CN102807603A - 脂肪胺链修饰的抗肿瘤寡肽及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃(n＝6、8、10、12、14或16)及其合成方法和应用。本发明以亮氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸为原料合成七肽小分子，然后用脂肪胺对这个七肽小分子进行修饰，从而得到了目标化合物。本发明在细胞模型和小鼠S₁₈₀模型上评价本发明化合物的抑制肿瘤细胞增值、粘附活性及抗肿瘤活性。体外和体内试验结果表明，本发明化合物无论是在体外或是在体内均具有良好的抗肿瘤活性，并有良好的抗粘附活性，可将其制备成抗肿瘤药物。

Description

脂肪胺链修饰的抗肿瘤寡肽及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及式如Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)nCH₃(式中n为6、8、10、12、14或16)的6种寡肽，涉及它们的制备方法，进一步涉及它们在细胞模型和小鼠S180模型上的抗肿瘤作用及抗粘附作用及应用，本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤作为一种复杂的疾病，严重危害着人民生命健康，如何有效有力地治疗肿瘤得到了越来越多学者的关注和研究。目前，化学治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要手段，寻找抗肿瘤药物是新药研究的热点之一。发明人了解，七肽LPNISKP能抑制肝癌细胞的运动与侵袭，显著降低肝内及肺转移率，并可降低肿瘤微血管密度，这些结果提示了七肽LPNISKP及其修饰物作为抗侵袭及抗肿瘤剂的临床应用前景。已知肿瘤细胞运动与侵袭的首要步骤是粘附，这也提示了七肽LPNISKP及其修饰物具有抗肿瘤细胞粘附的潜能。按照一般的认识，含多肽的两亲性分子，例如脂肪胺链修饰的多肽，在适当的条件下通过分子间非共价键相互作用可发生自组装，形成纳米结构。借助纳米结构可改善多肽在体内的输送、延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供脂肪胺链修饰的抗肿瘤寡肽，如下式：

Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃

其中，n为6、8、10、12、14或16。

本发明的第二个内容是提供所述寡肽的制备方法，是通过以下技术方案来实现的：

(1)将保护基保护的脯氨酸(Pro)与饱和脂肪胺缩合，所述饱和脂肪胺为CH₃(CH₂)_nCH₂NH₂，n＝6、8、10、12、14或16；

(2)脱去保护基后，再按照现有液相合成技术，逐步接肽合成保护基保护的Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

(3)按照现有液相合成技术，逐步接肽合成保护基保护的Leu-Pro-Asn-Ile；

(4)将保护基保护的Leu-Pro-Asn-Ile与保护基保护的Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)nCH₃缩合后脱去保护基得到目标化合物。

其中所述保护基包括N端保护基、C端保护基或侧链保护基，所述N端保护基是对多肽的N端进行保护时常用的保护基团，例如可以是叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)；C端保护基是对多肽的C端进行保护时常用的保护基团，例如可以是甲氧基(OMe)、苄氧基(OBzl)；所述侧链保护基是对多肽侧链进行保护时常用的保护基团，例如可以是苄基(Bzl)、苄氧基(OBzl)、硝基(N0₂)、苄氧羰基(Z)；所述液相合成技术及涉及的保护、缩合、脱保护的过程是本领域的常规并公知的技术。

其中缩合反应是在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下于无水THF中进行；脱去N端保护基如Boc是在含氯化氢的乙酸乙酯中进行或如Z是在甲醇中发生氢解；脱去C端保护基如OBzl是在甲醇中进行皂化；脱去侧链保护基如Z、OBzl、NO₂是在甲醇中发生氢解。

具体的，合成路线如图2所示，按照如下步骤制备：

1)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下Boc-Pro在无水THF中与饱和脂肪胺NH₂CH₂(CH₂)_nCH₃脱水形成Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；其中n为6、8、10、12、14或16；

2)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃脱除Boc生成Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

3)在DCC和HOBt存在下Boc-Lys(Z)在无水THF中与Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃缩合生成Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

4)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃脱除Boc生成Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

5)在DCC和HOBt存在下Boc-Ser在无水THF中与Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃缩合生成Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NH-CH₂(CH₂)_nCH₃；

6)将Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃经柱层析纯化后，在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃脱除Boc生成Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

7)在DCC和HOBt存在下Boc-Asn在无水THF中与Ile-OBzl缩合生成Boc-Asn-Ile-OBzl；

8)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Asn-Ile-OBzl脱除Boc生成Asn-Ile-OBzl；

