CN102725312A - 用于糖尿病治疗和β细胞成像的蛋白药物 - Google Patents

Abstract

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是营养素依赖的反应中分泌的肠降血糖素激素大家族的成员。GLP-1作用于胰β细胞上高表达的GLP-1受体(GLP-1R)。该肽具有发展糖尿病治疗和诊断的巨大潜力。然而，由于被二肽基肽酶-1(DPP-4)降解，该肽的药物作用受体内不稳定性和短寿命的影响。已将30个氨基酸的肽GLP-1整合到稳定的宿主蛋白人钙结合蛋白D9k中。如通过GLP-1R表达细胞的免疫染色分析表明的，融合蛋白与GLP-1R结合。该融合蛋白药物可用于糖尿病治疗和GLP-1R受体靶向MR成像。融合蛋白具有约14kDa的大小，这能够实现有效的组织穿透和滞留，和延长的循环时间，融合蛋白是稳定的，在与75％人血清孵育48小时之后维持完整并保持活性。煮沸10分钟后该蛋白保持其天然折叠结构，这形成大规模生产该融合蛋白(＞30mg/l细菌培养物)的实验方法的基础。在小鼠试验中尚未观察到毒性。因此，本公开内容的一个方面提供了包括其特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽的融合蛋白，其中融合蛋白比单独的所述第一肽更稳定。在本公开内容的该方面的实施方式中，融合蛋白还可包括与其连接的可检测标记。在本公开内容的该方面的某些实施方式中，融合蛋白的第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

Description

用于糖尿病治疗和β细胞成像的蛋白药物

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月20日递交的名称为“PROTEIN AGENT FORDIABETES TREATMENT AND BETA CELL IMAGING”的美国临时专利申请序列号：61/253,146的优先权，在此通过引用将其全部并入。

序列表

本公开内容包括序列表，通过引用将其全部并入本文。

技术领域

本公开内容一般涉及具有提高的稳定性的融合蛋白并涉及该融合蛋白在糖尿病治疗中作为治疗剂和作为具有增强的造影性能的成像剂的使用方法。

背景

糖尿病(Diabetes Mellitus)的特征是胰岛素分泌缺陷和胰岛素抗性，或由自身免疫破坏引起的胰β-细胞缺陷。在过去的10年中，美国的糖尿病人群已增加86％。估计2008年超过2,360万名儿童和成人，或人口的7.8％患有糖尿病(ADA，2008)，其中90％患有2型糖尿病。估计到2030年，全世界的糖尿病人群的总数将上升至3.66亿(Wild等人，(2004)Diabetes Care 27：1047-1053)。尽管已开发了多种治疗并已证明是非常有效的(Riddle，MC(2002)Diabetes Metab.Res.Rev.18(增刊3)：S42-49)，开发提供持久作用，具有较少的药物副作用例如低血糖症和体重增加，并改善药物施用途径的新型治疗剂和策略仍是疾病控制中的主要挑战。

糖尿病形成和演变的特征通常是胰β细胞和β细胞功能的损失(Stoffers，DA，(2004)Horm.Metab.Res.36：811-821；de Koning等人，(2008)Trends Pharmacol.Sci.29：218-227)。评价胰岛和β-细胞群(β-cellmass)和功能的能力将极大地有益于诊断/预测糖尿病及了解糖尿病的发病机制。胰β细胞和其功能的非侵入性评价也将能够实现疾病治疗策略的更好设计并监控疗法有效性。

在胰成像方面已取得了非常重要的进步(Holmberg & Ahlgren，(2008)Diabetologia 51：2148-2154)。然而，在胰岛、尤其是胰岛β-细胞成像中存在几个重要挑战。胰岛小并遍及整个胰脏分布，这要求高分辨率成像方法以清楚地定位并估计胰脏胰岛中的β细胞群。胰岛是许多内分泌细胞类型的组织群，包括α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞和PP细胞，且这些不同类型的细胞在整个胰岛内完全混杂。

