CN102787132A - 利用酵母甘露糖异构酶基因获得转基因拟南芥植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用真核生物酵母甘露糖异构酶基因PMI获得转基因拟南芥的方法。本发明的特征是，以酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因为筛选标记，通过农杆菌介导的转化方法将PMI基因和其它基因一起导入受体拟南芥，对转化后的拟南芥种子在含甘露糖的培养基上进行筛选，通过PCR检测和RT-PCR检测，得到转基因植株。本发明的优点是在植物转化及筛选过程中不需要添加抗生素和除草剂，并且转基因植物本身也不含有抗生素基因或抗除草剂基因，对环境和人体安全，消除人们对转基因生物安全的在筛选标记基因方面的担心。

Description

利用酵母甘露糖异构酶基因获得转基因拟南芥植物的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及利用来源于酿酒酵母的甘露糖异构酶(PMI)基因(pmi)作为拟南芥转基因的筛选标记，直接在含甘露糖的培养基上对拟南芥种子的萌发状态进行筛选，快速方便。并且在筛选过程中不需要添加抗生素或除草剂，获得的转基因植物也不含抗生素或除草剂基因，因而对人体和环境安全，是一种绿色转基因植物方法。

背景技术

植物基因转化的关键在于用一种合适的选择标记基因把极少数的转化子从未转化细胞中筛选出来，或者是杀死未转化细胞，或者是给转化细胞以生长优势。通常所利用的选择标记基因有；潮霉素抗性基因hpt、卡那霉素抗性基因npt II、除草剂抗性基因bar，这些筛选系统的原理都是未转化细胞被杀死，转化细胞能将筛选剂分解为无毒物质而得以生存繁殖。但这些筛选系统由于使用抗生素或除草剂及其基因，已经引起了社会的广泛争议。为了消除这种不利影响，目前采取的方法有：使用安全选择标记基因，主要有绿色荧光蛋白基因gfp、核糖醇操纵子-rtl、甘露糖磷酸异构酶(phosphomannose-isomerase，PMI)基因pmi、木糖异构酶基因xyl A和谷氨酸-1-半醛转氨酶基因heml(王兴春和杨长登，转基因植物生物安全标记基因.中国生物工程杂志，2003，23(4)：19-22.)；或者消除选择标记基因，包括利用共转化系统、位点重组系统、λ噬菌体插入/切割系统，以及转座子转座消除选择标记基因(Barbara et al.Elimination ofselection markers from transgenic plants.Current Opinion in Biotechnology，2001，2：139-143.)。

磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose-isomerase，PMI)基因pmi(是最近发展起来的一种正向选择标记基因。自然界中PMI基因广泛存在于细菌、酵母、动物和人类。在植物中除了肉桂和其他一些豆科植物外，都没有PMI基因(Lee and Matheson，Phosphomannoisomerase and phosphoglucoisomerase in seeds of Cassiacoluteoides and some other legumes that synthesize galactomannan.Phytochem，1984，23：983-987.)，因此，PMI基因可以作为选择标记应用于植物基因转化。

目前，植物基因转化中所利用的PMI基因都是来自于大肠杆菌。此筛选系统以PMI基因为选择标记基因，以甘露糖为筛选剂。1987年Malca等发现植物细胞不能在以甘露糖为碳源的培养基上正常生长分化。当植物细胞在含有甘露糖的培养基中生长时，植物细胞从培养基中吸收甘露糖，并在己糖激酶的作用下将甘露糖磷酸化为6-磷酸甘露糖，不含PMI基因的细胞不能进一步利用6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖的积累一方面会消耗细胞内的无机磷酸(Sheu-Hwa et al.，Stimulation of photosynthetic starch formation by sequestrationof cytoplasmic orthophosphate.New Phytol，1975，74：383-392.)，另一方面会抑制葡萄糖磷酸异构酶而阻碍糖酵解过程(Goldsworthy and Street，The carbohydrate nutrition of tomato roots VIII.The mechan-ism of the inhibition by D-mannose of the respiration of excised roots.Ann Bot，1965，29：45-58.)，这就使未转化的细胞在含有甘露糖的培养基上发生碳饥饿不能正常生长。而转化的细胞含PMI基因，在甘露糖磷酸异构酶PMI的作用下将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，6-磷酸果糖能够参与糖酵解而被进一步利用，这样就使转化细胞能够以甘露糖为碳源，在含有甘露糖的培养基上正常生长，而获得代谢优势(Joersbo et al.，Analysisof mannose selection used for transformation of sugar beet.Mol Breed，1998，4：111-117.)。

