CN102742599B - 利用氯化钠和gr24促进锁阳种子萌发的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用氯化钠和GR24促进锁阳种子萌发的方法。该方法采用由氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的试剂促进锁阳种子萌发。所述氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24的配比可为100-400mmol氯化钠和10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24。本发明的方法，可快速高效的破除锁阳种子休眠并使其在40天内的萌发率可达9-22%，且萌发整齐，大大节省了锁阳育种的时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用氯化钠和GR24促进锁阳种子萌发的方法。
背景技术
锁阳（Cynomorium songaricum Rupr.）是锁阳科（Cynomoriaceae）锁阳属（Cynomorium）的单属植物，生于干燥多沙地带，为多年生肉质茎专性寄生草本植物，多寄生于蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺属（Nitraria）植物根部，是盐生全寄生药用植物，主要分布于我国西北荒漠与半荒漠地区，生境土壤轻度盐渍化至中度盐渍化。在欧洲被称为马尔他蘑菇、在穆斯林国家被叫做“tarthuth”而在中国被叫做“锁阳”。
中国古籍记载，锁阳具有治疗肾脏疾病、肠道疾病及性无能的作用。现代生药学和药用化学研究发现锁阳含有大量的活性物质，具有调节哺乳动物生殖细胞活力、促性腺激素分泌及促进睾丸发育的作用；同时还具有抗氧化及抑制HIV蛋白活性的作用。
锁阳种子休眠率高，已经严重限制了人们对这种优良资源的研究和利用。前人已对锁阳种子的促进萌发方法进行了许多尝试性的研究，并取得了一定的成就。尽管前人在打破锁阳种子休眠方面已经取得了一定的进展，但这些方法费事、费力，且重复性不高，更遗憾的是萌发率低。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供促进锁阳种子萌发的试剂。
本发明所提供的促进锁阳种子萌发的试剂，分为只由活性成分组成的便于存放的贮存型试剂和由所述贮存型试剂和水配成的即用型试剂。
该贮存型试剂由氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24组成。其中，氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24可以独立包装也可混合在一起。所述氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24的配比具体可为下述a1）-a6）中的任一种：
a1）100mmol氯化钠：10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a2）100mmol氯化钠：10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a3）400mmol氯化钠：10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a4）100-400mmol氯化钠：10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a5）100mmol氯化钠：10-8mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a6）400mmol氯化钠：10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24。
上述即用型试剂，由活性成分和辅料组成，所述活性成分为所述贮存型试剂，所述辅料为水。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供促进锁阳种子萌发的成套试剂。
本发明所提供的促进锁阳种子萌发的成套试剂，由试剂1和试剂2组成，所述试剂1和试剂2均独立包装，所述试剂1为所述即用型试剂或所述贮存型试剂，所述试剂2为独脚金内酯人工合成类似物GR24或独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液；所述试剂1和试剂2的配比满足如下条件：所述试剂1和试剂2中的独脚金内酯人工合成类似物GR24的摩尔数相等。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种促进锁阳种子萌发的方法。
本发明所提供的促进锁阳种子萌发的方法，包括对锁阳种子进行盐胁迫培养的步骤；所述盐胁迫培养是将用含盐液体浸透的锁阳种子置于15-40℃（如19-26℃）黑暗的环境中进行培养；所述含盐液体为下述c1）-c10）中的任一种：
c1）由100mmol/L氯化钠和10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c2）由100mmol/L氯化钠和10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c3）由400mmol/L氯化钠和10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c4）由100-400mmol/L氯化钠和10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c5）由100mmol/L氯化钠和10-8mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c6）由400mmol/L氯化钠和10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c7）由100-400mmol/L氯化钠和0-10-8mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液
