CN102796157A

CN102796157A - 告达亭衍生物，其药物组合物及其用途

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Publication number: CN102796157A
Application number: CN2011101355036A
Authority: CN
Inventors: 陈纪军; 王立军; 张雪梅; 马云保; 罗杰; 黄晓燕
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: CN102796157B

Abstract

下述通式（Ⅰ）的告达亭衍生物，其中R₁，R₂，R₃，R₄单独为和/或其组合为：芳香酰基、取代芳香酰基、杂芳酰基、取代杂芳酰基、二元羧酸单酰基HOOC-M-CO-或无机酸基；HOOC-M-CO-中的M为亚烷基、芳香基、取代芳香基、杂环基、取代杂环基、或烯烃基。以其为活性成分的药物组合物，其制备方法，以及该类衍生物及其药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和抗乙型肝炎药物中的应用。

Description

告达亭衍生物,其药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及告达亭衍生物，以其为活性成分的药物组合物，其制备方法，以及该类衍生物及其药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和抗乙型肝炎药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）导致的乙型病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎已经严重影响人类健康，是影响人类寿命的九大疾病之一。据世界卫生组织报道，全球有超过20亿人为乙型肝炎病毒携带者，其中约3亿人为慢性终身感染并发病。中国属于乙型病毒性肝炎的高流行区，中国的慢性HBV携带者可能超过1.2亿，约占全世界的慢性HBV感染者的1/3。

乙肝疫苗在防止HBV感染过程中起到了很重要的作用，但是疫苗对已经感染者无效。抗HBV治疗药物主要针对清除或持久抑制HBV的复制，以减轻或终止肝脏炎症、坏死和纤维化病变;阻止病变向肝功能失代偿、肝硬化、肝功能衰竭和肝癌发展。目前抗乙肝病毒药物分为免疫调节剂、核苷类和中药等药物。临床上用于治疗慢性乙肝的免疫调节剂有干扰素（IFN-α和聚乙二醇（PEG）IFN-α）等。在国内上市的核苷类药物有拉米夫定（Lamivudine，3-TC）、阿德福韦酯（Adefovir dipivoxil，ADV）、恩替卡韦（Entecavir, ETV）、替诺福韦（Tenofovir）、替比夫定（Telbivudine, LdT）。在其他国家上市和进行临床研究的核苷类抗HBV药物还有恩曲他滨（Emtricitabine, FTC）、克拉夫定（Clevudine, L2FMAU）、泛昔洛韦（Famciclovir, FCV）、帕拉德福韦（Pradefovir）、泛托西他滨（Valtorcitabine）、依夫西他滨（Elvucitabin）等。核苷类药物主要是通过抑制HBV DNA逆转录酶的活性而发挥抗HBV作用，具有强的抗HBV作用，患者耐受性良好等优点，但是有停药后易复发，引起病情恶化，甚至发生肝脏失代偿，以及长期治疗后产生耐药性等缺点，一些药物还可导致头疼，恶心，腹泻等副作用。

由于核苷类抗HBV药物的耐药性及副作用，寻找结构新颖、新的作用机制的非核苷类药物已经成为了研究热点。我国研制的联苯双酯和双环醇是具有降酶作用治疗乙肝的药物。充分利用天然抗HBV物质，从丰富的天然药物资源中寻找有效成分，或以其为先导物进行结构修饰，开发活性更强的抗HBV药物，对新药研究与开发具有重要意义。

