着正确的路径直到它们到达肿瘤位置。由于在靶向步骤期间其可能需要改变和调整施加的磁场的特征，这种磁靶向的类型称为“活性”靶向。适合的MRI设备，在其中患者或磁场可以在任何方向上定向，可用于靶向步骤。另一方面，磁铁可置于肿瘤位置之中或附近以便将磁小体的链吸引至肿瘤和/或肿瘤环境中。在这种情况下，磁靶向将实质上是被动的（即实质上要等待磁小体的链在肿瘤和/或肿瘤环境中积累）。
在另一个实施方式中，靶向肿瘤的步骤通过将靶向肿瘤的生物和/或化学靶向分子附着至磁小体的链上或附着至含有磁小体的链的囊泡上得以实现。这种靶向分子是这样的，它特异性识别肿瘤细胞。这种靶向类型称为分子靶向。
在一个实施方式中，这种靶向分子是抗体，其特异性识别肿瘤细胞。
在另一个实施方式中，PEG或叶酸用作靶向分子。
在一个实施方式中，磁小体的链的表面包被或含有磁小体的链的囊泡的表面包被通过使用聚（乙二醇）PEG、和/或叶酸、和/或抗体实现。这些分子的存在可不仅使得能够靶向特异性细胞，还有利于细胞内吸收和/或使得能够避免磁小体的链被巨噬细胞识别（Allen等人，Trends in Pharmacological Sciences 1994,15,215-220；Blume等人，Biochim.Biophys.Acta 1990,1029,91-97；Gabizon等人，Biochim.et Biophys.Acta,1992,1103,94-100；Zhang等人，Biomaterials 2002,23,1553-1561）。
靶向肿瘤的步骤可以通过使用以上提及的技术的组合得以实现
-磁靶向；
-分子靶向；或
-磁靶向和分子靶向。
在一个实施方式中，在有机体中检测细菌磁小体的方法（即在肿瘤中或其它地方）使用MRI或另一种技术比如荧光。这种技术用来验证在通过热诱导的治疗开始之前磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）已达到目标位点，和/或验证磁小体的链在靶向肿瘤的路上，和/或验证它们已被正确地清楚，和/或验证它们已经成功地施用。
在一个非常有趣的实施方式中，磁场以及尤其是用于加热的磁场用于内在化或改善磁小体的链在肿瘤细胞中的内在化。
当磁小体的链在肿瘤或肿瘤细胞中时，也可能使用磁场作为“最后的方法”在热诱导的治疗期间调整磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）在肿瘤中的位置以便到达最大热效率和/或抗肿瘤活性。
在另一个实施方式中，通过MRI检测磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）。通过MRI检测全趋磁细菌已经得到证明（R.Benoit等人，Clin.Cancer.Res.2009,15,5170-5177）。这种实施方式关注磁小体的链的检测。
在一个实施方式中，磁小体的链用作对照剂，由于其特异的性质（氧化铁组成和/或良好的结晶度），其可以容易地通过MRI进行检测。
在另一个实施方式中，使用荧光检测技术检测磁小体的链。在这种情况下，荧光分子或荧光标签的存在对磁小体的链进行修饰，其位于一个或多个属于磁小体的链的细菌磁小体的表面和/或表面附近和/或之中。这种荧光分子可以是罗丹明、钙黄绿素、荧光素、溴化乙锭、绿色或黄色荧光蛋白、香豆素、青色素或这些所列分子的衍生物。
在另一个实施方式中，通过在这些荧光分子存在时培养趋磁细菌，使荧光分子位于磁小体内、在它们的表面或它们的表面附近。例如，通过在约0.1μΜ至约1mM荧光分子溶液存在时，培养趋磁细菌获得荧光磁小体。例如通过在约40μΜ至约400μΜ罗丹明溶液存在时培养趋磁细菌可以获得荧光磁小体。
在另一个实施方式中，荧光分子结合至磁小体的链。这可通过将荧光分子化学附着至磁小体的表面得以实现。
在另一个实施方式中，磁小体具有结合至它们表面以及包含在它们之内的荧光分子。这可以通过使用以上提及的技术来生产荧光磁小体而获得。
在另一个实施方式中，含有细菌磁小体的囊泡通过将荧光分子附着至囊泡表面而变成荧光的。
在一个实施方式中，激活磁小体的链的荧光并使用激发/检测方案进行检测，其是这样的，激发/检测方案位于有机体之外。如果肿瘤位于皮肤表面附近，将使用这种类型的激发/检测方案。例如，光学纤维可以刚好置于在皮肤表面附近的肿瘤的上面来激发修饰的磁小体并收集它们发射的光。
在另一个实施方式中，通过将一件装置（比如光学纤维）插入至有机体中进行修饰的磁小体的激发和/或检测，所述装置达到肿瘤和/或肿瘤环境，并且能够激发和/或检测修饰的磁小体的荧光。
在一个实施方式中，步骤（v）是从组织、肿瘤、肿瘤细胞和/或身体中去除磁小体的步骤。使用在有机体外引导磁小体的链的技术。细菌磁小体直接从肿瘤中去除（例如通过外科手段地打个孔，该孔为细菌磁小体离开肿瘤位置并到达有机体外提供了路径）。细菌磁小体还可以从肿瘤位置去除并驱向要从身体中除去的其它器官比如肝。
在另一个实施方式中，在以上实施方式中描述的技术使用在肿瘤和身体外驱使磁小体的磁场。
在另一个实施方式中，通过调整磁小体的链的电荷表面进行磁小体的链从肿瘤位置的去除。
在另一个实施方式中，磁小体的链是负电荷的。
在一个实施方式中，荧光团还是螯合剂，并用作趋磁细菌生长和磁小体生产期间的添加剂。在优选实施方式中，罗丹明用作螯合剂和荧光团。
治疗方法则包含如上所述的热治疗本身。这种方法因此使得能够局部治疗肿瘤和/或肿瘤细胞并将健康细胞的破坏降低到最小。因此，与通常不特异性靶向和破坏肿瘤细胞的化疗或其它癌症治疗技术相比，其提供了一种改善。
在另一个实施方式中，热治疗与化疗组合。
通过在活性成分（其是抗肿瘤或抗癌物质）存在时将磁小体的链包囊在囊泡中，优选脂质囊泡，可进行这两种治疗的组合。在这种情况下，形成囊泡的脂质特征在于相变温度（在这样的温度下，形成囊泡的脂质失去其双层结构）介于20℃和60℃之间。在肿瘤细胞中或肿瘤中或肿瘤细胞的环境中或肿瘤的环境中，通过加热磁小体的链以及因此施加交变磁场中的囊泡，来释放活性成分。
囊泡，尤其是含有本发明磁小体的链以及可能地根据本发明的活性成分的脂质囊泡也是本发明的目的。
还可能结合X射线和/或放射治疗和/或化疗和/或外科手术和/或其它类型的癌症治疗来实施本发明的方法。
在一个实施方式中，进行外科手术来部分或完全去除肿瘤和/或肿瘤的环境。在外科手术之后留下的腔中施用磁小体的链的混悬液，并且通过施加外部磁场开始热疗。在这种情况下，热疗用来破坏肿瘤的一部分（其在外科手术期间不可去除）和/或防止肿瘤在外科手术之后再次生长。
在另一个实施方式中，在外科手术期间在肿瘤和/或肿瘤环境中产生一个腔，来产生比肿瘤组织的环境（即例如较低粘度的环境）更有利于磁小体的链产生热的环境，在这种实施方式中，在这种腔中施用磁小体的链。
本发明还涉及如上所述的磁小体的链和/或含有磁小体的链的囊泡作为加热尤其是体内活组织或活细胞的手段的用途。
本发明还涉及磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）作为药物，尤其是作为用于抗肿瘤治疗（尤其是用于抗肿瘤热治疗）的药物的用途。
在一个实施方式中，磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）用作药物，其使得能够通过加热方法治疗肿瘤和/或肿瘤细胞。
在这些用途中，囊泡可能包含活性成分，其例如是抗肿瘤药物。
在一个实施方式中，含有磁小体的链和任选活性成分的囊泡用作药物，其允许通过加热方法治疗肿瘤细胞或肿瘤，该加热方法诱导活性成分的释放。
在另一个实施方式中，磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）用作由医疗装置（其是交变磁场）所激活的药物。
本发明还涉及磁小体的链和/或含有磁小体的链以及任选活性成分的囊泡作为医疗装置，尤其设计用于治疗肿瘤和/或肿瘤细胞的用途。
在一个实施方式中，磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）用作医疗装置，其使得能够磁治疗肿瘤或肿瘤细胞。
在一个实施方式中，磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）用作医疗装置，其使得能够加热肿瘤或肿瘤细胞或它们的环境。
在一个实施方式中，磁小体的链或含有磁小体的链的囊泡与活性成分组合用作医疗装置，其允许将活性成分在肿瘤、肿瘤细胞或它们的环境中递送。
根据特征，使用用于诱导磁小体的链的磁激发的装置来完成医疗装置。
本发明还涉及含有磁小体的链（包囊或不包囊于囊泡中）和装置的试剂盒，其能够产生具有热诱导的癌症或肿瘤治疗所需的特征的磁场。
在一个实施方式中，属于试剂盒的囊泡与活性成分组合使用，活性成分包囊于囊泡中。
现将使用以下非限制性实施例进一步详细描述本发明。
附图说明
图1：（a）趋磁螺菌（Magnetospirillum magneticum）AMB-1株的一个细胞的透射电子显微镜（TEM）显微照片，其中箭头表示磁小体的链的位置；（b）提取自细菌的磁小体的链的TEM显微照片；（c）从链上脱离的个体磁小体的TEM显微照片；（d）化学合成的纳米颗粒（SPIONCitrate）的TEM显微照片；（e）在磁小体的链（CM）以及个体磁小体（IM）的表面，电荷的测量作为含有这两种类型细菌磁小体的混悬液pH的函数；（f）磁小体的链（CM）以及个体磁小体（IM）的红外光谱。
图2：（a）当混悬液经受频率108kHz和AMF幅23mT的交变磁场（AMF）时，完整的趋磁细菌细胞的混悬液的温度变化作为时间的函数。线分别对应着水中（混悬液）和2%琼脂糖凝胶中（凝胶）的细胞混悬液；（b）对于88mT的AMF幅，与在（a）中的相同；（c）在23mT（方形）或88mT（磁滞）下测量的全细菌的小磁滞回线（Minor hysteresis loops）；（d）包含在水中、或凝胶中的趋磁细菌混悬液的特定吸收率（SAR），作为AMF幅的函数。根据包含在凝胶中的趋磁细菌混悬液的小磁滞回线面积测量的磁滞损耗；（e）在23mT和88mT下测量的完整细胞的SAR的柱条图。框代表由于磁滞损耗对所观察的温度提高的贡献。
图3：提取自趋磁螺菌(Magnetospirillum magneticum）AMB-1株细胞的磁小体的链的性质。（a）在频率108kHz和AMF幅23mT的AMF存在时，磁小体的链的温度的提高作为时间的函数。线分别表示混悬于水中（溶液）或在2%琼脂糖凝胶中（凝胶）的磁小体的链的加热速度；（b）对于88mT的AMF幅，与在（a）中的相同；（c）在23mT（方形）和88mT（线）下的磁小体的链的小磁滞回线；（d）根据混悬于水中（混悬液）或凝胶中（凝胶）的磁小体的链的加热速度在22℃处的斜率测量的SAR，作为AMF幅的函数。根据包含在凝胶中（磁滞）的磁小体的链的混悬液的小磁滞回线面积测量的磁滞损耗。（e）：在23mT和88mT下测量的磁小体的链的SAR的柱条图。框代表对分别由磁滞损耗和磁小体的链的旋转所导致的观察到的温度提高的贡献。
图4：提取自趋磁螺菌(Magnetospirillum magneticum）AMB-1株的细胞并进一步用SDS和热处理的个体磁小体的性质。（a）当施加频率108kHz和幅23mT的AMF时，个体磁小体的温度的提高作为时间的函数。线分别表示混悬于水中（混悬液）或在2%琼脂糖凝胶中（凝胶）的个体磁小体的温度变化；（b）对于88mT的AMF幅，与在（a）中的相同。（c）：在23mT（方形）和88mT（线）下测量的个体磁小体的小磁滞回线，（d）根据包含于水中（混悬液）或凝胶中（凝胶）的个体磁小体的加热速度在22℃处的斜率测量的SAR，作为AMF幅的函数。根据包含在凝胶中（磁滞）的个体磁小体的小磁滞回线面积测量的磁滞损耗；（e）：在23mT和88mT下测量的个体磁小体的SAR的柱条图。框代表对分别由于磁滞损耗和个体磁小体的旋转所观察到的温度提高的贡献。