9)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro在无水THF中与Asn-Ile-OBzl缩合生成Boc-Pro-Asn-Ile-OBzl；

10)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Pro-Asn-Ile-OBzl脱除Boc生成Pro-Asn-Ile-OBzl；

11)在DCC和HOBt存在下Z-Leu在无水THF中与Pro-Asn-Ile-OBzl缩合生成Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl；

12)将Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl经硅胶柱纯化后，在甲醇中将Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl皂化为Z-Leu-Pro-Asn-Ile；

13)在DCC和HOBt存在下Z-Leu-Pro-Asn-Ile在无水THF中与Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃缩合生成Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

14)在甲醇中Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃氢解为Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃。

本发明的第三个内容是通过评价所述寡肽的体外抑制肿瘤细胞增值、抑制肿瘤粘附活性及体内抗肿瘤活性，提供其在制备抗肿瘤和抗粘附药物中的应用。

附图说明

图1为本发明化合物8a-f在水中自组装纳米球的8天粒径图。

图2为本发明提供的合成路线，其中i)DCC，HOBt，NMM；ii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；iii)NaOH水溶液，甲醇；iv)Pd/C，H₂。

图3为本发明化合物8c在水溶液中形成的纳米球的代表性透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(1a)

将Boc-Pro 3.0g(13.95mmol)溶于20ml无水THF中，冰浴下加入2.07g(15.22mmol)HOBt，并使完全溶解。然后加入3.14g(15.22mmol)DCC，反应混合物冰浴搅拌10分钟，得对应的活泼酯溶液(I)，待用。

将1.64g(12.68mmol)CH₃(CH₂)₆CH₂NH₂用无水THF溶解，然后用N-甲基吗啉(NMM)，调pH＝8-9，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(II)加入反应液(I)中，得到的反应混合物室温搅拌24小时。TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示有产物点生成，反应基本完全。滤除二环己基脲(DCU)，反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到3.43g(83％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：327[M+H]⁺.

实施例2制备Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(1b)

按照实施例1的方法由Boc-Pro 3.0g(13.95mmol)和1.99g(12.68mmol)CH₃(CH₂)₈CH₂NH₂反应，得到3.82g(85％)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃。ESI-MS(m/e)：355[M+H]⁺.

实施例3制备Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(1c)

按照实施例1的方法由Boc-Pro 3.0g(13.95mmol)和2.35g(12.68mmol)CH₃(CH₂)₁₀CH₂NH₂反应，得到4.41g(91％)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃。ESI-MS(m/e)：383[M+H]⁺.

实施例4制备Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1d)

按照实施例1的方法由Boc-Pro 2.50g(11.63mmol)和2.25g(10.57mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂NH₂反应，得到4.03g(93％)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃。ESI-MS(m/e)：411[M+H]⁺.

实施例5制备Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(1e)

按照实施例1的方法由Boc-Pro 2.50g(11.63mmol)和2.55g(10.57mmol)CH₃(CH₂)₁₄CH₂NH₂反应，得到4.17g(90％)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃。ESI-MS(m/e)：439[M+H]⁺.

实施例6制备Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(1f)

按照实施例1的方法由Boc-Pro 3.00g(13.95mmol)和4.127g(15.35mmol)CH₃(CH₂)₁₆CH₂NH₂反应，得到5.46g(84％)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃。ESI-MS(m/e)：467[M+H]⁺.

实施例7制备Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(2a)

将3.50g(10.74mmol)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃溶解在35ml氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中，室温搅拌2小时，TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复用少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢，得到2.67g(95％)标题化合物，为白色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/e)：227[M-H]^-.

实施例8制备Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(2b)

按照实施例7的方法由4.10g(11.58mmol)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到3.15g(94％)Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃，为白色固体。ESI-MS(m/e)：253[M-H]^-.

实施例9制备Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(2c)

按照实施例7的方法由4.42g(11.57mmol)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到3.41g(92％)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃，为无色固体。ESI-MS(m/e)：281[M-H]^-.

实施例10制备Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2d)

按照实施例7的方法由4.64g(11.32mmol)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到3.68g(94％)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃，为无色固体。ESI-MS(m/e)：309[M-H]^-.

实施例11制备Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(2e)

按照实施例7的方法由4.00g(9.13mmol)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得3.38g(99％)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃，为白色固体。ESI-MS(m/e)：337[M-H]^-.

实施例12制备Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(2f)

按照实施例7的方法由4.97g(10.63mmol)Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到3.98g(93％)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃，为无色固体。ESI-MS(m/e)：365[M-H]^-.

