CN102757500A - 长效胸腺素α1 的聚乙二醇化修饰物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胸腺素α1聚乙二醇化修饰物（Tα1－PEGs），Tα1－PEG s的制备方法，含它们的药物组合物，及其在治疗或预防免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病的药物中的用途，包括在乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌、恶性黑色素瘤、非小细胞性肺癌、冠状病毒引起的SARS、艾滋病等相关疾病的治疗或预防中的应用。

Description

长效胸腺素α1 的聚乙二醇化修饰物
本申请是基于申请号为200910207003.1，申请日为2005年11月10日，发明名称为“长效胸腺素α1的聚乙二醇化修饰物”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及胸腺素α1聚乙二醇化修饰物（Tα1－PEGs），Tα1－PEG s的制备方法，含它们的药物组合物，及其在治疗或预防与免疫缺陷、免疫功能低下相关疾病的单独用药或联合用药中的用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，肝癌，恶性黑色素瘤，非小细胞肺癌，冠状病毒引起的SARS（严重的急性呼吸综合症），艾滋病等相关疾病的治疗或预防中的应用。
背景技术
胸腺素α1（Thymosin alpha1，Tα1）是由胸腺分泌的活性多肽之一，具有很高的序列保守性，不同种属来源的Tα1具有相同的化学结构。Tα1由28个氨基酸残基组成，分子量为3108，等电点为4.2，N－端为乙酰化结构。Tα1的一级结构如下：
1                                       10
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-
                    20                                28
Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
Tα1是针对T淋巴细胞的免疫增强剂，能促进T细胞的成熟和分化，并促使成熟的T细胞分泌多种淋巴因子（如白介素－2和γ－干扰素等），还能促进白介素－2受体的生成；另外，对一些病毒感染细胞和某些肿瘤细胞的生长有直接地抑制或杀伤作用。作为免疫增强剂，对免疫缺陷和免疫功能低下的疾病均有较好的疗效，其临床治疗研究始于20世纪80年代。当单独使用或与干扰素联合使用治疗慢性乙型肝炎时，是一种安全有效的药物。对于许多其它疾病，如丙型肝炎、肝癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌和艾滋病等，Tα1都有一定的疗效。此外，也可作为疫苗辅助用药，来加强流感疫苗和乙型肝炎疫苗的效果。
目前临床使用的Tα1为化学合成品，消毒干粉制剂，治疗慢性乙型肝炎的临床给药剂量1.6mg/次，注射2次/周，6个月/疗程，具有给药剂量大、注射次数频繁及价格昂贵等不足之处。因此，改善Tα1的体内代谢行为，提高生物利用度，延长作用时间，得到长效Tα1类似物具有重要意义。
发明内容
本发明人经研究已发现Tα1经聚乙二醇（PEG）共价修饰后的修饰产物，其体内生物利用度得到显著改善，体内作用时间被显著延长，并保持良好的免疫增强活性。
本发明涉及式（I）所示的Tα1的PEG化修饰物：
Z-[Cysx(PEG-M)]-（Aa）n－T    （I）
M＝
Figure BDA00001964827800021
（MAL），或
Figure BDA00001964827800022
或-NH
Figure BDA00001964827800023
Z＝H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、异戊基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、氨甲酰基、苄氧羰基、芴甲酰基等，优选为乙酰基、氨甲酰基；其中：PEG为RO(CH2CH2O)m-CH2CH2-，R＝H或CH3，m＝5－2000；Cys为半胱氨酸，其通过侧链硫醚原子与M基团共价连接；当n＝0时，Cys以其羧基与T的N－端氨基酸形成酰胺键相连，或以其氨基与T的C－端羧基形成酰胺键相连，Cys可位于T序列的两端、任意两相邻氨基酸之间以及替代任意位置的氨基酸；当n＝1－10时，Cys可通过Aa与T序列的N－末端或C－末端相连，Aa为20种天然氨基酸中的任一种或几种的任意组合，其中包括Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val等，Aa优选Gly、Ala、Val、Leu；
T表示天然Tα1全序列或其任意位点被至少一个cys取代的类似物。
本发明另一方面涉及含至少一种式（I）化合物及药用载体或赋形剂的药物组合物。
本发明还涉及至少一种式（I）化合物在制备用于预防或治疗与免疫缺陷或免疫功能低下相关疾病的药物中用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS，艾滋病等相关疾病的治疗或预防中的应用。
本发明中所有氨基酸的构型，除注明为D－型外，均为L－型。根据本发明，所涉及的平均分子量由几百到几万的PEG修饰剂可作为商品化试剂购买到。
Tα1全序列可用常规的固相或液相多肽合成法合成，在合成过程中很容易在N－端，C－端，或Tα1中任意其它位置引入或替换为Cys，将含Cys的肽链溶于水中，调pH近中性，加入PEG修饰剂，以高效液相色谱纯化得到PEG修饰的Tα1。
本发明应用固相多肽合成法，将Cys引入T的各个位点，得到T的衍生物Z－[Cysx]-（Aa）n－T，经裂解、纯化后，与平均分子量为750、1100、2000及5000的PEG修饰剂反应，以HPLC纯化，经冰冻干燥，得到Z－[Cysx(PEG-M)]-（Aa）n－T。产物经HPLC分析为单一峰，经生物质谱鉴定结构正确。
根据本发明，本发明的药物组合物制成适用于哺乳动物用的各种剂型，例如用甘露醇作赋形剂制成注射剂。
根据本发明，本发明中术语“类似物”是指天然Tα1全序列中的任意位点被至少一个cys取代形成的Tα1序列。
说明书中出现的PEG5000表示平均分子量为5000的PEG。
根据本发明，本发明中所涉及的Tα1序列及其半胱氨酸衍生物，优选如下的序列：
BMJBT001:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Cys-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT002:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Cys-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT003:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Cys-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT004:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Cys-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT005:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Cys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT006:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT007:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Cys-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT008:
Ac-Cys-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT009:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Cys-NH2
BMJBT010:
Ac-Cys-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT011:
Ac-Ser-Cys-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT012:
Ac-Ser-Asp-Cys-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT013:
Ac-Ser-Asp-Ala-Cys-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT014:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Cys-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT015:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Cys-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT016:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Cys-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT017:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Cys-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT018:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Cys-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT019:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Cys-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT020:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Cys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT021:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Cys-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT022:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Cys-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT023:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Cys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT024:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Cys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT025:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Cys-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT026:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Cys-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT027:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Cys-Ala-Glu-Asn-OH
BMJBT028:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Cys-Glu-Asn-OH
BMJBT029:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Cys-Asn-OH
BMJBT030:
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Cys-OH
根据本发明，本发明优选的Tα1的PEG化修饰物为：
BTJB005，
BTJB006，
BTJB007，
BTJB008，
BTJB009，
BTJB010，
BTJB011，
BTJB012，
BTJB013，
BTJB014，
BTJB015，
BTJB016，
BTJB017，
BTJB018，
BTJB019，
BTJB020，
BTJB021，
BTJB022，
BTJB023，
BTJB024。
根据本发明，符号“BMJBT”表示由一个cys在Tα1不同位点取代的Tα1序列；“BMJB”表示PEG化的BMJBT。
附图说明
图1Tα1的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图2Tα1及其PEG修饰物BMJB013的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图3Tα1及其PEG修饰物BMJB014的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图4Tα1及其PEG修饰物BMJB015的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图5Tα1及其PEG修饰物BMJB016的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图6Tα1及其PEG修饰物BMJB017的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图7Tα1及其PEG修饰物BMJB018的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图8Tα1及其PEG修饰物的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
图9Tα1及其类似物的小鼠体内血药浓度-时间曲线。
根据本发明中使用的缩写词具有下面的含义：
Tα1－胸腺素α1         PEG－聚乙二醇
Ala－丙氨酸             Arg－精氨酸
Asn－天冬酰胺           Asp－天冬氨酸
Cys－半胱氨酸           Gln－谷氨酰胺
Glu－谷氨酸             Gly－甘氨酸
His－组氨酸             Ile－异亮氨酸
Leu－亮氨酸             Lys－赖氨酸
Met－甲硫氨酸           Phe－苯丙氨酸
Pro－脯氨酸             Ser－丝氨酸
Thr－苏氨酸             Trp－色氨酸
Tyr－酪氨酸             Val－缬氨酸
Ac－乙酰基              MAL－马来酰亚胺
Fmoc－芴甲氧羰基        DMF－二甲基甲酰胺
DCC－二环己基碳二亚胺
HBTU－2-（1H-1-羟基苯并三唑）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBt－1－羟基苯并三唑    HOSu－N－羟基琥珀酰亚胺
