CN110029050A - 一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置及培养方法，属于趋磁细菌培养条件控制技术领域。本发明所述控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置包括：气体源(1)、西林瓶(2)和过气管(3)；所述气体源(1)包括氮气源和氧气源；所述过气管(3)的进气口与气体源(1)连接；所述过气管(3)的出气口连接有去除活塞的注射器(4)，去除活塞的注射器(4)的针头用于与西林瓶(2)相连；所述去除活塞的注射器(4)内填充棉花(5)。本发明所述装置简单易操作，不但能满足趋磁细菌生长环境中微需氧的要求，而且还可以保证操作过程中细菌不易受到污染。该装置成本低廉，简单易行。

Description

一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置及培养方法
技术领域
本发明涉及趋磁细菌培养条件控制技术领域，具体涉及一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置及趋磁细菌培养方法，即微需氧趋磁细菌生长环境中氧浓度控制的装置及方法。
背景技术
趋磁细菌是一类可以通过生物矿化在体内生成磁小体纳米颗粒的一类菌群。由于磁小体的独特性质，目前关于磁小体的研究已在多个相关领域成为研究热点，对其的开发和应用潜在着巨大的科研价值和商业价值。但是趋磁细菌是一类对生长环境要求较严格的微需氧细菌，即不同于常规的需氧菌群(O2浓度约为20％)，又有别于厌氧菌群(不需要O2)，其生长所需的氧浓度只有1％左右。如果不能精确控制其生长环境中的氧浓度，会直接影响到磁小体的合成。因此，对其生长环境中氧浓度的控制是培养这类细菌需要解决的首要关键问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置及趋磁细菌培养方法。本发明所述装置简单易操作，不但能满足趋磁细菌生长环境中微需氧的要求，而且还可以保证操作过程中细菌不易受到污染。该装置成本低廉，简单易行。
本发明提供了一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置，所述装置包括：气体源1、西林瓶2和过气管3；所述气体源1包括氮气源和氧气源；所述过气管3的进气口与气体源1连接；所述过气管3的出气口连接有去除活塞的注射器4，去除活塞的注射器4的针头用于与西林瓶2相连；所述去除活塞的注射器4内填充棉花5。
优选的是，所述过气管3的出气口有一个或多个，每个出气口分别与一个西林瓶2相连。
优选的是，所述过气管3的材质包括橡胶或硅胶。
优选的是，所述过气管3包括一体成型的过气管，或通过三通管或直角弯管连接多段过气管得到的过气管。
优选的是，所述西林瓶2包括瓶身和瓶盖，所述瓶盖包括丁基橡胶瓶塞和铝塑瓶盖。
优选的是，所述装置还包括用于固定过气管3的支架和夹子。
优选的是，所述装置还包括针头延长软管。
本发明还提供了基于上述技术方案所述装置的趋磁细菌的培养方法，包括以下步骤：
1)打开西林瓶的瓶盖，在西林瓶中注入趋磁细菌生长培养基，将所述过气管的进气口与氮气源连接，将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头通入所述趋磁细菌生长培养基中通入氮气20～40min，盖好瓶盖密封西林瓶，得到除去溶解氧气的第一培养基；
2)将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，插入西林瓶的丁基橡胶塞上，并立即插入另一个干净的针头，向西林瓶内通入氮气20～40min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到排除氧气的已灭菌第二培养基；
3)取另一个西林瓶，将氧气源与过气管连接，将过气管出气口去除活塞的注射器的针头插入该西林瓶，并立即插入另一个干净的针头，通入氧气10～30min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到含纯氧气的西林瓶；
