CN102747095A

CN102747095A - 一种刺参高温胁迫应答基因pcsk9

Info

Publication number: CN102747095A
Application number: CN201210205116XA
Authority: CN
Inventors: 孙国华; 杨建敏; 任利华; 郭婷婷; 李雪艳
Original assignee: SHANDONG PROVINCE MARINE LIVINGS RESEARCH INST
Current assignee: SHANDONG PROVINCE MARINE LIVINGS RESEARCH INST
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明公开了一种刺参高温胁迫应答基因，即刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因，该基因全长cDNA序列为1338bp，编码376个氨基酸。荧光定量PCR表明，该基因常温条件下在刺参各组织均有表达，30℃高温胁迫后在各组织中均表现为下调表达，其中呼吸树中表达量变化最显著；在15℃-30℃范围内，pcsk9随着温度升高总体呈现表达量下降, 30℃约为15℃的1/2；在30℃高温胁迫0-3 h时间内，pcsk9表现为表达下调，表达量最小值0.5出现在2 h。该刺参高温胁迫应答基因的克隆获得，为研究刺参应答高温胁迫的内在分子机理及刺参品种选育改良提供候选基因基础。

Description

一种刺参高温胁迫应答基因pcsk9

技术领域

本发明属于基因工程领域,具体涉及是一种刺参高温胁迫应答基因的全序列及其表达特性。

背景技术

温度是影响水生生物生长和生理活动的重要因子，直接影响到生物个体的生长发育、摄食代谢、繁殖存活等生命过程。刺参是我国北方海参的主要养殖种类，主要分布在黄、渤海，是典型的温带物种，限制其分布的主要因素就是海水温度。刺参具有“夏眠”的生态习性，夏眠期间消化道退化，体重也减轻，因此这一生态习性的存在明显延缓了刺参的生长速度，延长了养殖周期，给人工养殖造成了很大的弊端。

刺参的地域性分布和夏眠的生态习性都与温度相关，关于温度对刺参的影响以及刺参对温度变化响应等方面的研究，在国内外已经有许多报道，但在分子水平上的研究很少，温度影响刺参活动及分布的分子机制尚不清楚。如能通过分析温度胁迫下刺参基因的差异表达，就有可能获得胁迫相关基因，并在分子水平上阐明其表达调控的模式。获得可以作为刺参热应激指标的标记基因，可为探讨刺参应答高温胁迫的内在分子机理提供新的资料，为热抗性刺参品种选育改良和刺参夏眠机制研究提供分子基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刺参高温胁迫应答基因序列及其表达特性，为研究刺参的热激胁迫反应机理提供基因资源。

本发明提供了一种刺参高温胁迫应答基因是前蛋白转化酶枯草溶菌素9 -pcsk9基因，其cDNA序列全长为1338bp，如SEQ ID NO：1所示，其中1-31bp为5’非翻译区，1163-1338bp为3’非翻译区，开放阅读框为32-1162位核苷酸，编码376个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。本发明公开的前蛋白转化酶枯草溶菌素9 基因是筛选自刺参高温胁迫差异消减文库中的差异表达基因，消减文库克隆SSHP3H7T7测序获得前蛋白转化酶枯草溶菌素9 部分序列，后利用RACE技术获得该基因cDNA序列全长。

常温正常培养条件下pcsk9基因在刺参各组织中均有表达，体壁中的表达量最高，在呼吸树中表达量最少（图1）；高温胁迫后pcsk9在各组织中均表现为下调表达，其中呼吸树中表达量变化最显著（图2）。在15℃-30℃范围内，pcsk9随着温度升高其表达量总体呈现下调表达,30℃约为15℃的1/2（图3）。在30℃高温胁迫0-3 h时间内，pcsk9表现为表达下调，表达量最小值0.5出现在2 h（图4）。

