CN102747105B - 一种水溶性的植物黑色素的制造方法 - Google Patents

一种水溶性的植物黑色素的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明首次公开了一种水溶性的植物黑色素的制造方法。所述制造方法包括以乌饭树叶为原料制造黑色素前体，再经酶催化氧化、大孔树脂纯化和喷雾干燥等工序制造植物黑色素。通过本发明的方法制造的黑色素拥有良好的水溶性，解决了天然黑色素不能溶于水的难题。

Description

一种水溶性的植物黑色素的制造方法
技术领域
本发明涉及黑色素及其制造方法，具体而言就是指利用乌饭树叶为原料，通过生物酶促反应获得一种高水溶性的植物黑色素的制造方法。
背景技术
黑色素是广泛存在于生物界中通过吸收紫外线和电离辐射来保护组织的一道天然屏障。有关天然黑色素的研究已逾半个世纪，尽管研究得并不是完全透彻，但基本的合成途径及理化性质已有了较为明确的结论：动物和微生物来源的黑色素主要是酪氨酸等经过酪氨酸酶的催化氧化，经多巴、多巴醌、吲哚醌等途径最终合成黑色素；植物黑色素则是儿茶酚等含有邻位酚羟基的多酚经多酚氧化酶氧化成醌及其聚合体而形成。有关其功能因子的研究也没有停下脚步，陆续发现它不仅是一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂(HungY-C，Sava VM，Makan SY，et al.Antixidant activity of melanins derivedfrom tea：comparison between different oxidative states[J].FoodChemistry，2002，78：223-240.)，近来还发现其具有抑制艾滋病毒复制的功能(Montefiori DC，Zhou J.Selection antiuinal activity of syntheticL-tyronsine and L-Dopa malanins against human immunodeficiency virusin vitro[J].Antiviral Res.，1991，1：11-20)。因此，黑色素在医药、化妆品、食品等方面都有着广泛的应用前景
以往的植物黑色素的制备方法大致分为两种，其一，如专利CN101012340 A和CN 101643589 A介绍的，将含有黑色素的植物组织用0.5-1.0M碱液(氢氧化钠或氢氧化钾)浸泡提取，然后用酸水解杂质得到黑色素固体；其二，是以植物中的酚类为底物进行酶促合成黑色素的，如CN 1651574 A和CN 101205547A介绍以没食子酸等酚类为底物，以马铃薯、蘑菇等中提取得到的多酚氧化酶系为催化剂合成黑色素的方法。另外，在US 6576268 B2中介绍天然植物黑色素为儿茶酚类等含有邻位酚羟基的酚类物质通过酶促反应生成，其常与蛋白质、多糖、脂类、其他的色素或者以上多种的混合牢固的结合在一起，形成非均质性的三维聚合物，不溶于水和一般溶剂，难以分离和提纯。
但上述专利文献中所获得的黑色素均为非水溶性的，用这种黑色素制造的染发剂无法有效附着于头发组织上，制造的膳食补充剂或者医药产品在体内无法吸收代谢，制造的护肤品只能附着于皮肤表面而无法吸收，因而没有真正的商业价值，因此制备水溶性的植物黑色素成为天然黑色素产业化中的一个必须要解决的课题。
鉴于如上问题，本发明提供了一种以植物为原料制备高水溶性的天然植物黑色素的方法，具体而言，就是以乌饭树叶为原料，以酶为催化剂，并以大孔吸附树脂为纯化手段，来获得高水溶性的天然植物黑色素。
一般方法制得的天然植物黑色素都为非水溶性的，其根本原因在于植物组织中存在的黑色素是一种复杂的三维聚合物，其与蛋白质、脂类、其他的色素或者以上多种的混合牢固的结合在一起，不可能拥有水溶性，而通常的碱液提取法，只是破坏黑色素一部分的三维结构，也无法将黑色素恢复水溶性。因此，参与本发明的人员，为解决上述课题，在潜心研究黑色素的生成过程中，意识到只要在黑色素的生成过程中，尽量避免大分子蛋白质、脂类的存在，就能获得高水溶性的植物黑色素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以乌饭树叶为原料制造水溶性植物黑色素的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)制备黑色素前体：取适量新鲜或干燥的乌饭树叶，捣碎，转移至反应釜中，加入一定体积的含水有机溶剂，在一定温度下提取，滤除残渣，所得滤液减压、脱除其中所含有的有机溶剂后，补充去离子水至最初滤液的体积，然后经超滤膜过滤除去高分子物质，得到黑色素前体的水溶液；
(2)催化氧化：将所述黑色素前体的水溶液按GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量投入多酚氧化酶，在35～42℃的条件下进行保温反应，并持续通入空气，反应完毕后，反应液经超滤膜过滤，得到黑色素粗品溶液；
(3)纯化：将所述黑色素粗品溶液经大孔树脂吸附，用去离子水洗去不吸附的杂质，直至流出液变澄清为止，然后用一定浓度的有机溶剂解析出黑色素溶液；和
(4)干燥：将所述黑色素溶液在≤60℃的温度下减压回收有机溶剂，再经喷雾干燥得到无定形的植物黑色素粉末。
优选地，在步骤(1)中，每公斤新鲜乌饭树叶添加含水有机溶剂1～5L；每公斤干燥乌饭树叶添加含水有机溶剂3～10L。
优选地，在步骤(1)中，每公斤新鲜乌饭树叶添加含水有机溶剂2～3L；每公斤干燥乌饭树叶添加含水有机溶剂5～6L。
优选地，所述有机溶剂为极性有机溶剂，所述极性有机溶剂为乙醇或丙酮。
优选地，所述含水有机溶剂为含有低于80％(v/v)有机溶剂的水溶液。
优选地，所述含水有机溶剂为含有50～60％(v/v)有机溶剂的水溶液。
优选地，在步骤(1)中，所述温度为25℃～60℃。
优选地，在步骤(1)中，所述温度为40～50℃。
优选地，在步骤(1)中，所述超滤膜为能截留分子量在100000以上的聚砜膜。
优选地，在步骤(2)中，多酚氧化酶的投入量为黑色素前体溶液中总酚质量的10～100wt.％。
优选地，在步骤(2)中，按GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量投入多酚氧化酶的量为10～30％(m/m)。