4)使用无菌注射器，从步骤3)所述含纯氧气的西林瓶中吸取西林瓶体积1％的氧气，注入步骤2)所述排除氧气的第二培养基中，使用无菌注射器接种趋磁细菌，30～32℃孵育2～4h，28～30℃培养4～7d，得到趋磁细菌培养物；
所述步骤3)与所述步骤1)没有时间先后顺序的限制。
优选的是，步骤1)所述趋磁细菌培养基生长培养基以水为溶剂，每1L水添加10.0mL维生素补充溶液，5.0mL微量矿物质补充溶液，0.68g KH2PO4，0.848g琥珀酸钠六水合物，0.575g酒石酸二钠二水合物，0.083g三水合乙酸钠，0.45mL质量浓度为0.1％的水性刃天青，0.17g NaNO3，0.04g抗坏血酸和3.0mL浓度为10mM的喹啉铁储备溶液；
所述维生素补充溶液为每1L水包括生物素2.0mg、叶酸2.0mg，盐酸吡哆醇10mg，盐酸硫胺素5.0mg、核黄素5.0mg、烟酸5.0mg、D-泛酸钙5.0mg、对氨基苯甲酸5.0mg、硫辛酸5.0mg，维生素B120.1mg。
所述微量矿物质补充溶液由以下制备方法制备得到：先向1L水中溶解次氮基三乙酸1.5g，并用氢氧化钾溶液调节至pH值为6.5，然后加入MgSO4·7H2O 3g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoSO4·7H2O 0.18g，CaCl2·2H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.18g，CuSO4·5H2O 0.01g，Kal(SO4)2·12H2O 0.02g，H3BO30.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g，NiCl2·6H2O 0.03g，Na2SeO3·5H2O 0.3g和Na2WO4·2H2O 0.4g；最后用氢氧化钾溶液调节至pH值为7.0。
所述喹啉铁储备溶液的制备方法包括：将1.9g奎尼酸溶解在1L水中，然后加入4.5g FeCl3·6H2O，搅拌溶解，通过0.02μm针筒式滤膜过滤器过滤灭菌。
优选的是，步骤4)所述注入的同时，立即插入另一个干净的针头，注入后，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头。
本发明提供了一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置。本发明所述装置简单易操作，不但能满足趋磁细菌生长环境中微需氧的要求，而且还可以保证操作过程中细菌不易受到污染。该装置成本低廉，简单易行。试验结果表明，本发明所述装置能够精确控制培养瓶中用于趋磁细菌生长环境的氧气浓度，对趋磁细菌生长所需1％氧浓度的特殊环境可以更加精准地控制，从而很好地模拟了这类细菌的微需氧环境，因此也可以使细菌充分合成自身所需的磁小体；此外，利用本发明所述装置，不用洁净工作台就能做到杜绝趋磁细菌培养过程的污染问题，因此对接种等实验环节的环境要求大大减低。
附图说明
图1为本发明提供的氮气工作站的结构示意图；
图2为本发明提供的培养趋磁细菌所用西林瓶及配套附件的结构示意图；
图3为本发明提供的培养出的趋磁细菌AMB-1的电子显微镜图；
图4为本发明提供的培养出的趋磁细菌AMB-1的电子显微镜图中局部放大后的磁小体图；
图5为本发明提供的磁小体粒径统计图；
图6为本发明提供的磁小体膜厚度统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置，所述装置包括：气体源1、西林瓶2和过气管3；所述气体源1包括氮气源和氧气源；所述过气管3的进气口与气体源1连接；所述过气管3的出气口连接有去除活塞的注射器4，去除活塞的注射器4的针头用于与西林瓶2相连；所述去除活塞的注射器4内填充棉花5。
本发明所述控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置如图1所示，其中，1为气体源，2为西林瓶，3为过气管，4为去除活塞的注射器，5为棉花。
