CN102803503B - 愈创木酚产生菌的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种试样中的愈创木酚产生菌的检测方法，其特征在于，在含有1种以上的下式[式中，R为-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3的烷基或C1-C3的链烯基，该烷基及链烯基可以被-OH、-C(O)H或-COOH取代]表示的化合物的嗜酸菌用固体培养基上平板培养试样或其稀释物，检测形成的菌落。优选的例子中，嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上的香草酸，平板培养在20℃～55℃下进行。本发明还提供用于检测试样中的愈创木酚产生菌的嗜酸菌用固体培养基及试剂盒。根据本发明，能够通过迅速且简便的方法检测果汁原料等试样中存在的愈创木酚产生菌。

Description

愈创木酚产生菌的检测方法及检测试剂盒
关联的申请
本申请要求基于日本专利申请2009-142242(2009年6月15日申请)及日本专利申请2009-222796(2009年9月28日申请)的优先权，将其内容作为参照引入本说明书中。
技术领域
本发明涉及果汁原料中的愈创木酚产生菌的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
已知在用作果汁饮料和果汁加工食品的原料的果汁中，可能含有即使在通常的酸性饮料或食品的加热杀菌条件下也能生存的耐热性嗜酸菌(TAB)。在代表性耐热性嗜酸菌即Alicyclobacillus属的细菌中，已知Alicyclobacillus acidoterrestris(AAT)及Alicyclobacillusacidiphilus(AAP)为愈创木酚产生菌(以下称作愈创木酚产生菌)。特别是有报道指出AAT菌经由香草醛及香草酸产生愈创木酚(果汁协会报2005年12月号，p.1-15；非专利文献2)。愈创木酚虽没有毒性，但具有异臭，所以产品中含有愈创木酚产生菌时，饮料的风味显著恶化。特别是原料果汁中的AAT经常被视为问题。因此，检查原料果汁和果汁饮料产品中的愈创木酚产生菌的存在，在原料及产品的品质管理中非常重要。
作为AAT的检测方法，已知下述方法：在添加有香草醛的液体培养基中添加果汁饮料进行培养，利用感官检查确认愈创木酚的臭气的方法(日本特开平7-123998；专利文献1)；在香草酸的存在下培养含有试样的培养液，进一步通过使用过氧化物酶法的处理使生成的愈创木酚显色，通过定性或使用特别装置的分光定量分析确认愈创木酚产生菌的存在的方法(日本特开2004-201668；专利文献2)；使用对于愈创木酚生成酶基因特异性的引物，通过PCR检测的方法(日本特开2003-000259；专利文献3)等。
目前广泛使用的AAT的检测方法基于上述专利文献2的技术，是一种过氧化物酶法，即，在含有香草酸的液体培养基中培养试样，检测所生成的愈创木酚，由此间接地辨别有无AAT。
但是，在过氧化物酶法中，为了在液体培养基中使AAT增殖，需要适当的预培养，因此操作变得烦杂，需要花费时间来得到结果。例如，为了定量地检测试样的AAT，首先在平板培养基中形成菌落，选择多个菌落，将各个菌落进一步在液体培养基中培养，这是烦杂的操作且需要4～6天的时间。
进而，使用过氧化物酶法辨别有无AAT时，在过氧化物酶的作用下使愈创木酚转化为四愈创木酚，染成棕色，由此进行辨别，因此，在试样为接近该色调的橙汁等的原料或培养基时，难以辨别。由于颜色也受到原料的不同批量和培养基的高压灭菌器条件等的影响，所以为了通过目视进行比色判定，需要判定者相当熟练。另外，为了正确的判定，对每个试样及每个培养基制作标准曲线的基础上，需要用分光光度计进行分析、或用GC-MS进行分析，因此还需要昂贵的分析仪器和烦杂的操作。
另一方面，作为使用固体培养基的方法已知有30℃培养法，其原理是根据培养温度进行愈创木酚产生菌和愈创木酚非产生菌的分选。例如，在低于AAT的生长最佳温度(40～50℃)的30℃下进行培养，确认菌落的有无。但是，由于在30℃培养时AAT的生长也下降，所以不仅AAT的检测灵敏度下降，而且有时也检测出生长温度区域低的对象外的愈创木酚非产生菌。因此，进行30℃培养法时，进行预培养，提高AAT的检测灵敏度，此时，所有步骤需要花费8～10天的时间，并且选择性也不能说很充分。进而，由于进行预培养，所以存在不能得到定量性的问题。
