CN102782118B - 用于改进微生物存储容器中的氧气渗透性的方法和设备 - Google Patents

Abstract

这里公开的不同实施方式涉及改进的用于运输微生物和其他活体材料的容器。某些实施方式包括空气渗透性囊，其具有空气渗透性内壁和具有穿孔的更坚固的外壁。

Description

用于改进微生物存储容器中的氧气渗透性的方法和设备

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年2月8日提交的美国临时申请61/302228的优先权，该申请通过参考整个地结合于此。

技术领域

这里公开的不同实施方式涉及用于存储和运输微生物的改进的氧气渗透性的容器。更特别地，某些实施方式涉及具有薄内壁和具有穿孔的外壁的容器。

背景技术

液体根瘤菌孕育剂近年来可广泛地得到。孕育剂主要包装用于出售和在“盒中袋”（“BIB”）容器中运输，其通常包括位于纸板盒内的塑料袋或囊。作为示例目的，可以理解的是，BIB容器用于存储诸如酒和果汁之类的产品。

在液体孕育剂的运输和存储过程中，有利的是，活细胞（viablecells）的数量保持较高，且当在种植之前应用于种子时，根瘤菌是存活的。液体根瘤菌孕育剂不是休眠产品——微生物细胞进行积极的呼吸，导致对氧气的需求。结果，孕育剂包装必须具有氧气渗透性。其他微生物也要求具有氧气渗透性的包装，以进行存储和运输。

用于包装液体根瘤菌孕育剂的已知的BIB容器采用由低密度聚乙烯（“LDPE”）或相应的变形，例如非常低密度聚乙烯（“VLDPE”）制成的袋。这些膜认为是无障碍膜。即，它们可渗透氧气和二氧化碳。用于这些BIB容器的囊通常由单层膜或包括两个膜的两层膜制成，这两个膜由相同的材料制成，该材料典型地不能渗透液体。

现有技术中存在改进用于液体根瘤菌孕育剂和其他微生物的包装的需求。

发明内容

这里公开的是不同氧气渗透性囊的构造，其用于存储和运输活体材料，包括微生物。

在例1中，氧气渗透性囊包括两个壁，该两个壁沿着该两个壁的每个外边缘互相耦接。两个壁的每个包括第一膜和第二膜。第一膜限定出囊的内壁，并包括薄的非障碍的弹性膜。第二膜邻近第一膜的外表面设置，并包括多个穿孔。

例2涉及根据例1的囊，其中所述第一膜具有至少5500cc/m²/天的氧气渗透性。

例3涉及根据例1的囊，其中两个壁中的一个包括从两个壁的一个延伸的喷口（spout），该喷口限定出与囊的内腔流体连通的开口。

例4涉及根据例3的囊，还包括可构建用于耦接到该喷口上的盖。

例5涉及根据例1的囊，其中所述第一膜具有从约15μm到约90μm的范围的厚度。

例6涉及根据例1的囊，其中所述第一膜包括聚乙烯或聚丙烯。

例7涉及根据例1的囊，其中所述第二膜比第一膜机械地更坚固并更抗穿孔。

例8涉及根据例1的囊，其中所述第二膜具有从约40μm到约80μm的范围的厚度。

例9涉及根据例1的囊，其中所述第二膜包括聚酯、聚乙烯、聚丙烯或聚酰胺。

例10涉及根据例1的囊，其中多个穿孔的每个具有从约0.1mm到约3mm的范围的直径。

例11涉及根据例1的囊，其中所述第一和第二膜只沿着两个壁的每个外边缘互相粘合在一起。

例12涉及根据例1的囊，其中所述囊构建用于设置在外容器内。

在例13中，氧气渗透性囊包括至少一个壁。所述至少一个壁包括内氧气渗透性膜、外穿孔膜和粘合耦接部。内氧气渗透性膜包括非障碍弹性膜（non-barrierflexiblefilm）。外穿孔膜邻近内氧气渗透性膜设置，但是不沿着外穿孔膜的实质长度耦接内氧气渗透性膜。粘合耦接部构建用于将内氧气渗透性膜粘合到外穿孔膜上，并设置在至少一个壁的外部的周围。