基于本发明的抗HBV随机筛选，发现告达亭衍生物具有抗HBV作用。告达亭衍生物是以植物中存在的告达亭(caudatin)为原料，采用化学合成方法所得到的系列化合物。告达亭在萝摩科鹅绒藤属（Cynanchum）植物白首乌（Cynanchum auriculatum）（陈纪军等. 云南植物研究, 1989, 11 (3), 358-360, 1990, 12(2): 197-210）、青羊参（Cynanchum otophyllum）（Mu Quanzhang et al. Scientia Sinica (Series B), 1986, 29 (3), 295-301,）、Cynanchum caudatum (Tsukamoto S et al. Chem Pharm Bull, 1985, 33: 2291-2304 )等植物中以苷的形式大量存在。文献报道告达亭及其苷对实验癌细胞均有较强的抑制作用，告达亭及告达亭-2, 6-二去氧-3-O-甲基-β-D-吡喃加拿大麻糖苷的活性最好，对人肝癌细胞SMMC-7721的IC₅₀分别为24.95和13.49 μM [Zhang RS, et al. Chemistry & Biodiverstry. 2007, 4, 887-892. Peng YR, et al. Phytomedicine, 2008, 15, 1016–1020.]。1996年Simon Gibbons报道3-O-脂肪酰基（C_1-6）的告达亭衍生物具有抗癌活性[GB2296496A]。

现有技术中没有本发明提供的告达亭衍生物及其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有该类衍生物或其药物组合物应用在制备或治疗乙型肝炎药物中的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种新的具有药用价值的化合物达亭衍生物（

），其中含有治疗乙型肝炎有效量的化合物告达亭衍生物（

）及药用载体或赋形剂的用于治疗乙型肝炎药物组合物，其制备方法，该化合物或其药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

发明提供了一种新的具有药用价值的化合物达亭衍生物（

）。

Figure 2011101355036100002DEST_PATH_IMAGE002

其中R₁，R₂，R₃，R₄可以单独为或其组合为：芳香酰基、取代芳香酰基、杂芳酰基、取代杂芳酰基、二元羧酸单酰基HOOC-M-CO-或为无机酸基；

HOOC-M-CO-中的M为亚烷基、芳香基、取代芳香基、杂环基、取代杂环基、或烯烃基。

所述的芳香酰基是具有苯环的芳香酰基；

所述的取代芳香酰基是具有苯环的芳香酰基的苯环上具有不同取代基的取代芳香酰基，其中的取代基是烷基、羟基、烷氧基、乙酰氧基、卤素、硝基、氨基、取代氨基，取代基的位置是苯环的2、3、4、5、6位单取代或二取代或三取代或四取代或五取代；

所述的杂芳香酰基是芳环上含氮原子、或氧原子、或硫原子的六元或五元杂环或五并六元环；

所述的取代杂芳酰基，其中的取代基是烷基、卤素、烷氧基；

所述的芳香酰基为：苯甲酰基、苯乙酰基、桂皮酰基（苯丙烯酰基）；

所述的取代芳香酰基是：3-甲氧基苯甲酰基、3-硝基苯甲酰基、咖啡酰基、阿魏酰基、异阿魏酰基、（邻或间或对）香豆酰基、（2-或3-或4-）甲氧基桂皮酰基、（2-或3-或4-）甲基桂皮酰基、（2-或3-或4-）氟桂皮酰基、（2-或3-或4-）氯桂皮酰基、（2-或3-或4-）溴桂皮酰基、（2-或3-或4-）三氟甲基桂皮酰基、（2-或3-或4-）三氟甲氧基桂皮酰基、3,5-二氟桂皮酰基、3,4-亚甲氧基桂皮酰基、3,4,5-三甲氧基桂皮酰基；

所述的杂芳香酰基是吡啶酰基、吡唑酰基、苯并呋喃酰基、苯并吡喃酰基、苯并噻吩酰基、吲哚酰基、噻唑酰基；

所述的取代杂芳香酰基是：2-甲氧基-5-吡啶酰基、2-氟-5-吡啶酰基、5-溴-2-吡啶酰基、3-甲氧基-5-噻唑酰基、1-甲基-1氢-5-吡唑酰基；

所述的二元羧酸单酰基HOOC-M-CO-中的M为C_1-4的烷基或C_2-4的烯烃基；

所述的无机酸基是磷酸基或磺酸基。

药物组合物，含有上述通式（Ⅰ）的告达亭衍生物及可药用载体或赋形剂。

上述通式（Ⅰ）的告达亭衍生物在制备药物中的应用。

上述通式（Ⅰ）的告达亭衍生物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。

上述通式（Ⅰ）的告达亭衍生物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

上述药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用以及在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