需要靶向β细胞特异性分子标志的成像工具或试剂以对胰岛中的β细胞成像。目前没有可获得的允许对胰β细胞非侵入性成像的成功的成像方法。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，一种30个氨基酸的肽，是被分泌以降低血糖的主要肠降血糖素激素性肠来源的因子之一(Drucker，DJ，(2006)Cell Metab.3：153-165)。该肽由小肠和结肠内的肠内分泌L细胞产生。GLP-1由L细胞以37个氨基酸的前体分泌且该肽被加工成30个氨基酸(7-37)的酰胺的生物活性形式(Baggio & Drucker(2007)Gastroenterology132：2131-2157；Burcelin等人，(2007)J.Nutr.137(11增刊)：2534S-2538S)。由于被泛素蛋白酶二肽基肽酶4(DPP-4)降解成失活形式的氨基酸9-37，活化的GLP-1的循环时间少于2分钟(Baggio & Drucker(2007)Gastroenterology 132：2131-2157；Holst等人，(2008)Trends Mol.Med.14：161-168)。证据表明，失活(9-37)的GLP-1在清除葡萄糖和调控心血管功能方面起作用(Drucker，DJ，(2006)Cell Metab.3：153-165；Mannucci& Rotella(2008)Nutr.Metab.Cardiovasc.Dis.18：639-645；Nauck，MA，(2009)Eur.J.Intern.Med.20(增刊2)：S303-308)。GLP-1通过属于7次跨膜异三聚体G蛋白偶联受体B类家族的细胞表面受体，GLP-1受体(GLP-1R)起作用(Mayo等人，(2003)Pharmacol Rev.55：167-194)。

GLP-1R以非常高的水平表达在胰岛中(Korner等人，(2007)J.Nucl.Med.48：736-743)。该受体还表达在几个其他器官部位，包括肾、心脏、肺和中枢神经系统(Doyle & Egan(2007)Pharmacol.Ther.113：546-593)。在胰岛中，GLP-1R以高达105-106受体分子/细胞的密度主要位于β细胞内(Korner等人，(2007)J.Nucl.Med.48：736-743；Wei & Mojsov(1995)FEBS Letts.358：219-224)。

GLP-1的促胰岛素作用包括胰岛素分泌和胰岛素生物合成，胰岛素合成包括前胰岛素基因表达(Egan等人，(2003)Diabetes Metab.Res.Rev.19：115-123；Winzell & Ahren(2007)Pharmacol.Ther.116：437-448)。GLP-1对胰β-细胞中胰岛素分泌的这种刺激依赖血浆葡萄糖升高。未充分了解GLP-1在升高的血浆葡萄糖下刺激胰岛素分泌的详细机制。GLP-1可通过GLP-1R起作用以刺激环状AMP形成并激活胰β细胞中的蛋白激酶A。GLP-1的作用还包括通过上调胰岛素原的表达(包括胰岛素原基因转录和mRNA稳定性)补充细胞内胰岛素库(Doyle & Egan(2007)Pharmacol.Ther.113：546-593；de Heer等人，(2008)Diabetologia 51：2263-2270；Ahren等人，(2004)Horm.Metab.Res.36：733-734)。表明GLP-1刺激下的cAMP的产生和PKA活化激活了在胰岛素基因转录中起重要作用的转录激活因子Pdx(Li等人，(2005)Diabetes 54：482-491)。除了促胰岛素作用，GLP-1促进祖细胞分化成胰岛内的成熟β细胞(Yue等人，(2006)Tissue Eng.12：2105-2116)且还引发促进β细胞增殖并抑制凋亡的胰β细胞内的细胞过程，最后导致胰β细胞群增加并使胰中的β细胞功能正常化(Doyle & Egan(2007)Pharmacol.Ther.113：546-593；Klinger等人，(2008)Diabetes 57：584-593；Bonora，E，(2008)Nutr.Metab.Cardiovasc.Dis.18：74-83)。