进而，已知柑橘类的水果和葡萄中含有的多酚类等成分抑制AAT的增殖。因此，检查100％果汁等果汁浓度高的原料时，需要适当稀释试样进行试验。例如，如果为橙汁时稀释至1％进行试验，但需要根据果汁的种类和产地研究稀释率，这使上述各试验的操作更加复杂。
因此，人们谋求一种不需要复杂的操作、昂贵的仪器或操作者的熟练度、且能在短时间内正确判断原料果汁中是否存在愈创木酚产生菌的方法。还需要在果实生产地和果汁原料制造设施中也能检查的简便方法。
本说明书中引用的参考文献如下所述。下述文献中记载的内容全部作为参照引入本说明书中。
专利文献1：日本特开平7-123998
专利文献2：日本特开2004-201668
专利文献3：日本特开2003-000259
非专利文献1：“耐热性嗜酸菌统一检查法手册”，社团法人日本果汁协会，2005年P.25
非专利文献2：果汁协会报2005年12月号p.1-15
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测果汁原料等试样中存在的愈创木酚产生菌的、迅速且简便的方法。
本发明人等发现通过使用以特定的浓度范围含有具有甲氧基苯酚骨架的化合物的固体培养基，在培养基上愈创木酚产生菌能够选择性地增殖，形成菌落。通过检测固体培养基上的菌落形成，能简便地检测被检试样中是否存在愈创木酚产生菌，进而通过计算菌落，能简便地测定被检试样中存在的愈创木酚产生菌的数量。
本发明提供了一种试样中的愈创木酚产生菌的检测方法，其特征在于，在含有一种以上下式表示的化合物的嗜酸菌用固体培养基上培养试样或其稀释物，检测所形成的菌落，
[式中，R为-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3的烷基或C1-C3的链烯基，该烷基及链烯基可以被-OH、-C(O)H或-COOH取代]。具体而言，提供了下述方法，即，不需要现有的方法中所需的预培养或定性分析所需要的处理(利用过氧化物酶法显色)、能直接检测且能直接定量的方法。优选化合物选自香草醛、香草酸、阿魏酸、愈创木酚、4-羟基-3-甲氧基苯丙烯醛、4-羟基-3-甲氧基苯基丙酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲醇、甲氧基对苯二酚、4-羟基-3-甲氧基苯乙醛及4-乙烯基愈创木酚。更优选化合物为香草醛、香草酸或阿魏酸。
特别优选，嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上的香草酸、500ppm以上的香草醛、或25ppm以上的阿魏酸。更优选嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上225ppm以下、进而优选50ppm以上75ppm以下的香草酸。平板培养优选在20℃～55℃、较优选在30℃～45℃、特别优选在30℃(27℃～33℃)下进行。本发明中，为±10％左右的温度偏差时，可以期待同样的效果。
在另一方面，本发明提供一种愈创木酚产生菌检测试剂盒，所述试剂盒用于检测试样中的愈创木酚产生菌，含有嗜酸菌用固体培养基，所述嗜酸菌用固体培养基含有具有甲氧基苯酚骨架的化合物，特别含有香草醛、香草酸或阿魏酸。
进而，在另一方面，本发明提供一种含有嗜酸菌用固体培养基的愈创木酚产生菌选择培养基，所述嗜酸菌用固体培养基含有具有甲氧基苯酚骨架的化合物，特别含有香草醛、香草酸或阿魏酸。
通过使用本发明的方法，能够迅速且简便地检测果汁原料等试样中存在的愈创木酚产生菌。
具体实施方式
本发明的愈创木酚产生菌检测方法的特征在于，在嗜酸菌用固体培养基上平板培养试样或其稀释物，检测所形成的菌落，所述嗜酸菌用固体培养基含有具有甲氧基苯酚骨架的化合物、特别含有香草醛、香草酸或阿魏酸中的任一种。愈创木酚产生菌经由香草醛及香草酸产生愈创木酚。有报道指出阿魏酸虽为香草醛的关联物质，但并不直接参与利用AAT产生愈创木酚的过程。本发明基于下述发现而完成：香草酸不抑制愈创木酚产生菌的增殖，但抑制不产生愈创木酚的Alicyclobacillus属的细菌的增殖。至今为止，虽已知AAT在含有香草酸的培养基中能生成愈创木酚，但本发明首次发现在含有香草酸的固体培养基中，愈创木酚产生菌和愈创木酚非产生菌的增殖速度不同。根据本发明的方法，通过抑制愈创木酚非产生菌的增殖，愈创木酚产生菌优先增殖，因此，能够选择性地检测愈创木酚产生菌。