本发明对所述西林瓶的大小和性状没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的西林瓶即可。在本发明具体实施例中，为了方便计算，所述西林瓶优选选取总体积为100mL的西林瓶。在本发明中，所述西林瓶2包括瓶身和瓶盖，所述瓶盖优选包括橡胶瓶塞和铝塑瓶盖，更优选包括丁基橡胶瓶塞和铝塑瓶盖。本发明对所述丁基橡胶瓶盖和铝塑瓶盖没有特殊限定，采用西林瓶常规瓶盖即可。本发明优选在适当的时候用压盖钳、丁基橡胶塞及中空铝盖将西林瓶密封。本发明所述西林瓶优选为平底西林瓶，具体的结构如图2所示。
在本发明中，所述过气管3的出气口有一个或多个，每个出气口分别与一个西林瓶2相连。在本发明中，所述过气管3的材质包括橡胶或硅胶。在本发明中，所述过气管3包括一体成型的过气管，或通过三通管或直角弯管连接多段过气管得到的过气管。当所述过气管是通过三通管或直角弯管连接多段过气管得到时，所述三通管的数量优选为多个，所述直角弯管的数量优选为1个，三通管和直角弯管的总量与西林瓶的瓶数一致。在本发明中，所述过气管的安装方法优选包括以下步骤：①过气管的连接：过气管一端连接氮气罐出气口，另一端连接第一个三通管的水平出口端；第一个三通管的另一个水平出口端连接另一个过气管，以此类推，直至连接到最后一个直角弯管后，取新的过气管分别连接于上述三通管的垂直出口端；②将连接后的导气管装置安装在支架上，并用平行夹子固定；③将数个1ml容量一次性注射器(保留针头、去除活塞)用剪刀剪去外套卷边后，松散填入医用棉花，然后逐个与上述过气管的出气口端连接；④用肥皂水检查各个接口有无漏气，如有必要可用特氟龙胶带加以封闭，确保没有氮气泄露。
本发明所述过气管3的出气口连接有去除活塞的注射器4，去除活塞的注射器4的针头用于与西林瓶2相连。本发明所述注射器保留针头、去除活塞，优选用剪刀剪去外套卷边后，松散填入医用棉花，然后将减去外套卷边的一端连接导气管，另一端含针头的一端用于与西林瓶连接。本发明对所述注射器没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售无菌注射器即可。当所述西林瓶的体积为100mL时，所述注射器优选为1mL规格的注射器，相应的，所述注射器的针头优选长度为2.5cm。在本发明中，所述注射器优选大于等于23G(G：Gauge，国际型号，对应国内6号针头)，避免因针头过大而在塞子上留下永久性的不可密封的孔。
在本发明中，所述装置还包括用于固定过气管3的支架和夹子。
本发明还提供了基于上述技术方案所述装置的趋磁细菌的培养方法，包括以下步骤：
1)打开西林瓶的瓶盖，在西林瓶中注入趋磁细菌生长培养基，将所述过气管的进气口与氮气源连接，将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头通入所述趋磁细菌生长培养基中通入氮气20～40min，盖好瓶盖密封西林瓶，得到除去溶解氧气的第一培养基；
2)将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，插入西林瓶的丁基橡胶塞上，并立即插入另一个干净的针头，向西林瓶内通入氮气20～40min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到排除氧气的已灭菌第二培养基；
3)取另一个西林瓶，将氧气源与过气管连接，将过气管出气口去除活塞的注射器的针头插入该西林瓶，并立即插入另一个干净的针头，通入氧气10～30min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到含纯氧气的西林瓶；
4)使用无菌注射器，从步骤3)所述含纯氧气的西林瓶中吸取西林瓶体积1％的氧气，注入步骤2)所述排除氧气的第二培养基中，使用无菌注射器接种趋磁细菌，30～32℃孵育2～4h，28～30℃培养4～7d，得到趋磁细菌培养物；
所述步骤3)与所述步骤1)没有时间先后顺序的限制。
