CN102772471B - 一种蓝莓果皮提取物及其在制备抗肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药学领域，公开了一种蓝莓果皮提取物及其在制备抗肝损伤药物中的应用，解决了现有技术中的药物在治疗镉相关肝脏损伤疾病中效果不佳的技术问题。本发明的蓝莓果皮提取物为多酚类物质，主要活性成分之一为花青素，小鼠组织形态学切片及生化指标检测结果显示蓝莓果皮提取物能够降低肝脏损伤，其中蓝莓果皮提取物3-30mg/kg能够明显降低损伤肝脏组织MDA的含量，提高SOD的活性，能够起到对镉相关的肝脏损伤的保护作用。

Description

一种蓝莓果皮提取物及其在制备抗肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于药学领域，涉及一种蓝莓果皮提取物及其在制备与镉损伤相关的抗肝损伤药物中的应用。

背景技术

重金属镉在工业中应用广泛，包括染料、电镀、涂料、电池等，但是近年来，镉污染的问题日益严重，中国多地市场的镉米危机（约10%的大米镉含量超标）、广西柳江镉污染事件等，使得人们谈“镉”色变。镉污染主要来源于矿石开采和提炼过程，在生活中，主要通过食物和水源被人体摄入。香烟燃烧是日常生活中镉污染的一个重要途径，数据显示，每燃烧一支香烟，会释放0.2-3μg的镉颗粒，而中国烟民每年消耗的香烟达2万亿支。急性和慢性镉中毒会造成不同器官的损伤甚至癌症的发生，镉一旦被吸收，会迅速的从血液中分布到全身各个器官，肝脏是镉损伤的首要靶点器官；肝脏是人体新陈代谢的重要器官，肝脏一旦受到损伤，其功能即受到抑制。镉的强毒性还与其低代谢率、长生物半衰期（10-30年）有关。因此，镉被美国毒物管理委员会（ATSDR）列为第6位危及人类健康的有毒环境污染物质。

镉的毒性机制复杂，研究表明，氧化损伤、炎症反应等参与了镉的毒性机制的形成，基于此，镉损伤保护剂的开发多关注于抗氧化剂、螯合剂或钙结合剂的开发，目前已有的护肝产品参差不齐，护肝效果并不明显，而且天然护肝产品的开发相对滞后。

脂质过氧化反应广泛的存在于人体细胞中，通过对膜脂、蛋白质以及DNA的损伤，引起细胞或细胞器结构和功能的改变，正常情况下，机体中存在着抗氧化防御体系，能够维持氧化和抗氧化之间的动态平衡，保护细胞不受到严重损伤。一旦这种平衡被打破，细胞就会受到过量产生的自由基的损伤，从而引起凋亡或坏死。

花青素是一种天然的植物色素，是目前已知的抗氧化活性最强的天然产物，其抗氧化活性比Vc和VE要强20-50倍，而且长期服用对细胞的正常功能和结构不具有毒副作用，是安全有效的天然抗氧化剂。

超氧化物歧化酶（SOD）是生物机体内的抗氧化酶，其作用是清除超氧阴离子，防止自由基对细胞结构和功能的损伤，在平衡机体的氧化和抗氧化关系中起到至关重要的作用，体内SOD活性越高，自由基清除速度就越快。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝莓果皮提取物及其在制备抗肝损伤药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种蓝莓果皮提取物，所述蓝莓果皮提取物的制备方法为：将蓝莓果皮用pH为0-3、质量分数为60%的酸化乙醇水溶液（酸化采用硫酸、盐酸等常用酸）在25-40℃的水浴中超声提取30-60min，超声功率为60-200W，超声提取后过滤得提取液，将提取液用旋转蒸发仪常温减压（25℃、0.01Mpa）旋转蒸发处理至液态物质不再减少，将旋转蒸发处理后剩余的提取液用大孔树脂纯化，纯化后用旋转蒸发仪常温减压（25℃、0.01Mpa）旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到蓝莓果皮提取物。

