CN102735843A - Jmjd8基因及表达产物对肝癌细胞生长的抑制作用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了JMJD8基因及表达产物对肝癌细胞生长的抑制作用。具体地，本发明提供了原核表达的JmjC结构域蛋白8(JMJD8)，并通过细胞生长实验证明该蛋白用于肝癌的治疗。本发明还以慢病毒为介导系统得到了JMJD8过表达的SMMC-7721细胞，通过生长实验证明该基因可用于肝癌的基因治疗。此外，细胞凋亡实验证明了JMJD8基因、蛋白或其激动剂可用于肝癌的联合化学治疗。

Description

JMJD8基因及表达产物对肝癌细胞生长的抑制作用

技术领域

本发明涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及JmjC结构域蛋白8(JMJD8)基因和蛋白在肝癌检测方面的应用。本发明还涉及JMJD8基因、蛋白及其激动剂在肝癌治疗中的应用。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌的早期诊断对采用合理的治疗手段、延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。

因此，本领域迫切需要开发可用于肝癌诊断的相关蛋白。

此外，为了有效地抑制肝癌细胞的生长，本领域迫切需要开发可用于抑制肝癌细胞生长的药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于肝癌诊断的相关蛋白。

本发明的另一目的是提供一种抑制肝癌细胞生长的药物。

在本发明的第一方面，提供了一种JmjC结构域蛋白8(JMJD8)或其基因的用途，它们被用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括：对JMJD8蛋白或mRNA进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中记载了以下使用说明：对JMJD8蛋白或mRNA进行定量检测，并将检测结果用于表征肝癌几率高低。

在另一优选例中，所述的试剂包括JMJD8特异性抗体，或JMJD8的特异性引物。

在另一优选例中，上述的试剂包括检测用芯片，包括核酸芯片和蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与JMJD8基因或mRNA特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗JMJD8蛋白的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测JMJD8蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测肝癌。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：特异性抗体和引物。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象的JMJD8的mRNA表达量与β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≤0.008(较佳地≤0.007，更佳地≤0.006，最佳地≤0.005)，则提示该检测对象患肝癌的几率高于普通人群。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测人肝脏样品或血液样品。

在本发明的第三方面，提供了一种JMJD8蛋白、JMJD8基因或其激动剂的用途，它们被用于制备抑制肝癌细胞生长或增殖的药物，或用于制备治疗肝癌的药物。

在本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法，包括步骤：在JMJD8蛋白或其激动剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞生长或增殖。

在另一优选例中，所述的方法包括向癌细胞的培养体系中添加JMJD8激动剂，从而抑制癌细胞生长或增殖。

在另一优选例中，所述的癌细胞是肝癌细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种筛选治疗肝癌的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中JMJD8的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中JMJD8的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的JMJD8的表达量和/或活性大于对照组，就表明该测试化合物是对JMJD8的表达和/或活性有促进作用的治疗肝癌的候选化合物。

在另一优选例中，所述的细胞包括：肝癌细胞或肝细胞。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对肝癌细胞生长或增殖的抑制作用。

在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤：测试组中，肝癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察肝癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肝癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中肝癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对肝癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。

在本发明的第六方面，提供了一种JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激动剂的用途，它们被(a)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的药物组合物，或(b)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的促进剂，或(c)用于制备使得癌细胞对化疗或放疗诱导的细胞凋亡更敏感的增敏剂。

在另一优选例中，所述的JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

在本发明的第七方面，提供了一种JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激动剂的用途，它们被用作癌症治疗的增敏剂或促进细胞凋亡的促进剂。

在另一优选例中，所述的JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种抑制或治疗癌症的方法，包括步骤：给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的JMJD8激动剂的用途。

在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了JMJD8基因在肝癌的mRNA表达水平明显低于相应癌旁组织及正常组织。(HCC，hepatocellular carcinoma，肝细胞肝癌；N，normal liver，正常肝；CNL，corresponding noncancerous liver，相应的癌旁组织)。

图2显示了JMJD8基因原核表达产物显著抑制SMMC-7721细胞的生长(control，空白对照给药组；BSA，无关给药组，)。

图3显示了JMJD8基因过表达显著抑制SMMC-7721细胞的生长(Lenti-vector，对照细胞株；lenti-shJMJD8，干扰细胞株；Lenti-JMJD8，过表达细胞株)。

图4：慢病毒介导建立的SMMC-7721稳定细胞株中JMJD8基因表达水平鉴定(Lenti-vector，对照细胞株；lenti-shJMJD8，干扰细胞株；Lenti-JMJD8，过表达细胞株)。