本发明打开西林瓶的瓶盖，在西林瓶中注入趋磁细菌生长培养基，将所述过气管的进气口与氮气源连接，将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头通入所述趋磁细菌生长培养基中通入氮气20～40min，盖好瓶盖密封西林瓶，得到除去溶解氧气的第一培养基。优选的，本发明通入氮气30min。在本发明中，所述密封优选为用压盖钳及中空铝盖将西林瓶瓶口密封。在本发明中，所述趋磁细菌培养基生长培养基以水为溶剂，每1L水添加10.0mL维生素补充溶液，5.0mL微量矿物质补充溶液，0.68g KH2PO4，0.848g琥珀酸钠六水合物，0.575g酒石酸二钠二水合物，0.083g三水合乙酸钠，0.45mL质量浓度为0.1％的水性刃天青，0.17g NaNO3，0.04g抗坏血酸和3.0mL浓度为10mM的喹啉铁储备溶液。在本发明中，所述水优选为超纯水。所述维生素补充溶液优选为每1L水包括生物素2.0mg、叶酸2.0mg，盐酸吡哆醇10mg，盐酸硫胺素5.0mg、核黄素5.0mg、烟酸5.0mg、D-泛酸钙5.0mg、对氨基苯甲酸5.0mg、硫辛酸5.0mg，维生素B120.1mg；所述微量矿物质补充溶液由以下制备方法制备得到：先向1L水中溶解次氮基三乙酸1.5g，并用氢氧化钾溶液调节至pH值为6.5，然后加入MgSO4·7H2O 3g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoSO4·7H2O 0.18g，CaCl2·2H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.18g，CuSO4·5H2O 0.01g，Kal(SO4)2·12H2O 0.02g，H3BO30.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g，NiCl2·6H2O 0.03g，Na2SeO3·5H2O 0.3g和Na2WO4·2H2O0.4g；最后用氢氧化钾溶液调节至pH值为7.0；所述喹啉铁储备溶液的制备方法包括：将1.9g奎尼酸溶解在1L水中，然后加入4.5g FeCl3·6H2O，搅拌溶解，通过0.02μm针筒式滤膜过滤器过滤灭菌。在本发明中，所述维生素补充溶液、所述微量矿物质补充溶液和所述喹啉铁储备溶液中的水优选为超纯水。本发明优选将喹啉铁储备溶液在室温下避光储存，作为无菌储备溶液，当沉淀物变得明显时丢弃溶液。在本发明中，所述趋磁细菌培养基生长培养基在制备过程中，优选进行搅拌。在本发明中，所述微量矿物质补充溶液和喹啉铁(III)储备溶液需要保持无菌，为避免污染，使用时使用标准无菌技术(使用本生灯打开瓶子顶部)并使用无菌移液器吸头进行分配。本发明优选将微量矿物质补充溶液和维生素补充溶液储存在4℃的冰箱中。在本发明中，所述趋磁细菌培养基生长培养基的pH值优选为6.75，本发明所述pH值条件优选采用1M的NaOH。当所述西林瓶的体积为100mL时，西林瓶中优选注入50～80mL趋磁细菌生长培养基，更优选为60mL。本发明在将所述过气管出气口的针头通入所述趋磁细菌生长培养基中通入氮气时，优选将针头深入趋磁细菌生长培养基液面下，当本发明所述针头不够长时，优选使用无菌针头延长软管进行操作，在本发明具体实施例中，所述针头延长软管的长度优选为10～15cm，更优选为10cm；本发明在将所述过气管出气口的针头通入所述趋磁细菌生长培养基中通入氮气时，优选在西林瓶顶部放置丁基橡胶塞，留下一个小开口以允许多余气体排出瓶子。在本发明中，用氮气鼓泡时可能会形成泡沫，本发明优选通过相应地调节气流以避免泡沫产生。
得到排除氧气的第一培养基后，将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，插入西林瓶的丁基橡胶塞上，并立即插入另一个干净的针头，向西林瓶内通入氮气20～40min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到排除氧气的已灭菌第二培养基。本发明向西林瓶内融入氮气能够驱逐西林瓶中残留的氧气。在本发明中，所述氮气的通入速度优选为50mL/min。本发明在向西林瓶中通入氮气时，优选立即将另一个干净的针头插入同一西林瓶的丁基橡胶塞中，以使多余气体排出，最终用氮气替换瓶子中的空气。取下通入氮气的针头后，等待几秒钟，直到介质瓶中的压力降至大气压并移除第二个针头。为防止O2在排除氧气后重新进入西林瓶培养基中，优选快速连续操作。
本发明取另一个西林瓶，将氧气源与过气管连接，将过气管出气口去除活塞的注射器的针头插入该西林瓶，并立即插入另一个干净的针头，通入氧气10～30min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到含纯氧气的西林瓶。
