CN102764442A - 包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法。本发明的制备方法，包括以下步骤：1）以PEG为连续相制备亲水相系统；2）将嵌段高分子、鱼精蛋白和基因物质加入步骤1）所制备的亲水相系统中，搅拌或摇动，形成纳米颗粒；3）用透析袋透析除去所述纳米颗粒水相中留存的PEG，即可制得纳米颗粒。与现有技术相比，采用本发明的制备方法制成的纳米颗粒，可实现基因物质的输送，并且，不存在体内毒性和体内免疫原性的问题，由于纳米颗粒不带电荷，还可避免体内非靶组织的粘附，并可接枝靶向基团，实现体内病变细胞靶向，从而有效提高靶向效果，且不影响体内病变细胞的内吞。

Description

包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法。

技术背景

siRNA是一段21－25个碱基对的RNA分子，发现于单细胞生物抵御病毒侵袭的机制。单细胞生物针对入侵病毒的mRNA序列合成出一段与之互补的siRNA，主动结合mRNA，从而阻断病毒的复制。siRNA因其独特的靶点特异性、结构可设计性和代谢安全性，成为科研界普遍看好的新的治疗药物。然而，在过去的20年里，研究人员设计了一系列的载体用于siRNA的体内输送，但仅有极少数进入临床阶段，迄今，仍未有一个载体得到FDA认证，一个有效载体的缺位，导致核酸物质体内输送仍然处于临床瓶颈期。

将核酸物质输送到靶细胞的胞浆或细胞核内，需要克服一系列的体内输送屏障，因此，核酸载体是否高效，是其能否用于临床治疗的关键所在。核酸物质输送的载体一般为以下两类：（1）病毒载体：病毒载体（如慢病毒载体、腺病毒载体）作为基因的输送载体，虽然有较高的体外转染活性，然而，其免疫原性与易导致突变的缺点为临床试验带来了巨大的安全问题，使得其应用受限。（2）非病毒载体：非病毒载体的优势主要在于，在保证预期的转染活性的条件下，可以大大降低病毒载体所带来的免疫原性与诸多炎症反应，其一般为以下两种载体设计：(a)阳离子脂质体；(b)聚阳离子基因载体。而目前研究更多的主要集中于聚阳离子基因载体与阳离子脂质体的修饰，使之适用于基因物质的靶向输送。阳离子脂质体具有较高的体内外转染活性，然而，由于表面的正电荷影响其体内的正常分布，同时，由于选用阳离子脂质，免疫原性与炎症反应在动物试验中也成为不可避免的缺点之一（Gao,K.&Huang,L.Nonviral methodsfor siRNA delivery.Molecular pharmaceutics6,651-658(2008).）。

鱼精蛋白，是一种天然的富含多精氨酸结构的多肽，表面带有正电荷，可通过静电作用力压缩核酸物质至纳米尺度。目前，鱼精蛋白已经用于高效的体内、体外的基因输送载体。其优势在于，血浆敏感度低，在低质量比时，无免疫原性，低毒，成为基因输送的优良载体。然而，存在的一个问题是，没有经过修饰的鱼精蛋白基因颗粒，会产生一定的非靶组织粘附，同时，其血液半衰期也较低，易被血浆清除。鉴于此，诸多文献中报道，可选用鱼精蛋白与阳离子脂质体对DNA或者siRNA进行压缩包封，即LPD-Ⅰ(lipopolyplexes),并在表面接枝PEG以及靶向基团，以延长体内循环时间，并提高靶向效率。但由于选用非天然的阳离子脂质，存在体内毒性与体内免疫原性等问题，同时，未能中和的阳离子表面的正电荷会引起体内非靶组织的粘附，并与血浆成分发生聚集，从而降低靶向效果，并直接影响体内病变细胞的内吞。

发明内容

本发明目的在于提供一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，以解决现有的以鱼精蛋白与阳离子脂质体对DNA或者siRNA进行压缩包封得到的纳米颗粒，由于选用非天然的阳离子脂质，存在体内毒性和体内免疫原性的问题，并且，未能中和的阳离子表面的正电荷从而引起体内非靶组织的粘附，并与血浆成分发生聚集，从而降低靶向效果，并直接影响体内病变细胞的内吞的技术性问题。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以PEG为连续相制备亲水相系统；

2）将嵌段高分子、鱼精蛋白和基因物质加入步骤1）所制备的亲水相系统中，搅拌或摇动，形成纳米颗粒；

3）用透析袋透析除去所述纳米颗粒水相中留存的PEG，即可制得包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒。