PMI/甘露糖筛选系统不仅可以用于转化细胞的筛选，而且还可以用于种子和幼苗的筛选。早在1958年Ferguson等就发现甘露糖能够抑制番茄根的生长，之后又发现甘露糖能抑制拟南芥种子的发芽(Pego et al.，Mannose Inhibits Arabidopsis Germination via a Hexokinase-Mediated Step.Plant Physiology，1999，119：1017-1023.)和拟南芥初生根的伸长(Baskin et al.，The impact ofmannose and other carbon sources on the elongaion and diameter of the primary root of Arabidopsis thaliana.2001 Australian Journal of Plant Physiology 28：481-488.)，但这种抑制作用并不是由于无机磷酸的过渡消耗引起的ATP不足，而是由于己糖激酶磷酸化甘露糖促发的信号途径(Jang and Sheen Sugar sensing in higherplants.The plant cell，1665-1679；Pego et al.Mannose Inhibits Arabidopsis Germination via aHexokinase-Mediated Step.Plant Physiology，1999，119：1017-1023.；Baskin et al.，The impact of mannose andother carbon sources on the elongaion and diameter of the primary root of Arabidopsis thaliana.2001 AustralianJournal of Plant Physiology 28：481-488.)。此信号途径导致了有关发芽的基因受到抑制或使种子内储藏物质的利用受阻，在外加碳源，如：蔗糖、葡萄糖、果糖的作用下，能够逆转甘露糖对种子和幼苗的抑制作用。

PMI基因作为选择标记基因自从在甜菜(Joersbo et al.，Analysis of mannose selection used fortransformation of sugar beet.Mol Breed，1998，4：111-117.)中首次获得成功以来，已经成功应用于：拟南芥(Todd and Tague，Phosphomannose Isomerase：A Versatile Selectable Marker for Arabidopsis thalianaGerm-Line Transformation.Plant Molecular Biology Reporter，2001，19：307-319.)、水稻(Lucca et al.，Effectiveselection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent.Molecular Breeding7：43-49)、玉米(Wang et al.，A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants fromprotoplasts.Plant Cell Reports，2000，19：654-660.；Gadaleta et al.，Phosphomannose isomerase，pmi，as aselectable marker gene for durum wheat transformat-ion.Journal of Cereal Science，2006，43：31-37.)、小麦(Wright et al.，Efficient biolistic transf-ormation of maize(Zea mays L.)and wheat(Triticum aestivum L.)using the phosphomannose isomerase gene，pmi，as the selectable marker.Plant Cell Rep，2001，20：429-436.；Gadaleta et al.，Phosphomannose isomerase，pmi，as a selectable marker gene for durum wheat transformation.Journal of Cereal Science 43：31-37)、高梁(Gao et al.，Agrobacterium tumefaciens-mediated sorghumtransformation using a mannose selection system.Plant Biotechnology Journal 3：591-599)、甘蔗(Jainet al.，Prospecting the utility of a PMI/mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane(Saccharum spp.hybrid)plants.Plant Cell Rep 26(5)：581-590)、番茄(Sigareva et al.，An efficient mannoseselection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants.Plant Cell Rep23：236-245)等。此标记不仅安全无毒，对环境无害，而且筛选效率比常用选择标记基因高。

但是，以上研究中所用的磷酸甘露糖异构酶基因都是来自于大肠杆菌，目前还没有利用酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为拟南芥等植物遗传转化的筛选标记的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种使用来源于酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶基因PMI作为拟南芥遗传转化的筛选标记，直接在含甘露糖的筛选培养基上对转基因的拟南芥种子进行快速准确的筛选鉴定转基因植物。本发明的PMI基因来源于酿酒酵母，与来源于细菌的PMI基因相比，该基因更适合真核生物拟南芥的转化，因而可以提高该转基因植物的安全性。