优选地，在步骤(2)中，保温反应的时间为2～6hr，通入的空气量为5～10L/min。
优选地，在步骤(2)中，所述多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上。
优选地，在步骤(3)中，所述大孔吸附树脂包括AB-8树脂、X-5树脂、HP-20树脂、和XAD-7树脂。
优选地，在步骤(3)中，所述含水有机溶剂为含有20～80％(v/v)乙醇的水溶液、或含有20～80％(v/v)丙酮的水溶液。
优选地，在步骤(4)中，在0.09MPa、60℃条件下脱除有机溶剂。
乌饭树叶中含有大量的以低聚原花青素为代表的植物多酚类物质，原花青素的结构通式(I)，它是以儿茶素为单体聚合而成的直链分子。
原花青素的每一个单体上都有一对邻位酚羟基，其在多酚氧化酶的作用下，可被氧化成邻苯醌，邻苯醌本来并没有太深的颜色，但因为此邻苯醌上拥有众多的助色团---酚羟基，因而颜色就迅速加深，而且，在一定范围内，原花青素的聚合度越高，含有的酚羟基越多，那么其氧化产物，醌的色泽越深，直至变成黑色(参见由姚新生编.写的天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社(第二版)，1996：172-177.)。
本发明制造的黑色素之所以能溶于水，从本质上说，是因为采用本发明所制造的植物黑色素分子拥有众多游离的酚羟基，因而拥有较强的亲水性，而专利CN 1651574A和CN 101205547A中虽然也是利用多酚作为底物合成黑色素，但其制造的黑色素完全不能溶于水，其中的原因在于，以上两份专利所涉及的方法中都没有在酶促反应前设法除去高分子量的蛋白质(多酶氧化酶的分子量较小，一般只有几万左右，不足以导致黑色素产生沉淀，所以此处所指的高分子量的蛋白质并不包括多酚氧化酶)，而邻位酚羟基、邻位醌基都非常容易和蛋白质相结合(魏国华，许新德，邵斌等.天然食品防腐剂——乌饭树叶提取物[J].中国食品添加剂，2008，6：143-145；陆忠兵，石碧，刘欣.植物单宁一蛋白质相互作用的计算机模拟[J].皮革科学与工程，2001，11(4)：2～3.)，两者一旦结合，植物黑色素的分子量就会急剧增大，其三维结构也变得越来越复杂，由此导致其不再能溶于水或其他常见有机溶剂。
综上所述，制造水溶性植物黑色素的关键点在于：(1)黑色素前体必须是以低聚原花青素为主的多酚类物质，保证其反应之前和之后都能完全溶于水，和(2)在催化反应之前尽量除去高分子蛋白质，以免在催化氧化反应完毕后产物不溶于水，此目的主要通过两个关键控制点来完成：其一，选用较高浓度的乙醇水溶液或丙酮水溶液作提取溶剂，可使溶出的大分子蛋白质沉淀下来，从而过滤除去；其二，选用超滤膜来除去在前一步骤遗留下来的大分子蛋白质。
本发明所提供的以乌饭树叶为原料制造水溶性的植物黑色素的方法具有以下优点：(1)本发明制造的植物黑色素具有优良的水溶性，解决了天然黑色素不能溶于水的难题，为天然黑色素的商业应用铺平了道路；(2)通过本发明，首次证明了只要去除高分子蛋白质的影响，植物黑色素完全可以溶于水。
具体实施方式
为了能够进一步了解本发明的结构、特征及其他目的，现结合所附较佳实施例详细说明如下，所说明的较佳实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
实施例1
取1kg新鲜乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加2L 60％(v/v)乙醇水溶液，在约50℃温度下提取2.5hr，滤除残渣，得到滤液，减压脱除乙醇，直至无醇味止，得到的浓缩液补充去离子水至最初滤液体积，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，就得到黑色素前体的水溶液溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为24.5g。
向黑色素前体溶液中投入2.45g(即10wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在37℃的条件下，保温反应5hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上X-5树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 50％乙醇溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例2
取1kg新鲜乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加1L 80％(v/v)丙酮水溶液，在约25℃温度下提取2.5hr，滤除残渣，得到滤液，减压脱除丙酮，直至无丙酮味止，得到的浓缩液补充去离子水至最初滤液体积，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，就得到黑色素前体的水溶液溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为22.1g。
向黑色素前体溶液中投入4.42g(即20wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在35℃的条件下，保温反应3hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上AB-8树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 80％丙酮溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例3
取1kg新鲜乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加3L 50％(v/v)丙酮水溶液，在约50℃温度下提取2.5hr，滤除残渣，得到滤液，减压脱除丙酮，直至无丙酮味止，得到的浓缩液补充去离子水至最初滤液体积，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，就得到黑色素前体的水溶液溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为25.0g。