图5显示了JMJD8基因过表达显著促进SMMC-7721细胞中已诱发的早期凋亡(Lenti-vector，对照细胞株；lenti-shJMJD8，干扰细胞株；Lenti-JMJD8，过表达细胞株；UV，紫外)。其中，caspase酶活性越高，凋亡越高。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，JMJD8在肝癌组织中低表达，而在癌旁组织及正常组织中高表达，因此JMJD8可作为肝癌检测的标志物用于检测或辅助性检测肝癌。此外，JMJD8的激动剂可抑制癌细胞(尤其是肝癌细胞)的生长。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人用real-time PCR方法得到原发肝癌的癌组织样本和癌旁组织样本的JMJD8基因表达谱，通过比较两种组织的表达谱，得到癌与癌旁组织间表达差异性。JMJD8基因在癌组织中的mRNA表达明显低于癌旁组织及正常组织(P＜0.001)。因此，可以把JMJD8基因开发成小型基因芯片或RT-PCR试剂盒用于肝癌的鉴别诊断。

本发明还通过原核表达的方法纯化的到JMJD8基因原核表达蛋白。通过细胞生长实验检测，意外地发现：在未经变性和复性处理的情况下，原核表达的JMJD8蛋白(浓度≥850nM)居然能够明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。因此，JMJD8的基因原核表达产物可以开发成药物用于肝癌的治疗。

本发明人还以慢病毒载体系统为介导系统，在肝癌细胞SMMC-7721中过表达JMJD8基因(经鉴定过表达倍数为100倍)。通过细胞生长实验发现：JMJD8基因的过表达明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。因此，可将JMJD8基因用于肝癌的基因治疗。

此外，通过细胞凋亡实验发现：JMJD8基因的过表达明显促进因化疗或放疗而诱发的细胞早期凋亡。因此，可将JMJD8基因与肝癌的化疗或放疗联用，以促进肝癌的治疗效果。

JMJD8蛋白和多核苷酸

在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“JMJD8蛋白”可互换使用，指JmjC结构域蛋白8(简称为JMJD8)。应理解，所述术语还包括JMJD8的活性片段和衍生物。

在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码JMJD8蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。JMJD8基因定位于细胞染色体16p13.3，cDNA全长为1936bp，编码全长264个氨基酸的蛋白。

在本发明中，术语“JMJD8蛋白”、“JMJD8多肽”或“肝癌标志物JMJD8”可互换使用，都指具有人蛋白JMJD8氨基酸序列的蛋白或多肽。

全长JMJD8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示(其中ORF位于第5-796位)，全长JMJD8蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.：2所示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的JMJD8蛋白或多肽”是指JMJD8蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化JMJD8蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码JMJD8的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码JMJD8蛋白的多核苷酸。

本发明的人JMJD8核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或JMJD8蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的JMJD8蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人JMJD8蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人JMJD8编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗体

本发明还包括对人JMJD8蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人JMJD8基因产物或片段。较佳地，指那些能与人JMJD8基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

抗人JMJD8蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人JMJD8蛋白。

激动剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与JMJD8蛋白发生相互作用的物质，尤其是激动剂等。

本发明JMJD8蛋白的激动剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进JMJD8蛋白的表达和/或活性，进而抑制癌细胞(包括肝癌)的生长或增殖。通常，可将这些激动剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明JMJD8蛋白或其激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

此外，本发明的JMJD8基因、蛋白或其激动剂还特别适合与其他抗肿瘤的化疗药物或放疗联用，从而促进化疗或放疗所诱导的细胞凋亡。

检测方法和试剂盒

本发明还涉及定量和定位检测人JMJD8蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人JMJD8蛋白水平，可以用于诊断肝癌。

一种检测样品中是否存在JMJD8蛋白的方法是利用JMJD8蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与JMJD8蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在JMJD8蛋白。

JMJD8蛋白或其多核苷酸可用于JMJD8蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗JMJD8的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的JMJD8蛋白。

本发明还提供了一种检测肝癌的的试剂盒，它含有特异性扩增JMJD8的引物对和/或JMJD8特异性抗体。

筛选方法

本发明还提供了基于JMJD8进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(促进)JMJD8表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞。一种筛选方法可基于JMJD8的mRNA的表达水平。

其中，代表性的癌细胞包括(但并不限于)：肝癌细胞。

本发明的主要优点包括：

(a)JMJD8的表达水平可用作肝癌检测的标志物。

(b)JMJD8蛋白或其激动剂可有效抑制肝癌细胞生长。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例