本发明还提供了制备上述通式（Ⅰ）告达亭衍生物的方法在于告达亭、适当的羧酸（或酰氯）、4-二甲胺基吡啶的二氯甲烷溶液中加入N，N-二环己基碳二亚胺，过滤除去白色沉淀，减压回收二氯甲烷，得粗品；或在适当酸酐/吡啶体系中室温搅拌反应2~24小时，稀盐酸、饱和碳酸氢钠和饱和食盐水分别洗涤，干燥后减压蒸干，得粗品；粗品经硅胶柱层析，用石油醚∶丙酮洗脱得告达亭衍生物。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1 – 99%，优选为0.5 – 90%的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射（静注、肌注）和口服两种形式给药。

更具体地，本发明提供的化合物告达亭衍生物（Ⅰ）可按如下方法制备：

告达亭羧酸酯是告达亭与适当的羧酸或酰氯在一定的催化剂存在下在有机溶剂中反应制得。告达亭与羧酸或酰氯的投料摩尔比为0.5-10。催化剂可以是4-二甲胺基吡啶（DMAP）、吡啶、三乙胺、N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）、偶氮二甲酸二异丙酯（DIAD）、偶氮二甲酸二异丙酯（DEAD）等。有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷、吡啶、二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、二甲亚砜（DMSO）等。反应温度是-20-200℃，最好是室温。

告达亭二元羧酸衍生物是告达亭与适当的酸酐在一定的催化剂存在下在有机溶剂中反应制得。告达亭与酸酐的投料摩尔比为0.5-10。催化剂可以是4-二甲胺基吡啶（DMAP）、三乙胺等。有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷、吡啶、二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、二甲亚砜（DMSO）等。反应温度是0-200℃，最好50-110℃。

告达亭无机酸衍生物是告达亭与无机酸酰卤在碱存在下在有机溶剂中反应制得。告达亭与无机酸酰卤的投料摩尔比为0.5-10。碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、吡啶、4-二甲胺基吡啶（DMAP）、三乙胺、二乙胺等。有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷、吡啶、二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、二甲亚砜（DMSO）等。反应温度是-50-100℃，最好室温。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质性内容，下面用本发明的实施例来说明本发明化合物告达亭衍生物（Ⅰ）的制备方法和药理作用结果，但不以此来限定本发明。

化合物制备实施例 1

告达亭（Caudatin）的制备：

取白首乌块根粗粉10公斤，以90 %乙醇60公斤提取三次，每次3小时，合并乙醇提取液，浓缩至体积约10升，加入1 % 的盐酸1升，加热回流2小时水解。水解液以氯仿萃取三次，每次5升，合并氯仿萃取液，以饱和NaHCO₃ 溶液和食盐水分别洗3次，回收氯仿溶液至干，得告达亭粗品1000克。

将告达亭粗品1000克以丙酮溶解，吸附于2000克硅胶上，室温挥发至干，过60-100目筛，备用。取5000克柱层析硅胶（200-300目，青岛美高公司），湿法以氯仿混合溶剂填充于玻璃色谱柱中（柱直经18 cm, 填充硅胶高度36 cm），上样，以甲醇-氯仿（0:100—10:90,体积比）混合溶剂洗脱，流速100 ml/min，每5升为一流份，Si TLC薄板检查（青岛美高公司，展开剂：甲醇-氯仿，5：95），将含有告达亭的流份合并，回收溶剂得告达亭粗品300克。