DPP-4对天然GLP-1的快速降解阻碍了天然GLP-1作为潜在糖尿病治疗的应用。为开发基于GLP-1和GLP-1R通路的糖尿病治疗，进行了大量努力(Ahren & Schmitz(2004)Horm.Metab.Res.36：867-876；Salehi &D′Alessio(2006)Cleve.Clin.J.Med.73：382-389；Arulmozhi & Portha(2006)Eur.J.Pharm.Sci.28：96-108；McGill，JB(2009)Postgrad.Med.121：46-45)。大部分注意力集中在开发GLP-1R激动剂和DPP-4抑制剂上(Combettes，MM(2006)Curr.Opin.Pharmacol.6：598-605；Gromada等人，(2004)Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.95：252-262)。

一种早期的GLP-1R激动剂是从蜥蜴钝尾毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液中纯化的毒蜥外泌肽-4，39个氨基酸的GLP-1类似物。毒蜥外泌肽-4抗DPP-4裂解(Deacon等人，(1998)Diabetologia 41：271-278)，导致约为3小时的人体内血液循环时间。毒蜥外泌肽-4已被FDA批准通过每日两次注射治疗2型糖尿病。然而，短的血液循环时间限制了毒蜥外泌肽-4治疗糖尿病的有效性。

目前正在进行作为长效GLP-1R激动剂的几种新型药物的临床研究。GLP-1的两个氨基酸的置换和带有长链脂肪酸的肽的酰化导致利拉鲁肽的开发(Knudsen，LB(2004)J.Med.Chem.47：4128-4134；Juhl等人，2002)Diabetes 51：424-429)。因此，两个氨基酸的突变产生DPP-4抗性且酰化导致肽与血清白蛋白的结合。所得的肽具有大于10小时的血液循环时间。通过用D-Ala取代GLP-1的Ala-18且然后将其连接(通过马来酰亚胺丙酸)到血清白蛋白(CJC-1131)的C-末端，开发了另一种抗DPP-4且长时循环的GLP-1R激动剂(Kim等人，(2003)Diabetes 52：751-759)。阿必鲁肽(albugon)是另一种基于血清白蛋白的GLP-1激动剂(Baggio等人，(2004)Diabetes 53：2492-2500)。在这种情况下，GLP-1直接与血清白蛋白轭合。

研发长时循环GLP-1R激动剂的大多数途径以结合或轭合血清白蛋白为基础。这些途径获得了很大的成功，但是，存在缺陷。血清白蛋白是分子质量约70kDa的蛋白。大的分子大小限制了其内皮穿透和组织穿透的能力。血清白蛋白的生物分布也不利于药物的胰递送。深入研究表明血清白蛋白长时间地留在循环中，胰吸收、尤其是胰岛吸收很少(Bent-Hansen，L，(1991)Acta.Physiol.Scand.增刊603：5-10)。该性质明显限制了响应血糖的短暂升高，例如饭后情况的药物递送。因此，迫切需要开发替代途径的GLP-1R激动剂。