c8）100-400mmol/L氯化钠溶液；
c9）100mmol/L氯化钠溶液；
c10）400mmol/L氯化钠溶液。
上述c1）-c7）的含盐液体中，溶剂为蒸馏水，溶质是氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24，浓度是相应溶质的浓度，以c4）为例，该溶液中氯化钠的浓度是100-400mmol/L，独脚金内酯人工合成类似物GR24的浓度是10-8-10-10mol/L。
进一步，所述方法还可包括将经过所述盐胁迫培养仍未萌发的锁阳种子进行恢复培养的步骤；所述恢复培养是在15-40℃（如19-26℃）黑暗的环境中培养用如下任一种独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液浸透的所述仍未萌发的锁阳种子：
1）10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液；
2）10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液；
3）10-10mol/L/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液。
进一步，所述方法还包括将经过所述盐胁迫培养仍未萌发的锁阳种子进行恢复培养的步骤；所述恢复培养是在15-40℃（如19-26℃）黑暗的环境中培养用蒸馏水浸透的所述仍未萌发的锁阳种子。
上述方法中，所述盐胁迫培养和恢复培养的时间可均为20天。
上述方法中，所述锁阳种子按照如下方法获得：将锁阳坚果用10-30%（质量百分含量）的NaClO溶液浸泡0.5-7h后，去除果皮得到锁阳种子。其中去除果皮的方法可为用棉布或搅拌去除果皮。该去除锁阳小坚果果皮的方法简单，适用于大批量处理生产之用。
实验证明，在常温下，用蒸馏水浸种催芽，对锁阳种子的萌发没有任何影响，40天内的发芽率为4%；而采用本发明的方法，可快速高效的破除锁阳种子休眠并使其在40天内的萌发率可达9-22%，且萌发整齐，大大节省了锁阳育种的时间。在野外环境下，人为施加化学物质（NaCl、或NaCl和独脚金内酯人工合成类似物GR24）便可诱导锁阳种子的萌发，将是实际生产中提高锁阳产量的一个十分可行的方法，进而从根本上解决人工栽培条件下锁阳种子萌发困难，接种率低的问题，并最终为发展盐生药用寄生植物锁阳的生产质量管理规范（Good Agricultural Practices，GAP）、促进资源的可持续利用、改善品质和优良品种的推广提供基础。
附图说明
图1为实施例1的盐胁迫培养得到的萌发锁阳种子图片。
图2为实施例1的恢复培养得到的萌发锁阳种子图片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所采用的独脚金内酯人工合成类似物GR24是人工合成的萌发刺激信号物质，其结构式如下所示：
独脚金内酯人工合成类似物GR24可从商业途径获得，如可购自荷兰Chiralix公司(货号.CX23880-20MG)。使用时，先用丙酮溶解配制成10mmol L-1的母液，再用蒸馏水稀释至所需的浓度（如10-10mol L-1）即得到工作液。
实施例1、促进锁阳种子快速萌发
本实施例采用的促进锁阳种子快速萌发的成套试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1和试剂2均独立包装。试剂1为即用型试剂，是由100mmol/L氯化钠和10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液（溶剂为蒸馏水，溶质是氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24，该溶液中氯化钠的浓度是100mmol/L，独脚金内酯人工合成类似物GR24的浓度是10-10mol/L）。试剂2是10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液（溶剂为蒸馏水）。
本实施例的促进锁阳种子快速萌发的方法，包括有如下步骤：
A、采集锁阳坚果，晾干，在（-70）℃温度条件下保存备用；
B、将锁阳坚果经浓度为10%（质量百分含量）的NaClO溶液浸泡6小时后，用水冲至pH值6.5-7之间，置于磁力搅拌器上搅拌8小时直至果皮脱落，种子置于75%的酒精中消毒约3min，再用无菌水冲洗4-6次。
C、盐胁迫培养：在直径为9cm的培养皿底铺2层滤纸，加入5ml试剂1，放入25粒锁阳种子，使试剂1浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。实验设4次重复，每次重复设1个培养皿。结果如表1所示，该盐胁迫培养的种子萌发率为10%。图1显示的是该盐胁迫培养得到的萌发锁阳种子。
D、对经步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子进行恢复培养：在直径为9cm的培养皿底铺2层滤纸，加入5ml试剂2，放入经过步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子，使试剂2浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。结果如表1所示，该恢复培养的种子萌发率为13.22%。图2显示的是该恢复培养得到的萌发锁阳种子。
表1、种子萌发结果
可见，锁阳种子经过上述盐胁迫培养和恢复培养这两个步骤处理的总萌发率为22%。
萌发的锁阳种子如图1所示。
实施例2、促进锁阳种子快速萌发