实施例13制备Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(3a)

将4.78g(12.57mmol)Boc-Lys(Z)溶于20ml无水THF中，冰浴下加入1.87g(13.72mmol)HOBt，并使完全溶解。然后加入2.83g(13.72mmol)DCC，反应混合物冰浴搅拌10分钟，得对应的活泼酯溶液(I)，待用。

将3.00g(11.43mmol)Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃用无水THF溶解，然后用NMM，调pH＝8-9，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(II)加入反应液(I)中，得到的反应混合物室温搅拌24小时。TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示有产物点生成，反应基本完全。滤除DCU，反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到5.38g(80％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：589[M+H]⁺.

实施例14制备Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(3b)

按照实施例13的方法，由5.1g(13.26mmol)Boc-Lys(Z)和3.50g(12.05mmol)Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃反应得到产物5.79g(78％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：617[M+H]⁺.

实施例15制备Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(3c)

按照实施例13的方法，由4.99g(13.12mmol)Boc-Lys(Z)和3.80g(11.93mmol)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃反应得到产物5.84g(76％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：645[M+H]⁺.

实施例16制备Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3d)

按照实施例13的方法，由2.29g(6.03mmol)Boc-Lys(Z)和1.90g(5.48mmol)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃反应得到产物3.14g(86％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：673[M+H]⁺.

实施例17制备Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(3e)

按照实施例13的方法，由2.12g(5.58mmol)Boc-Lys(Z)和1.90g(5.07mmol)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃反应得到产物3.12g(88％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：701[M+H]⁺.

实施例18制备Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(3f)

按照实施例13的方法，由4.46g(11.74mmol)Boc-Lys(Z)和4.50g(11.18mmol)Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃反应得到产物6.35g(78％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：729[M+H]⁺.

实施例19制备Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(4a)

将5.28g(9.06mmol)Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃溶解在50ml氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中，室温搅拌2小时，TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复用少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢，得到4.65g(98％)标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：487[M-H]^-.

实施例20制备Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(4b)

按照实施例19的方法由5.10g(8.28mmol)Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到4.68g(93％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：515[M-H]^-.

实施例21制备Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(4c)

按照实施例19的方法由5.80g(9.01mmol)Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到4.99g(96％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：543[M-H]^-.

实施例22制备Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4d)

按照实施例19的方法由3.14g(4.67mmol)Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到2.81g(99％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：571[M-H]^-.

实施例23制备Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(4e)

按照实施例19的方法由3.12g(4.46mmol)Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到2.77g(97％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：599[M-H]^-.

实施例24制备Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(4f)

按照实施例19的方法由6.10g(8.38mmol)Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到5.27g(95％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：627[M-H]^-.

实施例25制备Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(5a)

将1.93g(9.44mmol)Boc-Ser溶于20ml无水THF中，冰浴下加入1.24g(9.13mmol)HOBt，并使完全溶解。然后加入1.88g(9.13mmol)DCC，反应混合物冰浴搅拌10分钟，得对应的活泼酯溶液(I)，待用。

将4.50g(8.58mmol)Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃用无水THF溶解，然后用NMM，调pH＝8-9，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(II)加入反应液(I)中，得到的反应混合物室温搅拌24小时。TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示有产物点生成，反应基本完全。滤除DCU，反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，通过柱层析纯化方法，得到1.97g(34％)标题化合物，无色油状物。ESI-MS(m/e)：676[M+H]⁺.

实施例26制备Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(5b)

按照实施例25的方法，由4.50g(8.14mmol)Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃和1.84g(8.96mmol)Boc-Ser反应得到产物4.98g(87％)，淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用石油醚-丙酮系统纯化得到2.07g(36％)标题化合物，无色油状物。ESI-MS(m/e)：704[M+H]⁺.

实施例27制备Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(5c)

按照实施例25的方法，由5.00g(8.61mmol)Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃和1.94g(9.47mmol)Boc-Ser-OH反应得到产物5.35g(85％)，淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用石油醚-丙酮系统纯化得到1.98g(31％)标题化合物，无色油状物。ESI-MS(m/e)：732[M+H]⁺.

实施例28制备Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(5d)

按照实施例25的方法，由2.50g(4.10mmol)Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃和0.92g(4.51mmol)Boc-Ser反应得到产物2.78g(89％)，淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用石油醚-丙酮系统纯化得到1.12g(36％)标题化合物，无色油状物。ESI-MS(m/e)：760[M+H]⁺.