本发明使用无菌注射器，从所述含纯氧气的西林瓶中吸取西林瓶体积1％的氧气，注入所述排除氧气的第二培养基中，使用无菌注射器接种趋磁细菌，30～32℃孵育2～4h，28～30℃培养4～7d，得到趋磁细菌培养物。本发明优选在30℃孵育3h，29℃培养5d。本发明在注入氧气时，优选在丁基橡胶塞插入一个针头利于多余气体排出，待操作完成后立即将针头拔出以防止气体外泄。在本发明中，如果接种来自西林瓶中生长的趋磁细菌，需要对含新鲜趋磁细菌生长培养基的西林瓶和旧培养瓶的塞子上滴几滴70％乙醇溶液并使它们通过本生灯的火焰进行灭菌，并将趋磁细菌培养物接种到新鲜趋磁细菌生长培养基中。如果接种冻存管的趋磁细菌，只需将其冻存管温热至室温，同时将冻存管密封在本生灯的火焰下，并每100mL的西林瓶中仅接种0.1mL以稀释冷冻过程中使用的甘油或二甲基亚砜(DMSO)；在这两种情况下，使用无菌针头和无菌注射器。在本发明中，所述趋磁细菌优选包括趋磁细菌AMB-1(Magnetospirillum magneticum(700264TM))。
在趋磁细菌培养过程中，本发明优选观察趋磁细菌的生长情况，本发明所述观察的方法优选包括：①在本生灯的火焰下，使用无菌针头和无菌注射器抽取趋磁细菌；②使用悬滴法(确保细菌AMB-1既有磁性又有运动性)将趋磁细菌滴于显微镜下进行观察，本发明所述显微镜优选包括相差显微镜放大倍数10X至60X较合适；③本发明优选使用透射电子显微镜(TEM)详细观察细胞结构和磁小体。
在本发明中，各步骤操作为无菌操作；所述无菌操作优选包括利用本生灯灭菌。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置及趋磁细菌培养方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
趋磁细菌生长环境中控制氧浓度的方法，包括下列步骤：
步骤A：装置设计及安装；具体部件有：氮气罐、工作台、实验室方座支架(带平行夹)、橡胶过气管(长)、5cm过气管(数个)、20cm过气管(数个)、支架、三通管(数个)、直角弯管、1mL容量一次性注射器(保留针头、去除活塞，填入棉花，数个)、10cm针头延长软管(数个)、西林瓶(直径52mm，高95mm，总体积100mL，口部直径20mm，平底)、20mm丁基橡胶瓶塞及同规格铝塑瓶盖、同规格压盖钳。
安装方法：
①橡胶过气管的连接：橡胶过气管(长)一端连接氮气罐出气口，另一端连接第一个三通管的水平出口端；第一个三通管的另一个水平出口端连接第一个5cm过气管，以此类推，直至连接到最后一个直角弯管后，将20cm过气管分别于上述连接三通管的垂直出口端。
②将连接后的导气管装置安装在实验室方座支架上，并用平行夹固定。
③将数个1mL容量一次性注射器(保留针头、去除活塞)用剪刀剪去外套卷边后，松散填入医用棉花，然后逐个与上述20cm过气管的出气口连接。
④用肥皂水检查各个接口有无漏气，如有必要可用特氟龙胶带加以封闭，确保没有氮气泄露。
步骤B：趋磁细菌生长培养基的制备；
①准备10mM喹啉铁储备溶液。将1.9g奎尼酸溶解在1L超纯水中，然后加入4.5gFeCl3·6H2O，搅拌溶解，通过0.02μm针筒式滤膜过滤器过滤灭菌。使用标准循环(即在121℃下高压灭菌15min)。
注意：将喹啉铁储备溶液在室温下避光储存，作为无菌储备溶液，当沉淀物变得明显时丢弃溶液。
②在含有1L超纯水的烧杯中，在搅拌下依次加入以下物质：10.0mL维生素补充溶液，5.0mL微量矿物质补充溶液，0.68g KH2PO4，0.848g琥珀酸钠六水合物，0.575g酒石酸二钠二水合物，0.083g三水合乙酸钠，0.45mL 0.1％水性刃天青，0.17g NaNO3，0.04g抗坏血酸和3.0mL 10mM喹啉铁(III)储备溶液。
注意：微量矿物质补充溶液和喹啉铁(III)储备溶液需要保持无菌。为避免污染，使用时使用标准无菌技术(使用本生灯打开瓶子顶部)并使用无菌移液器吸头进行分配。将矿物质和维生素溶液储存在4℃的冰箱中。
③加入所有化学药品后，用1MNaOH溶液调节pH至6.75。将新鲜制备的培养基分配到100mL西林瓶中，每瓶倒入60mL培养基。
④使用连接到步骤A中所述装置的针头上的15cm针头延长软管将氮气吹入培养基中30min以除去溶解的O2。在每个瓶的顶部放置丁基橡胶塞，留下一个小开口以允许多余的气体从瓶子中退出。
