CN102807984A

CN102807984A - 仪宁小麦抗小麦黄花叶病毒主效qtl的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN102807984A
Application number: CN2012102468445A
Authority: CN
Inventors: 王秀娥; 郭娇; 吴真真; 朱晓彪; 王海燕; 曹爱忠; 肖进
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-07-17
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2032-07-17
Also published as: CN102807984B

Abstract

本发明公开了与‘仪宁小麦’抗小麦黄花叶病毒主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记方法，属于生物技术领域。首先公开了与QTL QYm.nau-2D.1紧密连锁的分子标记2EST730，同时公开了该标记的引物2EST730F/2EST730R。在含有QTL QYm.nau-2D.1的材料中，标记引物2EST730F/2EST730R扩增出约600bp的产物与QYm.nau-2D.1紧密连锁，遗传距离为0.3cM。本发明公开的与QYm.nau-2D.1紧密连锁分子标记，可用于小麦抗黄花叶病分子标记辅助选择育种。

Description

仪宁小麦抗小麦黄花叶病毒主效QTL的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，公开了‘仪宁小麦’抗小麦黄花叶病毒主效QTL的分子标记及其应用。

背景技术

普通小麦(Triticum aestivum L)有21对染色体，每对包含两条一样的染色体，这21条染色体分别为1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D，普通小麦通常用AABBDD表示（图1）。每条染色体又包含长臂和短臂，分别用L和S表示，比如2D染色体包括长臂2DL和短臂2DS。

小麦作为世界性的重要粮食作物，在农业生产中具有举足轻重的地位，但由真菌—禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）（见参考文献：Inouye T(1969)Viral pathogen ofthe wheat yellow mosaic disease.Nogaku Kenkyu53：61-68）介导的小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic bymovirus，WYMV）引起的小麦黄花叶病（Wheat yellow mosaic，WYM）对小麦的生长发育及产量造成了严重危害，正日益成为危害我国和日本等亚洲国家小麦生产的最严重的病害之一（见参考文献：1、陶家凤，秦家忠，肖际亨，沈言章，赵福臻，李天眷，谢贻远，何代富，饶有后，黄显华（1980）四川土传小麦黄色花叶病的研究.植物病理学报10：5-25；2、于善谦，陈仲宜，徐来升，张若平，王鸣岐，罗瑞梧（1986）发生在我国的小麦黄花叶病毒病.植物保护学报13：217-219；3、李大伟，韩成贵，邢怡明，田兆丰，于嘉林，蔡祝南，刘仪（1997）中国小麦黄花叶病毒（WYMV）分布的RT-PCR鉴定.植物病理学报27：303-307）。将抗性主效QTL/基因引入小麦栽培品种，培育和推广抗病毒品种是目前生产上防治小麦黄花叶病最经济有效的方法。

普通小麦品种‘仪宁小麦’（公知公用，见参考文献：侯庆树（1993）抗梭条花叶病小麦新品种－仪宁小麦.江苏科技短讯9（4）：7-10）具有耐旱、耐寒、耐肥、抗倒等性状优良，抗病性较好，综合性状优良。南京农业大学细胞遗传所对‘仪宁小麦’抗黄花叶病进行了鉴定，结果表明‘仪宁小麦’对小麦黄花叶病表现出高抗，‘镇9523’表现高感。为了进一步研究‘仪宁小麦’对小麦黄花叶病的抗性遗传机制和定位抗性QTL，南京农业大学细胞遗传所以高抗小麦黄花叶病的‘仪宁小麦’作母本、高感小麦抗黄花叶病的‘镇9523’（审定品种）作父本、构建了F_2：8重组自交系群体（Recombinant inbred Iine，RIL），并开展了利用该RIL群体进行抗性QTL定位以及与主效QTL紧密连锁分子标记的筛选工作，以及进一步利用“RIL11－14×镇9523”次级F₂分离群体进行抗病主效QTL QYm.nau-2D.1精细定位的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供来自普通小麦品种‘仪宁小麦’的抗小麦黄花叶病主效QTLQYm.nau-2D.1紧密连锁分子标记2EST730。

本发明的另一目的是提供该分子标记的引物对。

本发明的又一目的是提供该分子标记的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

‘仪宁小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记2EST730，该分子标记2EST730的上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的分子标记2EST730与QYm.nau-2D.1之间的遗传距离为0.3cM。

所述的分子标记2EST730的引物对，其上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO.2所示。

抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记方法，包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求3所述的分子标记2EST730的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用银染法检测；能扩增出约600bp特异条带的植株为含有抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的植株。

所述的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记方法，优选包括如下步骤：

（1）以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求3所述的分子标记2EST730的引物对进行PCR扩增；

PCR试剂组成为：1μL DNA模板(20-100ng)，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl₂（25mmol/L），0.8μL dNTP（2.5mmol/L），上、下游引物(10μmol/L)各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase(5U/μL)，5.85μL ddH₂O；

PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存；

PCR产物检测：PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测；

（2）标记引物鉴定QYm.nau-2D.1的结果为：

能扩增出约600bp特异条带的植株为含有QYm.nau-2D.1的植株。

所述的分子标记2EST730在分子标记辅助选择育种中的应用。

所述的分子标记2EST730在选育抗小麦黄花叶病小麦品种中的应用。

有益效果：

1、本发明中公开的与‘仪宁小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1紧密连锁的分子标记的引物（2EST730F/2EST730R）是基于小麦EST序列设计而成，用来鉴定植株中是否含有QYm.nau-2D.1，简单易行、方便快捷、扩增稳定。

2、标记引物2EST730F/2EST730R扩增的产物与QYm.nau-2D.1之间的遗传距离为0.3cM，与现有技术中公开的分子标记相比，本发明分子标记与QYm.nau-2D.1遗传距离更近，意味着利用分子标记辅助选择QYm.nau-2D.1的准确性更高。

附图说明

图1：普通小麦染色体示图

图2：小麦抗黄花叶病单株抗性鉴定分级标准

图3：标记引物2EST730F/2EST730R所对应的小麦EST（BE423370）序列及引物序列位置

图4：利用F₂次级群体对QYm.nau-2D.1进行精细定位

图5：用“仪宁小麦×镇9523”RIL群体双亲和部分抗、感家系的DNA作为模板，用本发明中的标记引物2EST730F/2EST730R进行PCR扩增，结果表明标记引物2EST730F/2EST730R在抗病亲本‘仪宁小麦’（泳道1）和抗病家系（泳道3-7，10，11，13，15-17，19-22）中均扩增出约600bp的特异条带，而在感病的亲本和家系中均未扩增出相应的特异条带。白色箭头所示为特异条带。

注：M.Marker；1.仪宁小麦；18.镇9523；3-17及19-22为部分抗、感家系；R.纯合抗病；S.纯合感病

图6：用“RIL11－14×镇9523”次级F₂分离群体双亲和抗、感池及部分抗、感单株的DNA作为模板，用本发明中的标记引物2EST730F/2EST730R进行PCR扩增，结果表明标记引物2EST730F/2EST730R在抗病亲本’RIL11-14’（泳道21）、纯合抗病单株（泳道1，2，16）、杂合抗病单株（泳道11，19，20）中均扩增出约600bp的特异条带，而标记引物在感病的亲本和单株中均未扩增出相应的特异条带。白色箭头所示为特异条带。

注：M.Marker；21.RIL11－14；22.镇9523；1-20.部分抗、感单株；R.纯合抗病；H.杂合抗病；S.纯合感病。

具体实施方式

实施例1

小麦抗黄花叶病的抗性鉴定标准分为0-5级（图2）（参考文献：刘伟华，何震天，耿波，侯明生，张敏，聂桓等（2004）小麦对黄花叶病的抗性鉴定及典型品种的遗传分析.植物病理学报34：542-547）：0级为植株无症状；1级为植株矮缩不明显，轻度花叶，一般不产生明显的条纹坏死斑，叶片不黄化或少数黄化；2级为植株矮缩不明显，轻度花叶，产生明显的条纹坏死斑，叶片黄化明显；3级为植株轻度矮缩，花叶明显，条纹坏死斑占叶面积1/2左右，部分叶片黄化，少数枯死，分蘖黄化矮缩；4级为植株明显矮缩，严重花叶，条纹斑占叶面积3/4左右，心叶细弱扭曲或呈缩顶状，部分叶片和分蘖枯死；5级为植株严重矮缩，大部分叶片和分蘖或整株枯死。‘仪宁小麦’对小麦黄花叶病表现高抗，抗性水平为0级；‘镇9523’则表现高感，抗级水平为5级。

在三个环境中（2007在南京六合试验点；2008-2009连续两年在江苏扬州试验点）对“仪宁小麦×镇9523”的RIL群体（重组自交系群体）进行了小麦黄花叶病抗性鉴定。选取涉及小麦21条染色体上的1336对引物（包括SSR、EST-SSR和STS）在抗病亲本“仪宁小麦”与感病亲本“镇9523”之间进行引物多态性筛选，然后对179个表现多态的引物继续在自交系群体（106个株系）中进行扩增，并用作图软件JoinMap4.0进行连锁关系分析，构建分子标记遗传图谱，在此基础上进一步使用IciMapping3.1软件定位小麦黄花叶病抗性相关QTL。结果表明：位于‘仪宁小麦’2DL染色体上的主效QTL QYm.nau-2D.1在三个环境中均被检测到，可解释76.25-93.19％的表型变异。从RIL群体中选择一个农艺性状与镇9523相似的抗性家系‘RIL11－14’，利用该家系与镇9523杂交构建了一个次级F₂分离群体及其衍生的F_2：3家系。对该F₂群体及F_2：3家系的遗传分析表明‘RIL11－14’中的小麦黄花叶病抗性受显性单基因控制，F₂群体中纯合抗病基因型（QYm.nau-2D//QYm.nau-2D）的单株有348株，杂合抗病基因型（QYm.nau-2D//qym.nau-2D）有714株，纯合感病基因型（qym.nau-2D//qym.nau-2D）有349株，卡方测验表明符合1：2：1的分离比。利用F₂群体对QYm.nau-2D进行精细定位，采用MAPMAKER3.0软件计算遗传距离，其中标记2EST730与QYm.nau-2D.1紧密连锁，遗传距离为0.3cM（图4）。