将告达亭粗品300克以丙酮溶解，吸附于600克硅胶上，室温挥发至干，过60-100目筛，备用。取3000克柱层析硅胶（200-300目，青岛美高公司），湿法以丙酮-石油醚（25：75,体积比）混合溶剂填充于玻璃色谱柱中（直经18cm, 填充硅胶高度36cm），上样，以丙酮-石油醚（25：75，体积比）混合溶剂洗脱，流速100 ml/min，每2.5升为一流份，Si TLC薄板检查（青岛美高公司，展开剂：丙酮-石油醚，40：60），将含有告达亭的流份合并，回收溶剂得告达亭180克。经波谱数据（¹H NMR, ¹³ C NMR, MS, IR）测定，以及与标准品对照，确认所得告达亭与文献报道一致（陈纪军等. 云南植物研究, 1989, 11 (3), 358-360），作为以下制备告达亭衍生物的原料使用。

3-O-桂皮酰基告达亭衍生物的制备：

在10 mL圆底烧瓶中加入0.4mmol (200 mg) 告达亭、0.2mmol （14mg）4-二甲胺基吡啶（DMAP）和0.6mmol（89mg）桂皮酸，然后加入5毫升无水二氯甲烷，搅拌溶解后，冰浴条件下再加0.6mmol（124mg）N-二环己基碳二亚胺（DCC）。搅拌，反应温度自然升至室温。TLC检测告达亭反应完后，反应液过滤，二氯甲烷溶液用稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液分别洗涤三次，然后用无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，得粗品，经硅胶柱层析，用石油醚：丙酮（85:15）洗脱得化合物3-O-桂皮酰基告达亭160毫克。

质谱（MS）用VG Auto Spec - 3000型质谱仪测定，采用ESI–MS技术；核磁共振谱（¹H NMR和¹³C NMR）用Bruker AM–400超导核磁共振仪测定，TMS作内标；青岛海洋化工厂出品的200 - 300目硅胶作为柱层析材料。

3-O-桂皮酰基告达亭结构数据：¹H NMR (CDCl₃, 400MHz): δ 1.06 (d, 6H, J=6.8 Hz, 5′, 6′-2CH₃), 1.20 (3H, s, 19- CH₃), 1.40 (3H, s, 18-CH₃), 1.60 (1H, m, 9-H), 1.84-2.00 (9H, m, overlap), 2.13 (3H, s, 7′-CH₃), 2.17 (3H, s, 21-CH₃), 2.24 (2H, s, 7-H), 2.37 (1H, m, 4′-H), 2.49 (2H, m, 4-H), 2.86 (1H, m, 16-H), 4.59 (1H, t, 6.8 Hz, 12-H), 4.78 (1H, m, 3-H), 5.45 (1H, s, 6-H), 5.53 (1H, s, 2′-H), 6.42 (1H, d, 16.0 Hz, 2″-H), 7.38 (3H, m, overlap, 6″, 7″-H), 7.52 (2H, m, 5″-H), 7.68 (1H, d, 16.0 Hz, 3″-H), ¹³C NMR (CDCl₃, 400MHz): δ 9.4 (C-18), 16.5 (C-7′), 18.5 (C-19), 20.8 (C-6′), 20.9 (C-5′), 24.2 (C-11), 27.0 (C-2), 27.2 (C-21), 31.7 (C-16), 33.2 (C-7), 34.2 (C-15), 37.0 (C-10), 38.0 (C-1), 38.2 (C-4′), 38.5 (C-4), 43.6 (C-9), 58.0 (C-13), 71.6 (C-12), 73.8 (C-3), 74.2 (C-8), 87.9 (C-14), 91.4 (C-17), 112.9 (C-2′), 118.4 (C-6), 118.8 (C-2″), 128.0 (2C-5″), 128.8 (2C-6″), 130.2 (C-7″), 134.4 (C-4″), 139.4 (C-5), 144.7 (C-3″), 166.0 (C-3′), 166.3 (C-1″), 167.0 (C-1′), 208.9 (C-20). ESI-MS: m/z 643 [M+Na]⁺ HRESIMS: calc for C₃₇H₄₈O₈Na [M+Na]⁺ 643.3246, found 643.3232.