一、材料

组织样本：

50对癌和癌旁组织来自于原发性肝癌患者的手术切除标本，这些标本来自于启东肝癌研究所和浙江大学第一附属医院。9例正常肝来自于意外死亡者。上述所有标本的取得均通过上海市政府授权的WHO合作组织伦理委员会的同意。组织样本的临床资料包括：性别、年龄、肿瘤大小、病理分级(Edmonson)、肝硬化与否、转移与否、复发与否、HBV和HCV感染情况等。所有患者术前都没有接受化疗，术后随访最长达60个月。

RNA样本(组织总RNA提取)：

1.样品的收集和保存：离体组织切割成小块后立即置于液氮中速冻，然后移至-80℃冰箱保存。

2.组织块破碎：组织块放于液氮中研磨成粉，每克组织加入1mlTrizol(Invitrogen公司)。

3.总RNA抽提：按每毫升Trizol加0.2ml的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育2-3分钟；4℃，10,000g离心15分钟；将无色上清液移入新的离心管中，加0.5ml异丙醇，室温孵育10分钟，10000g 4℃离心10分钟；倒掉上清，0.75ml75％乙醇洗涤，4℃，7,500g离心5分钟；倒掉上清，室温干燥RNA沉淀5-10分钟，用DEPC处理后的无RNA酶H₂O溶解沉淀。

4.分光光度计法定量RNA，并取少量总RNA进行电泳，检查RNA是否降解。

二、通用方法

1.反转录：

细胞总RNA 9μl(4-5μg)和Oligo dT(10μM)1μl混合，72℃加热5min后，立刻置于冰上10min；加入8μl反转录混合液(10×RT Buffer 2μl，25mMMgCl22μl，10mM dNTPs 1μl，0.1mM DTT 2μl，RNase inhibitor 1μl)，在PCR仪上42℃加热5min后，加入1μl(50U)SuperScriptIII反转录酶，42℃反应50min；70℃加热15min终止反应，置于冰上；加入1μl RNase H，37℃反应20min。

2.Real-time PCR：

定量扩增时，每个反应取Super Mix PCR反应液10μl，cDNA 2μl、引物和探针各1μl，配成20μl体系。按如下条件进行扩增：预变性95℃5min，95℃30s、62℃15s、75℃15s，共40个循环。根据所获得的标准曲线，得到各检测标本中正常肝组织、癌旁组织、癌组织的相对浓度差异。根据ABI PRISM 7300SequenceDetection System自带软件进行分析。

3.慢病毒的包装及靶基因的转导：

本发明中使用的慢病毒包装体系是购自Addgene公司的三质粒系统，包括pWPXL，psPAX2和pMD2.G。转染试剂用Lipofectamine 2000，三质粒的用量的摩尔比为1∶1∶1。

将生长状态良好的HEK-293T细胞(ATCC：CRL-11268)接至10cm的细胞培养皿中，到第二天约达到95％以上的融合度，用作转染细胞。

将JMJD8基因克隆进病毒载体pWPXL中，与包装质粒psPAX2和pMD2.G共同转染HEK-293T细胞，48小时后收获上清中的病毒颗粒。以MOI＝50感染靶细胞(7721肝癌细胞)，感染液中加入6μg/ml的polybrene辅助感染，感染24小时后换为普通培养基进行后续实验。

4.细胞增殖和凋亡检测：

细胞增殖采用CCK-8试剂(Dojindo公司)。96孔板种植2,500个细胞，细胞处理后，每孔加入10μl CCK-8，37℃孵育2小时，检测450nm波长吸收值。采用

3/7试剂(Promega公司)检测caspase-3和caspase-7活性。96孔板种植2,500个细胞，细胞经相应药物处理后，每孔加入50μl

3/7试剂，室温避光1小时，检测荧光素酶活性。实验重复三次。

实施例1

肝癌组织中JMJD8基因的mRNA表达明显低于相应的癌旁组织及正常肝组织。

在本实施例中，运用real-time PCR的方法对50对肝癌组织、相应癌旁组织(50例)及正常组织(9例)中的JMJD8基因进行了mRNA水平的检测，以各组织中β-actin的表达水平为统一参照。

结果表明，JMJD8基因的mRNA水平的表达在肝癌组织及其相应癌旁组织中有显著差异，其中肝癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织(P＜0.0001)，并且明显低于正常肝组织(P＜0.0001)。因此，这种显著差异可用于区分肝癌组织、癌旁组织(见图1)。

其中，就基于β-肌动蛋白进行归一化处理后，若检测的JMJD8的相对表达≤0.008(较佳地≤0.007，更佳地≤0.006，最佳地≤0.005)，则提示该检测对象患肝癌的几率高于普通人群。