实施例29制备Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(5e)

按照实施例25的方法，由2.50g(3.93mmol)Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃和0.89g(4.51mmol)Boc-Ser反应得到产物2.79g(90％)，淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用石油醚-丙酮系统纯化得到1.12g(37％)标题化合物，无色油状物。ESI-MS(m/e)：788[M+H]⁺.

实施例30制备Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(5f)

按照实施例25的方法，由6.80g(10.23mmol)Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃和2.31g(11.26mmol)Boc-Ser反应得到产物6.09g(73％)，淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用石油醚-丙酮系统纯化得到2.88g(35％)标题化合物，无色油状物。ESI-MS(m/e)：816[M+H]⁺.

实施例31制备Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(6a)

将1.97g(2.93mmol)Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃溶解在20ml氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中，室温搅拌2小时，TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复用少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢，得到1.72g(96％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：574[M-H]^-.

实施例32制备Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(6b)

按照实施例31的方法由2.07g(2.94mmol)Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到1.80g(96％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：602[M-H]^-.

实施例33制备Ser-Lys(Z)-Pro-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(6c)

按照实施例31的方法由1.98g(2.71mmol)Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到1.74g(96％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：630[M-H]^-.

实施例34制备Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(6d)

按照实施例31的方法由112g(1.48mmol)Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到1.00g(98％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：658[M-H]^-.

实施例35制备Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(6e)

按照实施例31的方法由1.12g(1.42mmol)Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc得到1.02g(99％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：686[M-H]^-.

实施例36制备Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(6f)

按照实施例31的方法由2.88g(3.53mmol)Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃在氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液中脱除Boc，得到2.48g(94％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：714[M-H]^-.

实施例37制备Boc-Asn-Ile-OBzl

将1.00g(4.31mmol)Boc-Asn溶于15ml无水THF中，冰浴下加入0.703g(5.17mmol)HOBt，并使完全溶解。然后加入1.07g(5.17mmol)DCC，反应混合物冰浴搅拌10分钟，得对应的活泼酯溶液(I)，待用。

将1.86g(4.74mmol)Tos·Ile-OBzl用无水THF溶解，然后用NMM，调pH＝8-9，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(II)加入反应液(I)中，得到的反应混合物室温搅拌24h。TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示有产物点生成，反应基本完全。滤除DCU，反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1.62g(87％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：436[M+H]⁺.

实施例38制备·Asn-Ile-OBzl

将1.53g(3.50mmol)Boc-Asn-Ile-OBzl溶解在15ml氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复用少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢，最后1.19g(95％)标题化合物，为无色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/e)：334[M-H]^-.

实施例39制备Boc-Pro-Asn-Ile-OBzl

按照实施例37的方法，由114g(5.33mmol)Boc-Pro和1.80g(4.85mmol)Asn-Ile-OBzl反应得到标题化合物2.49g(97％)，淡黄色油状物。ESI-MS(m/e)：533[M+H]⁺.

实施例40制备Pro-Asn-Ile-OBzl

按照实施例38的方法，将2.41g(4.53mmol)Boc-Pro-Asn-Ile-OBzl脱除Boc后得到2.04g(97％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：431[M-H]^-.

实施例41制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl

按照实施例37的方法，由1.82g(3.88mmol)Z-Leu和2.00g(4.27mmol)Pro-Asn-Ile-OBzl反应得到标题化合物2.34g(89％)，淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用三氯甲烷-甲醇系统纯化得到1.10g(42％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：680[M+H]⁺.

实施例42制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile

将1.10g(1.62mmol)Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl溶于15ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH＝12并搅拌2小时，TLC显示Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl消失。反应混合物用饱和硫酸氢钾溶液调pH＝7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和硫酸氢钾溶液调pH＝2，用乙酸乙酯萃取(30ml×3)。合并的乙酸乙酯相用饱和氯化钠水溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得0.90g(1.52mmol)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：588[M-H]^-.

实施例43制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(7a)

将1.91g(3.24mmol)Z-Leu-Pro-Asn-Ile溶于15ml无水THF中，冰浴下加入0.47g(3.49mmol)HOBt，并使完全溶解。然后加入0.72g(3.49mmol)DCC，反应混合物冰浴搅拌10分钟，得对应的活泼酯溶液(I)，待用。

