CN104211753B - 一种细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌纳米磁小体‑糖鞘脂复合物及其制备方法与应用，属于分离领域和医药领域。本发明提供的BMPs‑糖鞘脂复合物，是先用表面活性剂去除BMPs表面蛋白，再将BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中，超声或室温反应，孵育，使BMPs与糖鞘脂偶联，即得到细菌纳米磁小体‑糖鞘脂复合物。表面蛋白的去除有效避免引入无关蛋白，可以获取与糖鞘脂相互作用的蛋白。本发明的复合物可以用于促进细胞对糖鞘脂的利用，同时复合物中的磁性颗粒可以起到靶向作用，引导复合物向病灶部位聚集，使得药物靶向性更高。将复合物导入肿瘤区域后，还可引入磁性靶向热疗，进一步对病灶进行治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物的制备方法，属于分离领域和医药领域。
背景技术
糖鞘脂(glycosphingolipids)是一类非常重要的糖脂(glycolipids)类分子，它由一个神经酰胺骨架(由鞘氨醇和脂肪链组成)与一个或多个糖链连接形成，其中鞘氨醇的氨基被脂肪酸酰化而成的脑酰胺(ceramide)构成疏水部分，嵌入细胞膜脂双层中，而糖链与鞘氨醇的伯羟基相连形成的亲水部分，伸向细胞质膜外。糖鞘脂成簇排列于细胞膜上，在免疫应答、细胞发育、细胞黏附与识别、细胞增殖与分化及信号转导等方面具有重要的作用，是细胞表面具有生物活性的标志；某些糖鞘脂还能参与到癌变的重要过程：上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)中，并对EMT起到调节的作用，这引起了人们对糖鞘脂靶向性免疫治疗的热情。以单唾液酸三己糖神经节苷脂GM3和N-羟乙酰-GM3制成的肿瘤疫苗经Ⅰ期临床试验证实安全且能诱导出特异的抗体反应,现Ⅱ期临床实验已开。
然而，目前人们对糖鞘脂的认知还不完全，在探究糖鞘脂的功能及机理时，常因无法得到与其相互作用的蛋白等，而无法确切的阐明其作用机制和结合位点。通过构建的BMPs-糖鞘脂复合物，可以方便的获取与糖鞘脂相互作用的蛋白质等，从而帮助阐明糖鞘脂的生理机能与机制，是一种很好的研究手段及方法。此外，糖鞘脂可作为新型癌症疫苗，所构建的细菌纳米磁小体(BMPs)-糖鞘脂复合物具有很高的应用价值。其表面包被的生物膜使其在生物亲和性和生物相容性方面具有其它人造纳米材料不可比拟的优越性，同时形成了很好的缓释体系，加之BMPs自身的靶向肿瘤热疗，使其具备靶向治疗肿瘤及癌症的潜力。
发明内容
本发明提供一种细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物，所述复合物是经表面去蛋白处理的细菌纳米磁小体(BMPs)与糖鞘脂偶联得到的复合物。
所述细菌纳米磁小体由趋磁细菌合成，磁小体表面有脂质包被。在本发明的一种实施方式中，是采用文献Xiang L,Wei J,Jianbo S et al.Purified and sterilizedmagnetosomes from Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 were not toxic tomouse fibroblasts in vitro[J].Letters in Applied Microbiology,2007,45(1):75-81所述方法来制备磁小体。
本发明还提供一种所述BMPs-糖鞘脂复合物的确认方法，是提取BMPs-糖鞘脂复合物表面总脂，用显色剂进行显色，BMPs-糖鞘脂复合物较BMPs出现糖鞘脂条带，即可认定糖鞘脂成功偶联于BMPs。
本发明还提供一种制备所述细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物的方法，是先用表面活性剂去除BMPs表面蛋白，再将BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中反应，孵育，使BMPs与糖鞘脂偶联，即得到细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物。
所述制备细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物的方法主要包括以下步骤：
(1)BMPs处理：配置一定浓度的表面活性剂溶液，加入与表面活性剂质量比为1:10-100:1的BMPs，使混合溶液中BMPs的终浓度在20mg/ml以下，通过表面活性剂去除BMPs表面蛋白，收集BMPs，即得到处理好的BMPs。
(2)BMPs-糖鞘脂复合物的制备：将与糖鞘脂溶液中糖鞘脂质量比为10:1至1:50的处理好的BMPs重新悬浮于糖鞘脂为100μg/mL至20mg/mL的糖鞘脂溶液中混合反应，孵育2h以上，收集，即得到BMPs-糖鞘脂复合物。