根据本发明的方法检查的试样为饮食品的原料、半成品及产品，为怀疑含有耐热性嗜酸菌的试样。具体可以举出作为酸性果汁原料的橙汁、苹果汁、橘子汁等，它们的半成品、它们的浓缩果汁及使用这些果汁原料制造的饮料及食品。另外，耐热性嗜酸菌在为了饮食品的杀菌而通常使用的加热处理条件下不会完全死亡，并且由于抑制物质的存在，有时在浓缩的果汁中不增殖而在含有稀释果汁的产品中增殖，因此，可以根据原料及产品的性质及流通的形态，将品质管理中一般认为需要检测的任意试样作为试样进行检测。根据本发明的方法，不需要现有方法中所需的预培养或用于确认的处理(使用过氧化物酶法显色)，能够直接检测愈创木酚产生菌，且能够测量培养基中的菌落的数量，由此可以直接定量。
进而，基于本发明的方法的愈创木酚产生菌培养基、和利用其的愈创木酚产生菌检测试剂盒，由于不需要在预培养和用于确认的处理中使用的器具或试剂，所以分析迅速且简便，并且是一种小型的试剂盒。
通过本发明的方法被检测的愈创木酚产生菌，主要是目前为止已经被鉴定的Alicyclobacillus acidoterrestris(AAT)及Alicyclobacillus acidiphilus(AAP)。其中，AAT经常从果汁原料中被检测到，而AAP则很少被检测到。因此，在品质管理上，如果基本上能够检测AAT，则可以说足够了，但本发明的方法，如下所述通过改变培养基中的香草酸的含量，可以在能够仅检测AAT的条件下实施，也可以在能够检测AAT和AAP两者的条件下实施。本发明的方法也可以用于检测能够产生愈创木酚的其它Alicyclobacillus属的细菌。对于上述细菌，有一些报道，但尚未详细调查。另一方面，作为不产生愈创木酚的Alicyclobacillus属的细菌，已知Alicyclobacillus acidocaldarius、Alicyclobacillus pomorum等。
在本发明的方法中，使用含有1种以上下式表示的、具有甲氧基苯酚骨架的化合物的嗜酸菌用固体培养基作为仅愈创木酚产生菌选择性形成菌落的选择培养基，
[式中，R为-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3的烷基或C1-C3的链烯基，该烷基及链烯基可以被-OH、-C(O)H或-COOH取代]。
作为具有甲氧基苯酚骨架的化合物，优选香草醛(R＝C(O)H)、香草酸(R＝COOH)、阿魏酸(R＝CH＝CH-COOH)、愈创木酚(R＝H)、4-羟基-3-甲氧基苯丙烯醛(R＝CH＝CH-C(O)H)、4-羟基-3-甲氧基苯基丙酸(R＝CH2CH2COOH)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醇(R＝CH2OH)、甲氧基对苯二酚(R＝OH)、4-羟基-3-甲氧基苯乙醛(R＝C(O)CH3)、及4-乙烯基愈创木酚(R＝CH2＝CH2)。报道称上述化合物均作为阿魏酸的代谢产物由微生物生产。
特别优选，作为具有甲氧基苯酚骨架的化合物使用香草醛、香草酸或阿魏酸中的任一种。或者，可以混合使用香草醛、香草酸及阿魏酸的2种或3种。作为嗜酸菌用培养基，只要为嗜酸菌用通常使用的培养基即可，可以为任意培养基。优选使用易于购买、经过深入研究的YSG培养基(含有酵母提取物、可溶性淀粉、葡萄糖，pH3.0～4.0)。香草醛、香草酸或均为市售。培养基中添加的香草醛、香草酸或阿魏酸的浓度，根据是否需要检测AAT和AAP两者、或仅检测AAT，可以如下选择。
当仅检测AAT即可时，可以使用50ppm以上的香草酸。优选香草酸的浓度为50～225ppm，较优选为75～200ppm，更优选为100～200ppm。使用香草醛时，浓度可以为500ppm以上，优选为900～1000ppm。使用阿魏酸时，为25ppm～50ppm的浓度，优选为约50ppm。
期望检测到AAT和AAP两者时，可以使用50ppm～75ppm的香草酸。现有的方法主要用于仅针对AAT进行检验，该AAT即使在愈创木酚产生菌中污染的可能性也特别高，而本发明的方法，通过适当选择香草酸的添加量，也可以检测到AAP等其它愈创木酚产生菌。
对于除香草醛、香草酸或阿魏酸之外的、具有甲氧基苯酚骨架的化合物，可以与下述实施例同样地求出最适浓度。
固体培养基可以按照常规方法如下制造，即，在YSG培养基中加入琼脂及规定量的1种以上具有甲氧基苯酚骨架的化合物，灭菌后，使琼脂固化，由此制造。由于培养基的pH低，所以培养基与琼脂一起高压灭菌处理时，有时没有良好地固化，因此，优选适当调节琼脂量、或将培养基和琼脂分别灭菌后混合、或将pH中性附近的培养基和琼脂灭菌后加入酸调节pH。用于涂抹时，固体培养基可以在培养皿中制成，或者在用于混稀时，可以在烧瓶、烧杯等中制成。