将1.80g(2.94mmol)Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃用无水THF溶解，然后用NMM，调pH＝8-9，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(II)加入反应液(I)中，得到的反应混合物室温搅拌24h。TLC(展开剂CHCl₃∶MeOH＝15∶1)显示有产物点生成，反应基本完全。滤除DCU，反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，通过柱层析纯化方法，得到350mg(10％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1169[M+Na]⁺；Mp：90-91℃；[α]_D ²⁵＝-68.00(c＝0.50，CH₃OH)；IR(KBr)：3296，3064，2958，2930，2864，1670，1636，1532，1454，1246，1053，1021，739，695cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.20-8.17(d，J＝9Hz，1H)，8.00-7.97(d，J＝9Hz，1H)，7.83-7.80(d，J＝9Hz，1H)；7.69-7.60(m，1H)，7.51-7.44(m，2H)，7.42-7.34(m，10H)，7.22(m，1H)，6.95(s，1H)，5.01(s，4H)，4.57-4.49(m，2H)，4.32-4.23(m，5H)，3.63-3.54(m，6H)，3.10-2.97(m，4H)，2.63-2.55(m，1H)，2.44-2.37(m，1H)，2.28-1.98(m，2H)，1.96-1.65(m，9H)，1.50-1.16(m，21H)，1.12-1.04(m，2H)，0.90-0.79(m，15H).

实施例44制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(7b)

按照实施例43的方法，由Z-Leu-Pro-Asn-Ile 1.57g(2.66mmol)和1.55g(2.42mmol)Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃反应得到标题化合物2.69g(93％)淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用三氯甲烷-甲醇系统纯化得到320mg(11％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1197[M+Na]⁺；Mp：86-87℃；[α]_D ²⁵＝-49.67(c＝0.50，CH₃OH)；IR(KBr)：3297，3064，2953，2929，2868，1633，1533，1453，1246，1047，739，696cm^-1.

实施例45制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(7c)

按照实施例43的方法由Z-Leu-Pro-Asn-Ile 1.07g(1.81mmol)和1.10g(1.65mmol)Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃反应，通过柱层析纯化方法，用三氯甲烷-甲醇系统纯化得到270mg(14％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1225[M+Na]⁺；Mp：88-89℃；[α]_D ²⁵＝-102.00(c＝0.51，CH₃OH)；IR(KBr)：3292，30642953，2928，28581717，1633，1533，1454，1245，1048，740，695cm^-1.¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ/ppm＝9.30-9.28(d，J＝6Hz，1H)，9.02-9.00(d，J＝6Hz，1H)，8.47-8.45(d，1H，J＝6Hz)，8.06-7.94(m，2H)，7.74(m，1H)，7.32-7.28(m，10H)，6.93(s，1H)，6.63(s，1H)，6.24(m，1H)，5.58-5.55(m，1H)，5.33-5.24(m，1H)，5.08-5.03(m，4H)，4.85-4.66(m，3H)，4.45-4.33(m，3H)，3.84(m，2H)，3.54(m，3H)，3.03(m，4H)，2.39-2.96(m，5H)，1.95-1.60(m，9H)，1.47-1.28(m，27H)，0.98-0.69(m，17H).

实施例46制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(7d)

按照实施例43的方法，由Z-Leu-Pro-Asn-Ile 0.71g(1.20mmol)和0.76g(1.10mmol)Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃反应，通过柱层析纯化方法，用三氯甲烷-甲醇系统纯化得到200mg(13％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1253[M+Na]⁺；Mp：87-89℃；[α]_D ²⁵＝-111.00(c＝0.5，CH₃0H)；IR(KBr)：3294，3060，2958，2927，2857，1717，1633，1533，1454，1245，1048，740，695cm^-1；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.21-8.19(d，J＝6Hz，1H)，8.00-7.98(d，J＝6Hz，1H)，7.83-7.81(d，J＝6Hz，1H)，7.75-7.70(m，1H)，7.57-7.34(m，12H)，7.22(m，1H)，6.95(s，1H)，5.00(s，4H)，4.51-4.47(m，2H)，4.32-4.22(m，5H)，3.63-3.54(m，6H)，3.10-2.55(m，1H)，2.44-2.36(m，1H)，1.99-1.65(m，11H)，1.50-1.03(m，35H)，0.90-0.79(m，15H).