本发明是这样实现的：

一种农杆菌介导的拟南芥花序侵染法获得转基因植株的方法，其步骤包括PCR、基因克隆、载体构建、遗传转化。其要点是，筛选标记基因PMI来源于酿酒酵母，通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因PMI导入到拟南芥中，利用不含抗生素的甘露糖代替传统的抗生素或除草剂作为筛选剂，筛选得到转基因植株；最后通过PCR和RT-PCR方法检测鉴定所得到的转基因植株。

本发明的具体步骤如下：

1、引物设计与转化载体检测：

培养含有PMI基因的转化质粒载体根癌农杆菌EHA105(含有pPMI基因)。根据已知酿酒酵母PMI基因序列(Genebank登记号：M85238)，用Primer Premier 5生物软件设计一对引物，检测根癌农杆菌中是否含有该基因存在。扩增PMI基因的引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物P1：5′-GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG-3′；

反向引物P2：5′-GCCTCGAGATAGAAAGAAAGCTAATTTGG-3′；

转化前用常用的LB培养基活化该菌株。

2、植物材料与生长

拟南芥种子采用报道的荷格伦特营养液(成分及使用浓度见表1)水溶液培养，待主花序长到3-10cm时，从基部剪去主花序，促进侧枝生长，一个星期后用于转化。

3、遗传转化

拟南芥花须浸染方法参照Clough和Bent报道的方法(Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana The Plant Journal.199816，735-743)，具体步骤如下：浸染前四天从-70℃取出转化好的根癌农杆菌菌株EHA105，在LB固体培养基上划线，28℃培养，两天后挑单菌落接种到10mL LB培养液中28℃ 200rpm培养18-24h。以体积比为1∶100的培养物接种到1.5L新鲜的LB培养液中，28℃ 200rpm摇菌过夜。8000rpm 5min收集菌体，重悬于含有1/2MS无机盐成分、附加50g/L的蔗糖、0.2g/L的Silwet-77的浸染液中，调OD600值至0.8左右。将浸染液倒在培养盆中，然后将拟南芥倒置，并让花序浸泡在浸染液中10-30S。浸染后用卫生纸吸干植株上多余的水分，放回培养室中，用黑色塑料袋遮盖避光培养24h。每隔一周浸染一次，共浸染三次。收集所有的种子。

4、转化拟南芥的筛选

拟南芥种子先用75％的酒精浸泡5min，再用含50％漂白剂浸泡5min，然后用无菌水冲洗5次，尽量吸干水后，放在4℃的冰箱中春化3天。方法是：用0.1％的琼脂糖悬浮种子，播种于甘露糖筛选培养基上，该甘露糖筛选培养基的配方为：MS基本培养基+0.4-1g/L甘露糖+0.4％Phytagel，pH5.8。

在23℃16h长日照的培养箱中培养。两周之后将可能的转基因植株移栽到水培培养液中23℃ 8h短日照培养。

5、PCR检测转基因植株。

提取拟南芥转化植株叶片的总DNA和RNA(具体方法见实施例1)，用引物P1、P2对拟南芥进行PCR和RT-PCR检测。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因PMI基因(Genbank登录号M85238)序列，序列全长为1455bp。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：本发明的植物转化载体pPMI物理图谱。

图3：PMI基因扩增PCR检测图。图中泳道序号如下：M，DL2000 marker；1-10，10个独立的酵母DNA样品作为模板进行PCR扩增得到的特异条带。

图4：拟南芥转化后代植株种子的甘露糖筛选效果。图中标记如下：A-D为在筛选条件下的拟南芥正常生长植株和未生长的拟南芥种子，E，F为筛选过程中出现的白化苗。

图5：拟南芥转基因植株的PCR检测。图中泳道序号如下：1，DL2000 maker；2，未转化植株；3-6，转化植株；7，pPMI质粒

图6：拟南芥转基因植株RT-PCR检测。图中泳道序号如下：1，DL2000 maker；2，未转化植株；3-5，转化植株；6，pPMI质粒

图7：拟南芥转基因植株的GUS染色检测。

具体实施方式

实施例1

含酵母PMI基因的质粒pPMI的农杆菌EHA105的制备

申请人构建的含有PMI基因的转化载体(或称为转化质粒)是pPMI，该质粒载体是由质粒pCAMBIA1303改造而成，由酿酒酵母中克隆的PMI基因代替原质粒pCAMBIA1303中的潮霉素抗性基因，在左右边界中除了PMI基因以外，该基因本身含有GUS-GFP融合蛋白基因。本实施例中的转化质粒pPMI的构建流程图见图2。