本实施例采用的促进锁阳种子快速萌发的成套试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1和试剂2均独立包装。试剂1为即用型试剂，是由100mmol/L氯化钠和10-8mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液（溶剂为蒸馏水，溶质是氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24，该溶液中氯化钠的浓度是100mmol/L，独脚金内酯人工合成类似物GR24的浓度是10-8mol/L）。试剂2是10-8mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液（溶剂为蒸馏水）。
本实施例的促进锁阳种子快速萌发的方法，包括有如下步骤：
A、采集锁阳坚果，晾干，在-70℃温度条件下保存备用；
B、将锁阳坚果经浓度为20%（质量百分含量）的NaClO溶液浸泡5小时后，用水冲至pH值6.5-7之间，用棉布包裹搓去果皮，种子置于75%的酒精中消毒约3min，再用无菌水冲洗4-6次。
C、盐胁迫培养：在直径为9cm的培养皿底铺两层滤纸，加入5ml试剂1，放入25粒锁阳种子，使试剂1浸透锁阳种子。将该培养皿置于20±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。实验设4次重复，每次重复设1个培养皿。结果如表2所示，该盐胁迫培养的种子萌发率为2%。
D、对经步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子进行恢复培养：在直径为9cm的培养皿底铺2层滤纸，加入5ml试剂2，放入经过步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子，使试剂2浸透锁阳种子。将该培养皿置于20±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。结果如表2所示，该恢复培养的种子萌发率为7.26%。
表2、种子萌发结果
可见，锁阳种子经过上述盐胁迫培养和恢复培养这两个步骤处理的总萌发率为9%。
实施例3、促进锁阳种子快速萌发
本实施例采用的促进锁阳种子快速萌发的成套试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1和试剂2均独立包装。试剂1为即用型试剂，是由400mmol/L氯化钠和10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液（溶剂为蒸馏水，溶质是氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24，该溶液中氯化钠的浓度是400mmol/L，独脚金内酯人工合成类似物GR24的浓度是10-10mol/L）。试剂2是10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液（溶剂为蒸馏水）。
本实施例的促进锁阳种子快速萌发的方法，包括有如下步骤：
A、采集锁阳坚果，晾干，在-70℃温度条件下保存备用；
B、将锁阳坚果经浓度为20%（质量百分含量）的NaClO溶液浸泡4小时后，用水冲至pH值6.5-7之间，用棉布包裹搓去果皮，种子置于75%的酒精中消毒约3min，再用无菌水冲洗4-6次。
C、盐胁迫培养：在直径为9cm的培养皿底铺两层滤纸，加入5ml试剂1，放入25粒锁阳种子，使试剂1浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20 天统计种子萌发率。实验设4次重复，每次重复设1个培养皿。结果如表3所示，该盐胁迫培养的种子萌发率为5%。
D、对经步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子进行恢复培养：在直径为9cm的培养皿底铺2层滤纸，加入5ml试剂2，放入经过步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子，使试剂2浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。结果如表3所示，该恢复培养的种子萌发率为5.14%。
表3、种子萌发结果
可见，锁阳种子经过上述盐胁迫培养和恢复培养这两个步骤处理的总萌发率为10%。
实施例4、利用NaCl促进锁阳种子快速萌发
本实施例采用的促进锁阳种子快速萌发的试剂是100mmol/L氯化钠溶液（溶剂为蒸馏水）。
本实施例的促进锁阳种子快速萌发的方法，包括有如下步骤：
A、采集锁阳坚果，晾干，在-70℃温度条件下保存备用；
B、将锁阳坚果经浓度为20%（质量百分含量）的NaClO溶液浸泡4小时后，用水冲至pH值6.5-7之间，用棉布包裹搓去果皮，种子置于75%的酒精中消毒约3min，再用无菌水冲洗4-6次。
C、盐胁迫培养：在直径为9cm的培养皿底铺两层滤纸，加入100mmol/L氯化钠溶液5ml，放入25粒锁阳种子，使溶液浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。实验设4次重复，每次重复设1个培养皿。结果 如表4所示，该盐胁迫培养的种子萌发率为3%。
D、对经步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子进行恢复培养：在直径为9cm的培养皿底铺两层滤纸，加入5ml蒸馏水，放入经过步骤C的盐胁迫培养仍未萌发的种子，使水浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。结果如表4所示，该恢复培养的种子萌发率为7.25%。
表4、种子萌发结果
可见，锁阳种子经过上述盐胁迫培养和恢复培养这两个步骤处理的总萌发率为10%。
对比例、在蒸馏水中进行锁阳种子萌发培养
该方法包括以下步骤：
A、采集锁阳坚果，晾干，在-70℃温度条件下保存备用；