附图说明

图1为常温下pcsk9基因在刺参各组织相对表达量，以体壁组织中基因的表达量作基准为1；

图2为高温胁迫后pcsk9在各组织相对表达量，常温下各组织中基因的表达量为基准1；

图3为15℃-30℃范围内pcsk9相对表达量，以15℃条件下基因表达量作基准为1；

图4为30℃高温胁迫0-3 h时间内pcsk9相对表达量，以0 h时间点基因的表达量为基准1。

具体实施方式

下面对本发明做进一步详细说明。

1、刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因的克隆

选取体态结实,大小相似的6只刺参迅速放到30℃水槽中, 作为高温处理组，另取6只刺参作为常温对照组，热应激3h 后,取出刺参解剖取体壁、纵肌、消化道和呼吸树等组织，用Trizol (GIBCOL公司)提取总RNA; 以DNaseI 消化基因组污染, 采用的Oligotex mRNA Kits（QIAGEN 公司）纯化mRNA。采用Clontech 公司提供的PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit 进行抑制性消减杂交,正向消减杂交即将高温组cDNA 作为Tester, 常温cDNA 为Driver，反向消减杂交反之。消减后2 次PCR 的产物连接到载体pGEM-T easy（Promega）, 转化至E. coli DH5α。正反向消减文库中各随机挑选384个阳性克隆，以³²P dATP标记探针进行斑点杂交，筛选表达差异明显克隆进行测序分析, 得到克隆号为SSHP3H7T7的下调表达基因刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9部分cDNA序列。根据获得序列设计RACE用基因特异性引物（5'-ATGGTCACGGAACTCACTGTGCTGG；5'-CAATGATGGAGTCCCCGTGATCGTT），利用SMART RACE(Clontech公司)试剂盒扩增得到刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因5’和3’端序列，进而拼接得到基因1338bp全长cDNA序列，如SEQ ID NO：1所示，其中1-31bp为5’非翻译区，1163-1338bp为3’非翻译区，开放阅读框为32-1162位核苷酸，编码376个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。

2、刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因的表达特性

以刺参看家基因β-actin为内参，采用实时荧光定量PCR技术，利用相对定量2^-△△CT法对刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因在不同胁迫时间、不同温度下以及不同组织中的应激表达特性进行分析。

不同组织：高温30℃和常温15℃水槽中，处理3 h；不同胁迫温度：设定15、18、21、24、27、30℃ 6个温度，高温胁迫3 h；不同胁迫时间： 30℃的水槽中的刺参，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h等7个时间点。各组分别取出6只刺参解剖取其等量体壁、纵肌、消化道和呼吸树等组织，在液氮中充分研磨，加入适量Trizol (Invitogen)提取总RNA，以DNaseⅠ（Promega）消化基因组污染，以Oligo nucleotide为反转录引物在M-MLV反转录酶(Promega)作用下转录合成单链cDNA。

设计荧光定量PCR引物：

pcsk9，211bp

F- TTCCATTGAACAACGGCTAC；R-GGTGACTGATTTGGCGACA

β-actin，262 bp

F-CGGGAAATCGTTCGTGACA；R-AGGACAAAGTTGGCGTACA

在ABI PRISM7300 FAST Real-Time PCR扩增仪上进行，PCR反应体系为：SYBR® Premix Ex TaqTM (2×) 10.0 μl，上下游引物各0.4 μl（10mM），ROX Reference Dye(50×) 0.4 μl，DNA模板2.0μl，加dH2O至20.0 μl。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，56℃退火30s，循环40次。

pcsk9基因常温条件下在刺参各组织中均有表达，体壁中的表达量最高，在呼吸树中表达量最少（图1）；高温胁迫后pcsk9在各组织中均表现为下调表达，其中呼吸树中表达量变化最显著（图2）。在15℃-30℃范围内，pcsk9表现为下调表达，随着温度升高其表达量下降，pcsk9在30℃较27℃的表达量0.54略微上升，但总体呈现下调表达（图3）。在30℃高温胁迫0-3 h时间内，pcsk9表现为表达下调，表达量最小值0.5出现在2 h（图4）。

pcsk9作为刺参高温胁迫后下调表达的一种基因，是本是本研究首次发现的刺参新基因，其功能很可能与刺参脂类代谢的调节有关，其表达水平直接或间接影响酯酶的表达。pcsk9基因表达产物既有可能作为功能蛋白直接参与代谢调节，也有可能作为调节蛋白通过调控胁迫蛋白的表达及其蛋白质活性来提高刺参对高温胁迫的耐受能力。该刺参高温胁迫应答基因的克隆获得，为研究刺参应答高温胁迫的内在分子机理及刺参品种选育改良提供候选基因基础。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省海洋水产研究所

<120> 一种刺参高温胁迫应答基因pcsk9

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 刺参（Apostichopus japonicus）

<220>

<221> CDS

<222> (32)..(1162)