图5：（a-c）：提取自趋磁细菌的磁小体的链的性质，其是在不存在螯合剂和/或除了铁以外的其它过渡金属时合成的。图表显示这种类型磁小体的磁小体大小的分布（a），以及磁小体链长度的分布（b）。（c）：当这种混悬液暴露于频率183kHz和磁场强度43mT或80mT的交变磁场时，含有406μg/ml磁赤铁矿的这种类型磁小体的混悬液随时间的温度变化。（d-f）提取自趋磁细菌的磁小体的链的性质，其是在存在0.4μM EDTA时合成的。图表显示这种类型磁小体的磁小体大小的分布（d），以及磁小体链长度的分布（e）。（f）：当混悬液暴露于频率183kHz和磁场强度43mT或80mT的交变磁场时，含有浓度为406μg/ml磁赤铁矿的这种类型磁小体的混悬液随时间的温度变化。
图6：（a）含有不同类型磁小体的链（存在不同螯合剂（4μΜEDTA、4μΜ罗丹明B、4μΜ多巴胺、4μΜ阿仑膦酸盐）和406μg磁赤铁矿每毫升时合成的）的各种混悬液经历频率183kHz和磁场强度43mT或80mT的交变磁场时，随时间的温度变化函数。（b）含有未掺加和Co掺加的、以链的形式组织的磁小体的两种混悬液的随时间的温度变化函数。这些混悬液的浓度是1.52mg/mL，并且它们暴露于频率183kHz和磁场强度80mT的交变磁场中。
图7：不存在或存在各种浓度的（0.125mg/mL<CγFe203<1mg/mL，其中CγFe203代表混悬液的磁赤铁矿浓度）提取的磁小体的链时孵育的并暴露于频率183kHz和各种强度（0mT<B<60mT，其中B代表施加的磁场的强度）的交变磁场中的混悬MDA-MB-231细胞的性质。（a）：对于各种浓度磁小体的链的混悬液的孵育，MDA-MB-231活细胞的百分比作为磁场强度的函数。（b）-（d）：当向这些混悬液施加B=20mT（b）、B=43mT（c）或B=60mT（d）交变磁场时，含有MDA-MB-231细胞（细胞是在不存在或存在各种浓度（0.125mg/mL<CγFe203<1mg/mL）磁小体的链时孵育的）的混悬液的温度变化。
图8：（a）-（c）：活的附着的MDA-MB-231细胞的百分比作为磁场强度（0mT<B<60mT）的函数，20分钟期间磁场施加一次。不存在或存在各种浓度的（0.125mg/mL<CγFe203<1mg/mL）提取的磁小体的链时，细胞孵育24小时，D1（a）、48小时，D2（b）或72小时，D3（c）。（d）：活的附着的MDA-MB-231细胞的百分比作为磁场强度（0mT<B<60mT）的函数，20分钟期间磁场施加两次。不存在或存在各种浓度的（0.125mg/mL<CγFe203<1mg/mL）提取的磁小体的链时，细胞孵育72小时。
图9：（a-c）含有磁小体的链（CM）、个体磁小体（IM）、柠檬酸离子覆盖的SPION（SPIONCitrate）、PEG分子覆盖的SPION（SPIONPEG）的四种不同混悬液存在时孵育的MDA-MB-231细胞的抑制百分比，作为这四种混悬液的磁赤铁矿的浓度的函数。（d）当上述四种混悬液（0.125mg/mL<CγFe203<1mg/mL）在MDA-MB-231细胞存在下并施加频率183kHz和强度43mT的交变磁场时进行孵育，变成磁性的细胞的百分比作为孵育时间的函数。
图10：（a）用于治疗小鼠的实验设置。其含有来自Ambrell,Soultz,France的10kWEasyHeat能源供应，配有直径6.7cm的线圈，其中施加各种强度（从20mT至80mT变化）的AMF。将小鼠置于线圈内用于治疗。（b）显示加热的肿瘤和横跨肿瘤的位置的示意图，其在红外测量温度期间进行记录。（c）-（f）：用个体磁小体混悬液治疗的小鼠的研究（小鼠1至4）。（c）当在治疗期间施加磁场时，肿瘤和直肠温度的变化。这些温度在不同的治疗的小鼠之间取平均（小鼠1至3）；（d）治疗开始后10分钟，对于显示出典型行为的小鼠，横跨经治疗的肿瘤所测量的温度分布；（e）对于其中已注射有个体磁小体混悬液的肿瘤（小鼠1至3），标准化的肿瘤体积的变化。肿瘤的体积通过治疗时的肿瘤体积进行标准化；（f）对于其中仅注射有PBS的所谓的对照肿瘤，与在（e）中的相同。在小鼠4中，注射个体磁小体混悬液但是不施加磁场。
图11：用个体磁小体治疗的小鼠的研究（小鼠1至4）。（a）刚刚治疗后（D0）、治疗后14天（D14）或治疗后30天（D30），小鼠1中经治疗的肿瘤的照片。（b）在小鼠2中治疗后30天收集的肿瘤组织的显微照片；（c）对（b）的区域的放大，显示存在细菌磁小体（蓝色或暗反差）；（d）对（c）的区域的放大，显示磁小体聚集。
图12：用含有磁小体的链的混悬液治疗的小鼠的研究（小鼠5至9）。（a）当在治疗期间施加磁场时，肿瘤和直肠温度的变化（小鼠5至8）。这些温度在不同的小鼠之间取平均（小鼠5至8）；（b）治疗开始10后分钟，对于显示出典型行为的小鼠，横跨经治疗的肿瘤所测量的温度分布；（c）对于其中已注射含有磁小体的链的混悬液的肿瘤，标准化的肿瘤体积的演变（evolution）。治疗的肿瘤的体积通过治疗时的肿瘤体积进行标准化；（d）对于其中仅注射有PBS的对照肿瘤，与在（c）中的相同。在小鼠9中，注射含有磁小体的链的混悬液，但是不向小鼠施加磁场。
图13：用磁小体的链的混悬液治疗的小鼠的研究（小鼠5至9）。（a）刚刚治疗后（D0）、治疗后14天（D14）、治疗后30天（D30），小鼠5中经治疗的肿瘤的照片。（b）在小鼠5中治疗后30天收集的肿瘤组织的显微照片显示存在细菌磁小体（蓝色或暗反差）；（c）对（b）的放大。（d）对（c）的放大，显示细胞的核被细菌磁小体所包围。
图14：（a）、（c）、（e）、（g）：当用含有标准磁小体的链（a）、磁小体-EDTA（c）、SPIONCitrate（e）、或SPIONPEG（g）的混悬液施用于肿瘤中并施加20分钟频率183kHz和强度43mT的交变磁场时，肿瘤和直肠温度的变化。治疗重复3次，不同的治疗之间1天休息时间。（b）、（d）、（f）、（h）：对于标准磁小体的链（b）、磁小体-EDTA（d）、SPIONCitrate（f）、或SPIONPEG（h）治疗后期间，标准化的肿瘤体积的变化（即，治疗后2天至30天测量的肿瘤体积除以治疗当天测量的肿瘤体积）。在（b）、（d）、（f）和（h）中，误差棒是通过考虑各小鼠标准化的肿瘤体积估计的标准偏差。
图15：（a）、（c）、（e）、（g）：小鼠的照片，其显示对于使用标准磁小体的链（a）、磁小体-EDTA（c）、SPIONCitrate（e）、或SPIONPEG（g）进行的治疗，热诱导的治疗后30天最好的抗肿瘤活性。（b）、（d）、（f）、（h）：对于显示出最好的抗肿瘤活性以及用标准磁小体的链（b）、磁小体-EDTA（d）、SPIONCitrate（f）和SPIONPEG（h）治疗的小鼠，治疗后期间，标准化的肿瘤体积的变化。
图16：对于肿瘤内施用含有磁小体的链（a）（b）、个体磁小体（c）（d）、SPIONCitrate（e）（f）和SPIONPEG（g）（h）的混悬液，注射时（D0）、注射后3天（D3）、注射后6天（D6）和注射后14天（D14），肿瘤中（（a）、（c）、（e）、（g））和排泄物中（（b）、（d）、（f）、（h））纳米颗粒的百分比。
图17：对于不存在双膦酸（a）、存在4μM利塞膦酸盐（b）、或存在4μM阿仑膦酸盐（c）时合成的趋磁细菌，显示磁小体大小分布的图表。对于不存在双膦酸（d）、存在4μM利塞膦酸盐（e）、或存在4μM阿仑膦酸盐（f）时合成的趋磁细菌，显示磁小体链长度分布的图表。当强度43mT或80mT的交变磁场施加于含有磁小体的链（不存在双膦酸（g）、存在4μM利塞膦酸盐（h）、或存在4μM阿仑膦酸盐（i）时合成的）的混悬液时，温度的变化作为时间的函数。
图18：对于用SPION治疗的小鼠，温度和肿瘤大小的演变（小鼠10至13）。（a）治疗期间肿瘤和直肠温度的演变。温度是在不同的治疗的小鼠之间取平均（小鼠10至12）；（b）治疗开始后10分钟，对于显示出典型行为的小鼠，横跨经治疗的肿瘤所测量的温度分布；（c）对于其中已注射有SPIONCitrate的混悬液的肿瘤（小鼠10至13），标准化的肿瘤体积的演变。经治疗的肿瘤的体积通过治疗时的肿瘤体积进行标准化；（d）对于其中仅注射有PBS的对照肿瘤，与在（c）中的相同。在小鼠14中，注射SPION溶液，但是不向小鼠施加磁场。
具体实施方式
实施例的描述
实施例1：
用作热源的不同类型颗粒的制备：
在本实施例中，我们描述了这样的方法，按照该方法制备用作热源的不同类型的颗粒。这些颗粒是包含在全趋磁细菌中的颗粒，磁小体的链提取自趋磁细菌，个体磁小体提取自趋磁细菌并通过加热和SDS处理从链上脱离，覆盖有柠檬酸离子的化学合成的超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPIONCitrate）或商业上可获得的覆盖有PEG分子的化学合成的纳米颗粒（SPIONPEG）。SPIONPEG购自德国公司Micromod（产品名称：
Figure BDA00001844721300191
-D-spio，产品编号：79-00-201）。
SPIONCitrate用作标准纳米颗粒，因为它们拥有与用于磁热疗的大多纳米颗粒相似的大小（见例如：Johannsen等人，European Urology 2007,52,1653-1662或本专利申请一开始所列出的其它参考文献）和化学包被，其稳定纳米颗粒，但应该不产生任何抗肿瘤活性。
SPIONPEG也用作标准纳米颗粒，因为它们商业上可获得并且与DeNardo小组实施磁热疗所用的那些相同（见例如：De Nardo等人，Clin.Cancer Res.2005,11，7087s-7092s）。比较了磁小体的链与这两种标准（SPIONCitrate和SPIONPEG）在热疗中的效率。
趋磁螺菌(Magnetospirillum magneticum）AMB-1株购自ATCC（ATCC700274）。细胞微厌氧地在室温（~25℃）生长于在稍作改良改进的MSGM培养基（ATCC培养基1653）的液体培养基中。一升中，这种生长培养基含有0.68g磷酸二氢钾、0.85g琥珀酸钠、0.57g酒石酸钠、0.083g醋酸钠、225μl 0.2%刃天青、0.17g硝酸钠、0.04g L-抗坏血酸、2ml 10mM的奎尼酸铁溶液、10ml Woolf维生素和5ml Woolf矿物质。通过将0.19g奎尼酸和0.29g FeCl3·6H2O溶解于100毫升蒸馏水中制备奎尼酸铁溶液。Woolf矿物质的溶液包含在1L 0.5g次氮基三乙酸（NTA，C6H9NO6）、1.5g硫酸镁HEPTA（MgSO4.7H2O）、1g氯化钠、0.5g硫酸锰（MnSO4.H2O）、100mg七水合硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）、100mg硝酸钴（CO(NO3)2.7H2O）、100mg氯化钙（CaCl2）、100mg七水硫酸锌（ZnSO4.7H2O）、10mg硫酸铜水合物（CuSO4.5H2O）、10mg十二水合硫酸铝钾（AIK(SO4).12H2O）、10mg硼酸（H3BO3）、10mg钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）、2mg亚硒酸钠（Na2SeO3）、10mg二水合钨酸钠（Na2WO4.2H2O）和20mg氯化镍（NiCl2.6H2O）的蒸馏水中。通过将2.2mg叶酸（维生素B9）、10.2mg吡哆醇（维生素B6）、5.2mg核黄素（维生素B2）、2.2mg生物素（维生素H或B7）、5.2mg硫胺素（维生素B1）、5.2mg烟酸（维生素B3或PP）、5.2mg泛酸（维生素B5）、0.4mg维生素B12、5.2mg氨基苯甲酸、5.2mg硫辛酸和900mg磷酸钾溶解于1升蒸馏水中制备Woolf维生素溶液。使用5M的氢氧化钠溶液将生长培养基的pH调整到6.85。在平台期如下所述收获细胞。如生长培养基的染色变化所指示的，从粉色到无色，当培养基完全还原时发生平台期。