NMM－N－甲基吗啡啉       TFA－三氟乙酸
TsCl－对甲苯磺酰胺       EDT－巯基乙醇
RP－HPLC－反相高效液相色谱
IFN－γ－干扰素－γ
具体实施方式
实施例
下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。实施例所用平均分子量为2000－85000的mPEG修饰剂，固相合成载体Wang树脂为南开合成产品，TFA、Rink酰胺树脂、DCC、HOBt、Fmoc－氨基酸为吉尔生化产品。
实施例1：Ac－[Cys5（mPEG5000－MAL）]Tα1（BTJB005）
1.1Ac－[Cys5]Tα1的合成：
用固相法合成[Cys5]Tα1：以Wang树脂100mg为固相载体，Fmoc－AA－OH（1－10倍量）为原料，DCC（1－10倍量）、HOBt（1－10倍量）为缩合剂，除以Cys5替换Val5外，其余氨基酸残基按Tα1序列合成，得到Ac－[Cys5]Tα1的全保护肽树脂。干燥后，TFA裂解，室温反应20-200分钟，滤除树脂，加入乙醚沉淀出白色固体，水溶解，冰冻干燥，得白色固体161mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]2+峰：1551.0（理论值：3098）。
1.2Ac－[Cys5（mPEG5000－MAL）]Tα1的合成
将纯化后的Ac－[Cys5]Tα1溶于水中，调pH5－10范围内，加入mPEG5000修饰剂，室温反应，用RP－HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体17.8mg，收率38.2%。
Ac－[Cys5（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8373附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例2：Ac－[Cys8（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB008）
按照实施例1.1方法合成Ac－[Cy s8]Tα1，得粗肽116mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]2+峰：1543.0（理论值：3083）。
按照实施例1.2方法合成Ac－[Cys8（mPEG5000－MAL）]Tα1，HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体16.9mg，收率37.1%。
Ac－[Cys8（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8247附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例3：Ac－[Cys11（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB011）
按照实施例1.1方法合成Ac－[Cys11]Tα1，得粗肽143mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]3+峰：1034.9（理论值：3098）。
按照实施例1.2方法合成Ac－[Cys11（mPEG5000－MAL）]Tα1，HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体21.4mg，收率28.9%。
Ac－[Cys11（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8282附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例4：Ac－[Cys16（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB016）
按照实施例1.1方法合成Ac－[Cys16]Tα1，得粗肽147mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]3+峰：1034.0（理论值：3098）。
按照实施例1.2方法合成Ac－[Cys16（mPEG5000－MAL）]Tα1，HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体15.6mg，收率53.3%。
Ac－[Cys16（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8296附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例5：Ac－[Cys17（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB017）
按照实施例1.1方法合成Ac－[Cys17]Tα1，得粗肽133mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]3+峰：1029.6（理论值：3083）。
按照实施例1.2方法合成Ac－[Cys17（mPEG5000－MAL）]Tα1，HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体17.4mg，收率42.6%。
Ac－[Cys17（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8237附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例6：Ac－[Cys21（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB021）
按照实施例1.1方法合成Ac－[Cy s21]Tα1，得粗肽166mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]3+峰：1029.0（理论值：3082）。
按照实施例1.2方法合成Ac－[Cys21（mPEG5000－MAL）]Tα1，HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体28.3mg，收率49.3%。
Ac－[Cys21（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8263附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例7：Ac－[Cys24（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB024）
按照实施例1.1方法合成Ac－[Cys24]Tα1，得粗肽162mg。RP－HPLC纯化，ESI－MS鉴定，[M]3+峰：1029.0（理论值：3082）。
按照实施例1.2方法合成Ac－[Cys24（mPEG5000－MAL）]Tα1，HPLC分离产物，冰冻干燥，得到白色固体17.3mg，收率37.4%。
Ac－[Cys24（mPEG5000－MAL）]Tα1经MALDI－TOF－MS鉴定，在8281附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。
实施例8：Tα1、Ac－[Cysx]Tα1类似物及其PEG修饰产物诱导小鼠脾细胞产生IFN－γ。
无菌取脾制备脾细胞悬液，用含20％小牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度为5×106细胞/mL，于24孔培养板中分别加入0.5mL细胞悬液、0.25mLCon A(终浓度为0.5ug/mL)和0.25mL不同浓度的待测样品，对照孔用RPMI-1640培养液代替，置37℃、5％CO2孵温箱中孵育24小时，离心收集上清，采用双抗体夹心ELISA法测定上清中IFN-γ的含量，按照ELISA试剂盒说明书操作。
表1-1 Tα1及其修饰物在Con A刺激下诱导脾细胞产生IFN-γ试验结果（1）.