实施例47制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(7e)

按照实施例43的方法，由Z-Leu-Pro-Asn-Ile 1.61g(1.20mmol)和1.80g(2.49mmol)Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃反应得到标题化合物，通过柱层析纯化方法，用三氯甲烷-甲醇系统纯化得到380mg(12％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1281[M+Na]⁺.Mp：84-86℃；[α]_D ²⁵＝-83.67(c＝0.51，CH₃OH)；IR(KBr)：3294，3067，2927，2856，1717，1632，1533，1454，1245，1047，1025，739，695cm^-1；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝8.31-8.18(d，J＝6Hz，1H)，8.01-7.98(d，J＝6Hz，1H)，7.84-7.81(d，J＝6Hz，1H)，7.70(m，1H)，7.52-7.43(m，2H)，7.25(m，10H)，7.22(m，1H)，6.96(s，1H)，5.00(s，4H)，4.51-4.47(m，2H)，4.32-4.22(m，5H)，3.79-3.54(m，6H)，3.10-2.90(m，4H)，2.63-2.55(m，1H)，2.44-2.36(m，1H)，2.12-2.00(m，2H)，1.98-1.65(m，9H)，1.50-1.15(m，38H)，1.12-1.03(m，1H)，0.90-0.79(m，15H).

实施例48制备Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(7f)

按照实施例43的方法，由Z-Leu-Pro-Asn-Ile 1.55g(2.64mmol)和1.80g(2.40mmol)Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃反应得到标题化合物2.50g(81％)淡黄色油状物。通过柱层析纯化方法，用三氯甲烷-甲醇系统纯化得到540mg(18％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1309[M+Na]⁺；Mp：83-84℃.[α]_D ²⁵＝-78.67(c＝0.50，CH₃OH)；IR(KBr)：3299，2927，2852，1713，1679，1648，1536，1457，1241，1025，739，694cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)；δ/ppm＝8.19-8.17(d，J＝6Hz，1H)，7.99-7.97(d，J＝6Hz，1H)，7.82-7.80(d，J＝6Hz，1H)，7.69(m，1H)，7.51-7.34(m，12H)，7.21(m，1H)，6.94(s，1H)，5.01(s，4H)，4.51-4.49(m，2H)，4.32-4.22(m，5H)，3.63-3.54(m，6H)，3.08-2.96(m，4H)，2.62-2.58(m，1H)，2.44-2.37(m，1H)，2.01-1.65(m，11H)，1.50-1.23(m，40H)，1.08-1.03(m，2H)，0.90-0.79(m，16H).

实施例49制备Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃(8a)

将150mg(0.13mmol)Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₆CH₃置于50ml茄形瓶中，用乙醇溶解，加0.03g Pd/C(20％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，得92.45mg(81％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：880[M+2H]⁺；Mp：104-105℃；[α]_D ²⁵＝-113.67(c＝0.52，CH₃OH)；IR(KBr)：3298，2970，2931，2872，1649，1541，1455，1384，1344，1243，1071，759，693cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.37(s，3H)，8.16-7.79(m，2H)，7.61-6.98(m，1H)，4.62-4.47(m，2H)，4.36-3.99(m，5H)，3.56-3.45(m，4H)，3.08-2.91(m，3H)，2.75-2.71(m，2H)，2.63-2.57(m，1H)，2.44-2.42(m，1H)，2.06-1.65(m，12H)，1.53-0.96(m，25H)，0.92-0.77(m，15H).

实施例50制备Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃(8b)

按照实施例49的方法，由150mg(0.13mmol)

Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₈CH₃脱保护后得到101mg(84％)标题化合物与，无色固体。ESI-MS(m/e)：908[M+2H]⁺；Mp：101-102℃；[α]_D ²⁵＝-94.66(c＝0.51，CH₃OH)；IR(KBr)：3294，3069，2958，2962，2929，2866，1650，1542，1455，1377，1339，1243，1066，759，661cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.38(s，2H)，8.12-7.81(m，2H)，7.53-6.98(m，1H)，4.61-4.47(m，2H)，4.36-4.22(m，5H)，3.23(m，4H)，3.06-2.95(m，3H)，2.73(m，2H)，2.62-2.60(m，1H)，2.45(m，1H)，2.28-2.15(m，1H)，2.02-1.75(m，12H)，1.53(m，4H)，1.56-1.24(m，23H)，1.06(m，2H)，0.91-0.80(m，15H).

实施例51制备Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃(8c)

按照实施例49的方法，由150mg(0.12mmol)

Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₀CH₃脱保护后得到93mg(83％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：936[M+2H]⁺；Mp：103-104℃.[α]_D ²⁵＝-152.33(c＝0.53，CH₃OH)；IR(KBr)：3301，3066，2953，2928，2861，1648，1540，1454，1384，1345，1242，1066，693cm^-1；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.32(s，4H)，8.20-7.99(m，1H)，7.91-7.81(m，1H)，7.64-6.98(m，1H)，4.73-4.62(m，1H)，4.60-4.38(m，3H)，4.36-4.28(m，2H)，4.26-4.20(m，3H)，3.68-3.36(m，7H)，3.06-2.90(m，3H)，2.80-2.73(m，2H)，2.62-2.55(m，1H)，2.45-2.40(m，1H)，0.91-0.80(m，15H)，2.06-1.62(m，11H)，1.53-1.17(m，28H)，1.11-0.97(m，2H).