概述

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是营养素依赖的反应中分泌的肠降血糖素激素大家族的成员。GLP-1作用于胰β细胞上高表达的GLP-1受体(GLP-1R)。该肽具有用于开发糖尿病治疗和诊断的巨大潜力。然而，由于被二肽基肽酶-1(DPP-4)降解，该肽的药物作用受体内不稳定性和短寿命的影响。已将30个氨基酸的肽GLP-1整合到稳定的宿主蛋白人钙结合蛋白D9k中。如通过GLP-1R表达细胞的免疫染色分析表明的，融合蛋白或工程蛋白与GLP-1R结合。大鼠胰岛素瘤β细胞系RINm5F的体外试验表明该蛋白具有强的刺激产生细胞内cAMP的活性(该活性与天然肽GLP-1和毒蜥外泌肽-4的活性相当)。糖尿病db/db小鼠的实验表明该蛋白表现出强的降低血糖的活性，以及与毒蜥外泌肽-4的活性相比明显更长时间的活性。宿主蛋白是之前工程化的具有高的Gd³⁺亲和力和金属选择性的Gd-结合蛋白。与Gd-DTPA的弛豫性能相比，本公开内容的蛋白表现出增强大于20倍的R1和R2弛豫性能(每Gd³⁺)。该蛋白药物可用于糖尿病治疗和GLP-1R受体靶向MR成像。该蛋白具有约14kDa的大小，这促使有效的组织穿透和滞留，和延长的循环时间。在与75％的人血清孵育48小时之后，该蛋白是稳定的，保持完整并保留活性。该蛋白在持续煮沸10分钟后保持其天然折叠结构，这形成大规模生产该融合蛋白(＞30mg/l细菌培养物)的实验方法的基础。在小鼠试验中未观察到毒性。

因此，本公开内容的一个方面提供了包括其特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽的融合蛋白，其中融合蛋白比单独的第一肽更稳定。

在本公开内容的该方面的实施方式中，融合蛋白可还包括与其连接的可检测标记。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，融合蛋白的第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

在本公开内容的一个实施方式中，融合蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，且第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)。

因此，本公开内容的一个方面提供了包括其特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽的工程蛋白，其中融合蛋白比单独的第一肽更稳定。

在本公开内容的该方面的实施方式中，工程蛋白可还包括与其连接的可检测标记。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，融合蛋白的工程蛋白可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

在本公开内容的一个实施方式中，工程蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，且第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)。

本发明的另一方面提供了调控动物或人细胞葡萄糖代谢的方法，包括：使动物或人细胞与包含蛋白的组合物接触，所述融合蛋白包括与第二肽连接的第一肽，其中该蛋白比单独的第一肽更稳定，且其中第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其变体；第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰的变体；且其中融合蛋白选择性地结合靶细胞的GLP-1受体，从而调控受体的活性和细胞的葡萄糖代谢。

本公开内容的又另一方面提供了成像探针，其中该探针是一种蛋白，该蛋白包括：特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽，其中第二肽增加了与其连接的第一肽的稳定性；和可检测标记。

在本公开内容的该方面的一个实施方式中，该蛋白的第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，第二肽可具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，且所述标记为钆(Gd⁺)，由此所述标记是通过MRI可检测的，且其中所述融合蛋白结合位点是胰细胞的GLP-1受体。

本公开内容的又另一方面提供了增强成像对比度的方法，包括：(i)向靶细胞递送包含蛋白的成像探针，其中融合探针包括：特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽，其中该蛋白比单独的第一肽更稳定；和可检测标记；和(ii)检测来自标记的信号，从而确定靶细胞的蛋白结合位点的存在。

附图简述

当结合附图再看以下描述的其各种实施方式的详述时，本公开内容的其他方面将更易于理解。

图1示出了质粒载体pRSETb的设计。

图2A是用16％SDS-PAGE分析并通过考马斯亮蓝染色法染色的半胱氨酸突变体和蛋白聚乙二醇化产物的数码图像。泳道1-3分别是未聚乙二醇化蛋白、非还原条件下的带有聚乙二醇化的聚乙二醇化蛋白，还原条件下的带有聚乙二醇化的聚乙二醇化蛋白。在分析前用DTT处理蛋白。泳道4-6是没有用DTT处理的相同蛋白样品。

