CN102727866A - 一种抗菌肽组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种稳定、透皮效果好的抗菌肽组合物及其制备方法。通过在抗菌肽制剂中加入保护剂、张力剂、促渗剂、pH缓冲物质，使制剂使用时pH值控制在5.0-7.0范围之间，大大提高抗菌肽的稳定性，增强渗透效果。

Description

一种抗菌肽组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物药物制剂领域，特别涉及一种稳定抗菌肽制剂组方及其制备方法。

发明背景

抗菌肽(antibacterial peptides，ABP)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子小肽，是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中发现2000多种抗菌活性肽。效果研究表明，抗菌肽不但广谱抗菌，能抑杀耐药性菌株，而且它的杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变，从而成为最具开发前景的抗生素替代品之一。

抗菌肽具有广谱抗菌活性，并且发现其中有些种类具有抗肿瘤、病毒、真菌的能力。近年实验研究表明，抗菌肽能促进伤口愈合。抗菌肽能刺激纤维母细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞的增殖，促进肉芽组织增生，加快创面愈合，用抗菌肽Cytoporin和磺胺嘧啶银制成的软膏治疗小白鼠烧伤，比单纯用磺胺嘧啶银伤口愈合快，疤痕小。Shahabuddin等(1998)发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显损伤。Efron等(2002)报道，从南美叶泡蛙皮肤得到的抗菌多肽demasepin对疟原虫显示抑制作用。

由于抗菌肽独特的抗菌机制，成为最具开发前景的抗生素替代品。现在国内外研究比较热的抗菌肽，包括有天蚕素(cecropin)，哺乳动物和人的防御素，人的BPI(杀菌/渗透-增强蛋白)，两栖动物的magainins等，蜜蜂的蜂毒中提取的蜂毒素等等。而通过DNA重组技术来获得基因工程抗菌肽，则成为抗菌肽研究的热点。

抗菌肽结构特点：各种抗菌肽有相似的一级结构，由二十几至五十几个氨基酸组成的短肽，一端为亲水性，另一端为疏水性。二级结构形成两亲α螺旋或β-折叠。属于碱性肽，带多个正电荷，水溶性好。研制长效、稳定的抗菌肽缓释制剂，是制剂专家不断研发的重要课题。本发明通过系统研究，研制出了长效一种稳定、透皮效果好的抗菌肽组合物，此组合物在临床使用中既可以涂抹、浇泼、喷洒，也可以注射，使用途径多样，并且透皮稀释效果明显增强，具有重要的应用价值。

发明内容

发明人经过深入、细致试验，研发出了在pH5.0-7.0之间稳定的抗菌肽组合物，该组合物不需要添加血清白蛋白，主要成分容易获得，组合物稳定大大提高，透皮效果更好。

本发明涉及一种稳定、透皮效果好的抗菌肽组合物及其制备方法，含有：抗菌肽或修饰后的抗菌肽、保护剂、张力剂、促渗剂、pH缓冲物质、辅料；各组分重量含量为：

本发明所包含的抗菌肽可以是从动物、植物、微生物中分离得到的，可以是基因工程方式表达的，可以是修饰过的或未修饰过的。

本发明所选用的保护剂为甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘露醇、山梨醇中的一种或多种；保护剂的优选比例为：甘氨酸、精氨酸、赖氨酸0.1％-1.0％(W/W)，甘露醇、山梨醇1％-10％(W/W)。

本发明所选用的张力剂为0.1％-1％(W/W)的氯化钠或氯化钾。

本发明所选用的促渗剂选自中链脂肪酸钠盐、胆酸盐中的一种或多种；其中中链脂肪酸钠盐选自辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠和油酸钠中的一种或多种，胆酸盐选自去氧胆酸钠、鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠中的一种或多种。

本发明的组合物要包括pH缓冲物质，所选用的pH缓冲物质选自NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、柠檬酸-柠檬酸钠两种缓冲体系，使用比例为0.1-18％(W/W)。