实施例52制备Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃(8d)

按照实施例49的方法，由100mg(0.08mmol)

Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₂CH₃脱保护后得到69mg(89％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：964[M+2H]⁺；Mp：99-100℃；[α]_D ²⁵＝-69.33(c＝0.52，CH₃OH)；IR(KBr)：3300，3064，2958，2927，2857，1650，1542，1456，1376，1344，1240，1066，759，657cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.39(s，4H)，8.24-8.02(m，1H)，7.99-7.82(m，1H)，7.65-7.39(m，1H)，4.62-4.49(m，3H)，4.47-4.37(m，2H)，4.22-4.19(m，2H)，3.76-3.67(m，6H)，4.01-3.82(m，3H)，3.10-2.90(m，3H)，2.73(m，2H)，2.62-2.55(m，1H)，2.45-2.42(m，1H)，2.16-1.65(m，12H)，1.53-1.46(m，5H)，1.35-1.15(m，28H)，0.93-0.77(m，15H).

实施例53制备Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃(8e)

按照实施例49的方法由150mg(0.12mmol)

Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₄CH₃脱保护后得到102mg(86％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：992[M+2H]⁺；Mp：99-100℃.[α]_D ²⁵＝-130.00(c＝0.54，CH₃OH)；IR(KBr)：3301，3063，2958，2926，2856，1650，1540，1457，1376，1344，1243，1070，693，658cm^-1；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.41(m，2H)，8.09-7.54(m，3H)，7.34(m，1H)，4.75-4.60(m，3H)，4.28-4.22(m，5H)，3.57-3.37(m，3H)，3.18-2.96(m，4H)，2.73(m，2H)，2.58(m，1H)，2.45(m，1H)，1.99-1.77(m，13H)，1.52-1.24(m，41H)，0.88-0.83(m，15H).

实施例54制备Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃(8f)

按照实施例49的方法，由200mg(0.16mmol)

Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)₁₆CH₃脱保护后得到134mg(82％)标题化合物，无色固体。ESI-MS(m/e)：1020[M+2H]⁺；Mp：100-101.3℃；[α]_D ²⁵＝-19.33(c＝0.5，CH₃0H)；IR(KBr)：3301，2958，2926，2855，1651，1542，1457，1346，1243，1066，759，649.cm^-1.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.32(s，4H)，7.82(m，2H)，4.50(m，3H)，4.49(m，3H)，4.28(m，3H)，3.76-3.55(m，6H)，3.45-3.37(m，3H)，3.04-2.95(m，3H)，2.74(m，2H)，2.55(m，1H)，2.38(m，1H)，1.99-1.76(m，5H)，1.52-1.46(m，5H)，1.35-1.09(m，39H)，0.91-0.80(m，15H).

实验例1本发明化合物8a-f抑制肿瘤细胞增殖试验

本发明的化合物8a-f均用PBS配制。共使用了HepG2(人肝癌细胞)、K562(慢性粒细胞白血病细胞)、HL60(人宫颈癌细胞)、S₁₈₀(小鼠腹水瘤细胞)、H22(小鼠肝癌细胞)5株肿瘤细胞(来自Lineberger Cancer Center，UNC-CH)。

分别将生长状态良好、处于对数生长期的HepG2、K562、HeLa、S₁₈₀、H22细胞按照3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度70μM、50μM、30μM和10μM加入经灭菌处理的本发明的化合物，对照组加入等体积溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的四噻唑兰(MTT)溶液，置于37℃及5％CO₂培养箱中孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μl DMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定吸光度(O.D.)值。计算抑瘤率及IC₅₀。结果列入表1。结果表明本发明的化合物8a-f对5株肿瘤细胞增殖有明确的抑制作用。

表1本发明化合物8a-f的体外抗肿瘤活性(IC₅₀±SDμM)

实验例2本发明化合物8a-f在S180小鼠模型上的抗肿瘤活性

测定前将本发明的化合物溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR雄性小鼠7天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为1×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2ml本发明化合物8a-f的水溶液，连续给药7天，剂量为6μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以五氟尿嘧啶(5-Fu，剂量为10mg/kg，76.89μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。结果列入表2。

表2本发明化合物8a-f对S₁₈₀荷瘤小鼠瘤重的影响

注：n＝12，瘤重表示为均值±SD g；a)与生理盐水组比较p＜0.01；b)与生理盐水组比较p＜0.001.