浸染前四天从-70℃取出根癌农杆菌菌株EHA105，在LB固体培养基上划线，28℃培养两天。用下列引物对(下划线为酶切位点)扩增所述的PMI基因，所用的引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物P₁：5′GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG3′，

下游引物P₂：5′GCCTCGAGATAGAAAGAAAGCTAATTTGG3′。

在50μLPCR反应液中含：1×buffer、1.5mM MgCl₂、200μM dNTP、0.4μM引物、2U LA DNA聚合酶(TaKaRa)、0.1μg酵母DNA，反应条件为：94℃ 2min预变性；94℃ 30S变性，56℃ 45S退火，72℃ 1min30S延伸，20个循环；72℃ 5min保温。确定有无PMI基因的产物，结果见图2，证明有PMI基因的存在。

实施例2材料来源及受体准备

本实施例中的拟南芥编号CS3081(品种名称：Nossen)由美国拟南芥生物资源中心(ArabidopsisBiological Resource Center)赠送。种子装入1.5mL的离心管中，加少量水湿润，放于4℃冰箱中春化3天。先用75％的酒精浸泡种子5～10min，并不停地颠倒混匀，再用无菌水冲洗5遍。为了转化，无菌种子先播种于无菌滤纸上，23℃16h长日照培养。种子发芽2～3天后，将幼苗移栽到荷格伦特营养液中(成分见表1)，具体步骤是：先在33cm×24cm×8cm的培养盆中加入2.5L荷格伦特营养液，再将与培养盆盆底大小相近的塑料泡木板打上直径约1～1.5cm的六个孔，并用充分吸水的海绵块塞住小孔，与空气接触的海面块表面略低于塑料泡木板的表面，然后将带有海面块的塑料泡木板置于培养液面，最后把拟南芥幼苗放在海面块的表面，并保证植株竖立。23℃ 8h短日照培养，等主花序长到3～10cm时，从基部剪去主花序，促进侧枝生长，一个星期后用于转化。

表1本发明所用的报道的荷格伦特营养液及使用浓度

实施例3

拟南芥的遗传转化

拟南芥植株的转化采用通常的花序浸染法(Clough和Bent，1998)。主要步骤如下：挑LB平板上单菌落农杆菌，接种到10mL LB培养液中，28℃ 200rpm培养18～24h。以体积比为1∶100的培养物接种到1.5L新鲜的LB培养液中，28℃ 200rpm摇菌过夜。8000rpm 5min收集菌体，重悬于含有1/2MS基本培养基的无机盐成分，加50g/L蔗糖、2X10^-3g/L Silwet-77的浸染液中，调OD600值到0.8左右。将浸染液倒在培养盆中，然后把拟南芥倒置，并让花序浸泡在浸染液中10～30S。浸染后用卫生纸吸干植株上多余的水分，放回培养室中，温度在23-24℃之间，用黑色塑料袋遮盖避光培养24h。每隔一周浸染一次，共浸染三次。继续培养，收集所有的种子。

实施例4拟南芥转化子的筛选

将实施例3收获的拟南芥种子先用75％的酒精浸泡5min，再用含50％漂白剂浸泡5min，然后用无菌水冲洗5次，尽量吸干水后，放在4℃的冰箱中3天(此为春化过程)。用0.01g/L的琼脂糖悬浮种子，播种于含甘露糖的筛选培养基上：该筛选培养基的配方为：MS基本培养基+0.4-1g/L的甘露糖+0.04g/L的Phytagel。

在23℃16h长日照的培养箱中培养，两周之后将可能的转基因植株移栽到荷格伦特营养液中23℃，8h短日照培养。筛选效果见图3，可以很明显的看到，转化后的拟南芥种子的大部分不能够萌发，或者生长缓慢，并且常常出现白化苗，只有少数的拟南芥种子可以生长。