例14涉及根据例13的囊，其中所述内氧气渗透性膜具有至少5500cc/m²/天的氧气渗透性。

例15涉及根据例13的囊，其中至少一个壁中的一个包括喷口和盖。该喷口与该至少一个壁中的一个相关联，并限定出与囊的内腔流体连通的开口。该盖可构建用于耦接到喷口上。

例16涉及根据例13的囊，其中所述外穿孔膜比内氧气渗透性膜机械地更坚固。

在例17中，用于运输活微生物的容器包括基本刚性的外容器和构建用于设置在基本刚性的外容器内的氧气渗透性囊。该氧气渗透性囊包括内膜和外膜。该内膜包括非障碍弹性膜，该膜具有从约15μm到约100μm的范围的厚度。该外膜邻近内膜，并包括多个穿孔。此外，所述外膜只沿着外膜的四个外边缘粘合到内膜上。

例18涉及根据例17的囊，其中所述内膜具有至少5500cc/m2/天的氧气渗透性。

例19涉及根据例17的囊，其中所述外膜比内膜机械地更坚固。

例20涉及根据例17的囊，其中所述囊还包括与所述囊相关联的喷口。

尽管公开了多个实施方式，本发明的其他实施方式将从下面详细的说明中对本领域技术人员变得显而易见，其中表示和描述了本发明的示例的实施方式。将认识到的，本发明能够在许多显而易见的方面作出改变，它们都不脱离本发明的精神和范围。相应地，附图和详细说明本质上认为是示例的而不作为限定。

附图说明

图1A是根据一个实施方式的氧气渗透性囊的示意侧视图。

图1B是图1A的囊的透视图。

图2是根据一个实施方式的线图，比较了在商业上可获得的囊和在两层的囊中微生物在7°C下随着时间的存活能力。

图3是根据一个实施方式的线图，比较了在商业上可获得的囊和在两层的囊中微生物在22°C下随着时间的存活能力。

图4是根据一个实施方式的线图，比较了在商业上可获得的囊和在两层的囊中存储后，微生物种子在22°C下随着时间的存活能力。

图5是根据一个实施方式的线图，比较了在商业上可获得的囊和在两层的囊中微生物在4°C－5°C下随着时间的存活能力。

具体实施方式

这里公开的具体实施方式涉及用于微生物，包括液体根瘤菌孕育剂的改进的BIB容器，及制造这样的容器的相关方法。实施方式包括具有囊的容器，所述囊具有改进的氧气渗透性，其可以改进氧气到微生物的供应，由此导致更好的存储存活性和应用时微生物由此带来的功效。通常，这里公开的不同囊的实施方式具有两层壁，每层壁具有两个未粘合的膜：内膜和外部穿孔膜。

图1A和1B描述了用于BIB容器的可渗透容器10的一个实施方式。该容器10的结构是用于BIB容器的囊的最普通的结构。即，容器10具有两个壁12、14，它们沿着四个边缘16、18、20、22的每个固定、粘合、胶着或另外地互相附接（如在图1B中最好地示出的），由此限定出容器10的内腔24。根据一个实施方式，两个壁12、14在边缘16、18、20、22处采用热处理粘合在一起。可选地，壁12、14可以在边缘16、18、20、22处采用粘合剂粘合在一起。可选地，任何已知的处理或组合物可用于将两个壁12、14附接在一起。在其他选择中，容器可通过任何已知的构造形成，其导致根据这里公开的不同实施方式的任一个所述的具有内腔和两层氧气渗透性壁的容器。如在图1B中最好示出的，容器10还可具有设置在容器10上的喷口26，以提供到内腔24的流体入口。喷口26还可以具有设置在喷口26上的盖28。

根据一个实施方式，每个壁12、14是“两层”或“双层”壁。即，每个具有内膜30和外膜32。两个膜30、32没有沿着腔24的长度物理地粘合或另外地互相附接。相反，膜30、32简单地以未粘合或未附接的方式邻近地或互相接触地设置，而如上所述只在边缘16、18、20、22处互相粘合。