1、与QYm.nau-2D.1紧密连锁分子标记引物的设计

在上述分子标记连锁图谱构建和抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1发掘的研究中，分子标记2EST730与QYm.nau-2D.1紧密连锁（图4），并且与QYm.nau-2D.1的遗传距离为0.3M。标记2EST730的引物是根据小麦第二同源群上的EST序列（BE423370）（公知公用，见参考文献Qi LL，Echalier B，Chao S，Lazo GR，Butler GE，Anderson OD et al(2004)A chromosome bin map of16,000expressed sequence tag loci and distribution of genes among the three genomes of polyploid wheat.Genetics168：701-712），采用在线引物设计软件Primer3V0.4.0设计而成（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/）。

标记2EST730的引物：

2EST730F：AAATCTCCCAAAAAGCTGAC（SEQ ID NO.1）；

2EST730R：GGGTCTAACATTGGAGAAGG（SEQ ID NO.2）（图3）

2、标记引物2EST730F/2EST730R在“仪宁小麦×镇9523”RIL群体中的分子检测

利用标记引物2EST730F（SEQ ID NO.1）/2EST730R（SEQ ID NO.2）在RIL群体的106个家系及其双亲中进行PCR扩增检测。结果表明：在高抗亲本‘仪宁小麦’和78个家系中均扩增出约600bp的特异条带，而在高感亲本‘镇9523’和剩下的28个家系中均未扩增出该特异条带（图5）。

PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存。PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法进行染色。

3、标记引物2EST730F/2EST730R在F₂分离群体中的分子检测

为了进一步评价QYm.nau-2D.1的抗病效应和精细定位该QTL，本实验室结合分子标记分析和表型鉴定结果，又从RIL群体中选择一个高抗家系‘RIL11－14’，并构建了“RIL11-14×镇9523” 次级F₂分离群体（1368个单株）。遗传分析表明，QYm.nau-2D.1在次级F₂分离群体中呈显性单基因遗传。利用标记引物2EST730F/2EST730R在F₂群体双亲及群体单株中进行PCR扩增检测（条件和方法同上）。结果表明：在1368个F₂单株中，346株纯合抗病单株均扩增出与高抗亲本‘RIL11-14'一致的特异条带（约600bp），305株纯合感病单株均扩增出与高感亲本‘镇9523’一致的特异条带（约595bp），而711株杂合抗病单株能同时扩增两种特异条带（图6）。根据扩增结果和连锁分析，结果表明标记2EST730与QYm.nau-2D.1之间的遗传距离为0.3cM（图4）。次级F₂分离群体和RIL群体的结果互相验证，即QYm.nau-2D.1既是‘仪宁小麦’中抗小麦黄花叶病的主效QTL，又是高抗家系‘RIL11-14’中抗小麦黄花叶病基因，并且标记2EST730与QYm.nau-2D.1紧密连锁。

Claims

1.‘仪宁小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记2EST730，其特征在于该分子标记2EST730的上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述‘仪宁小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1分子标记2EST730，其特征在于所述的分子标记2EST730与QYm.nau-2D.1之间的遗传距离为0.3cM。

3.权利要求1所述的分子标记2EST730的引物对，其特征在于上游引物2EST730F序列如SEQID NO.1所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO.2所示。

4.抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记方法，其特征在于包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求3所述的分子标记2EST730的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用银染法检测；能扩增出约600bp特异条带的植株为含有抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的植株。

5.根据权利要求4所述的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-2D.1的分子标记方法，其特征在于包括如下步骤：

PCR试剂组成为：PCR试剂组成为：1μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl₂，0.8μLdNTP，上、下游引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，5.85μL ddH₂O；

（2）标记引物鉴定QYm.nau-2D.1的结果为：

能扩增出约600bp特异条带的植株为含有QYm.nau-2D.1的植株。

6.权利要求1所述的分子标记2EST730在分子标记辅助选择育种中的应用。

7.权利要求1所述的分子标记2EST730在选育抗小麦黄花叶病小麦品种中的应用。