所述辅料选自葡萄糖、果寡糖、壳寡糖中的一种或两种以上组合。

本发明通过以下制备方法获得：

①先将张力剂、pH缓冲盐、促渗剂与适宜的辅料进行等量倍比稀释，充分混合均匀；

②将保护剂与抗菌肽充分混合均匀；然后用辅料倍比稀释两次；

③将上述两种混合物和剩余的全部辅料进行混合，混合均匀后，即得所述组合物。

本发明所述的抗菌肽组合物，在2-8℃下贮藏24个月后仍然保持着抗菌肽的高化学、生物学稳定性。

本文在说明用于本发明制剂中的抗菌肽时，使用的术语“高化学稳定性”指制剂中的抗菌肽在2-8℃下贮藏24个月后，化学完整性保持至少85％。使用的术语“高生物学稳定性”指本发明制剂中的抗菌肽在2-8℃下贮藏24个月后，生物学活性保持至少85％，(参见实施例2表1中的结果)，该生物学活性采用抑制液体生长菌活性测定方法(具体见附件1)进行。

本发明的技术优势

本发明所述的抗菌肽组合物，不用小牛血清或白蛋白作为保护剂，避免了这些蛋白携带病毒的潜在危险，节约了成本，利于更准确的监测产品的质量。该组合物既可以涂抹、浇泼、喷洒，也可以注射，使用途径多样。长效、透皮效果增强的抗菌肽组合物在2-8℃贮藏24个月后仍然保持着抗菌肽的高活性。

具体实施方式

结合以下实施例可以观察到本发明的有益性质，这些实施例是说明性的，不会对本发明构成限制。

实施例1、一种抗菌肽组合物及其制备方法

除非另外说明，所述样品包含

组合物的配制方法是：

①先用无水葡萄糖分别等量倍比稀释氯化钠、NaH₂PO₄·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、癸酸钠、甘氨胆酸钠两次，然后把几个成分充分混合得混合物A；

②用无水葡萄糖分别等量倍比稀释甘氨酸、山梨醇、低聚壳寡糖、抗菌肽两次，然后把几个成分充分混合得混合物B；

③将上述混合物A、B和剩余的全部无水葡萄糖进行混合，混合均匀后，即得所述组合物。

实施例2、一种抗菌肽组合物及其制备方法

组合物的配制方法是：

①先用无水葡萄糖分别等量倍比稀释氯化钾、柠檬酸、柠檬酸钠、月桂酸钠、去氧胆酸钠两次，然后把几个成分充分混合得混合物A；

②用无水葡萄糖分别等量倍比稀释精氨酸、山梨醇、低聚壳寡糖、抗菌肽两次，然后把几个成分充分混合得混合物B；

③将上述混合物A、B和剩余的全部无水葡萄糖进行混合，混合均匀后，即得所述组合物。

实施例3、抗菌肽组合物稳定性考察评价方法和稳定性考察结果

除非有另外说明，否则都采用以下的步骤进行稳定性评价。将实施例1中的样品分别置于温度为4℃±2℃的冰箱、温度为25℃±2℃和湿度为60％±5％的恒温恒湿箱中。稳定性考察过程中测量所述组合物的外观性状、抗菌肽活性，并与初始配制组合物进行比较。采用“抑制液体生长菌活性测定”方法检测抗菌肽活性，具体方法见附件1。

实施例1中的组合物在4℃±2℃的冰箱条件下放置24个月后，与初始配制样品无外观性状上、活性上的明显差异，在25℃±2℃和湿度为60％±5％条件下放置6个月内，制剂没有明显外观性状和活性上的变化。因此制剂在4℃条件下放置24月是稳定的。活性测定方法见附件一，具体活性测定结果见下表1所示。

表1实施例1中抗菌肽组合物稳定性考察数据

实施例4、抗菌肽组合物透皮效果测定

3.1离体鼠皮的制备

将小白鼠断颈处死，用剪刀除尽腹毛，剥离腹部皮肤，去除皮下脂肪，洗净后用生理盐水浸泡，并置于4℃冰箱中冷藏备用。

3.2接受液的制备

以含30％乙醇的磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.5，中国药典2010年版二部附录)配制。

2.3HPLC法测定8MOP含量渗透液的收集与检测

3.3体外透皮渗透考察

3.3.1体外透皮实验装置及方法

本实验采用Franz扩散池装置，使用前用酒精擦拭、紫外线照射方式进行消毒，然后置于超净工作台进行以下操作。将备用鼠皮固定在扩散池的供应室与接受室之间，使角质层面向供应室，上下夹紧后在接受室中注满接受液，驱除气泡。实验组：在供应室中加入10g用灭菌PBS缓冲液10倍稀释的实施例1中的组合物；对照组：在供应室中加入100mg用100ml灭菌PBS缓冲液稀释的未经过处理的抗菌肽原粉。开启电磁搅拌器连续搅拌，并保持水浴温度在(25±0.5)℃。分别在0.5、1、2、5、10h取样4mL，同时补加等量同温的新鲜接受液。