本发明的方法中，将试样直接或适当稀释后加入固体培养基中进行平板培养。为了易于计算菌落数量，试样可以连续稀释(1，1/10、1/100等)使用。另外，由于Alicyclobacillus属的细菌形成芽胞，所以优选在将试样加入培养基之前，在70℃下热处理20分钟左右，进行热休克，以使菌体活性化。通过混稀法检测时，将琼脂培养基熔解加入试样，混合后转移到培养皿中使其固化。使用涂抹法检测时，可以将试样涂抹在培养皿中的固体培养基上。使用膜过滤器法检测时，通过膜过滤器过滤试样后，将该过滤器置于培养皿中的固体培养基上。
只要在愈创木酚产生菌的生长温度域(20℃～55℃)内即可，可以在任意温度下进行培养，但为了提高从愈创木酚非产生菌中的选择性，在50℃以下、较优选在45℃以下、更优选在40℃以下、特别优选在30℃(27℃～33℃)下进行。需要说明的是，本发明中，有±10％左右的温度偏差时，可以期待同样的效果。本发明中，令人惊异地发现，通过在固体培养基中添加香草酸，愈创木酚产生菌的检测灵敏度显著提高。例如，确认了在含有75ppm的香草酸的固体培养基中于30℃下将AAT培养5天时，和在相同培养基中于45℃培养3天时形成相同数量的菌落。这表明在AAT的生长温度区域中能够正确地定量。即，本发明的方法显著提高检测灵敏度，是一种不需要预培养、且能够迅速且简便地进行更正确的定量的创新方法。进而，由于低温和香草酸的影响，也不会检测出对象外的菌。另外，使用香草醛或阿魏酸代替香草酸时，也观察到同样的倾向。
培养进行规定时间、例如3～5天后，通过目视确定有无菌落，能够判定试样中是否存在愈创木酚产生菌。另外，通过计算菌落的数量，能够容易地由试样的稀释率求出试样中的菌体的数量。按照本发明的方法，不需要特别的装置或技巧，能够简便地得到正确的定量数据。
另一方面，本发明提供了一种用于检测试样中的愈创木酚产生菌的试剂盒。所述试剂盒至少含有嗜酸菌用固体培养基，所述嗜酸菌用固体培养基含有1种以上下式表示的、具有甲氧基苯酚骨架的化合物，
[式中，R为-H、-OH、-C(O)H、-C(O)CH3、-COOH、C1-C3的烷基或C1-C3的链烯基，该烷基及链烯基可以被-OH、-C(O)H或-COOH取代]。嗜酸菌用固体培养基可以以经灭菌在表面皿中制成的形式提供，用于混稀时，也可以以在烧瓶、烧杯等中制成的形式提供。膜过滤器法用的试剂盒还可以包括膜过滤器及过滤装置。试剂盒还可以包括连续稀释制备用的平板、阳性对照用的愈创木酚产生菌及使用说明书。
本说明书中明确引用的全部专利及参考文献的内容全部作为参照引入本说明书中。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于所述实施例。
实施例1
使用添加有香草醛、香草酸或阿魏酸的YSG琼脂培养基，调查耐热性嗜酸菌(TAB)是否能形成菌落。使用的菌株为A.acidoterrestrisATCC49025、A.acidiphilus JCM21417、A.acidocaldarius ATCC27009、A.pomorum JCM21459的4个菌株。其中，A.acidoterrestrisATCC49025、A.acidiphilus JCM21417被报道是产生愈创木酚的菌株。
将YSG培养基(Merck公司，YGS Agar；20.0g)和香草酸(和光纯药工业株式会社；0～250mg)加热溶解在1000g水中，实施高压蒸汽灭菌(121℃，15分钟)。冷却至约50℃后，用10％硫酸调节pH为3.7，制作平板培养基。
在70℃对各菌株的菌液实施热休克20分钟。用磷酸盐缓冲液连续稀释菌液至103CFU/mL，在平板培养基上各涂抹100μL进行培养。在45℃下培养3天后，目视确认到了已经形成的菌落。
添加75ppm香草酸时，对于愈创木酚产生菌2个菌种，检测出为与无添加培养基同等的水平以上，而对于其它2个菌种，1个菌落也没检测到。添加100ppm香草酸时，对于A.acidoterrestrisATCC49025，检测出为与无添加培养基同等的水平以上，而对于其它3个菌种，1个菌落也未检测到。进而，在添加150ppm、200ppm香草酸的水平时，对于A.acidoterrestris ATCC49025，也检测出为与无添加培养基同等的水平。添加225ppm香草酸时，AAT的检测灵敏度下降，添加250ppm以上时，检测不到菌落。
接下来，使用香草醛或阿魏酸代替香草酸，进行同样的实验，在培养基难以固化时，适当调节琼脂量。实施例1的结果归纳示于下表中。
[表1]
添加香草酸实验结果(在45℃下培养3天)
添加香草酸实验结果(在45℃下培养3天)