根据一个实施方式，内膜30是薄膜，其具有高的氧气渗透性。膜30可以是轻量的、高可呼吸性的膜。根据一个实施方式，比起已知双层容器所要求的，膜30更薄，因此具有更小的强度，进而更具有可呼吸性。在一个实施方式中，内膜30由高密度聚乙烯（“HDPE”）和超低密度聚乙烯（“ULDPE”）的混合物制成。可选地，内膜30可以由不同类型的聚乙烯制成，包括但是不限于如下中的任何一个或多个：HDPE、中密度聚乙烯（“MDPE”）、低密度聚乙烯（“LDPE”）、非常低密度聚乙烯（“VLDPE”）、ULDPE、线性低密度聚乙烯（“LLDPE”）、茂金属线性低密度聚乙烯（“mLLDPE”）和低压聚乙烯（“LPPE”）。根据另一个替代，内膜30可以由聚丙烯制成。在还有的替代中，内膜可以是非障碍弹性膜，包括用于已知BIB囊的任何单膜，包括用于两层囊的那些单膜。为了本申请的目的，“非障碍弹性膜”指任何薄的、弹性的聚合物膜，其具有氧气渗透性。

在一个实施方式中，内膜30是挤压（或共挤压）膜。在该实施方式中，膜30可以采用标准的挤压工艺制成，其首先将不同组分在挤压器中混合或混和在一起，所述组分例如是上述示例组分的任何一个或多个。然后挤压器采用那些组分形成同质的膜。可选地，内膜30可以通过任何已知的挤压工艺制成。

根据一个实施方式，内膜30可以具有从约15μm到约90μm的厚度范围。可选地，内膜30具有约50μm的厚度。

在一个示例的实施方式中，内膜30是商业上可得到的聚合物和HDPE的混合物。更特别地，商业上可获得的聚合物在DowAffinityPF1140G的品牌名称下出售，其可从位于Midland,Ml的DowChemicalCo.获得。在一个实施方式中，最终的内膜30由约82％的Dow聚合物和约18％的HDPE制成。如在表1中陈述的，其提供了该特别的内膜30与传统的LDPE膜的渗透性的比较，内膜30具有约5977cc/m²/天的氧气渗透性。

膜的类型

cc/m2/天

内膜（Dow Affinity PF 1140G）HDPE	5977
		传统膜	3300

表1

根据一个实施方式，外膜32是具有多个穿孔30的膜。外膜32可以由聚酯/聚乙烯膜制成，其中该膜由24％厚度的聚酯和76％厚度的聚乙烯混合而成。除了聚酯和聚乙烯，材料的其他非限制性的例子包括聚丙烯和聚酰胺。可选地，外膜32可以由任何可热封的层状膜制成。可热封的膜可以由诸如LDPE或ULDPE的材料制成。在其他替换中，外膜32可以由任何弹性膜制成，例如包括由聚酯制成的膜。在一个专门示例的实施方式中，外膜32是聚酯和聚乙烯的混合物，其作为来自位于意大利Brenna的Corapack的CorapanPS/LLE12+40而商业上可得到，其中聚酯占膜的约24％，而聚乙烯占膜的约76％。

根据一个实施方式，外膜32是层状膜，其可以采用迭层工艺而形成。在一个例子中，首先形成聚酯层和聚乙烯层，然后将它们层叠在一起。在一个实施方式中，这两个层采用在它们之间的粘结层而层叠在一起。可选地，这两个层可以采用任何已知的工艺层叠在一起。根据一个专门的实施，聚乙烯层采用已知的吹膜工艺形成。可选地，聚乙烯层可以采用任何已知的工艺形成。聚酯层可以采用已知的铸膜工艺形成。可选地，聚酯层可以采用任何已知的工艺形成。

在一个实施方式中，外膜32具有从约40μm到约80μm的范围的厚度。可选地，外膜32具有约52μm的厚度。每个穿孔可以具有从约0.1mm到约3mm的范围的直径，和从约5mm到约30mm的范围的间距（pitch）。可选地，穿孔可以具有约1mm直径的孔，约10－20mm的间距。

外膜32比内膜30机械地更坚固。根据一个实施，外膜32可以比用于已知的BIB囊的膜机械地更坚固，同时因为穿孔而具有更高的氧气渗透性。即，源于穿孔的外膜32的渗透性特征独立于膜32的机械属性，由此产生这样的穿孔的外膜32，其机械地坚固，但是具有高的氧气渗透性。这样，在某些实施方式中，外膜32为容器10提供机械强度和抗穿孔能力。该强度使得内膜30由轻量、具有更小强度的高可呼吸膜制成成为可能，如同上面所述的。