优选地，所述亲水相系统中PEG的浓度为0.1~20wt%。

优选地，所述基因物质与所述鱼精蛋白的质量之和与所述嵌段高分子质量之比为1：0.1~1000，所述基因物质与所述鱼精蛋白的质量比为0.1~100：1。

优选地，所述透析袋的截留分子量为5000~20000Da，透析时间为6~72h。

优选地，所述嵌段高分子包括依次连接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段为亲水嵌段，所述第二嵌段为疏水嵌段。

优选地，所述第一嵌段可选自PEG或PEO。

优选地，所述第二嵌段可选自聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物或聚己内酯中的一种。

优选地，所述第三嵌段包括蛋白亲和作用力强的高分子，所述蛋白亲和作用力强的高分子选自葡聚糖、麦芽糖或壳聚糖中的一种。

优选地，所述嵌段高分子还包括靶向基团或荧光分子，所述靶向基团或所述荧光分子与所述第一嵌段连接。

优选地，所述靶向基团可选自蛋白、多肽、抗体或小分子靶向基团的一种或几种；所述蛋白可选自转铁蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可选自RGD或胰岛素；所述小分子靶向基团可选自叶酸、生物素或半乳糖的一种。

优选地，所述荧光分子可选自罗丹明、FITC、NBD、cy5.5或FAM的一种。

优选地，在步骤2）中，可将所述鱼精蛋白与所述基因物质形成复合物后再加入步骤1）所制备的亲水相系统中。

优选地，所述基因物质包括DNA或RNA。

优选地，在步骤2）中，搅拌或摇动的时间为0.5~72h。

优选地，所述嵌段高分子的合成方法包括以下步骤：

1）以mPEG-COOH为引发剂，在Sn(oct)₂的催化下，在80~140℃条件下于无水甲苯中引发开环聚合，加入己内酯，反应进行10~72h，合成PEG₄₅-PCL₃₀嵌段；

2）将葡聚糖与乙二胺按照1:（1~50）的摩尔比投料，即称取葡聚糖,乙二胺,溶解于2~50mL的DMSO中，混合物在0~80℃油浴中反应2~10天，每天加入0~50mg氰基硼氢化钠；反应结束后，加入大量甲醇沉淀，过滤，再加水溶解，甲醇沉淀，反复三次，最后将产物于室温下真空干燥，得到淡黄色还原氨化的DEX-EDA;

3）将DEX-EDA的氨基与mPEG₄₅-PCL₃₀-COOH的羧基进行反应，称取DEX-EDA，加入1~10倍摩尔量的PEG-PCL，溶解于1~50mL的DMSO中，加入0~50倍摩尔量的三乙胺，搅拌1~60min后，加入0~50倍摩尔量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，在0~90℃下反应2~48h；反应结束后，加入乙醚沉淀，减压抽滤，产物加入超纯水，溶解后，用截留分子量为1000~20000的透析袋透析除去杂质与未反应的反应物，于-20~-200℃预冻，低温冻干，得到白色粉末产物。

与现有技术相比，采用本发明的制备方法制成的纳米颗粒，可实现基因物质的输送，并且，不存在体内毒性和体内免疫原性的问题，由于纳米颗粒不带电荷，还可避免体内非靶组织的粘附，并可接枝靶向基团，实现体内病变细胞靶向，从而有效提高靶向效果，且不影响体内病变细胞的内吞。

附图说明

图1为本发明的嵌段高分子结构及合成方法示意图；

图2为本发明的嵌段高分子的核磁谱图；

图3为本发明的嵌段高分子的核磁谱图；

图4为本发明的纳米颗粒的制备示意图；

图5为本发明的纳米颗粒荧光共定位结构验证的示意图；

图6为本发明的嵌段高分子的细胞毒性检测示意图；

图7为本发明的细胞内吞摄取结果示意图。

具体实施方式

以下结合实施例详细说明本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。但所举实施例并非用于限定本发明的保护范围。

本发明对嵌段高分子与protamine/DNA所形成的纳米颗粒的理化性质表征方法包括：动态光散射和zeta电位测试。按本方案制备的纳米颗粒的细胞摄取、基因转染和小动物活体成像观察选用的DNA为小牛胸腺DNA,细胞毒性选用的细胞为Hela、HepG2、SMMC-7721细胞，内吞试验选用SMMC-7721细胞。

实施例1 嵌段高分子PEG₄₅-PCL₃₀-DEX的合成方法

嵌段高分子PEG-PCL-DEX的合成路线如图1所示。整个反应在无水无氧的环境中进行，将PEG、聚己内酯、辛酸亚锡加至三颈瓶中，加入无水甲苯，于120℃下搅拌反应24小时，反应完成后加入乙醚沉淀，滤饼加入少量二氯甲烷溶解，再用乙醚沉淀，反复三次，洗除小分子杂质，得到PEG₄₅-PCL₃₀嵌段高分子产物，真空干燥，备用。