向黑色素前体溶液中投入25.0g(即100wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在42℃的条件下，保温反应2hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上AB-8树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 80％丙酮溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例4
取1kg新鲜乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加5L 80％(v/v)乙醇水溶液，在约50℃温度下提取2.5hr，滤除残渣，得到滤液，减压脱除乙醇，直至无醇味止，得到的浓缩液补充去离子水至最初滤液体积，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，就得到黑色素前体的水溶液溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为26.2g。
向黑色素前体溶液中投入13.1g(即50wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在42℃的条件下，保温反应2hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上AB-8树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 70％乙醇溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例5
取1kg干燥的乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加3L 60％(v/v)丙酮水溶液，在约60℃温度下提取2.5hr，滤除残渣，得到的滤液，补充去离子水至最初滤液体积，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，得到黑色素前体溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为27.8g。
向前体溶液中投入8.34g(即30wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在40℃的条件下，保温反应5hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上HP20树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 50％丙酮溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例6
取1kg干燥的乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加5L 50％(v/v)乙醇水溶液，在约60℃温度下提取3hr，滤除残渣，得到的滤液，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，得到黑色素前体溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为28.6g。
向前体溶液中投入5.72g(即20wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在40℃的条件下，保温反应6hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上HP-20树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 40％乙醇溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例7
取1kg干燥的乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加6L 60％(v/v)乙醇水溶液，在约60℃温度下提取2.5hr，滤除残渣，得到的滤液，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，得到黑色素前体溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为26.1g。
向前体溶液中投入5.22g(即20wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在40℃的条件下，保温反应5hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上HP-20树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 50％乙醇溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例8
取1kg干燥的乌饭树叶，用组织捣碎机将其捣碎，捣碎过程中防止局部温度超过60℃。转移至反应釜中，加10L 80％(v/v)乙醇水溶液，在约60℃温度下提取3hr，滤除残渣，得到的滤液，过AMICON-聚砜P100的超滤膜，得到黑色素前体溶液，并依照GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量为29.5g。
向前体溶液中投入5.9g(即20wt.％)多酚氧化酶(此多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上)，在40℃的条件下，保温反应6hr，并以5-10L/min的流速通入空气。反应完毕后，反应液经过AMICON-聚砜P100的超滤膜过滤。
滤液上XAD-7树脂柱，以去离子水洗柱直至流出液为澄清止，随后用约500ml 40％乙醇溶液为解析剂，得到黑色素溶液。