从完整的M.magneticum全细胞制备三种不同类型的样品。通过在8000rpm下离心15分钟，在平台期收获细胞。弃掉上清（失效的生长培养基）并且细胞重悬于3ml去离子水中。对于全完整细胞的混悬液，这种样本不再进一步处理。图1（a）的TEM显微照片显示一个典型的含有几条磁小体的链的AMB-1趋磁细菌。
为了提取磁小体的链，1ml细胞混悬液再离心并重悬于10mM Tris·HCl缓冲液（pH 7.4）中，然后30W下超声120分钟来裂解细胞释放磁小体的链。60和180分钟的超声时间也进行了测试，并能够从细菌中提取磁小体的链。对于60分钟以内的超声时间，并未裂解所有的趋磁细菌，而对于180分钟以上的超声时间，由于个别聚集的磁小体的存在，开始观察到聚集。
超声后，通过将钕（0.1-1T）强磁铁放置在收集有沉淀形式的磁性材料的管的旁边，进行磁小体的链的混悬液的磁分离。去除含有细胞碎片和其它有机材料的上清。磁小体链用10mM Tris·HCl缓冲液（pH 7.4）以这种方式洗涤10次，并最终重悬于无菌去离子水中。提取自全细菌的磁小体的链的典型的组装显示于图1（b）的TEM显微照片中。使用动态光散射测量（NanoZetasizer，Malvern仪器Ltd.），测量的磁小体的链的表面电荷作为pH的函数。在生理pH，图1（e）显示磁小体的链的表面电荷在-22mV下为负。使用Nicolet 380FT IR Thermo Electro进行红外测量。还记录磁小体的链的混悬液的红外线吸收光谱。显示官能团羧酸、胺、酰胺、磷酸（P-O）产生的峰，揭示了磁小体的链的混悬液中蛋白质和磷脂的存在。这一结果表明，包围磁小体的膜以及将磁小体结合在一起的丝存在于样本中（D.Faivre等人，Chem.Rev.,2008,108,4875-4898）。
通过在90℃下1%十二烷基硫酸钠（SDS）存在时在去离子水中将磁小体链的混悬液加热5小时去除大多数包围磁小体的生物材料（即，大多数包围磁小体的磁小体膜以及负责磁小体在各链中的排列的细胞骨架）来获得个体磁小体（即，不以链的形式组织的磁小体）（D.Faivre，Chem.Rev.,2008,108,4875-4898）。如针对磁小体链所述的洗涤个体磁小体并重悬于去离子水中。图1（c）的TEM显微照片显示一个典型的个体磁小体的组装。个体磁小体具有不同于磁小体的链的性质。它们形成纳米颗粒的聚集的组装体（图1（c））。它们具有强烈依赖于其聚集水平的表面电荷。当个体磁小体经超声并分散于水中时，在pH 7时它们具有和磁小体的链相对相似的表面电荷。然而，当它们聚集时，个体磁小体具有正电荷（在pH 7时10mV，图1（e））。个体磁小体被磷脂酸（在图1（f）的红外线吸收光谱中存在的P-0峰）而非蛋白质（在图1（f）的红外线吸收光谱中没有酰胺）所包围，这表明包围磁小体的生物材料尚未完全去除，但是已经充分变性，产生不以链的形式组织的个体磁小体。
按照先前所述的操作制备化学合成的纳米颗粒（SPIONCitrate）（Lalatonne等人，Phys.Rev.E，2005,71,011404-1,011404-10）。为了制备未包被γFe2O3的颗粒，碱（二甲胺）溶液首先加入至十二烷基硫酸亚铁（Fe(DS)2）的胶束水溶液中并混合。最终反应物浓度，对于Fe(DS)2和二甲胺分别为1.3×10-2mol L-1和8.5×10-1mol L-1。然后溶液在28.5℃强烈搅拌2小时，通过离心从上清中分离出获得的未包被的纳米晶体的沉淀。在第二步骤中，用酸性溶液（HNO3，10-2mol.L-1）洗涤沉淀，直至到达溶液pH=2。溶解于水中的柠檬酸钠（[Na3C6O7H5]＝1.5×10-2molL-1）用于包被纳米颗粒。溶液在90℃时经历2小时超声以及加入诱导纳米晶体沉淀的丙酮。用大量过量丙酮洗涤之后，在空气中干燥沉淀。用柠檬酸离子包被的纳米晶体最后分散在水中。通过加入氢氧化钠NaOH（10-1mol.L-1）溶液，pH从起始时~2，逐步上升到7.4。SPIONCitrate由磁赤铁矿组成，并具有~10nm的平均大小。SPIONCitrate的TEM显微照片显示于图1（d）中。
SPIONPEG的详细性质可以获自Micromod公司。在Micromod提供的信息单（产品No：79-00-201）中表明SPIONPEG具有34emu/g的饱和磁化强度（saturating magnetization）、约20nm的大小、20%以内的多分散性，以及它们在对于pH>4的水缓冲液中是稳定的。
实施例2：
通过细菌磁小体暴露于振荡磁场的热生产
在这个实施例中，我们提供由趋磁细菌生物矿化的磁小体的热产生的机制的详细研究。用于加热不同样本的磁场频率（108kHz）和磁场幅（23至88mT）的值介于用于进行高频高幅AMF（交变磁场）过热的磁场参数范围内（Ivkov等人，Clin.Cancer Res.,2005,11,7093s-7103s；De Nardo等人，Clin.Cancer Res.,2005,11,7087s-7092s；De Nardo等人，The J.Nucl.Med.,2007,48,437-444）。对于AMF过热，推荐磁场频率介于50kHz和1MHz之间，而磁场幅需要保持在100mT以下（Mornet等人，J.Mater.Chem.,2004,14,2161-2175）。我们比较三种不同类型的磁小体排布的产热性质（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309；Alphandéry等人，ACS Nano,2009,3,1539-1547）：1）包含在完整AMB-1趋磁细菌中的磁小体链；2）提取自保留其磁小体膜的细菌的磁小体的链；以及3）个体磁小体晶体，其磁小体膜大多已被去除。
据了解，对于大的铁磁纳米颗粒，有两个主要的产热机制。第一个是由于磁性纳米颗粒在磁场中的物理旋转，第二个是磁滞损耗的结果（Hergt等人，IEEETrans.Mag.,1998,34,3745-3754）。为了确定这些机制中的哪个负责上述三种不同类型磁小体排布的热产生，我们比较样本在水中的加热速度，在水中细胞和磁小体的旋转是可能的，出现在凝胶中的那些，旋转被抑制。以这种方式，可以确定由细菌或磁小体的旋转产生的热的量，以及磁滞损耗产生的热的量。为了验证凝胶中产生的热是由于磁滞损耗，我们使用磁测量独立测量了磁滞损耗。
材料和方法：
使用JEOL型JEM1011透射电子显微镜（JEOL Ltd.，Tokyo）在100kV下操作来检验样本。五微升含有按重量计2×10-4%磁小体的溶液沉积在碳包被的铜网上，检验之前使网干燥。相同相对量的磁小体用于制备所有样本，从而特定样本中的聚集不是由于磁小体浓度上的差异造成的。
使用振动样品磁强计（VSM，Quantum design，San Diego，CA）进行磁测量。对于磁测量，含有按重量计2.10-3%磁小体的趋磁细菌细胞、磁小体的链或个体磁小体的25微升液体混悬液，沉积在硅基底顶上。然后样品以平行于磁场的方向放置在由硬明胶制成的囊内。进行三种类型的磁测量，饱和等温剩磁（saturatingisothermal remanent magnetization）（SIRM）以及主（major）或小（minor）磁滞回线的那些。按照和前述相似方法，SIRM测量用于确定磁小体的组成（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C，2008,112,12304-12309）并显示磁小体中的磁铁矿已几乎完全氧化成磁赤铁矿。这一结果并不令人意外，因为我们的磁性材料的混悬液不是新鲜配制的，并且磁小体中的磁铁矿已知随着时间被氧化成磁赤铁矿（Chen等人，Earth Planet.Sci.Lett，2005,240,790-802）。磁赤铁矿和磁铁矿在室温下具有非常相似的磁性质（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309）。磁小体的磁铁矿转化为磁赤铁矿的事实并没有本质上改变这种模式得出的结论，因为磁赤铁矿和磁铁矿在室温具有非常相似的磁性质（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C，2008,112,12304-12309）。在300K下进行主磁滞回线测量以便确定包含在样品中的磁赤铁矿的量。通过样本的饱和磁化强度除以磁赤铁矿的饱和磁化强度来确定后者。对于磁小体晶体那么大的纳米颗粒，饱和磁化强度是整批材料（bulkmaterial）的饱和磁化强度（整批磁赤铁矿的情况下）。最后，还通过作为连续磁场的函数记录样本的磁化强度进行小磁滞回线的测量，在-H0和H0之间施加磁场，其中H0是23mT、36mT、66mT或88mT。
用混悬于超纯去离子水（18.6ΜΩ）或琼脂糖水凝胶（按重量2%）中的全细菌、磁小体的链和个体磁小体进行这些实验。对于含有全细胞的液体混悬液，磁赤铁矿的浓度是457μgml-1，对于含有磁小体的链的液体混悬液为435μg ml-1以及对于含有个体磁小体的液体混悬液为380μg ml-1。这三种混悬液的各250μl倾入聚丙烯管内，并放置在产生108kHz频率的振荡磁场的线圈中心，场幅被固定在23mT、36mT、66mT或88mT。为了产生交变电流，将线圈连接到发电机上（Celesinductor C97104），使用光学纤维探针（Luxtron STF-2，BFi OPTiLAS SAS）测量温度。
结果与讨论：
图1（a）描述了显示出典型磁小体的链的趋磁螺菌(Magnetospirillummagneticum）AMB-1株的细胞的透射电子显微照片（TEM）。全细胞中磁小体占据的体积相当小，通常~0.02%。含有完整的M.magneticum全细胞的水混悬液经受频率ν=108kHz和场幅H0=23mT和H0=88mT的振荡磁场。当磁场强度从23mT的提高到88mT时，混悬于液体中的细胞加热速度提高（图2（a）和图2（b））。根据22℃下测量的温度随时间的变化斜率（ΔΤ/δΤ），我们使用如下等式1来估计混悬于液体中的完整细胞的SAR（Mornet等人，J.Mater.Chem.,2004,14,2161-2175；Hergt等人，J.Magn.Magn.Matter.,2005,293,80-86）：
Figure BDA00001844721300231