<400> 1

gctcaagaaa catcaagaca atttgtcaaa aatgaaattc ctcctcgtcg tcctcttcgc 60

cgccgctgtt agcggtttgg cccctcttta cacccagaag gacaagatcg aaggatctta 120

cctcgtcacc ctcaagagaa acgtcgacgt caaaagtgcc gtagcaacca tcaaagccct 180

gcctctcttc tccactctcg gaggaagaat cgaccgtgaa tacaccaccg tgctcaatgg 240

atttgctgct actcttagcg gaaaggccct tgacttggtt cgtcgtctcg actttgttga 300

gttcgttgaa gaggatcaga tgatgtatgc ctctgtagag tggggacttg acagaattga 360

ccagaggtct cttccattga acaacggcta cagcgcmaag ggaactggta gcggagtttc 420

cgtgtacgtt cttgatactg gaattaaccc cagccacaac gacttcggtg gtcgtgcttc 480

aaccagctct tcaatggact tccactccaa ccccaacagc ggtattgact gtcatggtca 540

cggaactcac tgtgctggaa ctgtcggagg aaatacttat ggtgtcgcca aatcagtcac 600

cctttacggc gtcagagttc ttggttgctt tggaagtgga tcaaactctg gaattaccgc 660

tggtatggac tacgtcggtg gccgcagtgg aaagagagtt gcctccatgt cccttggagg 720

aggagctagt attactactg acaatgccgt cgctaatctt tacaatgatg gagtccccgt 780

gatcgttgcc gccggaaacg agaaccaaga cgcgtgcaac gtttcaccag cccgtgccgc 840

taaggcttac accgttggtg ccaccgacga cagtgacagc attgcttcct tctccaactg 900

gggaacgtgt gtagatatct ttgctcctgg tgtcgacatc aggtctgcca gtcactcctc 960

caactctgga tctaccacca tgagcggtac ttcaatggcc tgtccacacg ttgctggtgg 1020

tgccgccctt gagtgtggat ctgtcagttg tagcccaagc ggcatttaca gctctctatc 1080

caacaatgcc agttccaaca aaatcagtgg tttgactttc agcaagtcag gcagccctaa 1140

ccttctcctc tatgtcgcct aagaaggtac cgatgaggaa ttgccaggct gatacttggg 1200

tgcaattaat ttgttgacaa tttacgattt caattttaaa tgatgtttaa cgataggtgg 1260

cggaaaacct cggattgtat taattattaa taaaacaaat aaaagagcat aacaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1338

<210> 2

<211> 376

<212> PRT

<213> 刺参（Apostichopus japonicus）

<400> 2

Met Lys Phe Leu Leu Val Val Leu Phe Ala Ala Ala Val Ser Gly Leu

1 5 10 15

Ala Pro Leu Tyr Thr Gln Lys Asp Lys Ile Glu Gly Ser Tyr Leu Val

20 25 30

Thr Leu Lys Arg Asn Val Asp Val Lys Ser Ala Val Ala Thr Ile Lys

35 40 45

Ala Leu Pro Leu Phe Ser Thr Leu Gly Gly Arg Ile Asp Arg Glu Tyr

50 55 60

Thr Thr Val Leu Asn Gly Phe Ala Ala Thr Leu Ser Gly Lys Ala Leu

65 70 75 80

Asp Leu Val Arg Arg Leu Asp Phe Val Glu Phe Val Glu Glu Asp Gln

85 90 95

Met Met Tyr Ala Ser Val Glu Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln Arg

100 105 110

Ser Leu Pro Leu Asn Asn Gly Tyr Ser Ala Lys Gly Thr Gly Ser Gly

115 120 125

Val Ser Val Tyr Val Leu Asp Thr Gly Ile Asn Pro Ser His Asn Asp

130 135 140

Phe Gly Gly Arg Ala Ser Thr Ser Ser Ser Met Asp Phe His Ser Asn

145 150 155 160

Pro Asn Ser Gly Ile Asp Cys His Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly

165 170 175

Thr Val Gly Gly Asn Thr Tyr Gly Val Ala Lys Ser Val Thr Leu Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Val Leu Gly Cys Phe Gly Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ile

195 200 205

Thr Ala Gly Met Asp Tyr Val Gly Gly Arg Ser Gly Lys Arg Val Ala

210 215 220

Ser Met Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Ile Thr Thr Asp Asn Ala Val

225 230 235 240

Ala Asn Leu Tyr Asn Asp Gly Val Pro Val Ile Val Ala Ala Gly Asn

245 250 255

Glu Asn Gln Asp Ala Cys Asn Val Ser Pro Ala Arg Ala Ala Lys Ala

260 265 270

Tyr Thr Val Gly Ala Thr Asp Asp Ser Asp Ser Ile Ala Ser Phe Ser

275 280 285

Asn Trp Gly Thr Cys Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly Val Asp Ile Arg

290 295 300

Ser Ala Ser His Ser Ser Asn Ser Gly Ser Thr Thr Met Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ser Met Ala Cys Pro His Val Ala Gly Gly Ala Ala Leu Glu Cys Gly

325 330 335

Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Leu Ser Asn Asn

340 345 350

Ala Ser Ser Asn Lys Ile Ser Gly Leu Thr Phe Ser Lys Ser Gly Ser

355 360 365

Pro Asn Leu Leu Leu Tyr Val Ala

370 375

Claims

1.一种刺参高温胁迫应答基因，该基因是前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因的cDNA序列全长为1338bp，其中1-31为5’非翻译区，1163-1338为3’非翻译区，开放阅读框为32-1162位核苷酸，编码376个氨基酸。

2.一种刺参高温胁迫应答基因，其编码的刺参前蛋白转化酶枯草溶菌素9的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。