化合物制备实施例2-43

依照实施例1在10 mL圆底烧瓶中加入0.4 mmol (200 mg) 告达亭、0.2mmol （14mg）4-二甲胺基吡啶（DMAP）和0.6mmol相应取代的桂皮酸，然后加入5毫升无水二氯甲烷，搅拌溶解后，冰浴条件下再加0.6mmol（124mg）N-二环己基碳二亚胺(DCC)。搅拌，反应温度自然升至室温。TLC检测告达亭反应完后，反应液过滤，二氯甲烷溶液用稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液分别洗涤三次，然后用无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，得粗品，经硅胶柱层析，用石油醚：丙酮（70:30-90:10）洗脱，制备以下结构告达亭衍生物：

Figure 2011101355036100002DEST_PATH_IMAGE003

表1 实施例2-48化合物结构

Figure 2011101355036100002DEST_PATH_IMAGE004

化合物制备实施例44

3-O-单丁二酸告达亭酯的制备：在10 mL圆底烧瓶中加入200 mg 告达亭、274mg丁二酸酐、8 ml吡啶室温搅拌反应18 h，反应液倾入30 ml冰水中，乙酸乙酯萃取（3×50 ml），乙酸乙酯层分别用5%盐酸，饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，减压回收乙酸乙酯，得粗品，经硅胶柱层析，用7∶3的石油醚∶丙酮洗脱得化合物3-O-单丁二酸告达亭酯，收率78.3%。

3-O-单丁二酸告达亭酯结构数据：¹H NMR (CD₃(C=O)CD₃, 400MHz): δ 1.05 (d, 6H, J=6.8 Hz, 5′,6′-2CH₃), 1.18 (3H, s, 19- CH₃), 1.51 (3H, s, 18-CH₃), 1.63 (1H, m, 9-H), 1.83-2.02 (9H, m, overlap), 2.10 (3H, s, 7′-CH₃), 2.15 (3H, s, 21-CH₃), 2.03-2.09(2H, m, overlap, -CH ₂-), 2.26 (2H, s, 7-H), 2.37 (5H, m, 4′-H, 2 - CH₂-), 2.49 (2H, m, 4-H), 2.86 (1H, m, 16-H), 4.47 (1H, dd, 4.3, 11.4 Hz, 12-H), 4.58 (1H, m, 3-H), 5.34 (1H, s, 6-H), 5.55 (1H, s, 2′-H), ¹³C NMR (CD₃(C=O)CD₃, 400MHz): δ 10.3 (C-18), 16.5 (C-7′), 18.3 (C-19), 20.9 (C-3″), 21.1 (C-6′), 21.2 (C-5′), 24.9 (C-11), 27.2 (C-21), 27.9 (C-2), 31.7 (C-16), 32.7(C-2″), 33.1 (C-4″), 33.8 (C-7), 33.9 (C-15), 37.0 (C-10), 38.5 (C-1), 38.7 (C-4′), 39.0 (C-4), 44.3 (C-9), 58.0 (C-13), 72.3 (C-12), 74.3 (C-3), 74.5 (C-8), 89.4 (C-14), 92.5 (C-17), 112.9 (C-2′), 120.1 (C-6), 139.0 (C-5), 165.6 (C-3′), 165.7 (C-1′), 172.7 (C-1″), 174.1 (C-5″), 208.7 (C-20). EI-MS: m/z 604 HREIMS: calc for C₃₃H₄₈O₁₀ 604.3247, found 604.3238.