其中C水是水的比热容（C水=4.184J/g.K）以及xm是按g计的铁在每毫升溶剂（水）中的浓度。使用上述公式，我们推导，当磁场幅从23mT增加至88mT时，全细菌混悬液的SAR从108±32W/gFe增加至864±130/W/gFe。为了确定全趋磁细菌产生的热的量（SAR）是否来自全细菌的旋转、来自磁滞损耗或来自这两种机制，我们测量全完整细胞的小磁滞回线的面积（图2（c）），其提供全细胞磁滞损耗的估计。使用Hergt等人的方法（Hergt等人，J.Magn.Magn.Matter.,2005,293,80-86）我们从图2（c）显示的小磁滞回线的面积推导出完整细胞的磁滞损耗从23mT时的54±25W/gFe增加至88mT时的810±121W/gFe。这些SAR值与混悬液中的细菌细胞测量的那些相似（图（2d））。出乎意料地，固定在琼脂糖凝胶中的细胞所确定的SAR，显著小于小磁滞回线的面积并且似乎并没有提供良好的磁滞损耗的估计（图2（d））。这可能是由于制备凝胶期间一些细菌细胞的损失导致比其它样品中更低浓度的磁小体。从这些结果中，我们推导完整的细菌细胞的旋转不利于在这种情况下热的生产。由于大的重量和体积，M.magneticum的完整细胞不能够在施加外部磁场下充分旋转来产热。通过对由于细菌细胞旋转的SAR的估计，SARrot，可以证实缺少旋转的贡献。使用以下等式（2）估计后者（Hergt等人，IEEETrans.Mag.1998,34,3745-3754）。
SAR rot = 1 2 ( M s H o V ) 2 K b T 1 &rho;V 1 &tau; b ( &omega; &tau; b ) 2 1 + ( &omega; &tau; b ) 2 - - - ( 2 )
在（2）中，我们假定布朗弛豫时间τb比Néel弛豫时间τn小得多，其中τb=3ηV/KbT并且τn=τ0exp（Ea/KbT）。对于不同的样品，τb介于2.510-5sec.和0.3sec之间（Mornet等人，J.Mater.Chem.,2004,14,2161-2175）。假定τ0~10-9sec并且磁小体的链的各向异性能和热能之间的比，Ea/KbT~480（Alphandéry等人，ACS Nano 2009,3,1539-1547），我们发现，τn~3.1038sec.并且因此τb/τn<<1。这证实了使用（2）测量SAR。在等式（2）中，ω=2πf，其中f=108kHz是振荡磁场的频率，Ms是磁赤铁矿的饱和磁化强度（MS=390emu/cm3），H0是施加的磁场的幅（23mT<H0<88mT），V~2010-17cm3是典型的磁小体的链的体积（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309），ρ~5g/cm3是磁赤铁矿的比重，Kb~1.3810-23J/K是波尔兹曼常数以及τb~10sec是完整细菌细胞在水中的布朗弛豫时间。使用公式τb=3ηVh/KbT估计布朗弛豫时间，其中Vh是流体动力学体积。对于全趋磁细菌，我们认为Vh=4/3πr3，其中r是细菌典型长度的一半（1.5μm）。使用这些值，我们发现，SARrot介于5.10-2W/gFe和7.10-1W/gFe之间，对于H0值在23至88mT之间。这些值比由于磁滞损耗测量的SAR小得多，其是23mT时的~82±58W/gFe以及88mT时的~841±153W/gFe（图2（d）），这些值是根据溶液中加热速度推导的SAR与根据小磁滞回线的测量推导的（SAR）之间的平均值。因此全细菌细胞的旋转似乎无助于观测到的温度的上升。如图2（d）所示，SAR似乎完全是由于磁滞损耗。这些损耗在更高的磁场幅时（88mT时SAR~841±153W/gFe）变得比在23mT时（SAR~82±58W/gFe）更显著。随着磁场幅的增加而增加的磁滞损耗的这一发现，之前已经在化学合成的磁铁矿纳米颗粒中观察到（Hergt等人，IEEE Trans.Mag.,1998,34,3745-3754）。混悬液中全细胞的SAR每周期，其定义为SAR除以振荡磁场频率，介于0.7±0.5J/kgFe和7.8±1.4J/kgFe之间。这些值比大多化学合成的磁性纳米颗粒获得的那些值高，对于广范围的磁性纳米颗粒大小和组成以及对于大的磁场频率和幅的选择，其典型地介于0.001J/kgFe和1.2J/kgFe之间（Dutz等人，J.Magn.Magn.Mater.,2007,308,305-312；Ma等人，J.Magn.Magn.Mater.,2004,268,33-39；Jordan等人，J.Nano.Res.,2003,5,597-600；Brusentsov等人，J.Magn.Magn.Mater.,2001,225,113-117；Chan等人，Scientific and clinical applications of magnetic carriers,
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等人，（编辑），Plenum Pres,NY,1997,607-618）。我们得出这样的结论，在我们的实验条件下全趋磁细菌的混悬液比大多化学合成的磁性纳米颗粒产生更大量的热。
从细菌细胞提取磁小体的链，假设增强它们在磁场中的旋转而没有细胞结构干扰旋转。要验证磁小体实际上提取自细菌以及它们以链的形式保持，我们使用电子显微镜。图1（b）显示了典型的磁小体的链的组装（Alphandéry等人，ACS Nano,2009,3,1539-1547；Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C，2008,112,12304-12309），其不聚集成团块，但是彼此作为链足够接近以至于磁性地相互作用。对于磁场幅23mT和88mT，磁小体的链的热产生速度分别显示于图3（a）和3（b）中。在溶液中，它们特征在于在23mT时在1500sec.的时间段~43℃的增加（图3（a））以及在88mT时在相同的时间段~48℃的增加（图3（b））。这些加热速度比用全细胞获得的那些高约2至约10倍之间（图2（a）、2（b）、4（a）和4（b））。这表明磁小体的链产生比完整细菌细胞产生更大的磁滞损耗，或表明它们在振荡磁中旋转有助于热产生或两者都有。为了辨别，如果有的话，这些解释中的哪个负责更大的热产生速度，确定了磁小体的链的磁滞损耗。图3（c）显示链在23mT和88mT时的小磁滞回线。磁小体的链的小磁滞回线的面积小于完整细菌细胞获得的那些（图2（c））。这种降低可能是由于磁小体的链之间的磁相互作用（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C，2008,112,12304-12309），并且因此我们得出这样的结论与混悬于液体中的完整细菌细胞相比，观察到的磁小体的链的更高的热产生速度，不是由于磁滞损耗的增加而是由于链的旋转。旋转对磁小体的链的热产生的贡献可以进一步通过估计混悬于液体中的磁小体的链的SAR来证实。使用等式（1）以及对于混悬于中磁小体的链的ΔΤ/δΤ值（图3（a）和图3（b）），我们发现，SAR从23mT时的~864±86W/gFe增加至88mT时的~1242±124W/gFe（图3（d））。这些SAR值大于推导自凝胶中磁小体的链的SAR（SAR在23mT时的~54±22W/gFe以及88mT时的SAR~487±97W/gFe）或推导自小磁滞回线面积（SAR在23mT时的~108±41W/gFe以及88mT时的SAR~486±97W/gFe）的磁滞损耗。为了证实旋转对磁小体的链的产热机制的贡献，我们使用等式2确定SARrot，其为布朗弛豫时间中的因素。这一公式，仅在饱和区域下适用，其中SAR显示强烈依赖场幅（Hergt等人，IEEE Trans.Mag.,1998,34,3745-3754）。由于~36mT以上发生饱和（图3（d）），我们只测量23mT时的SAR。使用布朗弛豫时间τB~1.210-4sec，我们发现在23mT时SARrot~3600W/gFe大于我们通过测量混悬于液体中的磁小体链的SAR（864±86W/gFe）与由于磁滞损耗的SAR（90±59W/gFe）之间的差异所实验测量的774±145W/gFe的SAR。理论预测和实验观察之间的差异可解释为磁小体的链的部分聚集。我们得出这样的结论，旋转有助于磁小体的链的加热机制以及这种贡献从23mT时的90±10%的SAR降低至88mT时的相同SAR的40±10%（图3（c））。这种降低可以解释为，随着磁滞损耗的磁场幅的增加，比由磁小体的链在磁场中旋转造成的SAR的增强更强的增强（Hergt等人，IEEE Trans.Mag.1998,34,3745-3754）。
我们测试的最后的样本是个体磁小体的混悬液，使用热和溶脂的去污剂（十二烷基硫酸钠（SDS））的组合去除大部分它的膜。这些晶体不以链的形式维持，显示于图1（c）中。这些纳米晶体与个体纳米晶体的紧密组装体相互作用和组织（Alphandéry等人，ACSNano.,2009,3,1539-1547、Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C,2008,112,12304-12309；Kobayashi等人，Earth Planet.Sci.Lett,2006,245,538-555），不像图1（b）中显示的有膜的磁小体。对于23mT和88mT的磁场幅，含有这些个体磁小体的液体混悬液的加热速度显示于图4（a）和4（b）中。它们比在23mT和88mT时混悬于液体中的磁小体的链观察到的那些低（图3（a）、3（b）、4（a）和4（b））。磁小体的链与个体磁小体之间观察到的溶液加热速度的差异可以是由于磁小体旋转的贡献的差异或对SAR的磁滞损耗或者两者的组合。根据小磁滞回线的面积估计磁滞损耗（图4（c））产生SAR值介于23mT时的270±100W/gFe与88mT时的427±85W/gFe，或根据凝胶中个体磁小体的加热速度估计磁滞损耗（图4（a）和4（b））产生SAR值介于23mT时的135±70W/gFe与88mT时的432±86W/gFe。上述两种方法估计的磁滞损耗（图4（d））与对于磁小体的链估计的那些相似（图3（d））。因此，磁小体的链与混悬于液体中的个体磁小体之间观察到的SAR中的差异必然由结构在磁场中旋转的能力差异所导致。等式2预测由于混悬于液体中的个体磁小体的旋转的SAR应当与磁小体的链推导的相同，在23mT时SARrot~3600W/gFe。因此，个体磁小体观察到的更低的加热速度最可能是由于个体磁小体比磁小体的链更易于聚集成团块的事实。使用电子显微镜，个体磁小体的聚集是清晰明显的（图1（c）），并且还可以在液体混悬液中视觉观察到。这阻止这些磁小体旋转，就像磁小体的链一样容易。
从这些结果，我们可以得出以下结论：
（i）三个磁样本（全趋磁细菌、磁小体的链和个体磁小体）中每一个的SAR大于更小的超顺磁纳米颗粒所报道的SAR。
（ii）对由完整细菌细胞的热产生的主要贡献似乎是磁滞损耗，而物理旋转和磁滞损耗都负责磁小体的链和混合于溶液中的个体磁小体的热的产生。
（iii）与它们在溶液中的行为相反，磁小体的链和个体磁小体应当较少能够在体内旋转。因此，体内应当产生的热的量可以通过测量它们的磁滞损耗进行预测。由于磁小体的链和个体磁小体具有相似的磁滞损耗，假定它们都是体内热治疗的等价的良好候选者。
实施例3：
通过在各种螯合剂和/或过渡金属存在时合成趋磁细菌获得的提取的磁小体的链的改善的加热效率。
在本实施例中，我们描述了混悬于水中提取的磁小体的链的加热效率的各种改善方法。这些方法使用引入到AMB-1趋磁细菌生长培养基中的各种添加剂。这些添加剂是螯合剂比如双膦酸盐分子、多巴胺、罗丹明、EDTA或过渡金属比如钴。
材料和方法：