注：每个样品中均加入Con A，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t检验。
表1-2Tα1及其修饰物在Con A刺激下诱导脾细胞产生IFN-γ试验结果（2）.
Figure BDA00001964827800141
注：每个样品中均加入Con A，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t检验。
表1-3Tα1及其修饰物在Con A刺激下诱导脾细胞产生IFN-γ试验结果（3）.
Figure BDA00001964827800151
注：每个样品中均加入Con A，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t检验。
结论：Tα1经PEG修饰后，仍具有促脾细胞产生INF－γ的活性。
实施例9：Tα1、Ac-[Cysx]Tα1类似物及其PEG修饰产物刺激T淋巴细胞增殖反应
首先活杀放血处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏，制成脾细胞悬液；裂解红细胞后，洗涤三次，用台盼蓝染色，活细胞数需在95%以上；用10%小牛血清1640液将细胞浓度稀释成5×106个/mL，备用；将脾细胞加入无菌96孔培养板中，每孔100μL，总量200μL（包括ConA和药物各50μL），每一样品浓度重复3～4孔；置5%CO2培养箱中，培养72小时,，终止培养前16小时，每孔加入10μci/mL3H-TdR20μL，使其终浓度为1.0μci（37.0KBq）/mL，用Herveste96型细胞收集仪将细胞收集于滤膜上，置80℃烘箱内干燥20分钟或自然干燥;将干燥的滤膜装入1450-423型microBeta样品袋中，加入闪烁液后，置Perkin Elmer MicroBeta Trilux1450型微量液闪仪测定样品的放射性强度（cpm）。
表2-1Tα1及其修饰物在Con A刺激下刺激小鼠脾细胞增殖的试验结果（1）.
Figure BDA00001964827800171
注：每个样品中均加入Con A，n=4，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t检验。
表2-2Tα1及其修饰物在Con A刺激下刺激小鼠脾细胞增殖的试验结果（2）.