由于膜30、32的属性，这里所述的双层壁实施方式的不同版本具有高氧气渗透性，同时还具有足够的强度，以保持容器10内的液体孕育剂。尽管不同的已知的囊具有氧气渗透性，大多数只具有单层膜或物理粘合在一起以生成单层膜的两层。这些单层膜为了获得强度所需的厚度而牺牲了渗透性，该强度对于容纳液体而不破裂或以一些方式进行物理折衷是必要的。在这里公开的不同实施方式中，可呼吸的、高渗透性的薄的内膜组合有高渗透性但是机械坚固的穿孔外膜，该外膜邻近但是非粘合或物理连接地连接到内膜上，以产生高渗透性但是机械坚固的壁，该壁可以用于容纳含有微生物的液体。

根据一个实施方式，具有这里所述的内和外膜的不同双层壁比现有技术已知的传统的囊具有更大的氧气渗透性。根据一个实施方式，两个膜30、32产生的双层壁具有的总氧气渗透性在从约4000cc/m²/天到约12000cc/m²/天的范围中。可选地，最终的双层壁具有约6000cc/m²/天的总氧气渗透性。假如特别已知的传统双层两层囊（其采用两件相同LDPE膜构建，该膜可从位于Northlake,IL的SchollePackagingInc.作为FlexiOne^TM27而可商业上获得）的渗透性是约1650cc/m2/天（采用用于确定渗透性的标准的方式计算得到，其陈述为ASTM#F1927-28，通过在英格兰Leatherhead,Surrey的包装工业研究协会完成），具有约6000cc/m²/天渗透性的该特殊的双层实施方式展现了比已知的囊大363％的渗透性。

可以理解的是，在某些实施中，这里所述的渗透性容器或囊的实施方式位于外部容器的里面（由此导致具有外容器和囊的容器，或设置在外容器内的渗透性容器，其构造典型地称为如上所述的盒中袋）。在这些实施中，外部容器可以是用于BIB容器的任何已知的外部容器。在一个示例的实施方式中，外部容器是基本刚性的纸板盒。可选地，任何其他已知的外部容器也是可以的。

例子

例1－7°C下容器中B.japonicum的稳定性

两个12.4升的发酵Bradyrhizobiumjaponicum肉汤样本包装到两个不同的囊内。一个样本保持在如上所述的由FlexiOne^TM27制成的相同的传统聚乙烯两层囊中（图2中标签为“传统”），而第二样本包装在双层囊的特殊的实施方式中（图2中标签为“高渗透性”）。该双层囊实施方式具有460x600mm的尺寸，内膜厚50μm，该内膜由82％的Affinity1140G和18％的HDPE的混和物制成，而外膜由具有24％聚酯和76％聚乙烯的穿孔的聚酯/聚乙烯膜制成。

在两个囊中的材料存储在7°C下，样本每月无菌保存，经过6个月。结果陈述在图2的图表中。如在图中可以看到的，在12周后，在已知的传统的BIB容器中的细菌量表现出生存能力的急剧下降。相反，在双层囊实施方式中的细菌量在26周内保持在高位。

例2－22°C下容器中B.japonicum的稳定性

两个6.4升的发酵B.japonicum肉汤样本包装到两个不同的囊内。一个样本包装在如上例1所述相同的囊中（图3中标签为“传统”），而第二样本包装在双层囊实施方式中，也在例1中描述（图3中标签为“高渗透性”）。

在两个囊中的材料存储在22°C下，样本每月无菌保存，经过6个月。结果在图3的图表中示出。这些结果表明，尽管在已知囊和双层囊实施方式中的细菌数都有下降，但是在传统包装系统中的下降比在双层实施方式中的大得多。

例3－存储后B.japonicum种子的稳定性

例2的两个样本在本实验中使用。如上所述那样在22°C下存储5周之后，每个样本分别应用于500克种子上。

在每批中存活的根瘤菌的数量如图4所示那样周期性地测试。结果表明，存储在例2的双层囊实施方式中的根瘤菌细胞在种子上的存活量高于存储在传统囊中的根瘤菌细胞在种子上的存活量。此外，存储在双层囊实施方式中的根瘤菌细胞5周以上保持在100000个细胞每个种子的专门数量（每个种子种植前最小可接收活细胞量，如在加拿大规章中陈述的）之上，而对于存储在传统囊中的细胞，其在约3周中下降到专门数量之下。换句话说，采用用于本例中的双层囊实施方式，在处理种子和在田地里种植处理过的种子之间的时间周期可以增加。