首先通过按照和实施例1中描述的相同方法制备趋磁细菌的生长培养基。然后如下添加剂中的一种加入到趋磁细菌的生长培养基：0.4μM、4μM或40μM不同类型的双膦酸（阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐或奈立膦酸盐）、4μM、20μM或400μM的罗丹明溶液、0.4μM或4μM的EDTA溶液、0.4μM、4μM或40μM多巴胺溶液、2μM或20μM奎尼钴溶液。1ml趋磁细菌的混悬液加入到一升上述生长培养基中，并且细菌生长10天。生长10天后，按照和实施例1中描述的相同操作收集细菌并从细菌中提取细菌磁小体的链。然后五微升含有按重量计2×10-4%磁小体的细菌磁小体的链的混悬液沉积在碳网上，用于透射电子显微镜（TEM）分析。TEM用于确定磁小体的大小和估计链的长度。以便评价各种类型提取的磁小体的链的加热性质，后者混合于水中。不同混悬液的浓度估计为每毫升磁赤铁矿的量。对于含有在几种双膦酸存在时合成的磁小体的混悬液，它们是0.3mg/mL，对于含有Co掺加的磁小体的混悬液是1.52mg/mL，以及对于含有在EDTA、罗丹明、多巴胺或阿仑膦酸盐存在时合成的磁小体的混悬液，是0.406mg/mL。施加频率183kHz和强度43mT或80mT的交变磁场下，加热混悬液。使用热电偶微探针（IT-18,Physitemp,Clifton,USA）测量这些混悬液的温度变化。
结果和讨论：
在这个部分，我们比较了通过在标准条件下（即没有螯合剂和/或过渡金属）培养趋磁细菌而获得磁小体的链（CM-对照）与在0.4μM EDTA存在时培养趋磁细菌而获得磁小体的链（CM-EDTA）的性质。呈现了CM-EDTA的结果，因为它们导致了最重要的磁小体性质的变化，即和CM-对照相比，磁小体大小、磁小体链长度和加热效率的最大提高。
如在图表5（a）和5（d）中所示，对于CM-对照和CM-EDTA，磁小体大小的分布均看似是双峰的，大的磁小体比小的磁小体更高的百分比。对于CM-EDTA（图5（d））大的磁小体的百分比高于CM-对照的（图5（a））。此外，磁小体大小分布的吻合（fit）表明大的磁小体的大小从CM-对照的~42nm（图5（a））提高至CM-EDTA的~60nm（图5（d））。我们还观察到小的磁小体（<30nm）的百分比对于CM-对照是显著的（>25％，图5（a））而对于CM-EDTA是低的（<10％，图5（d））。如通过比较图5（b）和5（e）中所呈现的图表可以观察到的，平均磁小体链长度还从CM-对照的~150nm（图5（b））提高至CM-EDTA的~300nm（图5（e））。长的磁小体的链（长度>800nm）仅对于CM-EDTA出现（图5（e））。当向含有CM-EDTA的混悬液施加交变磁场时，对于CM-EDTA其产生温度上的提高比CM-对照的大，对于两者磁场强度均为43mT和80mT（图5（c）及5（f））。此外，CM-EDTA的饱和温度（43mT时35℃以及80mT时45℃，图5（f））均比CM-对照获得的那些高（43mT时28℃以及80mT时35℃，图5（c））。这些特征揭示，与CM-对照比较，CM-EDTA加热能力更高，其可以归因于磁小体大小和/或磁小体链长度的增加。
对于引入细菌生长培养基的一系列其它螯合剂，可观察到与用0.4μMEDTA所观察到的那些相同的趋势，但是具有不太明显的效果。如在图6（a）所示，对于出自在各种螯合剂（4μM罗丹明B、4μM多巴胺、4μM阿伦磷酸盐）存在时培养的细菌的磁小体的链，在施加强度43mT或80mT的交变磁场下，比CM-对照温度提高得更快。
当在4μM利塞磷酸盐或4μM阿伦磷酸盐存在时合成磁小体，具有大小在45nm以上的磁小体的百分比变得比在没有双膦酸存在时合成的磁小体的更高（图17（a）、17（b）和17（c））。对于在双膦酸存在时合成磁小体（图17（e）和17（f）），具有长度在400nm以上的链的百分比也比没有双膦酸时合成的（图17（d））那些更高。由于这些行为，对于在4μM利塞磷酸盐（图17（h））或4μM阿伦磷酸盐（图17（i））存在时合成的磁小体，由施加磁场诱导的温度的变化比没有双膦酸存在时合成的磁小体的那些（图17（g））大。对于40mT和80mT强度的磁场均观察到这种行为。对于引入至生长培养基的具有0.4μM浓度的双膦酸，与对于4μM浓度获得的那些，观察到相似的结果。相反，对于引入至细菌生长培养基的40μM的双膦酸浓度，细菌磁小体的链的性质没有显著区别于在标准条件中合成的细菌磁小体的链的性质。这些结果表明，到达最佳加热效率必要的双膦酸浓度介于0.1和40μM之间，尤其0.1和10μM之间，典型地在0.4和4μM之间。还测试了第三个双膦酸（奈立膦酸），并产生与阿仑膦酸或利塞膦酸获得的那些相似的结果。
还在生长培养基中培养AMB-1趋磁细菌，培养基含有ATCC培养基1653的化学品以及20μΜ或400μΜ罗丹明溶液。当在罗丹明存在时合成并混合于1毫升水中的55μg磁小体的链经受43mT的交变磁场时，混悬液的温度在30分钟内升高3度。对于没有罗丹明存在时合成的磁小体的链，在相同实验条件下观察到仅一度的温度升高。这表明，在生长培养基中存在罗丹明改善磁小体的链的加热能力。
还测试了提取的磁小体的链的加热效率，其中通过向细菌生长培养基引入20μΜ奎尼酸钴溶液合成磁小体。使用电子能量损失谱（Energy Electron LossSpectroscopy，EELS）测量来检测一些磁小体中钴的存在。这一结果与Staniland等人的一致（S.Staniland等人，Nature Nanotech.,2008,3,158-162），其还显示对于在相似条件下合成的趋磁细菌，磁小体中钴的存在。如图6（b）中所示，当含有Co掺加的磁小体（CγFe203=1.52mg/mL）的混悬液暴露于强度80mT和频率183kHz的交变磁场中，混悬液的温度比含有CM-对照的提高更多。由于磁小体大小和磁小体链长度显示出与未掺加和Co掺加的磁小体极为相似，Co掺加的磁小体的增强的加热效率可以解释为它们磁晶各向异性的增加。
从这些结果，我们可以得出以下结论：
（i）向AMB-1细菌生长培养基引入浓度介于0.1μΜ和1mM之间的铁螯合剂，产生混合于溶液中提取的磁小体的链的改善的加热性质。我们相信，这种行为是由于当细菌培养于这些条件时磁小体大小和/或磁小体链长度的增加。
（ii）向AMB-1细菌生长培养基引入浓度介于0.1μΜ和1mM之间的奎尼酸钴，产生混合于溶液中提取的磁小体的链的改善的加热性质。我们相信，这种行为是由于掺加有钴的磁小体的磁晶各向异性的增加。
（iii）向细菌生长培养基引入铁螯合剂和/或奎尼酸钴提供一种增强磁小体的链的加热效率的方式。这为在热疗中使用更少量的这些磁小体的链从而降低磁小体的链的存在所诱导的毒性风险打开了道路。
实施例4：
体外评价热疗的效率
材料和方法：
MDA-MB-231细胞获自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。细胞系培养于Dulbecco's改良Eagle's培养基（DMEM）补充中，其中含有10%胎牛血清（FCS）、2mM l-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50U/ml链霉素（均购自Life Technologies Inc.）。所有体外实验在37℃时在5%二氧化碳孵化器中进行。
使用所谓的MTT法（微培养四甲基偶氮唑蓝比色法，T.Mosmann,1983,J.Immunol.Methods,65,55-63）评价细胞活性。这种技术测量线粒体酶将溴化3-(4,5-二甲基噻唑基-2-基)-2,5-二苯基四氮唑（购自Sigma,St Louis,MO,USA）还原为紫色甲臜晶体的能力。将细胞以每孔2104个细胞的密度接种于96-孔平底板（Falcon,Strasbourg,France）并在培养基中孵育24小时。然后，去除培养基，并替换为含有具有不同磁赤铁矿浓度（0.125mg/mL<CγFe203<1mg/mL）的各种纳米颗粒（磁小体的链、个体磁小体、SPIONCitrate和SPIONPEG）的10%FCS培养基。这些混悬液暴露于（或不针对对照）频率183kHz和强度43mT的交变磁场中。该处理进行一次或两次20分钟。孵育72小时后，用磷酸盐缓冲液（PBS来自LifeTechnologies）洗涤细胞并用0.1mLMTT（2mg/mL）在37℃时孵育额外4小时。然后通过加入100μl DMSO（Sigma-Aldrich）溶解不溶性产物（基本上由甲臜组成）。使用Labsustem MultiScan MS酶标仪在570nm处测量溶解的甲臜的吸光度。提供了有功能的线粒体数目的评估，其是一种与活细胞数目成正比的数字。抑制百分比然后估计为死细胞（即凋亡中的细胞）的数目除以总细胞数目。
对于毒性研究，细胞接种于培养皿中（直径为30nm，每培养皿50000个细胞），并生长24小时。这种生长起始阶段之后，在研究的各种类型纳米颗粒存在时（或对于对照不存在）孵育细胞24小时、48小时或72小时。孵育时间结束时，细胞暴露于（对于对照不暴露于）频率183kHz和强度20mT、43mT或60mT的交变磁场中。该处理进行一次或两次20分钟。处理后，用PBS洗涤细胞两次。然后，为了收获细胞，250μl胰蛋白酶-EDTA加入到粘附的细胞中。750μl液体培养基加入到收获的细胞中对混悬液进行匀浆。然后在700G下将混悬液离心3分钟，去除上清，将细胞重悬于1mL PBS中。为了评价活细胞百分比，5μl碘化丙啶（PI）（1mg/mL混合于乙醇中，Sigma Aldrich）加入至细胞混悬液中。由于PI仅穿透至死细胞中，测量它的荧光提供死细胞百分比的估计。根据这种估计，我们可以推导活细胞的百分比。为了测量PI的荧光，在流式细胞仪（Beckton Dickinson FACSCalibur 3C）中分析细胞，流式细胞仪含有488nm处发射的氩激光以及能够检测激光激发的PI荧光的检测器FL3-H。测量每样本上万个细胞来确定活细胞的百分比。
为了体外测量细胞混悬液的加热性质，对混悬液中的细胞进行与对粘附细胞上述的基本相同的实验。在这种情况下，唯一的差异在于细胞立刻与磁小体的链进行混合，并通过施加磁场来处理。用热电偶微探针（IT-18,Physitemp,Clifton,USA）测量温度，探针宏观地测量温度（即细胞混悬液作为一个整体的温度，而非各个体细胞中的温度）。
为了估计磁性细胞的数量，遵循基本上与以上描述的对于混悬液中的细胞的相同的操作。包含在上述液体培养基中的50000个细胞在各种纳米颗粒存在时孵育5至20分钟。孵育期间，施加频率183kHz和磁场强度43mT的交变磁场。处理后，通过将0.6mT的强磁铁放置于接近混悬液中细胞来收集磁性细胞。去除含有非磁性细胞的上清，而被磁铁吸引的细胞重悬于1mL PBS中。然后使用流式细胞仪估计磁性细胞的百分比。
结果与讨论：
对于用混悬液中的细胞的治疗，细胞首先在各种浓度磁小体的链的混悬液存在时孵育几分钟。与此同时，施加频率183kHz和各种强度（0mT<B<60mT）的交变磁场。然后对于不同的磁场强度，在流式细胞仪中测量活细胞的百分比。图7（a）显示，对于所施加磁场的不同强度，活细胞的百分比是高的（>80%），表明毒性低。这可以解释为这样的事实，刚治疗后细胞没有达到凋亡的状态。对于在各种量的磁小体的链存在时孵育几分钟的细胞，混悬液的温度变化（其是由于交变磁场的施加）对于磁场强度20mT（图7（b））、43mT（图7（c））和60mT（图7（d））分别显示于图7（b）、7（c）和7（d）中。如图7（b）所示，20mT的磁场强度过低以至于不能引起温度升高。相反，图7（d）显示60mT的磁场强度诱导温度上大的升高。甚至对于没有磁小体的链存在时孵育的细胞，也发生后者的情况，表明它产生自傅科电流。43mT的磁场强度是提供可接受的行为的强度，即不存在磁小体的链时没有温度变化以及温度的升高，其中温度随着孵育的磁小体的链的量的增加而增加（图7（c））。