所述大孔树脂纯化包括以下步骤：先用含0.01%HCl的蒸馏水淋洗大孔树脂层析柱，至流出液澄清后再用质量分数为0.1%的三氟醋酸甲醇溶液洗脱，收集流出液。

上述蓝莓果皮提取物在制备抗肝损伤药物中的应用。

所述肝损伤为重金属致肝损伤。

所述肝损伤为镉致肝损伤。

所述蓝莓果皮提取物的用量为3-30mg/kg。

制备得到的蓝莓果皮提取物呈紫红色固态结晶、无味，易溶于水。采用pH示差法测定总花青素含量，所述蓝莓果皮提取物中花青素的质量分数为40%左右。

本发明所述蓝莓果皮提取物可以与药学上可接受的辅料制备制剂，剂型包括口服制剂等。

本发明所述蓝莓果皮提取物为多酚类物质，主要活性成分包括花青素。通过建立镉损伤小鼠肝脏损伤模型，观察其组织病变结果及生化指标的改变表明，蓝莓果皮提取物具有降低与镉相关的肝损伤、保护肝脏的作用，3-30mg/kg蓝莓果皮提取物能够明显降低损伤肝组织丙二醛（MDA）的含量，同时提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，本发明所述蓝莓提取物在制备肝脏保护药物中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是镉急性中毒模型组小鼠组织形态学切片，苏木精&曙红染色，40×观察，→表示炎症细胞侵润，*表示空泡的形成；

图2是镉急性中毒模型组与其他组小鼠MDA的含量；

图3是镉急性中毒模型组与其他组小鼠SOD的活性。

*表示与空白组相比，结果具有显著性差异；#表示与损伤组相比，结果具有显著性差异。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

蓝莓果皮提取物的制备方法为：将蓝莓果皮用pH为1、质量分数为60%的酸化乙醇水溶液在30℃的水浴中超声提取40min，超声功率为150W，超声提取后过滤得提取液，将提取液用旋转蒸发仪常温减压旋转蒸发处理至液态物质不再减少，将旋转蒸发处理后剩余的提取液用大孔树脂（Amberlite XAD-7）纯化，纯化后用旋转蒸发仪常温减压旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到蓝莓果皮提取物。

所述大孔树脂纯化包括以下步骤：先用含0.01%（质量分数）HCl的蒸馏水淋洗大孔树脂层析柱，使提取液中的色素随流出液流出，至流出液澄清后再用质量分数为0.1%的三氟醋酸（TFA）甲醇溶液洗脱，收集流出液，至流出液颜色变淡为止。

蓝莓果皮提取物在制备与镉损伤相关的抗肝损伤药物中的用途，采用的试验方法是：镉致小鼠肝脏损伤，建立镉急性中毒模型，胃饲蓝莓果皮提取物后观察小鼠肝脏组织形态学变化，同时测定肝脏组织中MDA的含量以及SOD的活性变化，与正常对照组以及保护组比较是否存在差异。具体如下：

1.材料

1.1药品与试剂

蓝莓果皮提取物，氯化镉，0.9%NaCl，pH7.4的50mM磷酸缓冲液，浓盐酸，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT），三氯乙酸（TCA），硫代巴比妥酸（TBA）、考马斯亮蓝G-250，邻苯三酚，苏木精，曙红。

1.2仪器

紫外可见分光光度计，Beckman低温冷冻离心机，电热恒温水浴锅，电子天平。

1.3动物

昆明小鼠，体重为20±2g，雄性。

1.4统计学处理

所有的实验数据都表示为mean±S.E.来表示。平均值用单向方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)和相应的学生t-检验(Student’s t-test)进行统计学分析。统计学上p<0.05认为具有显著性差异。

2.试验方法

2.1试验分组

将小鼠随机分成7组（每组7只）：包括生理盐水对照组，镉急性中毒模型组以及试验给药组，试验给药组按蓝莓果皮提取物浓度的不同分为5组，即试验组I，试验组II，试验组III，试验组iV以及试验组V。

2.2试验方法

生理盐水对照组（Control）腹腔注射（ip）0.9%的生理盐水以及灌胃（ig）0.9%的生理盐水

镉急性中毒模型组（Cd(Ⅱ)）腹腔注射（ip）2mg/kg的氯化镉溶液（CdCl₂）以及灌胃（ig）0.9%的生理盐水

试验给药组（Cd(Ⅱ)+Ay），药物是蓝莓果皮提取物，分别腹腔注射（ip）2mg/kg的CdCl₂溶液，以及灌胃（ig）不同剂量的蓝莓果皮提取物，浓度分别为0.3,1,3,10,30mg/kg（即试验组I-V），每天一次，连续给药14天。

在末次给药禁食24h后将小鼠脱颈椎处死，解剖观察肝脏组织变化，并取肝脏于福尔马林中固定，制作石蜡切片，苏木精和曙红染色，光镜观察照相。另外，新鲜肝脏匀浆制备肝脏匀浆液，制备方法：用生理盐水充分洗去小鼠肝脏表面残血，滤纸吸干。取适量肝组织称重，置玻璃匀浆器中，加冰冷的磷酸缓冲液制成10%的肝匀浆。

按照文献报道方法，利用硫代巴比妥酸法测定肝脏匀浆中MDA的含量，邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性，考马斯亮蓝法测定匀浆中蛋白质的含量。