所述步骤1中，表面活性剂去除BMPs表面蛋白的处理，可以是将混合溶液在60-100℃加热处理5-20min或者室温震荡0.5-4h。
所述步骤2中，BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中的反应，可以是超声处理。
所述BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中的反应中，超声处理是用50-150W的超声处理10至60min(有效超声时间为50％至100％，即间歇时间与超声时间的比值为0-0.5)。
所述表面活性剂是以下任意一种：十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。
所述制备得到的细菌纳米磁小体与糖鞘脂复合物于牛血清白蛋白(BSA)中封闭、保藏。
所得制备得到的细菌纳米磁小体与糖鞘脂复合物加入封闭液(1mM-100mM的PBS、质量分数为1％-5％的BSA、1％-4％的PEG4000和1％-4％的PEG6000)，4℃保存。
所述制备细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物的方法的步骤中，步骤1、2收集得到的处理好的BMPs或者复合物进行清洗以去除BMPs表面的的表面活性剂或者未结合的糖鞘脂。
所述步骤1中，表面活性剂与BMPs质量比在一种实施方式中为10：1至1：10。
所述步骤2中，BMPs与糖鞘脂质量比在一种实施方式中为1：1至10：1。
所述步骤2中，孵育在一种实施方式中中为避光孵育。
本发明还提供一种应用所述BMPs-糖鞘脂复合物获取与该糖鞘脂相互作用的蛋白的方法，是将BMPs-糖鞘脂复合物于缓冲液中超声打散后，与蛋白反应后目标蛋白结合在该BMPs-糖鞘脂复合物上，再用清洗缓冲液清洗该复合物，最后用洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来。
本发明还提供一种应用所述BMPs-糖鞘脂复合物提高细胞对糖鞘脂吸收利用能力的方法，是待细胞贴壁后，将BMPs-糖鞘脂复合物于缓冲液中超声打散后，加入培养皿中，混匀。
本发明提供的BMPs-糖鞘脂复合物，是先用表面活性剂去除BMPs表面蛋白，再将BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中，使BMPs与糖鞘脂偶联，即得到细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物。所述BMPs经表面活性剂处理后，表面蛋白被去除、表面原脂质层变得疏松，糖鞘脂的非极性端段即脂端能够插入到BMPs表面脂质层中，并形成稳定结构。表面蛋白的去除有效解决了生物磁纳米颗粒表面自身蛋白对其应用的影响，避免引入无关蛋白，可以获取与糖鞘脂相互作用的蛋白。用超声法形成的糖鞘脂质包裹磁颗粒的形态处于亚稳定状态，避光孵育可保证所形成的复合物更加稳定，磁颗粒偶联脂质的效率更高。本发明的复合物可以应用于细胞中，促进细胞对糖鞘脂的利用。同时复合物中的磁性颗粒可以起到靶向作用，引导复合物向病灶部位聚集，使得药物靶向性更高。将复合物导入肿瘤区域后，还可引入磁性靶向热疗，进一步对病灶进行治疗。
附图说明
图1：不同方法富集A431细胞蛋白中表皮生长因子受体(EGFR)的SDS-PAGE图；
各泳道为：1，maker；2，A431细胞蛋白；3，用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431细胞蛋白后上清液；4，用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后上清液；5，用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431细胞蛋白后洗脱液；6，用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后洗脱液。
图2：不同方法富集A431细胞蛋白中表皮生长因子受体(EGFR)的WesternBlot图；
各泳道为：1，A431细胞蛋白；2，用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后上清液；3，用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后洗脱液；4，用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431细胞蛋白后洗脱液。
图3：不同方法处理YTS-1细胞后的激光共聚焦图；(a)空白组(不添加GM1及BMPs-GM1)；(b)添加GM1(100μg/mL)；(c)BMPs-GM1(10μg/mL)。