实验例3本发明化合物8a-f抗肿瘤细胞粘附试验

本发明的化合物8a-f均用PBS配制，使用了HepG2(人肝癌细胞)进行实验。

将96孔板用FN包被，并在4℃过夜孵育。2％BSA 30μL封板继续在37℃及5％CO₂培养箱中孵育3小时，弃各孔培养液。将生长状态良好、处于对数生长期的HepG2细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl，同时加入化合物8a-f，其终浓度为2μM及20μM。在37℃、5％CO₂培养箱中培养3小时，用PBS洗去没有粘附的细胞，其PBS后每孔加25μl浓度为5mg/mL的四噻唑兰(MTT，5g/L)溶液，置于37℃及5％CO₂培养箱中孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μlDMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定吸光度(O.D.)值。计算粘附抑制率，计算如下：粘附抑制率(％)＝1-(实验组细胞OD值/空白组细胞OD值)×100％，结果列入表3中。

表3化合物8a-f抑制HepG2细胞粘附率

8a-f浓度为2μM时有抑制肿瘤细胞粘附的作用，当浓度增加到20μM时，抑制粘附的能力有所增加。

实验例48a-f的自主装性能评价

1)水溶液中8a-f纳米球的粒径

先测得8a-f在水溶液中的临界胶束浓度为4×10^-5mg/ml。然后在Nano-ZS90纳米粒度测定仪上25℃测定8a-f在4×10^-5mol/L的粒径。结果表明，8a-f在水溶液中可组装为纳米球，从第一天到第八天8a-f化合物粒径在200-500nm之间，没有大的浮动，自组装成比较稳定结构。

2)8a-f的纳米球的形态

将8a-f配成浓度为4×10^-11mol/ml的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米球的形态。测定表明，8a-f形成规则的纳米球。8c的透射电子显微镜照片作为代表，用图3描述。

Claims (4)

1.脂肪胺链修饰的抗肿瘤寡肽，如下式：

Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃其中，n为6、8、10、12、14或16。

2.根据权利要求1所述寡肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)将保护基保护的脯氨酸(Pro)与饱和脂肪胺缩合，所述饱和脂肪胺为CH₃(CH₂)_nCH₂NH₂，n＝6、8、10、12、14或16；

(2)脱去保护基后，再按照现有液相合成技术，逐步接肽合成保护基保护的Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

(3)按照现有液相合成技术，逐步接肽合成保护基保护的Leu-Pro-Asn-Ile；

(4)将保护基保护的Leu-Pro-Asn-Ile与保护基保护的Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)nCH₃缩合后脱去保护基得到目标化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，按照如下步骤进行：

1)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)存在下Boc-Pro在无水THF中与饱和脂肪胺NH₂CH₂(CH₂)_nCH₃脱水形成Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；其中n为6、8、10、12、14或16；

2)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃脱除Boc生成Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

3)在DCC和HOBt存在下Boc-Lys(Z)在无水THF中与Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃缩合生成Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

4)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃脱除Boc生成Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

5)在DCC和HOBt存在下Boc-Ser在无水THF中与Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃缩合生成Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NH-CH₂(CH₂)_nCH₃；

6)将Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃经柱层析纯化后，在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃脱除Boc生成Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

7)在DCC和HOBt存在下Boc-Asn在无水THF中与Ile-OBzl缩合生成Boc-Asn-Ile-OBzl；

8)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Asn-Ile-OBzl脱除Boc生成Asn-Ile-OBzl；

9)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro在无水THF中与Asn-Ile-OBzl缩合生成Boc-Pro-Asn-Ile-OBzl；

10)在含氯化氢的乙酸乙酯中Boc-Pro-Asn-Ile-OBzl脱除Boc生成Pro-Asn-Ile-OBzl；

11)在DCC和HOBt存在下Z-Leu在无水THF中与Pro-Asn-Ile-OBzl缩合生成Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl；

12)将Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl经硅胶柱纯化后，在甲醇中将Z-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl皂化为Z-Leu-Pro-Asn-Ile；

13)在DCC和HOBt存在下Z-Leu-Pro-Asn-Ile在无水THF中与Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃缩合生成Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃；

14)在甲醇中Z-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Z)-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃氢解为Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro-NHCH₂(CH₂)_nCH₃。

4.权利要求1所述的寡肽在制备抗肿瘤和抗粘附药物中的应用。

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