例4－4－5°C下容器中B.japonicum的稳定性

已知张力532C的发酵B.japonicum肉汤的两个12.8升样本包装到两个不同的囊内。一个样本包装在上述例1和2所述的相同的囊中（图5中标签为“传统”），而第二个样本包装在也在例1和2所述的双层囊实施方式中（图5中标签为“高渗透性”）。

在两个囊中的材料存储在4－5°C下，样本每月无菌保存，经过8个月。结果在图5的图表中示出。如在图中看到的，在已知的传统BIB容器中的细菌量在约9周时开始显著下降。经过35周，在双层囊实施方式中的细菌量保持较高，而在传统容器中的量多于两个对数地下降。

尽管本发明已经参考优选实施方式进行了描述，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明精神和范围的情形下可以对形式和细节作出改变。

Claims (16)

1.用于运输活微生物的容器，该容器包括：

(a)实质上刚性的外容器；和

(b)构建用于设置在实质上刚性的外容器内的氧气渗透性囊，该囊包括：

(i)内膜，该内膜包括具有氧气渗透性的薄的、弹性的聚合物膜，具有从15μm到100μm的范围的厚度；和

(ii)邻近内膜的外膜，该外膜包括多个穿孔，其中所述外膜只沿着外膜的四个外边缘粘合到内膜上，

其中所述外膜比内膜机械地更坚固。

2.根据权利要求1所述的容器，其中所述内膜具有至少5500cc/m²/天的氧气渗透性。

3.根据权利要求1所述的容器，其中所述囊还包括与所述囊相关联的喷口。

4.氧气渗透性囊，包括两个壁，该两个壁沿着该两个壁的每个外边缘互相耦接，其中两个壁的每个包括：

(a)第一膜，其限定出囊的内壁，该第一膜包括具有氧气渗透性的薄的、弹性的聚合物膜；和

(b)第二膜，其邻近第一膜的外表面设置，并包括多个穿孔，

其中所述第二膜比第一膜机械地更坚固并更抗穿孔，所述第一和第二膜只沿着两个壁的每个外边缘互相粘合在一起。

5.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中所述第一膜具有至少5500cc/m²/天的氧气渗透性。

6.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中两个壁中的一个包括从两个壁的一个延伸的喷口，该喷口限定出与囊的内腔流体连通的开口。

7.根据权利要求6所述的氧气渗透性囊，还包括可构建用于耦接到该喷口上的盖。

8.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中所述第一膜具有从15μm到90μm的范围的厚度。

9.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中所述第一膜包括聚乙烯或聚丙烯。

10.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中所述第二膜具有从40μm到80μm的范围的厚度。

11.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中所述第二膜包括聚酯、聚乙烯、聚丙烯或聚酰胺。

12.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中多个穿孔的每个具有从0.1mm到3mm的范围的直径。

13.根据权利要求4所述的氧气渗透性囊，其中所述囊构建用于设置在外容器内。

14.氧气渗透性囊，包括至少一个壁，该壁包括：

内氧气渗透性膜，其包括具有氧气渗透性的薄的、弹性的聚合物膜；

外穿孔膜，其邻近内氧气渗透性膜设置，但是不沿着外穿孔膜的实质长度耦接内氧气渗透性膜；和

粘合耦接部，其构建用于将内氧气渗透性膜粘合到外穿孔膜上，其中所述粘合耦接部位于至少一个壁的外部的周围，

其中所述外穿孔膜比内氧气渗透性膜机械地更坚固。

15.根据权利要求14所述的氧气渗透性囊，其中所述内氧气渗透性膜具有至少5500cc/m²/天的氧气渗透性。

16.根据权利要求14所述的氧气渗透性囊，其中至少一个壁中的一个包括：

(a)与至少一个壁中的一个相关联的喷口，该喷口限定出与囊的内腔流体连通的开口；和

(b)可构建用于耦接到喷口上的盖。