实施例2

JMJD8基因的原核表达产物的制备

设计引物(sense：5’-CATATGATGGCGCCGGCG-3′(SEQ ID NO.：3)；antisense：5′-CGGCCCGACGCTCCTGCGAC-3′(SEQ ID NO.：4))，以常规方法抽提cDNA为模板，应用Pfu酶进行PCR扩增。扩增条件：95℃1min，55℃1min，72℃2.5min，30个循环。扩增产物为1.2kb，经Nde I/SalI双酶切，分别克隆于市售的表达载体pET21a和融合表达载体pET232a(购自Novogen)上，然后将表达质粒转化入常规的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌进行表达。

采用Ni2NTAresin(购自Qiagen)，按厂商说明进行纯化，从而获得表达的JMJD8蛋白(为trxA2-JmjD8融合蛋白)。

实施例3

JMJD8基因的原核表达产物能够显著抑制肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长。

将上一实施例中制备的纯化JMJD8基因原核表达蛋白，直接外加在SMMC-7721细胞培养上清中，观察体外细胞生长情况。

结果意外地发现：JMJD8基因的原核表达产物，在未经复性处理就具有活性，能够显著抑制肝癌细胞株SMMC-7721的生长，并且850nM的JMJD8为有效浓度(见图2)。

由于原核表达体系能够方便地大规模制备JMJD8蛋白，且JMJD8蛋白在不必变性复性的情况下就具有很高的活性，因此这有利于对肝癌细胞的生长进行抑制。

实施例4

JMJD8基因的过表达能够显著抑制肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长。

在本实施例中，以慢病毒为介导系统，在SMMC-7721细胞中过表达JMJD8基因，然后在体外进行细胞生长实验。此外，还引入针对JMJD8基因的shRNA。ShRNA靶向的基因序列如下：5’-TAGATCACTTCTGAGTACCCGGGTC-3’(SEQ ID NO.：5)。shRNA在体内会形成或产生siRNA，从而抑制JMJD8的表达。

结果表明：JMJD8基因过表达能够显著抑制肝癌细胞株SMMC-7721的生长(见图3)。

作为负向对照，引入了针对JMJD8基因的shRNA，以便减少细胞中JMJD8基因的表达(见图4，稳定细胞株中JMJD8基因表达水平降低)，得到了与基因过表达相反的结果(即促进肝癌细胞生长)，这符合预期。

本实验证明了，通过使用合适的介导系统，可将JMJD8基因用于对肝癌的基因治疗。

实施例5

JMJD8基因的过表达能够显著促进细胞凋亡

在本实施例中，以慢病毒为介导系统，在肝癌细胞株SMMC-7721细胞中过表达JMJD8基因。再以药物staurosporine(星形孢菌素)、etoposide(依托泊甙)或用紫外线UV处理细胞，检测JMJD8表达量不同的细胞株中细胞早期凋亡的水平。

体外细胞凋亡实验证明：JMJD8基因过表达能够显著促进肝癌细胞SMMC-7721中已诱导的细胞早期凋亡(见图5)。

作为负向对照，引入了针对JMJD8基因的shRNA，目的在减少细胞中JMJD8基因的表达(见图4)。得到了与基因过表达相反的结果(抑制已诱导的细胞早期凋亡)，这符合预期。

鉴于JMJD8基因可促进已诱发的细胞早期凋亡，因此可将JMJD8与肝癌的化学治疗联用。

此外，JMJD8可促进UV诱导的细胞凋亡，这表明可将JMJD8与肝癌的放射性治疗联用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种JmjC结构域蛋白8(JMJD8)或其基因的用途，其特征在于，用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒包括：对JMJD8蛋白或mRNA进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。

3.一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测JMJD8蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测肝癌。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象的JMJD8的mRNA表达量与β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≤0.008(较佳地≤0.007，更佳地≤0.006，最佳地≤0.005)，则提示该检测对象患肝癌的几率高于普通人群。

5.一种JMJD8蛋白、JMJD8基因或其激动剂的用途，其特征在于，被用于制备抑制肝癌细胞生长或增殖的药物，或用于制备治疗肝癌的药物。

6.一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法，其特征在于，包括步骤：在JMJD8蛋白或其激动剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞生长或增殖。

7.一种筛选治疗肝癌的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中JMJD8的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中JMJD8的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的JMJD8的表达量和/或活性大于对照组，就表明该测试化合物是对JMJD8的表达和/或活性有促进作用的治疗肝癌的候选化合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对肝癌细胞生长或增殖的抑制作用。

9.一种JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激动剂的用途，其特征在于，(a)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的药物组合物，或(b)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的促进剂，或(c)用于制备使得癌细胞对化疗或放疗诱导的细胞凋亡更敏感的增敏剂。

10.一种JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激动剂的用途，其特征在于，被用作癌症治疗的增敏剂或促进细胞凋亡的促进剂。

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