下面的抗乙肝病毒药理作用试验例用来说明本发明的告达亭衍生物的药理作用结果：

试验例1：

本发明上述的化合物制备实施例得到的化合物告达亭衍生物（Ⅰ）在HepG 2.2.15细胞模型上对乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和HBV DNA的抑制作用以及其对细胞的毒性：

1 材料和方法

1.1 材料:化合物告达亭衍生物；泰诺福韦(江西晨阳药业有限公司)作阳性对照药；HBV转染的Hep G 2.2.15细胞 (自行传代培养)；细胞培养液：高糖培养液添加10 %胎牛血清，0.03 % L–谷氨酰胺，100 mg/L G418, 105 IU/L青酶素，100 mg/L链霉素，用5% Na₂CO₃调pH至6.8–7.0；高糖DMEM (GIBICO)；G418 (GIBICO)；胎牛血清 (天津血研所)；L–谷氨酰胺 (AMRESCO)；青霉素，链霉素 (石药集团中诺药业(石家庄)有限公司)；HBsAg和HBeAg试剂盒 (安图生物工程公司)。

Hep G2.2.15细胞，用高糖DMEM液培养，培养液添加10 %胎牛血清，0.03 % L–谷氨酰胺，100 mg/L G418, 10⁵ IU/L青酶素，100 mg/L链霉素，5% NaHCO₃调pH至6.8 – 7.0。

仪器：酶标仪Bio-RAD 680(美国)；CO₂培养箱Thermo Forma 3310 (美国)；倒置生物显微镜XD-101型（南京）等。

实验过程

1.4.1 HBsAg和HBeAg分泌抑制活性的测定：

利用ELISA (酶联免疫吸附试验)法，测定样品对HBsAg和HBeAg分泌抑制活性。Hep G2.2.15细胞接种与48孔板，3 ×10⁴细胞每孔，加入生长培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72 h，吸除原培养基，加入不同浓度待测样品溶液，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72 h。取上清液，分别利用HBsAg和HBeAg试剂盒检测。利用酶标仪测定溶液在的吸光度值(490 nm)。

抑制率η _inhibitory = (A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100

IC₅₀ = Anti lg [(50 – <50 %抑制率) / (>50 %抑制率 – <50 %抑制率)×lg (稀释倍数)+lg (<50 %抑制率的浓度)]

SI = CC₅₀/IC₅₀

1.4.2 HBV DNA复制抑制活性的测定：

Hep G2.2.15细胞接种于24孔细胞板， 5 ×10⁵个每孔，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72 h。更换为含药培养基，培养48 h后再次更换一次含药培养基，继续培养48h。使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Gemomic DNA Kit，TIANGEN，China)提取DNA。用荧光定量PCR的方法定量检测HBV DNA载量。1μL DNA样品用20 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) 以及2条 HBV特异的引物作为PCR扩增体系: 前引物(5' GGA ACC TCT ATG TAT CCC TCC 3') ，后引物(5' TCC GTC CGA AGG TTT GGT AC 3'). 扩增以及检测试用Mastercycler Ep Realplex System 定量PCR仪(Eppendorf, Masteraycler Eprealplex, German) 在95 °C 预热 2 分钟,并按95 °C (20秒)，58 °C (15秒)，72 °C (20秒)的条件重复进行40 个循环的反应。根据结果计算药物的抑制百分率和IC₅₀值，计算方法与1.4.1相同。

细胞毒性测定：

根据Mosmann建立的MTT法检测药物的细胞毒性。具体方法是：Hep G2.2.15细胞接种与48孔板，3 ×10⁴细胞每孔，加入生长培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72 h，吸除原培养基，加入不同浓度待测样品溶液，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72 h。吸除上清后(用于两抗测定)，每孔加入浓度为0.4 mg/mL的MTT，0.3 mL，于5% CO₂，37 ℃孵育4 h。吸除上清液，每孔中加入0.3 mL二甲基亚砜，于37 ℃孵育10 min，在酶标仪上测定溶液在的吸光度值(490 nm)。根据结果计算药物对细胞的破坏百分率：

破坏率η_destroy = (A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100

CC₅₀ = Anti lg [(50 – <50 %破坏率) / (>50 %破坏率 – <50 %破坏率)×lg (稀释倍数)+lg (<50 %破坏率的浓度)]