黑色素溶液在0.09MPa真空、60℃条件下回收溶剂，然后进行喷雾干燥，并过60目筛，得到植物黑色素产品。
实施例9
将实施例1～实施例6中的植物黑色素产品合并，混合均匀后，参照美国专利US 6576268 B2中所涉及的鉴定方法进行鉴定：
(1)红外光谱鉴定：此黑色素产品的红外光谱有两个明显的吸收区间，其一为1620cm-1～1650cm-1，可能是由芳香C＝C或羰基的振动引起；另一区间在3350附近，可能是由OH的伸缩振动产生。
鉴定结果：符合上述专利提及的范围。
(2)紫外-可见光光谱鉴定：此黑色素的紫外光谱则是带有明显的特征性：在短波区没有任何明显吸收峰，在可见光区，以吸光度取对数对波长作回归图，可得到一条斜率为-0.0022的直线。
鉴定结果：符合上述专利提及的范围。
(3)简单试剂鉴定：
配置0.5％的黑色素水溶液，取少量置于试管中，滴加几滴FeCl3溶液，出现大量絮状沉淀。
鉴定结果：符合上述专利提及的鉴定指标。
实施例10
将实施例1～实施例6中的植物黑色素产品合并，混合均匀后，进行溶解度实验，分别取一定重量的黑色素溶于不同体积和不同温度的去离子水中，振摇或搅拌约3～5min后，用微滤膜过滤，观察滤膜上是否有明显的滤饼，若有，干燥后称重，并计算溶解度，具体结果见表1。
表1黑色素在不同温度下的溶解度
水温 30℃ 50℃ 70℃ 90℃ 100℃
水体积 100ml 100ml 100ml 100ml 100ml
黑色素重量 1g 5g 10g 20g 30g
溶解度 97.2％ 100％ 98.5％ 95.4％ 92.7％
表1数据说明黑色素的溶解度随着水温的升高而增加，另外，在50℃条件下，100ml水中可完全溶解5g黑色素，而在100℃可溶解27.81g黑色素，证明其水溶性良好。
需要说明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。

Claims (14)

1.一种水溶性的植物黑色素的制造方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(1)制备黑色素前体：取适量新鲜或干燥的乌饭树叶，捣碎，转移至反应釜中，加入一定体积的含水有机溶剂，在一定温度下提取，滤除残渣，所得滤液减压、脱除其中所含有的有机溶剂后，补充去离子水至最初滤液的体积，然后经超滤膜过滤除去高分子物质，得到黑色素前体的水溶液，其中，所述含水有机溶剂为含有20～80％(v／v)乙醇的水溶液、或含有20～80％(v／v)丙酮的水溶液；
(2)催化氧化：将所述黑色素前体的水溶液按GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量投入多酚氧化酶，在35～42℃的条件下进行保温反应，并持续通入空气，反应完毕后，反应液经超滤膜过滤，得到黑色素粗品溶液，其中，多酚氧化酶的投入量为黑色素前体溶液中总酚质量的10～100wt.％，所述多酚氧化酶的比活为10000单位/g以上；
(3)纯化：将所述黑色素粗品溶液经大孔树脂吸附，用去离子水洗去不吸附的杂质，直至流出液变澄清为止，然后用一定浓度的有机溶剂解析出黑色素溶液；和
(4)干燥：将所述黑色素溶液在≤60℃的温度下减压回收有机溶剂，再经喷雾干燥得到无定形的植物黑色素粉末。
2.根据权利要求1所述的黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(1)中，每公斤新鲜乌饭树叶添加含水有机溶剂1～5L；每公斤干燥乌饭树叶添加含水有机溶剂3～10L。
3.根据权利要求2所述的黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(1)中，每公斤新鲜乌饭树叶添加含水有机溶剂2～3L；每公斤干燥乌饭树叶添加含水有机溶剂5～6L。
4.根据权利要求1～3任一所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，所述有机溶剂为极性有机溶剂，所述极性有机溶剂为乙醇或丙酮。
5.根据权利要求1～3任一所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，所述含水有机溶剂为含有低于80％(v／v)有机溶剂的水溶液。
6.根据权利要求5所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，所述含水有机溶剂为含有50～60％(v／v)有机溶剂的水溶液。
7.根据权利要求1所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述温度为25℃～60℃。
8.根据权利要求7所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述温度为40～50℃。
9.根据权利要求8所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述超滤膜为能截留分子量在100000以上的聚砜膜。
10.根据权利要求1所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(2)中，按GB8313-87测得黑色素前体溶液中总酚质量投入多酚氧化酶的量为10～30wt.％。
11.根据权利要求1或10所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(2)中，保温反应的时间为2～6hr，通入的空气量为5～10L／min。
12.根据权利要求1所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述大孔吸附树脂包括AB-8树脂、X-5树脂、HP-20树脂、和XAD-7树脂。
13.根据权利要求12所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述含水有机溶剂为含有20～80％(v／v)乙醇的水溶液、或含有20～80％(v／v)丙酮的水溶液。
14.根据权利要求1所述的植物黑色素的制造方法，其特征在于，在步骤(4)中，在0.09MPa、60℃条件下脱除有机溶剂。
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