3.3.2接受液含量测定和累积透皮量的计算

取接受液4mL直接在DNA/RNA微量定量仪上测定，同时用考马斯亮兰法(Bradford法)(方法见附件2)测定蛋白含量。实验组和对照组样品中蛋白质含量的差异见下表2。从表2可以看出，经过处理后抗菌肽的渗透速度在0.5、1、2h时，比对照组有显著提高。

表1抗菌肽透皮液蛋白含量(μg/ml)

附件1抑制液体生长菌活性测定——对抗菌肽活性检测的方法

采用液体生长抑制方法检测抗菌肽的活性。将新鲜的E.coli菌液稀释为OD600约0.05。在96孔板上，各加入50μL用0.22μm滤器过滤过的0.1g/L实施例1产品(实验组)、LB阴性对照液、1mg/ml Amp的阳性对照液，再将稀释好的100μL E.coli菌液与其混合，每个样品重复3次。于37℃温箱培养12h，用ELX800型Universal Microplate Reader测定OD630值。

OD₆₃₀值等同于各孔中细菌的浓度，OD₆₃₀值越高，抗菌肽活性越小。为了比较各抗菌肽的抑菌活性，我们按以下公式计算各抗菌肽的抑菌效价。在加入相同剂量抗菌肽时，我们初步认为抑菌效价越高则抑菌效果越好。

附件2蛋白浓度测定方法-考马斯亮兰法(Bradford法)

(一)实验原理

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

(二)试剂与器材

1.试剂：

(1)标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白(BSA)配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

(2)考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用水稀释至1L。

2.器材：

(1)可见光分光光度计

(2)旋涡混合器

(3)试管16支

3.试剂

(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg/mL的原液。

(2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％(W/V)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

(3)乙醇

(4)磷酸(85％)

(三)、操作步骤

1、标准曲线制作

(1)0～100μg/mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD₅₉₅nm，并做标准曲线。

表2低浓度标准曲线制作

(2)0～1000μg/mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同(1)操作，做出蛋白质浓度为0～1000μg/mL的标准曲线。

表3高浓度标准曲线制作

2.样品蛋白质浓度的测定

2)测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取样品0.1mL(做一重复)，放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD₅₉₅nm，并通过标准曲线查得待测样品中蛋白质的含量X(μg)。以标准曲线1号试管做空白。

表4样品含量测定

Claims (10)

1.一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述组合物中各组分的重量含量为：

2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述组合物中的抗菌肽选自动物、植物、微生物中分离得到的、基因工程方式表达的、修饰过的或未修饰过的。

3.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述组合物中使用的保护剂选自甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘露醇、山梨醇中的一种或两种以上组合；添加比例为甘氨酸、精氨酸、赖氨酸0.1％-1.0％(W/W)，甘露醇、山梨醇1％-10％(W/W)。

4.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述组合物中使用的张力剂选自氯化钠或氯化钾中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述促渗剂选自中链脂肪酸钠盐、胆酸盐中的一种或两种以上组合。

6.根据权利要求5所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述中链脂肪酸钠盐选自辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠和油酸钠中的一种或两种以上组合。

7.根据权利要求5所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述胆酸盐选自去氧胆酸钠、鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠中的一种或两种以上组合。

8.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述辅料选自葡萄糖、果寡糖、壳寡糖中的一种或两种以上组合。

9.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，所述pH缓冲物质选自NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、柠檬酸-柠檬酸钠两种缓冲体系，使用比例为0.1-18％(W/W)。

10.根据权利要求1所述的一种抗菌肽组合物，其特征在于，其制备方法为：

①先将张力剂、pH缓冲盐、促渗剂适宜的辅料进行等量倍比稀释，充分混合均匀；

②将保护剂与抗菌肽充分混合均匀；然后用辅料稀释倍比两次；

③将上述两种混合物和剩余的全部辅料进行混合，混合均匀后，即得所述组合物。