具体实施方式
实施例1 BMPs-GM3复合物的制备
BMPs处理：秤取1mg BMPs于100μL1％SDS溶液中100℃加热5min，以去除BMPs表面蛋白；磁力架收集BMPs，并用100mM磷酸盐(PB，pH＝7.5)缓冲液清洗3次。
BMPs-GM3复合物的制备：将处理后1mg的BMPs重新悬浮于1ml的2mg/mL GM3(单唾液酸三己糖神经节苷脂)溶液，100W超声60min(超声6s，间歇4s)；避光孵育2h后，100mM磷酸盐(PB，pH＝7.5)缓冲液清洗BMPs三次，即得到BMPs-GM3复合物。
封闭及保存：将所得复合物加入封闭液(10mM PBS含1％BSA,并含有2％PEG4000,2％PEG6000)，4℃保存备用。
所述SDS溶液配制方法：秤取1g SDS溶于100mL水中。所述缓冲液配制方法：取170mmol Na2HPO4,30mmol KH2PO4溶于水中。所述GM3溶液配制方法秤取2mg GM3溶于1mL水中。
实施例2 BMPs-GM1复合物的制备
(1)BMPs处理：秤取20mg BMPs，用1ml20％SDS在室温下震荡2h，以去除BMPs表面蛋白。收集BMPs，并用去离子水清洗3次，即得到处理好的BMPs。
(2)BMPs-GM1复合物的制备：将处理好的10mg BMPs重新悬浮于1ml 20mg/mL GM1(单唾液酸四已糖神经节甘脂)溶液中，80W超声10min，避光孵育3h后，用去离子水清洗，即得到BMPs-GM1糖鞘脂复合物。
实施例3 BMPs-GM3糖鞘脂复合物的制备
(1)原料BMPs的制备：参照文献Xiang L,Wei J,Jianbo S et al.Purified andsterilized magnetosomes from Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 were nottoxic to mouse fibroblasts in vitro[J].Letters in Applied Microbiology,2007,45(1):75-81所述方法来制备。
(2)BMPs处理：秤取10mg BMPs，用1ml0.01％CTAB60℃处理20min，以去除BMPs表面蛋白。收集BMPs，并用去离子水清洗3次，即得到处理好的BMPs。
(3)BMPs-GM3复合物的制备：将10mg处理好的BMPs重新悬浮于10ml 0.1mg/mL GM3溶液中，150W超声15min(超声5s，间隔5s)，静置反应2h后，用去离子水清洗，即得到BMPs-GM3糖鞘脂复合物。
实施例4 BMPs-GM1糖鞘脂复合物的制备
(1)BMPs处理：秤取10mg BMPs，用1ml0.01％CHAPS 80℃处理12min，以去除BMPs表面蛋白。收集BMPs，并用去离子水清洗3次，即得到处理好的BMPs。
(2)BMPs-GM1复合物的制备：将1mg BMPs重新悬浮于2.5ml 20mg/mL GM1溶液中，50W超声60min(超声8s，间隔2s)，静置反应12h以上，用去离子水清洗，即得到BMPs-GM1糖鞘脂复合物。
实施例5 BMPs-磷脂酰乙醇胺的制备方法
BMPs处理：秤取1mg BMPs于100μL1％SDS溶液中100℃加热5min，以去除BMPs表面蛋白；磁力架收集BMPs，并用100mM磷酸盐(PB，pH＝7.5)缓冲液清洗3次。
BMPs-磷脂酰乙醇胺复合物的制备：将处理后1mg的BMPs重新悬浮于1ml的2mg/mL磷脂酰乙醇胺溶液，100W超声10min(超声6s，间歇4s)；避光孵育3h后，100mM磷酸盐(PB，pH＝7.5)缓冲液清洗BMPs三次，即得到BMPs-磷脂酰乙醇胺复合物。
封闭及保存：将所得复合物加入封闭液(10mM PBS含1％BSA,并含有2％PEG4000,2％PEG6000)，4℃保存备用。
实施例6 应用BMPs-GM3复合物获取与GM3相互作用的蛋白
(1)制备BMPs-GM3复合物，并于封闭液(10mM PBS含1％BSA,并含有2％PEG4000,2％PEG6000)以阻断非特异性结合位点，4℃保存备用。
(2)培养人表皮癌细胞A431并提取蛋白：用含10％胎牛血清，100IU/mL青霉素的DMEM培养基于37℃，5％CO2条件下培养A431细胞，待细胞铺满皿底后，将培养皿至于冰上，用4℃预冷PBS(137mM NaCL,2.7mM KCL,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4)缓冲液清洗皿底3次，去除培养基，另取PBS1.5ml加入皿底，用刮铲将细胞刮下于2ml离心管1000rpm离心5min去上清，添加1ml RIPA裂解液(1％Triton X-100,150mM NaCl,25mM Tris pH7.4,5mM EDTA,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,5mM焦磷酸四钠,50mM氟化钠,1mM Na3VO4,2mM苯甲基磺酰氟,0.076U/ml抑肽酶)，及10mM苯甲基磺酰氟(PMSF)充分吹打，至于冰上30min后于4℃12000rpm离心15min，取上清即蛋白液于-80℃保存待用。