B、将锁阳坚果经浓度为20%（质量百分含量）的NaClO溶液浸泡1小时后，用水冲至pH值6.5-7之间，用棉布包裹搓去果皮，种子置于75%的酒精中消毒约3min，再用无菌水冲洗4-6次。
C、萌发培养：在直径为9cm的培养皿底铺两层滤纸，加入5ml蒸馏水，放入25粒锁阳种子，使水浸透锁阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。实验设4次重复，每次重复设1个培养皿。结果如表5所示，种子萌发率为0%。
D、对经步骤C的培养仍未萌发的种子换培养皿培养：在直径为9cm的培养皿底铺两层滤纸，加入5ml蒸馏水，放入经过步骤C的培养仍未萌发的种子，使水浸透锁 阳种子。将该培养皿置于25±1℃黑暗条件下培养20天统计种子萌发率。结果如表5所示，该种子的种子萌发率为4%。
表5、种子萌发结果
可见，锁阳种子经过上述蒸馏水培养和恢复培养这两个步骤处理的总萌发率为4%。
Claims (13)
1.促进锁阳种子萌发的试剂，由氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24组成；
所述氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24的配比为100-400mmol氯化钠：10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24的配比为下述a1)或a2)：
a1)100mmol氯化钠：10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a2)400mmol氯化钠：10-8-10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述氯化钠和独脚金内酯人工合成类似物GR24的配比为下述a3)-a5)中的任一种：
a3)100mmol氯化钠：10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a4)100mmol氯化钠：10-8mol独脚金内酯人工合成类似物GR24；
a5)400mmol氯化钠：10-10mol独脚金内酯人工合成类似物GR24。
4.促进锁阳种子萌发的组合物，由活性成分和辅料组成，所述活性成分为权利要求1-3中任一所述的试剂，所述辅料为水。
5.促进锁阳种子萌发的成套试剂，由试剂1和试剂2组成，所述试剂1和所述试剂2均单独包装，所述试剂1为权利要求1-3中任一所述的试剂或权利要求4所述的组合物，所述试剂2为独脚金内酯人工合成类似物GR24或独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液；所述试剂1和所述试剂2的配比满足如下条件：所述试剂1和所述试剂2中的独脚金内酯人工合成类似物GR24的摩尔数相等。
6.权利要求1-3中任一所述的试剂、权利要求4所述的组合物、或权利要求5所述的成套试剂在促进锁阳种子萌发中的应用。
7.一种促进锁阳种子萌发的方法，包括对锁阳种子进行盐胁迫培养的步骤；所述盐胁迫培养是将用含盐液体浸透的锁阳种子置于15-40℃黑暗的环境中进行培养；所述含盐液体为由100-400mmol/L氯化钠和10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述含盐液体为下述c1)或c2)：
c1)由100mmol/L氯化钠和10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c2)由400mmol/L氯化钠和10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述含盐液体为下述c3)、c4)或c5)中的任一种：
c3)由100mmol/L氯化钠和10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c4)由100mmol/L氯化钠和10-8mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液；
c5)由400mmol/L氯化钠和10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24组成的溶液。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将经过所述盐胁迫培养仍未萌发的锁阳种子进行恢复培养的步骤；所述恢复培养是在15-40℃黑暗的环境中培养用10-8-10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液浸透的所述仍未萌发的锁阳种子。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述恢复培养是在15-40℃黑暗的环境中培养用如下任一种独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液浸透的所述仍未萌发的锁阳种子：
1)10-8mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液；
2)10-10mol/L独脚金内酯人工合成类似物GR24溶液。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将经过所述盐胁迫培养仍未萌发的锁阳种子进行恢复培养的步骤；所述恢复培养是在15-40℃黑暗的环境中培养用蒸馏水浸透的所述仍未萌发的锁阳种子。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述锁阳种子按照如下方法获得：将锁阳坚果用10-30％质量百分含量的NaClO溶液浸泡0.5-7h后，去除果皮得到锁阳种子。
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