Figure BDA00001964827800172
Figure BDA00001964827800181
注：每个样品中均加入Con A，n=4，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t检验。
结论：Tα1经PEG修饰后，仍然显示较好地促T淋巴细胞增殖作用。实施例10：Tα1、Ac-[Cysx]Tα1类似物及其PEG修饰产物在小鼠体内血药浓度的动态变化过程
包被抗原：用包被液稀释Tα1检测抗原贮备液，至终浓度2μg/mL，加到酶标板孔中，0.1mL/孔，4℃孵育5天。然后，用洗涤液洗涤酶标板，0.2mL/孔，3min/次，洗涤三次。每孔加封闭液0.2mL，37℃孵育1.5小时，洗涤液洗2次，甩干。
样品制备：准确称量样品，用生理盐水溶解，浓度为1.5mg/mL；小鼠腹腔注射给药0.2mL/只；分别抽取3min，20min，40min，1h，2h，3h，6h，8h，12h，24h血样，以10000转/分钟的速度离心5分钟，收集血清，-20℃冰箱保存备用。取样品0.2mL，加1：1500兔抗Tα1血清0.1mL（终滴度为1：6000），CD-1＠小鼠正常血清0.2mL，1%脱脂奶粉PBS0.1mL，同时做抗体空白对照，总反应体积为0.4mL，置37℃孵温箱反应2小时，制备待测样品。取0.0004～400μg/mL不同浓度的Tα10.1mL，加1：1500兔抗Tα1血清0.1mL（终滴度为1：6000），CD-1＠小鼠正常血清0.2mL，同时做抗体空白对照，总反应体积为0.4mL，置37℃孵温箱反应2小时，制备标准样品。
样品检测：将已制备好的标准样品和待测样品分别加入酶标板，0.1mL/孔，置37℃孵温箱反应1小时，洗三次，甩干。加底物显色液0.1mL/孔，反应10分钟。加2mol/L H2SO4溶液0.05mL/孔，终止反应。在450nm处测定光密度值。以标准品（Tα1）浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，依此计算待测样品的含量。
测定的药代动力学参数结果见表5，图1-9分别为Tα1及其PEG修饰物的小鼠体内药时曲线。从这些图表数据中可以看出：与Tα1相比，Tα1的PEG修饰物确实改善了其体内生物利用度，并大幅延长了作用时间。
表5Tα1及其类似物在小鼠体内药代动力学行为*
Figure BDA00001964827800191
*：24h时的药代动力学参数，n=3，剂量为300μg/只。

Claims (6)

1.式（I）化合物及其PEG修饰物：
Z-[Cysx(PEG-M)]-（Aa）n－T    (I)
其中：Z为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、异戊基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、氨甲酰基、苄氧羰基、芴甲酰基，优选为乙酰基、氨甲酰基，M＝
Figure FDA00001964827700011
（MAL），或
Figure FDA00001964827700012
或
Figure FDA00001964827700013
PEG为RO(CH2CH2O)m-CH2CH2－，R＝H或CH3，m＝5－2000；Cys为半胱氨酸，它通过侧链硫醚原子与M基团共价相连，Cys还以其羧基与T的N－端氨基形成酰胺键相连，或以其氨基与T的C－端羧基形成酰胺键相连；T表示天然Tα1全序列或其任意位点被至少一个cys取代的类似物，T或其所述类似物N－端乙酰化；x表示Cys在T中的位置，x＝1－30；Aa表示20种天然氨基酸的任一种或几种氨基酸的组合，n＝0－10。
2.权利要求1的化合物或其PEG修饰物，其中含Tα1及其半胱氨酸衍生物的序列以下式表示：
Z-[Cysx]-(Aa)n-T或Z-T－(Aa)n-Cys－NH2
即：当n＝0时，Cys可在T的N－末端、C－末端以及其它（1－29）中的任一位置；当n＝1－10时，Aa可为天然20种氨基酸中的任一种或几种氨基酸的组合，其中包括Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val等，Aa优选Gly、Ala、Val、Leu。
3.权利要求1的化合物或其PEG修饰物，其中所述PEG修饰物为：
Ac－[Cys5（mPEG5000－MAL）]Tα1（BTJB005）；
Ac－[Cys8（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB008）；
Ac－[Cys11（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB011）；
Ac－[Cys16（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB016）；
Ac－[Cys17（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB017）；
Ac－[Cys21（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB021）；或
Ac－[Cys24（mPEG5000－MAL）]Tα1（BMJB024）。
4.以下符号表示的化合物：
BMJB012；
BMJB013；
BMJB014；
BMJB015；
BMJB016；
BMJB017；
BMJB018；
BMJB019；
BMJB020。
5.药物组合物，其含有至少一种权利要求1-4任一项的化合物或其PEG修饰物及药物载体或赋形剂。
6.权利要求1－4中任一项的化合物或其PEG修饰物在制备用于预防或治疗与免疫缺陷或免疫功能低下相关疾病的单独用药或联合用药中的用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，肝癌，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS，艾滋病等相关疾病的治疗或预防中的应用。
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