2. 结果：对HBsAg, HBeAg的抑制作用结果以选择指数（Sective Index, SI，SI = CC₅₀ / IC_50,为评价药物临床应用前景的参数）来评价，其中SI ﹥ 2为无毒有效，1 < SI < 2为有毒有效，SI ﹤ 1为有毒无效。具体结果见表2：

表2 告达亭衍生物（Ⅰ）对Hep G2.2.15细胞的毒性作用、对HBsAg和HBeAg分泌抑制活性及HBV DNA复制抑制活性表

其他告达亭衍生物对HBsAg和HBeAg分泌抑制活性IC₅₀范围在0.05-500 μM之间，对HBV DNA复制抑制活性IC₅₀范围在0.01-400 μM之间.

3.结论：实验结果显示，化合物告达亭衍生物在体外对Hep G2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有较好的抑制作用，对HBV DNA 的复制有较强的抑制作用。

制剂实施例

制剂实施例1：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

制剂实施例2：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

制剂实施例3：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

制剂实施例4：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。

制剂实施例5：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，按常规口服液制法制成口服液。

制剂实施例6：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

制剂实施例7：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

制剂实施例8：

按制备实施例1的方法先制得告达亭衍生物，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。

Claims

1.具有下述通式（Ⅰ）的告达亭衍生物，

Figure 2011101355036100001DEST_PATH_IMAGE001

（Ⅰ）

其中R₁，R₂，R₃，R₄单独为和/或其组合为：芳香酰基、取代芳香酰基、杂芳酰基、取代杂芳酰基、二元羧酸单酰基HOOC-M-CO-或无机酸基；HOOC-M-CO-中的M为亚烷基、芳香基、取代芳香基、杂环基、取代杂环基、或烯烃基。

2.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物，其中：

所述的芳香酰基是具有苯环的芳香酰基；

所述的无机酸基是磷酸基或磺酸基。

3.根据权利要求1或2所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物，其中：

所述的芳香酰基是苯甲酰基、苯乙酰基、桂皮酰基即苯丙烯酰基；

所述的取代芳香酰基是3-甲氧基苯甲酰基、3-硝基苯甲酰基、咖啡酰基、阿魏酰基、异阿魏酰基、（邻或间或对）香豆酰基、（2-或3-或4-）甲氧基桂皮酰基、（2-或3-或4-）甲基桂皮酰基、（2-或3-或4-）氟桂皮酰基、（2-或3-或4-）氯桂皮酰基、（2-或3-或4-）溴桂皮酰基、（2-或3-或4-）三氟甲基桂皮酰基、（2-或3-或4-）三氟甲氧基桂皮酰基、3,5-二氟桂皮酰基、3,4-亚甲氧基桂皮酰基、3,4,5-三甲氧基桂皮酰基；

所述的取代杂芳香酰基是：2-甲氧基-5-吡啶酰基、2-氟-5-吡啶酰基、5-溴-2-吡啶酰基、3-甲氧基-5-噻唑酰基、1-甲基-1氢-5-吡唑酰基。

4.药物组合物，含有权利要求1所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物及可药用载体或赋形剂。

5.权利要求1－3所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物在制备药物中的应用。

6.权利要求1－3所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。

7.权利要求1－3所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

8.权利要求4所述的药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。

9.权利要求4所述的药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

10.制备权利要求1所述的通式（Ⅰ）的告达亭衍生物的方法，其特征在于告达亭、适当的羧酸或酰氯、4-二甲胺基吡啶的二氯甲烷溶液中加入N，N-二环己基碳二亚胺，过滤除去白色沉淀，减压回收二氯甲烷，得粗品；或在适当酸酐/吡啶体系中室温搅拌反应2~24 小时，稀盐酸、饱和碳酸氢钠和饱和食盐水分别洗涤，干燥后减压蒸干，得粗品；粗品经硅胶柱层析，用石油醚∶丙酮洗脱得告达亭衍生物。