图2B是用碘染色的与图2A相同的SDS-PAGE的数码图像。10分钟染色前，用10％BaCl2处理SDS-PAGE凝胶10分钟。

图3示出了聚乙二醇化之前S42C突变的融合蛋白的MALDI-TOF-MS图，该图表明大部分蛋白是约20,398Da的二聚体和约10,845Da的单体。

图4示出了聚乙二醇化之后S42C突变的融合蛋白的MALDI-TOF-MS图，该图表明大部分蛋白是约15,302Da的聚乙二醇化蛋白。

图5是蛋白血清稳定性试验的凝胶分析的数码图像。使用无DTT的16％SDS-PAGE分析与小鼠血清孵育一定时间之后的蛋白水平。泳道1：单独的小鼠血清；泳道2：单独的融合蛋白；泳道3-5：用50％血清分别孵育1hr、3hr和24hr的融合蛋白；泳道6：单独的聚乙二醇化蛋白；泳道7-9：用50％血清分别孵育1hr、3hr和24hr的聚乙二醇化蛋白。

图6用图解法示出了来自钙结合蛋白D9k的Cal.GLP(右)的设计。

图7是融合蛋白Cal.GLP的血清稳定性的SDS-PAGE分析的数码图像。将50mM Cal.GLP与25mL的75％人血清(S+CA)在37℃下孵育1小时(泳道3)、3小时(泳道4)和24小时(泳道5)。通过16％SDS-PAGE将混合物分离并通过考马斯亮蓝染色观察。泳道1是75％人血清(S)且泳道2是单独的Cal.GLP(CA)。泳道M是分子量标准参照物。

图8是显示蛋白Cal.GLP(50μM)在各种pH值下的荧光光谱的图。将不同pH下的光谱与8M尿素中完全变性的Cal.GLP的光谱进行比较。

图9是显示使用Lance cAMP试剂盒测定的RINm5F细胞中的cAMP水平的图。用不同浓度的毒蜥外泌肽-4(实线和菱形)、GLP-1(点线和矩形)、Cal.GLP(短划线和三角形)和CA1.CD2(实线和交叉符)处理细胞。处理后30分钟收集细胞。从收集的细胞制备细胞裂解物。然后测定裂解物中的cAMP水平并用皮摩尔值表示。误差线代表4次测量的标准差。

图10是一系列数码图像，示出了用钙结合蛋白(50μM)和Cal.GLP(10μM)处理的CHO或RINm5F细胞的免疫荧光染色。在37℃下在显微镜腔式载玻片中处理30min后充分洗涤细胞并随后固定。用钙结合蛋白特异性抗体对细胞染色并在共聚焦显微镜下观察。淡阴影表示抗体染色。

图11是这种图，其示出了使用葡萄糖测量试剂盒测量的注射25纳摩尔/kg的剂量的毒蜥外泌肽-4(空心柱)、Cal.GLP(实心柱)和钙结合蛋白(灰色柱)之后的一组8只糖尿病小鼠在不同时间点(标明)的血糖水平的变化(Δ)。药物施用后5小时且在收集血液样品的最后时间点之前35分钟，再给动物喂食25分钟。通过计算在任何给定时间点测量的血糖水平和初始血糖水平之间的差异确定Δ血糖(mg/dl)。喂食20分钟后且在施用药物(零时)之前测量初始血糖水平。误差线代表八只小鼠的测量值的标准差。

图12是一对图，示出了注射含有有25纳摩尔/kg的不同药物的15毫摩尔/kg的葡萄糖之后的一组8只糖尿病小鼠在不同时间点的Δ血糖(上图)和Δ胰岛素(下图)的变化。

图13A是一系列的数码图像，示出了用阴性细胞系MDA-MB-231和阳性细胞系SKOV-3接种的裸鼠。每个点的细胞数为约5x10⁶。在注射后21小时使用Kodak NIR体内FX-pro动物成像系统显示注射双标记造影剂Gd-CA1-Affi-Cy5.5后右侧的阳性肿瘤的特异性结合。