实施例5检测转基因植株

取筛选出的拟南芥叶片进行DNA和RNA的提取，拟南芥总DNA提取方法如下：

1.将拟南芥的新鲜叶片放在研钵中，加入400ml CTAB溶液(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版，科学出版社)，或同时加入石英砂和CTAB研磨，然后转入1.5ml离心管中；

2.在65℃水浴30min～60min(每10min反转摇匀一次)；

3.加等体积的氯仿—异戊醇(体积比24∶1)，或加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀15min；

4.11,000rpm离心10～15min，取上清于新管中；

5.向上清中加入2倍体积的无水乙醇(或2/3体积的异丙醇)沉淀DNA，室温放置20min；

6.11,000rpm离心6min，去上清；

7.加75％的乙醇清洗DNA，每次11000rpm 2～3min，去上清；

8.风干后加入50ul的TE缓冲液或无菌水溶解DNA；

9.放于4℃冰箱保存。

拟南芥RNA提取方法如下：

1.液氮研磨叶片，每1.5ml试管中加入0.1g样品；

2.每管加入1ml Trizol试剂，迅速混匀，室温放置10分钟；

3.添加200ul氯仿，迅速混匀15S，在室温放置10分钟，以利于核算蛋白质的解离；

4.于4℃，12000rpm下离心15min；

5.吸取上清，放置于新的试管中；

6.在试管中加入500ul异丙醇，室温放置10min；

7.于4℃，12000rpm离心15min；

8.弃上清，加入70％DEPC处理的乙醇，重悬沉淀；

9.于4℃离心5min，去上清，使沉淀自然干燥，加入20-30ul DEPC处理的水。

用引物P1、P2对拟南芥总DNA进行PCR及RT-PCR扩增检测，实施条件见实施例1。用没有转化的拟南芥作为对照，检测结果见图4、图5所示。可看到转化拟南芥中有PMI的DNA和转录产生的RNA。对所得到的转基因拟南芥叶片进行GUS化学组织染色检测(见图6)，结果证明GUS基因在拟南芥转基因植株中得以表达。

Claims (1)

1.一种利用酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因获得转基因拟南芥植物的方法，其特征在于，以酿酒酵母甘露糖异构酶PMI基因作为安全的转基因筛选标记，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的PMI基因导入受体拟南芥中，利用甘露糖代替抗生素或除草剂作为筛选剂，将转化后的拟南芥种子在含有甘露糖的培养基上进行筛选：

其步骤如下：

1)利用XhoI限制性内切酶对质粒pCAMBIA1303进行酶切，切除其中的潮霉素基因hpt；

2)设计如下一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：

正向引物P1：5′-GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG-3′，

反向引物P2：5′-GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG-3′；

扩增酿酒酵母甘露糖异构酶PMI基因，得到如序列表SEQ ID NO：1所示的DNA片段，片段长度为1455bp；

3)将步骤2)得到的SEQ ID NO：1所示的DNA片段连接到到步骤1)所述的质粒pCAMBIA1303中，得到重组质粒pPMI；

4)将重组质粒pPMI转化根癌农杆菌，得到含有pPMI质粒的根癌农杆菌，将所述的根癌农杆菌培养于YEP培养基中，得到转化菌株

5)使用水培方法，将拟南芥CS3081于23℃，8h短日照下培养，待主花序为3～10cm长时，从其基部剪去主花序，促进侧枝生长，于7天后用于转化；

6)将步骤5)的拟南芥花序浸泡到步骤4)的农杆菌菌液中，使农杆菌菌液的浓度保持至OD₆₀₀＝1.0，处理时间为10s，在23℃16h长日照的培养箱中培养，两周之后将转基因植株移栽至水培培养液中，23℃，8h短日照下培养；收获被转化拟南芥植株上的所有种子；

7)在含有1g/L的甘露糖筛选培养基上，播种步骤6)的拟南芥种子，得到转基因植株；

8)采用PCR和RT-PCR方法检测转基因植物；

其中

步骤7)所述的甘露糖筛选培养基的配方如下：

MS基本培养基，附加0.4-1g/L的甘露糖和0.4％Phytagel，pH5.8；

步骤8)所述方法如下：

设计如下一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：

正向引物P1：5′-GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG-3′，

反向引物P2：5′-GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG-3′；

PCR扩增所述的PMI基因的DNA片段，该片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其片段长度为1455bp。

Images