注意：用氮气鼓泡时可能会形成泡沫，相应地调节气流以避免泡沫产生。
⑤使用准备好的丁基橡胶塞和铝塑瓶盖密封及同规格压盖钳每个瓶子。
⑥从氮气工作站断开针和细管，并更换干净的针(长2.5cm，≥23G)插入密闭西林瓶的橡胶塞。调节氮气罐的阀门，使温和连续的氮气气体驱逐西林瓶中残留的氧气(约50mL/min)。立即将另一个干净的针头插入同一个瓶子中。对其他瓶子重复此步骤，让氮气流动约25min，用氮气替换瓶子中的空气。
注意：小于23G的针头可能会在塞子上留下永久性的不可密封的孔。
⑦通过取下相应的针头将西林瓶从氮气站断开。等待几秒钟，直到西林瓶中的压力降至大气压并移除第二个针头。对所有剩余的瓶子重复此步骤。
注意：为防止O2在步骤B④后重新进入西林瓶培养基中，应快速连续执行步骤B④-⑦。如果所有瓶子不能同时连接到本发明装置，请按照步骤B④-⑦对第一组瓶子进行操作，然后对剩余的瓶子重复这些步骤。
⑧高压灭菌步骤B⑦中的瓶子，使其冷却至室温，然后在室温下储存。
步骤C：接种趋磁细菌AMB-1。
注意：在本生灯的火焰下，无菌条件执行除①以外的以下所有步骤。
①使用丁基橡胶塞和压盖钳，密封一只空的100mL西林瓶。将本发明所述装置与氧气罐连接，将所述装置的针头插入瓶中，并在丁基橡胶塞上插入另一根针用于排气。
②让O2流过瓶子约30min，以确保瓶子中的所有空气都被O2取代。取下注射器的针头和另一针头，在瓶中稍微过压，然后进行高压灭菌。使用前让瓶子冷却至室温。
注意：为节省时间，在培养基准备期间执行步骤C①-②，并将西林瓶与培养基或储备溶液一起高压灭菌。
③对新鲜培养基西林瓶和步骤C②中盛有O2西林瓶的塞子顶部加几滴70％乙醇溶液，然后通过本生灯的火焰进行消毒。
④使用无菌注射器和针头，从步骤C②中盛有O2西林瓶中提取1mL O2并将其转移到步骤B⑧得到的盛有新鲜培养基的西林瓶中。在此步骤中，确保将针头紧紧地贴在注射器上，以避免注射器中有任何空气。
⑤如果接种来自西林瓶中生长的AMB-1，需要对新鲜培养基西林瓶和旧培养瓶的塞子上滴几滴70％乙醇溶液并使它们通过本生灯的火焰进行灭菌，并将1mL较旧的AMB-1培养物接种到新鲜培养基中。如果接种冻存管的AMB-1，只需将其冻存管温热至室温，同时将冻存管密封在本生灯的火焰下，并仅接种0.1mL以稀释冷冻过程中使用的甘油或二甲基亚砜(DMSO)。在这两种情况下，使用无菌针头和无菌注射器。
⑥将AMB-1培养物在30℃孵育4h，30℃培养5d，后接种到新鲜培养基中。
步骤D：观察AMB-1生长情况。
①在本生灯的火焰下，使用无菌针头和无菌注射器提取细菌AMB-1。
②使用悬滴法确保细菌AMB-1既有磁性又有运动性。
使用相差显微镜，放大倍数10X至60X较合适。
③使用透射电子显微镜(TEM)详细观察细胞结构和磁小体，观察结果如图3和图4所示。
图5为磁小体粒径统计图，磁小体粒径统计分析显示粒径为46.72±5.87nm；图6为磁小体膜厚度统计图，磁小体膜厚度统计分析显示厚度为5.02±1.15nm。由图3～6可知，磁小体呈链状排列，大小约46.72±5.87nm，其外可见膜状结构，其膜的厚度约为5.02±1.15nm。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种控制趋磁细菌培养过程氧浓度的装置，其特征在于，所述装置包括：气体源(1)、西林瓶(2)和过气管(3)；所述气体源(1)包括氮气源和氧气源；所述过气管(3)的进气口与气体源(1)连接；所述过气管(3)的出气口连接有去除活塞的注射器(4)，去除活塞的注射器(4)的针头用于与西林瓶(2)相连；所述去除活塞的注射器(4)内填充棉花(5)。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过气管(3)的出气口有一个或多个，每个出气口分别与一个西林瓶(2)相连。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过气管(3)的材质包括橡胶或硅胶。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过气管(3)包括一体成型的过气管；或通过三通管或直角弯管连接多段过气管得到的过气管。