对于孵育几分钟以上的粘附细胞，活MDA-MB-231细胞的百分比也测量作为磁场强度的函数（图8）。细胞在各种浓度的磁小体的链的混悬液存在时孵育24小时（D1，图8（a））、48小时（D2，图8（b））或72小时（D3，图8（c）和8（d））。进行一次（图8（a）至8（c））或两次（图8（d））热诱导的处理。没有磁场时，对于孵育48小时或72小时的1mg磁小体的链，磁小体的链的存在是有毒的（50%以下的活细胞）。对于所有其它测试条件，磁小体的链的存在表现出低毒性（50%以上的活细胞）。存在磁场时，图8（a）至8（c）显示对于43mT或以上的磁场以及对于0.5mg以上的孵育的磁小体的量，活细胞的百分比显著降低。图8（d）显示通过重复两次治疗，有可能改善治疗的效率，其中通过使用少量磁小体破坏高百分比的活细胞来限定治疗的效率。事实上，对于进行两次的治疗，和用0.5mg进行一次治疗相比（B=43mT）（图8（c）），对于所用的0.25mg磁小体的链达到20%的活细胞百分比（B=43mT）（图8（d））。
在没有磁场（图9（a））或存在43mT的磁场时进行一次治疗（图9（b））或进行两次治疗（图9（c））时，还估计了上述各种类型纳米颗粒存在时孵育的MDA-MB-31细胞的抑制百分比。在所有的测试条件下，对于磁小体的链存在时孵育的MDA-MB-31细胞，细胞的抑制百分比所有其它类型纳米颗粒（个体磁小体、SPIONCitrate和SPIONPEG）存在时孵育的那些更大。针对所用的0.125mg的最少的磁小体的链的量以及对于进行一次以上的治疗（图9（a）和图9（c）），获得治疗的最佳条件（即磁场存在时产生高百分比的抑制，而没有磁场时产生低百分比的抑制的那些条件）。
图9（d）显示MDA-MD-231细胞的百分比，当它们在各种类型纳米颗粒存在下孵育时并施加0至20分钟之间43mT的交变磁场时，变成磁性的。对于磁小体的链和SPIONCitrate存在时孵育的细胞，磁性细胞的百分比是高的。其介于40%和90%之间，这取决于交变磁场施加多久（图9（d））。图9（d）还显示MDA-MD-231细胞中个体磁小体的内在化百分比是低的（<20％）。这可解释为个体磁小体聚集的倾向性，其阻止它们穿透到细胞中。图9（d）中所示，SPIONPEG具有极低的MDA-MD-231细胞中内在化百分比，这表明施加交变磁场后磁性纳米颗粒在真核细胞中的内在化百分比强烈取决于所用纳米颗粒的类型。
从这些结果，我们可以得出以下结论：
（i）没有治疗的情况下，对于1mg以下的磁小体的链的量，磁小体的链的毒性是低的。
（ii）对于各种浓度磁小体的链存在时混悬的MDA-MB-231细胞，43mT的磁场强度产生最佳的加热性质。
（iii）对于孵育的磁小体的链的最低量（0.125mg）以及重复两次的治疗，达到最佳的条件。
（iv）与个体磁小体相比，磁小体的链达到更高的抑制百分比，可以是由于与个体磁小体相比磁小体的链在MDA-MD-231细胞中更好的内在化。
（v）与SPIONCitrate存在时孵育的细胞所观察到的相比，对于磁小体的链存在时孵育的细胞所观察到的更高的抑制百分比，可以解释为磁小体的链的更高的SAR或磁小体的链更均匀的加热或这两个性质的组合。
实施例5：
各种细菌磁小体和SPIONCitrate的加热效率和抗肿瘤活性
在本实施例中，比较了磁小体的链、个体磁小体、SPIONCitrate和全趋磁细菌的体内加热效率和抗肿瘤活性。
材料和方法：
所有动物实验在“Centre Léon Bérard,Ecole normale supérieure,Plateau deBiologie Expérimentale de la Souris,Lyon,France”委员会审查的操作规程批准之后进行。
在30只六周龄的裸鼠上进行体内加热实验，裸鼠在Charles Rivers实验室,Arbresle,France购买。为了制备具有肿瘤的动物，小鼠首先经过gamma-辐射。100μl磷酸盐缓冲液（PBS）中的大约两百万个MDA MB 231人乳腺癌细胞然后用注射器（26G针）皮下注射至小鼠的左和右两侧。使用卡钳每3天测量肿瘤大小。然后使用公式V=A×B2/2估计肿瘤体积，其中A是长的肿瘤横向直径，B是短的肿瘤横向直径（Sun等人，Cancer Lett.,2007,258,109-117）。肿瘤生长为期21天，直到它们达到约100mm3的体积。
治疗开始之前，用氯胺酮/甲苯噻嗪（100/6mg kg-1，i.p.）麻醉小鼠，取决于不同小鼠这导致它们的体温从37℃降低到30-36℃。治疗的第一个步骤期间，三只小鼠死亡,最有可能是由于麻醉剂量的高估。尸体剖检后，这些小鼠的器官没有显示明显的系统性充血或梗死。麻醉下，含有分散至无菌水中的化学合成的纳米颗粒或各种类型的细菌磁小体的注射器的针纵向插入到小鼠的肿瘤中。然后将小鼠置于直径6.7cm的线圈内，其中向它们施加交变磁场。为了产生交变磁场，使用来自Ambrell,Soultz,France的10kW EasyHeat能源供应在线圈内产生交变电流。图10（a）的示意图显示用于进行实验的实验设置。使用可植入的热电偶微探针（IT-18,Physitemp,Clifton,USA）进行温度的测量来获得直肠温度或肿瘤中心部分中的温度的局部估计。监测直肠温度的变化来证实肿瘤温度的升高是局部的，不发生在小鼠的整个体内。红外照相机（Moblr2,Optophase,Lyon,France）用于获得更全面的肿瘤和肿瘤环境的温度变化的图。在图10（b）的示意图中通过线来表示穿过横截面测量的温度。第一治疗后的30天期间，测量未加热的和加热的肿瘤的肿瘤大小的变化。
通过追踪各小鼠两侧肋皮下生长的肿瘤的大小演变，研究了抗肿瘤活性。随机选择小鼠并分成五组。前四组按照如下处理。含有个体磁小体（小鼠1至3中混悬液1）、磁小体的链（小鼠5至8中混悬液2）、SPION（小鼠10至13中混悬液3）以及全趋磁细菌（小鼠15至16中混悬液4）的100微升混悬液施用至位于小鼠右肋侧的肿瘤中。注射不同混悬液后，小鼠经受频率183kHz和磁场强度~43mT（小鼠1、2、3、5、6、7、8、10、11、12、13）或~80mT（小鼠15和16）的交变磁场，持续20分钟。以3天的间隔重复3次治疗。对于接受磁小体的链的混悬液的小鼠，磁场要降低~5mT以避免肿瘤内的温度超过50℃。对于接受全细菌的小鼠，磁场要提高至~80mT来观察肿瘤内的温度提高。第五组被认为是对照组，并不经受交变磁场的施加。这组由这样的小鼠组成，其中在位于它们右肋侧的肿瘤内接受100μl生理盐水（小鼠17和18）、100μl混悬液1（小鼠4、19和20）、100μl混悬液2（小鼠9、21和22）、100μl混悬液3（小鼠14、23和24）以及100μl混悬液4（小鼠25、26、27）。最后位于各小鼠左肋侧的27个肿瘤用作内对照，并仅接受生理盐水。
以这样的方式选择不同混悬液的浓度（对于混悬液1和3为10mg ml-1，以及对于混悬液2为20mg ml-1）从而它们在水中产生相似的加热性质。这些浓度代表包含在一毫升水中磁赤铁矿的量。它们以三种不同的方式进行估计，通过在480nm处测量不同混悬液的吸光度、通过冻干后称量纳米颗粒或磁小体的量或通过使用SQUID磁强计测量（Alphandéry等人，J.Phys.Chem.C，2008,112,12304-12309）来测量沉积在基底顶上的20μl各混悬液的饱和磁化强度。这三种不同类型的测量产生对含有个体磁小体和SPION的混悬液浓度相同的估计。对于含有磁小体的链的混悬液，包围细菌磁小体的生物材料的存在导致通过吸光度和冻干对磁赤铁矿浓度的高估。因此使用SQUID测量确定这些混悬液的浓度。对于用全趋磁细菌的治疗，注射的细菌浓度为100μl中108个细胞。
选择这样的细菌细胞浓度使得其产生与混悬液2相同的氧化铁浓度。
在第一次注射后30天收集的皮下肿瘤、肝、肾和肺中进行组织学检查。样品在10%福尔马林溶液中固定、石蜡包埋并切成厚度4μΜ的片。用苏木素-伊红（HE）和普鲁士蓝对切片进行染色来检测染成蓝色的细菌磁小体的存在。在位于小鼠右侧肋的肿瘤病理切片中评价赘生细胞的坏死、在非坏死区域中400×放大时每3个随机选择的视野有丝分裂的数目以及色素细胞的量。
为了阐明组织学检查和研究磁小体在肿瘤细胞中的内在化，5.105乳腺癌细胞（MDA-MB-231系）已接种在显微镜盖玻片上。在37℃下5%CO2中生长48小时。没有或存在0.6mT的磁场时，进一步在各种磁小体的混悬液存在时将细胞处理1至24小时。使用两毫升的两种磁小体的混悬液，其中含有混合于细胞生长培养基中的个体磁小体或磁小体的链。以避免过高的细胞的细胞毒性，两种磁小体混悬液的氧化铁浓度保持在较低水平~130μg.ml-1。治疗后，用PBS洗涤细胞以去除包围细胞的细菌磁小体。然后细胞用5％多聚甲醛进行固定，并在溶液存在时孵育，在铁存在时在普鲁士蓝（Prussian blue）中变得有颜色。这种溶液含有5％亚铁氰化钾和10%盐酸盐（等量）。然后使用空气物镜（×100）观察细胞。调整物镜的聚焦来检测细胞内而不是在细胞表面铁的存在。
结果和讨论：
在第一组小鼠中，注射含有个体磁小体的混悬液并施加交变磁场。因此，在肿瘤小鼠中的温度升高了4℃，从31℃至35℃（图10（c））。加热10分钟后，红外测量显示温度在肿瘤中的蔓延是~0.5cm，其中这个距离是通过测量图10（d）所示的温度分布的半高全宽估计的。治疗的肿瘤的大小的演变显示于图10（e）。治疗随后的30天期间，这些大小在小鼠1至3中增加，表明没有抗肿瘤活性。还可以在小鼠3中通过检查一套三张的照片观察到治疗的肿瘤大小的增加，照片是在治疗当天（D0）、治疗后14天（D14）和治疗后30天（D30）拍的（图11（a））。在这些小鼠中没有抗肿瘤活性进一步通过不接受个体磁小体的肿瘤的行为得以证实（图10（f））。这些肿瘤的大小以与经治疗的肿瘤的速度相似的速度增长（图10（e）和10（f））。当不施加磁场注射混悬液1时（在小鼠4和两只其它小鼠中），肿瘤大小也增加（图10（f））。这些结果共同表明既不是个体磁小体的存在也不是磁场存在时产生的热产生抗肿瘤活性。
位于小鼠2右肋侧的肿瘤的病理学检查进一步证实这个结论。它们显示第一次治疗后30天肿瘤中收集的大量坏死细胞。有丝分裂很多，并表示每所选视野（大小为300μm2）平均12个有丝分裂的重要肿瘤扩增活性。获自右肿瘤的病理切片的普鲁士蓝（Berlin Blue）染色显示出现扩散的暗点（图11（b））。假设这些点来自放大图（图11（c）和11（d））所示的磁小体的聚集。器官的组织学分析显示肝、肾和肺中没有发现个体磁小体。这些器官中不出现个体磁小体表明它们在注射后30天仍然位于肿瘤内，可能是因为它们倾向于聚集。
为了研究个体磁小体是否穿透至癌细胞内，个体磁小体混悬液存在时孵育癌细胞。孵育1小时后，不存在和存在磁场时都只有很少的个体磁小体位于细胞内的迹象。细胞孵育24小时后，不存在和存在磁场时都没有观察到更多的个体磁小体的迹象。这表明，个体磁小体不易于穿透肿瘤细胞。当它们的确穿透时，它们也不长时间维持在这些细胞内。