添加阿魏酸实验结果(在45℃下培养3天)
*○：显示出与基质无添加(＝YSG培养基)同等或其以上的检出性；△：即使检出，检出性也很差；×：表示检测不到。
实施例2
使用添加有香草醛、香草酸或阿魏酸的YSG琼脂培养基，研究因培养温度引起的A.acidoterrestris ATCC49025的菌落检测率的不同。向YSG培养基中加入75ppm香草酸，与实施例1同样地制备固体培养基，将含有相同数量A.acidoterrestris ATCC49025的菌液涂抹在平板培养基上，在45℃或30℃下培养。使用无添加的YSG培养基作为对照。
在45℃下培养3天时的菌落数及在30℃下培养5天时的菌落数示于下表。数值是以在无添加YSG培养基中于45℃培养3天时的菌落数作为100时的相对值表示的。
[表2]
  45℃，3天   30℃，5天
 无添加   100   21
 香草酸75ppm   183   186
使用无添加YSG培养基在30℃下培养5天时，与在45℃下培养3天时相比，不能检测出充分的菌落。这证实在30℃培养法中需要预培养。
另一方面，加入75ppm香草酸时与无添加的培养基相比，在45℃下检测出更多的菌落。这暗示，通过添加香草酸能够促进A.acidoterrestris ATCC49025的菌落形成，检测灵敏度变高。使用50ppm香草酸、750ppm香草醛或25ppm阿魏酸代替75ppm香草酸时，检测灵敏度也变高。
进而，添加75ppm香草酸时，即使在30℃下培养5天时也能够检测出与45℃下培养3天时几乎相同数量的菌落。综合考虑实施例1的结果，即香草酸的存在抑制愈创木酚非产生菌的增殖，可知通过使用含有香草酸的培养基在30℃下培养试样，能够以高灵敏度且特异性地检测出愈创木酚产生菌。
产业上的可利用性
本发明的方法在饮食品及其制造原料的品质管理中有用。本发明的方法不需要现有方法中所需的预培养和用于确认的处理(使用过氧化物酶法的显色)，能够直接检测愈创木酚产生菌且能直接定量，因此，能够显著削减在对品质有不良影响的菌的检测中所需的时间和费用。进而，基于本发明的方法的愈创木酚产生菌检测试剂盒不需要在预培养和用于确认的处理中使用的器具、试剂，小型且简便，能够迅速检测，所以产业上的有用性高。

Claims (11)

1.一种试样中的愈创木酚产生菌的检测方法，其特征在于，在含有50ppm以上225ppm以下的香草酸、500ppm以上1000ppm以下的香草醛或25ppm以上50ppm以下的阿魏酸的嗜酸菌用固体培养基上培养试样或其稀释物，检测所形成的菌落。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上、225ppm以下的香草酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上、75ppm以下的香草酸。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述培养在20℃～55℃下进行。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述培养在27℃～33℃下进行。
6.一种用于检测试样中的愈创木酚产生菌的试剂盒，所述试剂盒含有经灭菌的嗜酸菌用固体培养基，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上225ppm以下的香草酸、500ppm以上1000ppm以下的香草醛或25ppm以上50ppm以下的阿魏酸。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上、225ppm以下的香草酸。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上、75ppm以下的香草酸。
9.一种愈创木酚产生菌检测培养基，所述培养基由含有50ppm以上225ppm以下的香草酸、500ppm以上1000ppm以下的香草醛或25ppm以上50ppm以下的阿魏酸的嗜酸菌用固体培养基构成。
10.如权利要求9所述的培养基，其中，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上、225ppm以下的香草酸。
11.如权利要求9所述的培养基，其中，所述嗜酸菌用固体培养基含有50ppm以上、75ppm以下的香草酸。
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