将葡聚糖与乙二胺溶解于DMSO中，在60℃的油浴中反应8天，同时，每天补加10mg氰基硼氢化钠。反应结束后，加入大量甲醇沉淀，过滤，再加水溶解、甲醇沉淀，反复三次，最后将产物于室温下真空干燥，得到淡黄色还原氨化的DEX-EDA。

取DEX-EDA与mPEG₄₅-PCL₃₀-COOH，溶解于20mL的DMSO中，加入适量三乙胺（TEA），搅拌，而后加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，在室温下反应24h。加入乙醚沉淀，产物加入超纯水溶解，用截留分子量为10000的透析袋透析除去杂质，-80℃预冻，冻干，得到白色粉末产物。

其¹H-NMR图谱如图2、3所示：在¹H-NMR图谱¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)：其峰归属见图2、图3。在图2中，化学位移为2.82ppm处出现的峰为DEX还原氨化后的乙二胺上亚甲基的峰，而图3中，在化学位移为4.79ppm，4.63ppm，4.87~5.12ppm处，为DEX的特征化学位移，3.98ppm,2.36ppm,1.58ppm,1.27ppm为PEG-PCL-DEX中PCL嵌段的化学位移，而在3.51ppm处，为PEG嵌段中亚甲基的化学位移。

实施例2 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA二元复合物的制备

配制PEG（MW8000）外水相溶液，PEG的浓度为10wt%，于外水相溶液中加入基因物质、鱼精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物质与鱼精蛋白的质量之和与嵌段高分子质量之比为7：30，基因物质与鱼精蛋白的质量比为1:1.5。在50℃油浴下磁力搅拌24h，即可得到内水相为protamine-DNA或siRNA复合物的载体结构，最后，采用截留分子量为10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具体制备方法，见图4。

实施例3 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA二元复合物的制备

配制PEG（MW8000）外水相溶液，PEG的浓度为0.1wt%，于外水相溶液中加入基因物质、鱼精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物质与鱼精蛋白的质量之和与嵌段高分子质量之比为1：0.1，基因物质与鱼精蛋白的质量比为0.1：1。在50℃油浴下磁力搅拌24h，即可得到内水相为protamine-DNA或siRNA复合物的载体结构，最后，采用截留分子量为10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具体制备方法，见图4。

实施例4 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA二元复合物的制备

配制PEG（MW8000）外水相溶液，PEG的浓度为20wt%，于外水相溶液中加入基因物质、鱼精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物质与鱼精蛋白的质量之和与嵌段高分子质量之比为1：1000，基因物质与鱼精蛋白的质量比为100:1。在50℃油浴下磁力搅拌24h，即可得到内水相为protamine-DNA或siRNA复合物的载体结构，最后，采用截留分子量为10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具体制备方法，见图4。

实施例5 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA二元复合物纳米颗粒的荧光共定位表征

按照上述方法制备PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA二元复合物的纳米颗粒，通荧光共定位对其进行表征，具体做法如下，将小牛胸腺DNA用Hoechst22258（蓝色）荧光染料标记，并同时用nile red标记嵌段高分子的疏水PCL嵌段，观察结果见图5，红色（nile red）和绿色(FITC)在相同位置出现并重合，验证了纳米颗粒的形成。

实施例6PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA二元复合物纳米颗粒的粒径与电位的表征

通过粒径与电位的测定对纳米颗粒结果进行表征，电位的变化，经过PEG-PCL-DEX包裹后纳米颗粒的电位在0mV左右，而未经过包裹的protamine-DNA复合物颗粒明显带过量正电荷，由此可以直观证明本发明的嵌段高分子材料可以屏蔽电荷。由测定结果可得，其粒径分布比较均匀，结果见表1。

表1 不同复合物的粒径与电位变化结果

实施例7 嵌段高分子的细胞毒性的考察

采用MTT法测定细胞毒性，选用HepG2、Hela、SMMC-7721细胞考察细胞毒性，以8000个/孔的细胞密度转96孔细胞板，置于37℃5%细胞培养箱里培养过夜。配制1、2、4、8、15mg/mL的系列不同浓度的嵌段高分子溶液，每孔加入100μL，稀释介质是DMEM高糖培养基（无血清无酚红），从培养箱中取出96孔细胞板，吸去培养液，每孔用100μL磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再弃去磷酸盐缓冲溶液，将不同浓度的嵌段高分子溶液依次加入到细胞板中，平行测定3个孔。置于细胞培养箱里培养4小时。然后，吸去培养液，每孔用100μL磷酸盐缓冲溶液冲洗一次，再弃去磷酸盐缓冲溶液，每孔加入100μLDMEM高糖培养基（无血清无酚红）和25μLMTT溶液（5mg/mL），继续于培养箱里培养。6小时之后，吸去培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，放置充分溶甲赞，采用多功能酶标仪测定样品在570nm和630nm处的吸光度值（以630nm处为对照）。经过测试可知，嵌段高分子材料毒性较低，结果见图6。