图13B示出了施用造影剂之前和之后35min和21hr获得的快速自旋回波在4.7T下的肿瘤小鼠的横向MR数码图像。

图13C是示出通过Image J分析的借助于本公开内容的造影剂的实施方式的阳性肿瘤处的强度增强的图。

图14是示出对携带有肿瘤的小鼠的MRI成像之后来自不同器官的组织的NIR成像的数码图像。NT，阴性肿瘤；K，肾；L，肝脏；SP，脾；PT，阳性肿瘤。

图15是一系列的数码图像，示出了腹腔注射蛋白CA1.CD2或聚乙二醇化的CA1.CD2(CA1.CD2+PEG)之后在兔血清中产生的抗体的蛋白质印迹分析。用来自注射如下物质的兔的抗血清(第3次取血)进行蛋白质印迹：与缓冲盐水混合的CA1.CD2(左图，CA1.CD2+Sal)，与佐剂混合的CA1.CD2(中间图，CA1.CD2+Ad)；聚乙二醇化的CA1.CD2(右图，CA1.CD2+PEG)。用0.5μg聚乙二醇化的(PEG-CA1.CD2)或未修饰的CA1.CD2(CA1.CD2)进行蛋白质印迹实验。箭头表示检测到的蛋白条带的位置。

图16是示出CalGLP和CalGLP-10K对cAMP水平的影响的图。

图17是示出缓冲液、毒蜥外泌肽-4、CalGLP和CalGLP-10K对血糖的影响的图。将动物禁食6小时。禁食后，对动物喂食30分钟并随后立即抽血。通过腹腔注射施用药物(图中所示为25纳摩尔/kg)。然后将动物放回笼子。在施用药物后30、120、240分钟抽取血液样品(约20ml)。测量血液样品中的葡萄糖。Δ血糖是在紫色箭头和红色箭头的时间点抽取的血糖之差。

图18示出了在所示时间点在再喂食后和禁食后/再喂食前之间的血糖水平的差异。在零时施用(腹腔注射)药物(25纳摩尔/kg)。在零时通过腹腔注射施用药物(图中所示为25纳摩尔/kg)。将动物禁食6小时。禁食之后，禁食后立即抽取血液样品(约20ml)。然后对动物喂食30分钟并随后立即抽血。然后将动物放回笼子。在所示时间点重复相同的程序。测量血液样品中的葡萄糖。Δ血糖是在紫色箭头和对应的红色箭头的时间点抽取的血糖之差。

图19提供了一系列的图，示出了在每天5:00pm每日测量的血糖。每天在相同时间2:00pm施用药物(图中所示为25纳摩尔/kg)持续4周。将动物放回笼子。持续4周每天在5:00pm抽取血液样品(约20ml)。测量血液样品中的葡萄糖。绘制血糖水平对天数的图。每日在抽血前称量动物体重。绘制每组六只小鼠的平均体重对天数的图。

图20提供了一系列的数码图像，示出了注射(静脉注射)80ml的Gd-CalGLP(5mM)的CD1小鼠的结果。箭头指示胰。

图21示出了显示在施用Gd-CalGLP后的不同时间点测量的胰脏的MR图像强度的图。误差线是8个不同ROI的测量值的标准差。

图22A是示出注射80ml的Gd-CalGLP(5mM)(Gd-CalGLP)或80ml的缓冲盐水(无Gd-CalGLP)之后24小时收集的来自CD1小鼠的胰的数码图像。

图22B是示出了标准化到背景强度的图22A的图像强度的图。误差线是8个不同ROI的测量值的标准差。

以下说明和实施例中更详细地描述了附图。

以下说明书中阐述了本公开内容的方法和系统的某些示例性实施方式的细节。通过考察以下说明书、附图、实施例和权利要求书，本公开内容的其他特征、目标和优点将是对于本领域技术人员明显的。意图将所有这些其他系统、方法、特征和优点包括在本说明书内，包括在本公开内容的范围内，并受所附权利要求书保护。

详述

在更详细地描述本公开内容之前，应当理解本公开内容不局限于所述的具体实施方式，且因此当然可以变化。还应当理解本文所用的术语仅为了描述具体实施方式的目的，且并不意在是限制性的，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求书限定。