在第二组小鼠中，注射含有磁小体的链的混悬液。出乎意料的是，施加磁场比第一组小鼠中观察到的产生更大的温度升高。20分钟内，肿瘤内的温度升高了10℃，从33℃至43℃（图12（a））。此外，红外图像显示穿过肿瘤横截面更大的温度蔓延。图12（b）显示对于磁小体的链，温度分布的半高全宽是0.75cm，表明比个体磁小体更均匀的肿瘤内温度分布。和个体磁小体观察到的行为相反，在这种情况下抗肿瘤活性是明确的。图12（c）显示经治疗的肿瘤的大小没有像在未治疗的肿瘤中所观察到的明显增加（图12（d））。在小鼠5中治疗的肿瘤完全消失，并且在小鼠6中非常显著的大小的减小（图12（c））。通过检查在治疗当天（D0）、治疗后14天（D14）和治疗后30天（D30）拍的一套三张的照片（图13（a）），可以看到小鼠5中经治疗的肿瘤的消失。此外，组织学检查显示在小鼠5中没有肿瘤组织的残留。经治疗的肿瘤的病理学检查显示观察到的有丝分裂的数目是低的（所选300μm2的视野平均4个）表明肿瘤扩增的活性的降低。在小鼠9中以及两个其它小鼠中，当注射磁小体的链的混悬液而不施加磁场时，第一次治疗后的30天内肿瘤大小显著增加（图12（d））。这表明抗肿瘤活性是由于当它们暴露于交变磁场时磁小体的链所释放的热。肿瘤组织的显微照片显示，和个体磁小体相比，磁小体的链的更均匀的分布（图11（d）和13（b））。此外，图13（b）的放大，其显示于图13（c）和13（d）中，显示细胞核周围黑色的区域。这表明，磁小体的链已穿透至细胞内（与实施例4中得出的结论一致的结果）。器官的组织学检查也表明存在零星的磁小体的链，在肝细胞和血管周的肝细胞中检测到，而没有在肾和肺中检测到。尽管在肝细胞中磁小体的链的积累，肝中没有观察到病变。
为了证实获自组织学检查的结果，癌细胞存在时体外孵育磁小体的链。孵育1小时后，不存在和存在磁场时，比个体磁小体观察到更清晰的细胞内磁小体的链的存在。对于24小时的细胞孵育时间，细胞内磁小体的链的存在变得更加明显。存在磁场时，磁小体的链位于细胞核周围，而没有磁场时，磁小体的链更随机分散在不同的细胞区内。这些结果表明，有可能用磁场使用磁小体的链靶向肿瘤细胞。
在第三组小鼠中，SPION的混悬液注射至位于小鼠右肋侧的肿瘤中。磁场的施加产生比磁小体的链所观察到的稍低的温度升高。20分钟内，肿瘤内的温度升高了6℃，从36℃至42℃（图18（a））。通过红外测量估计的温度分布的半高全宽（0.75cm，图18（b））与磁小体的链所观察到的相同。在这种情况下，在小鼠10和12中经治疗的肿瘤的大小非常显著的降低（图18（c）），但是组织学检查显示癌旁淋巴结的存在，表明在这些小鼠中抗肿瘤活性只是部分的。在小鼠11和13中，未治疗的和经治疗的肿瘤的大小以相似的速度增加，没有显示明显的抗肿瘤活性（图18（c）和18（d））。在小鼠14中和两只其它小鼠中，当注射SPION而不施加磁场时，注射后的30天期间肿瘤大小显著增加（图18（d））。如在第二组小鼠中，其中注射磁小体的链的混悬液，有丝分裂的平均数目是低的（所选300μm2的视野，平均5个）并且坏死的活性与对照组中观察到的相当。根据普鲁士蓝染色，染为蓝色的SPION发现于肝中、枯氏细胞、巨噬细胞中以及肺淋巴结窦中。已经观察到SPION在肺中的存在（Zhou等人，Biomaterials,2006,27,2001-2008）。它是潜在毒性的征兆，因此它是对于发展热疗的缺点，比如本公开中所述的。
在第四组小鼠中，包含在100μl PBS中的108个细胞注射到位于小鼠右肋侧的肿瘤中，并施加~80mT的磁场。在这些情况下，20分钟内温度只升高4℃，从33℃到37℃。使用红外测量也观察到温度的升高。在用个体磁小体治疗的组中，治疗后30天期间，经治疗的肿瘤的大小增加。组织学检查揭示在经治疗的肿瘤中着色的区域具有高的有丝分裂活性（所选300μm2的视野，平均15个有丝分裂），表明没有抗肿瘤活性。肝、肾和肺中没有发现趋磁细菌。
从这些结果，我们可以得出以下结论：
（i）当含有个体磁小体、磁小体的链和SPIONCitrate的混悬液注射到小鼠肿瘤中不施加磁场时，没有观察到抗肿瘤活性。
（ii）当个体磁小体在肿瘤中施用来开始治疗时，观察到低的体内加热能力以及没有抗肿瘤活性。考虑到在溶液中观察到的加热能力（实施例2），这是出乎意料的。
（iii）相反，当磁小体的链在肿瘤中施用来开始治疗时，当它们加热时观察到显著的抗肿瘤活性。这种行为可以解释为它们高的体内加热效率、它们在小鼠肿瘤内的均匀分布以及它们穿透到肿瘤细胞内的能力。
（iv）目前用于高热治疗的SPION也显示出抗肿瘤活性。然而，它们的抗肿瘤活性没有磁小体的链所获得的显著。此外，对于SPION混悬液的实验数据是在含有磁小体的链的混悬液所用的两倍的氧化铁浓度下获得的。对于具有相似氧化铁浓度的混悬液，对于施用含有SPION的混悬液，观察到比含有磁小体的链的更低的加热和抗肿瘤效率（实施例6）。
实施例6：
与SPIONPEG和SPIONCitrate相比，通过将趋磁细菌在没有或存在EDTA时培养制备的磁小体的链的加热效率和抗肿瘤活性
比较了提取自趋磁细菌的磁小体的链的加热效率和抗肿瘤活性，其中通过将细菌在没有螯合剂或存在0.4μM EDTA时培养来制备趋磁细菌。此外，这两种类型的细菌磁小体的加热效率和抗肿瘤活性，还与其它组用于实施磁过热的SPIONPEG和SPIONCitrate的进行比较。
材料和方法：
实验操作和实施例5中描述的很相似，除了在这种情况中只在治疗开始时注射一次不同类型的纳米颗粒。含有10mg/ml氧化铁的不同类型的纳米颗粒的100μl四种不同混悬液首先注射至位于小鼠右肋侧的肿瘤中。位于小鼠左肋侧的肿瘤用作内对照。通过施加频率183kHz和场幅43mT的交变磁场开始热诱导的治疗。在一种情况中，即对于EDTA存在时制备的磁小体，磁场强度降低到43mT以下来避免温度超过50℃。以3天的间隔重复3次治疗。治疗后30天期间测量肿瘤的大小来评价治疗效率。
含有提取的磁小体的链、SPIONPEG和SPIONCitrate的混悬液如实施例1中所述进行制备。AMB-1趋磁细菌在存在或不存在0.4μM EDTA时进行培养，并按照和实施例1中所述相同的操作提取磁小体的链。通过不存在EDTA时培养的趋磁细菌制备的磁小体的链被称为“标准磁小体的链”或CM，而那些通过存在0.4μM EDTA时培养的趋磁细菌而制备的称为磁小体-EDTA或CM（EDTA 0.4μM）。磁小体-EDTA特征在于比实施例3中所示的CM更大的磁小体、更长的磁小体的链以及更高的加热能力（当混合在水中时）。
结果和讨论：
当含有CM的1mg混悬液注射至肿瘤中并施加交变磁场时，图14（a）显示4分钟的治疗之后肿瘤内温度达到50℃。治疗后30天期间，图14（b）显示标准化的肿瘤体积（其在经治疗的不同小鼠之间取平均）比未治疗的肿瘤的体积的增加少得多。对于治疗得最高效的小鼠，如在这只小鼠中肿瘤体积变化（图15（b））以及通过治疗后30天拍的该肿瘤照片（图15（a））所指示的，肿瘤完全消失。用CM观察到清楚的抗肿瘤活性。因此，证实了实施例5中出现的结果。当磁小体-EDTA混悬液施用至肿瘤并施加磁场时，通过比较图14（a）和14（c）所观察到的肿瘤内温度比施用CM后升高得更迅速。这种行为与当它们混合在溶液中时磁小体-EDTA具有比CM更高的加热能力的事实一致（实施例3）。然而，尽管磁小体-EDTA显示比CM更好的体内加热能力的事实，它们的抗肿瘤活性更低。事实上，图14（d）显示用磁小体-EDTA治疗的肿瘤的体积比用CM治疗的肿瘤的体积增加得多（图14（b））。
图15描述了小鼠的行为，对于所述小鼠在各组中治疗是最高效的。用CM和用磁小体-EDTA观察到肿瘤的完全消失（图15（c）和15（d）），表明各种长度的磁小体的链的抗肿瘤活性。
当含有SPIONCitrate的1mg混悬液施用至肿瘤中并施加43mT的交变磁场时，图14（e）显示2分钟内温度升高4℃，这比CM（2分钟内12℃）或磁小体-EDTA（2分钟内20℃）所观察到的温度升高低得多。这种情况中，治疗后期间经治疗的肿瘤体积以和未治疗的肿瘤体积相同的速度增加（图14（f））并且治疗后30天期间没有小鼠显示肿瘤的完全消失。对于用SPIONCitrate治疗的典型的小鼠，治疗后30天期间肿瘤仍然在（图15（e）和15（f））。这表明没有磁小体的链参与的高效。对于SPIONPEG的注射，如在图14（g）中所示的施加磁场后小鼠肿瘤内的温度根本不升高，并且治疗后期间没有肿瘤在大小上减小（图14（h）、15（g）和15（h））。
从这些结果，我们可以得出以下结论：
（i）当施用含有相同量的氧化铁的各种纳米颗粒的混悬液时，含有提取的磁小体的链的混悬液显示比含有SPIONPEG和SPIONCitrate的那些更好的加热效率以及抗肿瘤活性。
（ii）与磁小体-EDTA相比，CM产生的更高的抗肿瘤活性可解释为比磁小体-EDTA更好的CM的细胞内吸收。这最有可能是由于这两种类型磁小体之间的长度差异。由于细胞内过热被认为是比细胞外过热更高效的细胞破坏机制，这两种类型磁小体之间内在化的这种差异可以解释抗肿瘤活性的差异。
实施例7：
小鼠中各种细菌磁小体的生物分布
在本实施例中，研究了注射后立即、3天、6天或14天，小鼠不同器官内包含的各种类型颗粒（磁小体的链、个体磁小体、SPIONCitrate和SPIONPEG）的生物分布。对于本研究，含有1mg上述各类型纳米颗粒的各种混悬液肿瘤内注射，即直接在小鼠肿瘤内。
我们只显示肿瘤内和小鼠排泄物中的颗粒百分比，因为颗粒基本上在这些地方发现。为了估计肿瘤内颗粒的百分比，进行了两种磁测量（MIAtek和SQUID）。除了这两种类型的测量，对于施加交变磁场下加热的肿瘤离体测量了各种颗粒的特定吸收率（SAR）。由于SAR与加热的颗粒的量成反比（见实施例2），这种测量使得能够估计注射于肿瘤中的颗粒的量。
材料和方法：
如实施例5中之前所报道的进行人乳腺肿瘤的诱导。简言之，54只六周龄的雌性瑞士裸鼠（Charles River,Arbresle,France）在左和右两侧接受两百万个MDAMB231人乳腺癌细胞的皮下注射（Cailleau等人，J.Natl.Cancer Inst.,1974,53,661-674）。肿瘤移植后14天进行各种类型颗粒的注射。以10mg Fe/mL的浓度制备磁小体的链、个体磁小体、SPIONCitrate和SPIONPEG的混悬液（Micromod,Rostock-Warnemuende,Germany）。以1mg磁赤铁矿的剂量将100μl这些混悬液直接注射于位于右肋侧的肿瘤中。在注射当天（0天，D0）、注射后3天（3天，D3）、注射后6天（6天，D6）或注射后14天（14天，D14）测量包含在小鼠不同器官中的磁赤铁矿的量。在不同天（D0、D3、D6或D14），通过颈椎脱臼法处死动物，并立即收集兴趣组织或器官（血、肝、脾、肺、肾、肿瘤、排泄物），称重并在4℃时冷冻直至分析。首先，离体测试含有各种类型颗粒的并在不同天收集的不同肿瘤的加热效率。对此，肿瘤组织插入管中，然后置于线圈中，在其中施加20分钟频率183kHz和场强43mT的交变磁场（EasyHeat 10kW,Ambrell,Soultz,France）。使用可植入的热电偶微探针（IT-18,Physitemp,Clifton,USA）测量肿瘤内的温度变化。然后，使用设备
Figure BDA00001844721300381
确定磁赤铁矿的量，设备是由公司Magnisense开发的（Nikitin等人，2007,J.Magn.Mater.311,445）。这种技术使得能够在生物靶中对磁性纳米颗粒进行灵敏的检测和准确的定量。对于用的测量，在超纯水中通过机械匀浆制备组织（16%排泄物湿重，即100mlPBS中16g排泄物，25%肿瘤湿重，50%肾，肺、脾湿重以及100%肝脏湿重）。100μl以这种方式制备的组织置于检测系统中
Figure BDA00001844721300383