实施例8 嵌段高分子PEG-PCL-DEX包裹protamine-DNA复合物的细胞内吞试验

按上述方法制备PEG-PCL-DEX包裹protamine-DNA的纳米颗粒，其中，DNA以绿色荧光蛋白标记，加入至24孔细胞板中，选择SMMC-7721细胞进行考察，以无血清的DMEM孵育6h,而后，弃去培养基，用PBS冲洗3遍，确保细胞外的颗粒完全去除，加入胰酶消化，而后终止，离心，将细胞重悬于PBS中，流式细胞仪检测发光细胞个数，考察复合物颗粒的内吞效率。结果见图7，实验结果显示：未经过包裹的DNA基本无细胞内吞能力，而经过包裹后，其在培养4小时后，与阴性区域相比，有21.04%的细胞内吞颗粒而产生荧光。

采用本发明的制备方法制成的纳米颗粒，可实现基因物质的输送，并且，不存在体内毒性和体内免疫原性的问题，由于纳米颗粒不带电荷，还可避免体内非靶组织的粘附，并可接枝靶向基团，实现体内病变细胞靶向，从而有效提高靶向效果，且不影响体内病变细胞的内吞。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims (15)

1.一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以PEG为连续相制备亲水相系统；

2）将嵌段高分子、鱼精蛋白和基因物质加入步骤1）所制备的亲水相系统中，搅拌或摇动，形成纳米颗粒；

3）用透析袋透析除去所述纳米颗粒水相中留存的PEG，即可制得包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述亲水相系统中PEG的浓度为0.1~20wt%。

3.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述基因物质与所述鱼精蛋白的质量之和与所述嵌段高分子质量之比为1：0.1~1000，所述基因物质与所述鱼精蛋白的质量比为0.1~100：1。

4.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为5000~20000Da，透析时间为6~72h。

5.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述嵌段高分子包括依次连接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段为亲水嵌段，所述第二嵌段为疏水嵌段。

6.如权利要求5所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述第一嵌段可选自PEG或PEO。

7.如权利要求5所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述第二嵌段可选自聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物或聚己内酯中的一种。

8.如权利要求5所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述第三嵌段包括蛋白亲和作用力强的高分子，所述蛋白亲和作用力强的高分子选自葡聚糖、麦芽糖或壳聚糖中的一种。

9.如权利要求5所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述嵌段高分子还包括靶向基团或荧光分子，所述靶向基团或所述荧光分子与所述第一嵌段连接。

10.如权利要求9所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述靶向基团可选自蛋白、多肽、抗体或小分子靶向基团的一种或几种；所述蛋白可选自转铁蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可选自RGD或胰岛素；所述小分子靶向基团可选自叶酸、生物素或半乳糖的一种。

11.如权利要求9所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述荧光分子可选自罗丹明、FITC、NBD、cy5.5或FAM的一种。

12.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，可将所述鱼精蛋白与所述基因物质形成复合物后再加入步骤1）所制备的亲水相系统中。

13.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述基因物质包括DNA或RNA。

14.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，搅拌或摇动的时间为0.5~72h。

15.如权利要求1所述的一种包括鱼精蛋白和基因物质的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述嵌段高分子的合成方法包括以下步骤：

1）以mPEG-COOH为引发剂，在Sn(oct)₂的催化下，在80~140℃条件下于无水甲苯中引发开环聚合，加入己内酯，反应进行10~72h，合成PEG₄₅-PCL₃₀嵌段；

2）将葡聚糖与乙二胺按照1:（1~50）的摩尔比投料，即称取葡聚糖,乙二胺,溶解于2~50mL的DMSO中，混合物在0~80℃油浴中反应2~10天，每天加入0~50mg氰基硼氢化钠；反应结束后，加入大量甲醇沉淀，过滤，再加水溶解，甲醇沉淀，反复三次，最后将产物于室温下真空干燥，得到淡黄色还原氨化的DEX-EDA;

3）将DEX-EDA的氨基与mPEG₄₅-PCL₃₀-COOH的羧基进行反应，称取DEX-EDA，加入1~10倍摩尔量的PEG-PCL，溶解于1~50mL的DMSO中，加入0~50倍摩尔量的三乙胺，搅拌1~60min后，加入0~50倍摩尔量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，在0~90℃下反应2~48h；反应结束后，加入乙醚沉淀，减压抽滤，产物加入超纯水，溶解后，用截留分子量为1000~20000的透析袋透析除去杂质与未反应的反应物，于-20~-200℃预冻，低温冻干，得到白色粉末产物。

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