提供值的范围时，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文明确另外指明，至下限值单位的十分之一)和该指定范围内的任何其他指定值或中间值包含在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小的范围内，且也可包括在本公开内容内，遵从指定范围内的任何明确排除的限值。当指定范围包括限值的之一或两者时，本公开内容中还包括排除那些包括在内的限值的任何一个或两者的范围。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料也可用于实施或检验本公开内容，现在描述优选的方法和材料。

通过引用将本说明书中引用的所有出版物和专利并入本文，如同明确并单独指明通过引用并入每一个单独的出版物或专利并通过引用将这些出版物和专利并入本文以公开和描述与所引用的出版物关联的方法和/或材料。任何出版物的引用是因为其在申请日之前公开，且不应解释为承认本公开没有权利借助在先公开而先于这种出版物。另外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要单独确认。

如对于阅读了本公开内容的本领域技术人员是明显的，本文描述并说明的每个单独的实施方式具有分立的组成部分和特征，其可易于与任何其他几种实施方式的特征分开或组合，而不偏离本公开内容的范围或精神。可以以所提及事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序实施任何所提及的方法。

除非另外指明，本公开内容的实施方式将采用属于本领域技术内的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术。文献中详细解释了这些技术。

必须注意的是，除非上下文明确另外指明，如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包含复数的所述对象。因此，例如，述及“一个支持体”包括多个支持体。在本说明书和随后的权利要求书中，将引用许多术语，这些术语应被定义具有以下含义，除非相反的用意是明显的。

除非另外指出，如本文所用的，以下术语具有归属于它们的含义。在本公开内容中，“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包含(containing)”和“具有(haVing)”及类似术语可具有在美国专利法中赋予它们的含义且可以指“包括(includes)”、“包括(including)”及类似的术语；当应用于本公开内容包括的方法和组合物时，“主要由...组成”或“主要包括”或类似的术语是指如本文公开的那些组合物的组合物，但其可包含额外的结构基团、组成组分或方法步骤(或如以上讨论的其类似物或衍生物)。然而，与本文公开的那些对应组合物或方法相比，这些额外的结构基团、组成组分或方法步骤等不会实质性地影响组合物或方法的基本特征和新颖特征。当应用于本公开内容包括的方法和组合物时，“主要由...组成”或“主要包括”或类似的术语具有在美国专利法中赋予的含义，且该术语是开放式的，允许存在多于所提及的那些，只要所提及的那些的基本特征或新颖特征未被多于所提及的那些的存在改变，但排除现有技术实施方式。

在描述各种实施方式之前，提供以下定义且除非另外指明，应使用该定义。

定义

如本文所用的术语“细胞或细胞群”指从组织中切除或通过组织培养技术在体外培养的分离的细胞或许多细胞。最特别地，细胞群指位于动物或人的组织中的体内细胞。

如本文所用的术语“接触细胞或细胞群”指向分离的或培养的细胞或细胞群递送根据本公开内容的肽或探针，或向动物或人的靶组织施用处于合适的药学可接受的载体中的探针。施用可以是但不限于静脉内递送、腹腔内递送、肌肉内、皮下递送或通过本领域已知的任何其他方法递送。一种有优势的方法是直接递送到血管内，立即引导入靶器官或靶组织例如胰，从而减少探针在常规循环系统中的稀释。

如本文所用的术语“染料”指任何报告基团，可通过其光吸收或光发射性质检测其存在。例如，Cy5是菁蓝染料家族的反应性水溶性荧光染料。Cy5是红光区域(约650至约670nm)内的荧光。其可合成为带有位于一个或两个氮侧链上的反应基，以致于这些反应基可与核酸或蛋白分子化学连接。为了观察和量化目的进行标记。在光谱的远红外部分，Cy5在约649nm处最大激发且在约670nm处最大发射，量子产率是0.28。FW＝792。用于本公开内容的探针的合适荧光团(铬)可以选自，但不意在局限于异硫氰酸荧光素(FITC，绿光)、菁蓝染料Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5(从绿光到近红外变化)、德克萨斯红及类似物。用于本公开内容的实施方式中的这些染料的衍生物可以是但不限于Cy染料(Amersham Bioscience)、Alexa荧光剂(Molecular Probes Inc.)、HILYTE^TM荧光剂(AnaSpec)和DYLITE^TM荧光剂(Pierce，Inc.)。