通过测量含有混合于水中的磁小体的链、个体磁小体、SPIONCitrate和SPIONPEG的混悬液的信号，作为这些混悬液的磁赤铁矿浓度（浓度从15μg/mL至125μg/mL之间不等）的函数进行校准。为了验证用对磁赤铁矿浓度的估计，在含有最高磁赤铁矿百分比的样本上（肿瘤和排泄物）进行SQUID测量。对此，估计了含有各种类型颗粒的不同肿瘤和排泄物的饱和磁化强度。根据这种估计，使用体磁赤铁矿的饱和磁化强度（80emu/g）我们可以推导出现在不同样本中磁赤铁矿的量。从
Figure BDA00001844721300386
测量推导的估计与根据SQUID测量推导的那些比较。最后，对含有各种类型颗粒的不同肿瘤在施加频率183kHz和场强43mT的交变磁场下进行离体加热。根据加热曲线，我们可以通过测量25°C处的斜率推导SAR，因此包含在不同肿瘤中磁赤铁矿的量（实施例2）。
通过肿瘤内颗粒的匀浆之后收集五分之一总肿瘤体积获得对包含在不同肿瘤中磁赤铁矿的量的估计。最有可能是因为非均匀的匀浆，收集的肿瘤不含有注射的各种类型的颗粒的量的五分之一。这导致测量中大的误差条，并且在一些情况中，检测肿瘤中比注射的量更多的颗粒。然而，尽管这些不确定性，在本研究中得出的主要结论仍然有效。
结果与讨论：
图16（a）显示在注射后立即（D0）、注射后3天（D3）、注射后6天（D6）或注射后14天（D14）磁小体的链在肿瘤中的生物分布（估计为每克组织注射剂量的百分比）。三种类型的测量（SAR和SQUID）显示基本上相同的趋势：注射后期间包含在肿瘤中的磁小体的链的百分比快速降低（图16（a））。实际上磁小体的链的90%以上在注射后14天已被排除。磁小体的链基本上在排泄物中发现，注射后第一天排泄物中10-15%以及注射后3天、6天、14天15至20%（图16（b））。磁小体的链，排除途径显示为基本上是排泄物。注射后的第三和第六天，只有很少迹象的磁小体的链（<0.1%ID/g组织）发现于肺、肾、肝和脾中。血中未发现磁小体的链。这些结果表明，磁小体的链迅速以其天然形式迅速排出。
对于个体磁小体的注射，注射后不同天的每克组织注射剂量（I.D.）的百分比显示在图16（c）中。对于磁小体的链，三种不同类型的测量（SAR和SQUID）之间有相对较好的一致性。治疗后期间包含在肿瘤中的个体磁小体的百分比似乎降低得没有磁小体的链的显著（图16（a）和16（c））。对于磁小体的链，个体磁小体发现于排泄物中但是百分比更低（在D3、D6和D14，5至10%）。个体磁小体排除的途径似乎（至少部分）也是排泄物排泄。
还研究了化学合成SPIONCitrate和SPIONPEG的生物分布。如图16（e）和16（g）所示，注射后14天SPIONCitrate和SPIONPEG似乎留在肿瘤中。治疗后期间纳米颗粒在肿瘤中的百分比不像磁小体的链那样显著的降低。此外，SPIONCitrate和SPIONPEG没有在小鼠排泄物中检测到。这些结果可以解释为这样的事实SPIONCitrate和SPIONPEG以游离铁的形式代谢因此在排泄物中不以纳米颗粒的形式排除。和磁小体相比，宁愿这是这些化学合成的纳米颗粒的缺点，因为游离铁可引起氧化压力（Puntarulo等人，2005,Mol.Aspects,Med.,299-312）。
从这些结果，我们可以得出以下结论：
磁小体的链迅速离开肿瘤，似乎在排泄物中排除。这些性质都有助于发展本公开所述的热疗。我们可以通过这样的事实常识性地解释这种行为，即磁小体的链不强烈聚集。与磁小体的链相反，注射后14天大比例的个体磁小体仍留在肿瘤中，表明有机体可能发现更难将它们迅速排除。我们可以通过这样的事实常识性地解释这种行为，即个体磁小体聚集。注射后14天大比例的化学合成纳米颗粒（SPIONCitrate和SPION的PEG）仍留在肿瘤中，并且排泄物中没有发现它们。表明这些化学合成纳米颗粒不迅速离开肿瘤，并且它们以铁的形式代谢和/或它们在尿液中排除。这些特征潜在地使得它们不如磁小体的链成为更具吸引力的药物候选者。

Claims (49)

1.细菌磁小体的链，其通过热治疗用于肿瘤的治疗，优选实体肿瘤。
2.根据权利要求1的链，其用于通过热治疗的肿瘤的治疗，其中磁小体的链经受交变磁场来导致热的产生。
3.根据权利要求1或2所述的链，其中所述磁小体的链含有至少2个磁小体，优选2至30个磁小体，更优选4至20个磁小体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的链，其中所述磁小体包含在具有介于10至120nm之间的大小的链中。
5.根据权利要求1-4任一项所述的链，其中所述磁小体的链获自趋磁细菌，趋磁细菌在含有铁和/或其它过渡金属比如钴、镍、铜、锌、锰、铬的生长培养基中培养。
6.根据权利要求1-5任一项所述的链，其中所述磁小体的链获自趋磁细菌，趋磁细菌在含有螯合剂的生长培养基中培养。
7.根据权利要求6所述的链，其中所述螯合剂选自双膦酸、罗丹明和EDTA。
8.根据权利要求1-7任一项所述的链，其中所述磁小体的链具有结合至磁小体和/或并入磁小体的试剂，其中试剂用于使磁小体的链可见。
9.根据权利要求8所述的链，其中所述试剂是荧光团。
10.根据权利要求8所述的链，其中所述试剂是荧光团和螯合剂，优选罗丹明。
11.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述磁小体的链包囊于囊泡中。
12.根据权利要求9所述的链，其中所述囊泡和活性成分组合使用。
13.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述肿瘤细胞或肿瘤的治疗是过热。
14.根据权利要求13所述的链，其中所述治疗的温度介于37℃至45℃之间，优选40℃至45℃之间，最优选在43℃。
15.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述肿瘤细胞或肿瘤的治疗是热消融。
16.根据权利要求15所述的链，其中所述治疗的温度介于约45℃至约100℃之间，优选约45℃至约70℃之间，更优选约45℃至约55℃之间，最优选约50℃至约55℃之间。
17.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述磁场的频率介于50至1000kHz之间。
18.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述磁场的幅介于0.1至200mT之间，优选1至100mT之间，更优选10至50mT之间。
19.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述磁场施加的时间段在1秒至6小时之间，优选1分钟至1小时之间，最优选1分钟至30分钟之间可变。
20.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述加热方法是重复的。
21.根据前述权利要求任一项所述的链，其中通过使用磁场通过磁小体的链进行对肿瘤或肿瘤细胞的靶向。
22.根据前述权利要求任一项所述的链，其中所述对肿瘤或肿瘤细胞的靶向是通过使用抗体和/或叶酸和/或PEG结合至磁小体的链上或结合至含有它们的囊泡上进行的，其特异性识别肿瘤和/或肿瘤细胞。
23.根据前述权利要求任一项所述的链，其中施加所述交变磁场来改善磁小体的链于肿瘤细胞中的穿透。
24.一种用于在有需求的受试者中治疗兴趣细胞或组织的方法，其是通过使用热的产生诱导的治疗，其中使用磁小体的链并且其中这些链经受交变磁场来导致热的产生。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞或组织是肿瘤细胞或肿瘤。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述磁小体的链含有至少2个磁小体。
27.根据权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述磁小体包含在具有介于10至120nm之间，优选10nm至70nm之间，最优选30nm至50nm之间的大小的链中。
28.根据权利要求24-27任一项所述的方法，其中所述磁小体的链获自趋磁细菌，趋磁细菌在含有铁和/或其它过渡金属比如钴、镍、铜、锌、锰、铬的生长培养基中培养。
29.根据权利要求24-28任一项所述的方法，其中所述磁小体的链获自趋磁细菌，趋磁细菌在含有螯合剂的生长培养基中培养。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述螯合剂选自双膦酸、罗丹明和EDTA。
31.根据权利要求24-30任一项所述的方法，其中所述磁小体的链具有结合至磁小体和/或并入磁小体的试剂，其中试剂用于使磁小体的链可见。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述试剂是荧光团。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述试剂是荧光团和螯合剂，优选罗丹明。
34.根据权利要求24-33任一项所述的方法，其中所述磁小体的链包囊于囊泡中。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述囊泡和活性成分组合使用。
36.根据权利要求24-35任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞或肿瘤的治疗是过热。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述治疗的温度介于37℃至45℃之间，优选40℃至45℃之间，最优选在43℃。
38.根据权利要求24-35任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞或肿瘤的治疗是热消融。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述治疗的温度介于约45℃至约100℃之间，优选约45℃至约70℃之间，更优选约45℃至约55℃之间，最优选约50℃至约55℃之间。
40.根据权利要求24-39任一项所述的方法，其中所述磁场的频率介于50至1000kHz之间。
41.根据权利要求24-40任一项所述的方法，其中所述磁场的幅介于0.1至200mT之间，优选1至100mT之间，更优选10至50mT之间。
42.根据权利要求24-41任一项所述的方法，其中所述磁场施加的时间段在1秒至6小时之间，优选1分钟至1小时之间，最优选1分钟至30分钟之间可变。
43.根据权利要求24-42任一项所述的方法，其中所述加热方法是重复的。
44.根据权利要求24-43任一项所述的方法，其中通过使用磁场通过磁小体的链进行对肿瘤或肿瘤细胞的靶向。
45.根据权利要求24-44任一项所述的方法，其中所述对肿瘤或肿瘤细胞的靶向是通过使用抗体和/或叶酸和/或PEG结合至磁小体的链上或结合至含有它们的囊泡上进行的，其特异性识别肿瘤和/或肿瘤细胞。
46.根据权利要求24-45任一项所述的方法，其中施加所述交变磁场来改善磁小体的链于肿瘤细胞中的穿透。
47.一种试剂盒，其包括细菌磁小体的链和装置，装置能够产生交变磁场。
48.根据权利要求47的试剂盒，其中所述磁小体的链包囊在囊泡中。
49.一种用于在趋磁细菌中生产磁小体的链的方法，其中趋磁细菌在含有铁源和螯合剂和/或除铁以外的过渡金属比如钴、镍、铜、锌、锰、铬的生长培养基中培养，其中所述方法使得能够提高磁小体的大小和链的长度，及其加热性质。
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