5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述西林瓶(2)包括瓶身和瓶盖，所述瓶盖包括丁基橡胶瓶塞和铝塑瓶盖。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括用于固定过气管(3)的支架和夹子。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括针头延长软管。
8.基于权利要求1～7任一项所述装置的趋磁细菌的培养方法，包括以下步骤：
1)打开西林瓶的瓶盖，在西林瓶中注入趋磁细菌生长培养基，将所述过气管的进气口与氮气源连接，将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头通入所述趋磁细菌生长培养基中通入氮气20～40min，盖好瓶盖密封西林瓶，得到除去溶解氧气的第一培养基；
2)将所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，插入西林瓶的丁基橡胶塞上，并立即插入另一个干净的针头，向西林瓶内通入氮气20～40min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到排除氧气的已灭菌第二培养基；
3)取另一个西林瓶，将氧气源与过气管连接，将过气管出气口去除活塞的注射器的针头插入该西林瓶，并立即插入另一个干净的针头，通入氧气10～30min，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头，高压灭菌，得到含纯氧气的西林瓶；
4)使用无菌注射器，从步骤3)所述含纯氧气的西林瓶中吸取西林瓶体积1％的氧气，注入步骤2)所述排除氧气的第二培养基中，使用无菌注射器接种趋磁细菌，30～32℃孵育2～4h，28～30℃培养4～7d，得到趋磁细菌培养物；
所述步骤3)与所述步骤1)没有时间先后顺序的限制。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤1)所述趋磁细菌培养基生长培养基以水为溶剂，每1L水添加10.0mL维生素补充溶液，5.0mL微量矿物质补充溶液，0.68gKH2PO4，0.848g琥珀酸钠六水合物，0.575g酒石酸二钠二水合物，0.083g三水合乙酸钠，0.45mL质量浓度为0.1％的水性刃天青，0.17g NaNO3，0.04g抗坏血酸和3.0mL浓度为10mM的喹啉铁储备溶液；
所述维生素补充溶液为每1L水包括生物素2.0mg、叶酸2.0mg，盐酸吡哆醇10mg，盐酸硫胺素5.0mg、核黄素5.0mg、烟酸5.0mg、D-泛酸钙5.0mg、对氨基苯甲酸5.0mg、硫辛酸5.0mg，维生素B120.1mg；
所述微量矿物质补充溶液由以下制备方法制备得到：先向1L水中溶解次氮基三乙酸1.5g，并用氢氧化钾溶液调节至pH值为6.5，然后加入MgSO4·7 H2O3g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，FeSO4·7 H2O 0.1g，CoSO4·7H2O 0.18g，CaCl2·2 H2O 0.1g，ZnSO4·7 H2O0.18g，CuSO4·5 H2O 0.01g，Kal(SO4)2·12H2O 0.02g，H3BO3 0.01g，Na2MoO4·2 H2O0.01g，NiCl2·6 H2O 0.03g，Na2SeO3·5 H2O0.3g和Na2WO4·2 H2O0.4g；最后用氢氧化钾溶液调节至pH值为7.0；
所述喹啉铁储备溶液的制备方法包括：将1.9g奎尼酸溶解在1L水中，然后加入4.5gFeCl3·6H2O，搅拌溶解，通过0.02μm针筒式滤膜过滤器过滤灭菌。
10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤4)所述注入的同时，立即插入另一个干净的针头，注入后，先拔出所述过气管出气口去除活塞的注射器的针头，西林瓶中的培养基压力降至大气压后再移除另一个针头。
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