(3)A431细胞蛋白中富集与GM3相互作用的蛋白
将1mg BMPs-GM3复合物及1mg BMPs-磷脂酰乙醇胺复合物分别溶于1mL TBS(+)缓冲液(130mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH8.0),0.9mM CaCl2,0.5mM MgSO4,0.1mMMnCl2)中，超生打散。分别加入A431细胞蛋白(1mg/mL)于4℃摇床(80rpm)过夜。用磁力架将复合物吸附后，吸去上清，用TBS(+)缓冲液清洗3次。此时将BMPs-GM3复合物及1mg BMPs-磷脂酰乙醇胺复合物分别于0.5mL1％SDS溶液中，沸水浴5min，使目的蛋白洗脱，并用SDS-PAGE及WesternBlot验证实验结果(各泳道均上样30μL)，结果如图1、图2所示。通过以BMPs-磷脂酰乙醇胺复合物作为空白对照，对BMPs-GM3与特异性蛋白富集能力进行验证。由图1可知用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后上清液较用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431细胞蛋白后上清液蛋白丰度低，且用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后洗脱液较用BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后洗脱液蛋白丰度高，表明表明BMPs-GM3复合物富集了更多的细胞蛋白。因所合成复合物经BSA封闭，因此在本实验中60kd及40kd处两条条带较深，为实验过程中从复合物掉下的BSA。为进一步验证BMPs-GM3复合物富集蛋白为特异性蛋白，选取表皮生长因子受体EGFR为对象进行蛋白印迹实验，结果如图2所示。已有大量文献报道证明GM3可特异性与EGFR结合，而PE与EGFR无特异性结合，实验结果表明通过BMPs-GM3复合物富集前后A431细胞蛋白液中EGFR含量明显减少，并且在BMPs-GM3富集A431细胞蛋白后洗脱液中出现EGFR，而BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431细胞蛋白后洗脱液中未出现。结果表明通过BMPs-GM3复合物可有效的从A431细胞蛋白中富集EGFR等与GM3特异性结合的蛋白。
实施例7 BMPs-GM1复合物促进膀胱癌细胞YTS-1细胞对GM1的利用
(1)制备BMPs-GM1复合物，并于封闭液(10mM PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mMNa2HPO4,2mM KH2PO4)含1％BSA,并含有2％PEG4000,2％PEG6000)以阻断非特异性结合位点，4℃保存备用。
(2)细胞处理：将直径12mm的小玻片高温灭菌后，放入24孔板中，每空加入每孔加入500μL DMEM培养基(10％胎牛血清，10μg/mL胰岛素，100IU/mL青霉素)并接入1×104个膀胱癌细胞YTS-1，于37℃，5％CO2条件下培养24h。待细胞黏附于玻片，分别加入GM1(100μg/mL)及BMPs-GM1(10μg/mL)于控板内继续培养48h。
(3)细胞染色及观察：吸去培养基，用预冷的PBS洗两次各5min，加入4％多聚甲醛固定20min，PBS洗两次后，加入300μL5％BSA的PBS溶液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mMNa2HPO4,2mM KH2PO4)常温封闭2h，PBS洗一次后，加入终浓度0.4μg/mL异硫氰酸荧光素FITC标记的霍乱毒素B亚基室温孵育2h(注意避光)，PBS溶液洗两次各5min后，300μL PBS种加入5μg/ml终浓度的4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI染核30min(注意避光)，把小玻片置于载玻片上，于激光共聚焦显微镜下分别于405nm波长激光及488nm波长激光观察拍照，并将照片重合，结果如图3所示。DAPI及FITC可分别在405nm及488nm激发波长下产生荧光，DAPI可直接与细胞核作用，产生荧光为细胞核所在位置；霍乱毒素B亚基可以特异性与GM1结合，而霍乱毒素B亚基被FITC标记，因此荧光处为细胞内GM1位置，荧光强度越强表明GM1含量越高。从结果中可知加入BMPs-GM1的荧光强度远大于空白对照组及仅添加GM1组，表明BMPs-GM1可促进细胞对GM1的吸收利用。