3.结果

3.1观察小鼠肝脏组织病理学切片

参见图1，镉的毒性作用能够造成肝脏组织中空泡的形成以及炎症细胞的侵润。

3.2蓝莓果皮提取物对镉中毒小鼠肝脏组织内MDA的含量影响

参见图2，由MDA试验结果分析，可以看出：

1）镉急性中毒模型组MDA含量较生理盐水对照组升高（p<0.05）,说明急性镉中毒小鼠模型建立。

2）蓝莓果皮提取物试验给药组中，试验组I与镉急性中毒模型组相比较，有显著差异，p<0.05，而试验组II与镉急性中毒模型组相比，无显著性差异，p>0.05，试验组III、IV以及V与镉急性中毒模型组相比具有显著性差异，p<0.01,说明蓝莓果皮提取物能够降低MDA的产生，但与剂量浓度有关，呈现剂量依赖型关系，蓝莓果皮提取物浓度为3-30mg/kg降低MDA生成的效果最好。

3.3蓝莓提取物对镉中毒小鼠肝组织SOD活性的影响

参见图3，由SOD活性结果分析得出：

1）镉急性中毒模型组SOD含量较生理盐水对照组明显降低（p<0.05），说明急性镉中毒小鼠模型建立。

2）蓝莓果皮提取物试验给药组中，试验组I与镉急性中毒模型组相比无显著性差异，p>0.05，而试验组II-V与镉急性中毒模型组呈显著差异，p<0.01和p<0.001，此结果说明蓝莓果皮提取物能够提高SOD的活性，与剂量浓度有关，蓝莓果皮提取物浓度在1-30mg/kg对SOD活性的提高效果最好。

4.对比试验，蓝莓果皮提取物为多酚类物质，其主要的活性成分之一是花青素。通过与多酚类化合物咖啡酸苯乙酯（CAPE，10mg/kg）抗脂质过氧化反应作用进行比较（如图2），蓝莓果皮提取物具有更强的抗氧化效果。V_C以及V_E在体内实验中，效果较CAPE更差。

5.结论

镉中毒小鼠肝脏组织形态学观察到其肝脏中出现空泡以及炎症细胞的侵润，主要是由于镉导致肝脏细胞的凋亡和坏死造成的，研究表明，镉急性损伤的首要器官为肝脏，因此，镉中毒与之最相关的脏器即为肝脏。

重金属镉属于非氧化还原性金属，不能直接产生自由基，但是可以间接的影响自由基的产生，从而造成氧化压力的形成。活性自由基通过攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，形成脂质过氧化物。肝脏脂质过氧化的程度可以通过测定脂质过氧化物来评价。丙二醛（MDA）是不饱和脂肪酸脂质过氧化反应的终产物之一，它在组织中的含量能够反映机体内脂质过氧化的程度，间接的体现自由基对细胞及组织的损伤破坏的程度。

镉致小鼠肝脏损伤结果表明蓝莓果皮提取物能够降低肝脏损伤，本发明基于镉致肝脏损伤的机理，通过测定SOD活性及MDA含量的变化，发现并证实镉引起肝脏损伤是由于自由基的损伤作用，导致机体SOD活性降低，以及MDA含量升高，通过本次发明阐明了镉中毒与天然提取物改善镉相关肝脏损伤的作用机理，其中蓝莓果皮提取物3-30mg/kg能够降低损伤组肝脏MDA的含量，提高SOD的活性，说明蓝莓果皮提取物对肝脏的保护作用可能与自由基的清除或抑制作用有关。蓝莓果皮提取物有望成为一种有效的镉相关的肝脏损伤保护制剂，为从事镉相关行业的职业人员以及吸烟者提供更好的肝脏保护作用。

Claims (2)

1.一种蓝莓果皮提取物，其特征在于：所述蓝莓果皮提取物的制备方法为：将蓝莓果皮用pH为0-1、质量分数为60％的酸化乙醇水溶液在25-40℃的水浴中超声提取30-40min，超声功率为60-200W，超声提取后过滤得提取液，将提取液用旋转蒸发仪在25℃、0.01Mpa常温减压旋转蒸发处理至液态物质不再减少，将旋转蒸发处理后剩余的提取液用大孔树脂纯化，纯化后用旋转蒸发仪在25℃、0.01Mpa常温减压旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到蓝莓果皮提取物；所述大孔树脂纯化包括以下步骤：先用含0.01％HCl的蒸馏水淋洗大孔树脂层析柱，至流出液澄清后再用质量分数为0.1％的三氟醋酸甲醇溶液洗脱，收集流出液。

2.一种如权利要求1所述蓝莓果皮提取物在制备抗肝损伤药物中的应用，所述肝损伤为镉致肝损伤；所述蓝莓果皮提取物的用量为3-30mg/kg。