实施例8 一种确认BMPs-糖鞘脂复合物的方法
将合成后的BMPs-GM3复合物及未处理的BMPs各1mg采用Bligh-Dyer法(参考文献Bligh，E.G.and Dyer,W.J.1959.A rapid method for total lipid extraction andpurification.Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917)提取复合物表面总脂，溶于100μL氯仿：甲醇(2：1，V/V)溶液中，于氯仿：甲醇：水((30:60:8,V/V/V)展层剂中展开，用显色剂(0.02％(W/V)地衣酚,1MH2SO4)于95℃进行烘烤显色。合成后的复合物中的总脂较原始BMPs出现GM3条带，由此可认定糖鞘脂GM3已成功偶联于BMPs。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物，其特征在于，所述复合物是将经去除表面蛋白的细菌纳米磁小体与糖鞘脂偶联得到的复合物；
所述细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物的制备，是先用表面活性剂去除BMPs表面蛋白，再将BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中反应，孵育，使BMPs与糖鞘脂偶联，即得到细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物；
包括以下步骤：1)BMPs处理：配置表面活性剂溶液，加入与表面活性剂质量比为1：10-100：1的BMPs，使混合溶液中BMPs的终浓度为20mg/ml以下，通过表面活性剂去除BMPs的表面蛋白，收集BMPs，即得到处理好的BMPs；2)BMPs-糖鞘脂复合物的制备：将与糖鞘脂溶液中糖鞘脂质量比为10:1至1:50的处理好的BMPs重新悬浮于糖鞘脂浓度为100μg/mL至20mg/mL糖鞘脂溶液中混合反应，孵育2h以上，收集，即得到BMPs-糖鞘脂复合物；所述表面活性剂去除BMPs表面蛋白，是将混合溶液用60-100℃加热处理或者在室温震荡处理；BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中的反应，是用超声处理。
2.一种制备权利要求1所述的细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物的方法，其特征在于，是先用表面活性剂去除BMPs表面蛋白，再将BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中反应，孵育，使BMPs与糖鞘脂偶联，即得到细菌纳米磁小体-糖鞘脂复合物；
包括以下步骤：1)BMPs处理：配置表面活性剂溶液，加入与表面活性剂质量比为1：10-100：1的BMPs，使混合溶液中BMPs的终浓度为20mg/ml以下，通过表面活性剂去除BMPs的表面蛋白，收集BMPs，即得到处理好的BMPs；2)BMPs-糖鞘脂复合物的制备：将与糖鞘脂溶液中糖鞘脂质量比为10:1至1:50的处理好的BMPs重新悬浮于糖鞘脂浓度为100μg/mL至20mg/mL糖鞘脂溶液中混合反应，孵育2h以上，收集，即得到BMPs-糖鞘脂复合物；
所述表面活性剂去除BMPs表面蛋白，是将混合溶液用60-100℃加热处理或者在室温震荡处理；BMPs悬浮于糖鞘脂溶液中的反应，是用超声处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述孵育是避光孵育。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂是以下任意一种：十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、聚乙二醇辛基苯基醚。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备得到的细菌纳米磁小体与糖鞘脂复合物于牛血清白蛋白中封闭、保藏。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，去除BMPs表面蛋白后得到的BMPs、得到的复合物进行清洗，去除BMPs表面的的表面活性剂或者未结合的糖鞘脂。
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Granted publication date: 20180821 Termination date: 20190912 |
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