如本文所用的术语“荧光”是指在冷体中经常作为光学现象而发现的发光，其中光子的分子吸收引发具有较长波长(能量较小)的光子的发射。吸收和发射的光子之间的能量差异以分子转动、振动或发热告终。有时吸收的光子位于紫外光范围内，而发射光位于可见光范围内，但这取决于特定荧光团的吸收曲线和斯托克斯位移。

“可检测标记的”是指包含放射性部分，或被荧光团取代的部分，或被引发可被肉眼或借助于设备例如但不限于闪烁计数器、比色计、UV分光光度计及类似设备观察或检测到的物理或化学反应的某些其他分子物质取代的部分的蛋白或核酸，或其片段。如本文使用的，“标记”或“标签”可指当通过例如但不限于共价键合或杂交而被另一个分子(例如也不限于肽)附着时，提供或增强检测其他分子的手段的分子。当在不同波长下激发时，荧光或荧光标记或标签发射出在特定波长下可检测的光。放射性标记或放射性标签发射出用仪器例如但不限于闪烁计数器可检测的放射性粒子。如本文所用的术语“标记”可以指可与本公开内容的化合物连接并可用来提供可检测图像的任何部分，包括但不限于荧光染料、MRI剂例如Gd³⁺、F¹⁹及类似物；PET剂例如但不限于F¹⁸、I¹²⁵和Cu⁶⁴；或SPECT剂例如I¹³¹。

如本文所用的术语“药学可接受的载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂或介质，这些载体可与本公开内容的异二聚体探针一起施用且被联邦或州政府的监管机构批准或在美国药店或其他公认药典中列出用于动物且更特别地用于人。这些药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似物。药物载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素及类似物。当向患者施用时，异二聚体探针和药学可接受的载体可以是无菌的。当静脉内施用异二聚体探针时，水是有用的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油的水溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇及类似物。如果期望的话，本组合物也可包含小量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。有利地，本组合物可采用适合使用的溶液、乳液、缓释制剂的形式或任何其他形式。

如本文所用的术语“聚合酶链式反应”或“PCR”指热循环的聚合酶介导的DNA扩增反应。PCR通常包括模板分子、与模板分子的每条链互补的寡核苷酸引物、热稳定性DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸，并包括多次重复以实现初始核酸扩增的三个不同的过程。通常在不同的温度下，并在时间不同的步骤中进行这三个过程(变性、杂交和引物延伸)。然而，在许多实施方式中，可同时进行杂交和引物延伸过程。待分析的核苷酸样品可以是使用在美国专利第6,569,672、6,569,627、6,562,298、6,556,940、6,569,672、6,569,627、6,562,298、6,556,940、6,489,112、6,482,615、6,472,156、6,413,766、6,387,621、6,300,124、6,270,723、6,245,514、6,232,079、6,228,634、6,218,193、6,210,882、6,197,520、6,174,670、6,132,996、6,126,899、6,124,138、6,074,868、6,036,923、5,985,651、5,958,763、5,942,432、5,935,522、5,897,842、5,882,918、5,840,573、5,795,784、5,795,547、5,785,926、5,783,439、5,736,106、5,720,923、5,720,406、5,675,700、5,616,301、5,576,218和5,455,175号中所述的快速循环技术提供的PCR扩增产物，这些专利的公开内容通过引用全部并入。其他扩增方法包括但不限于NASBR、SDA、3SR、TSA和滚环复制。应当理解，在用于生产包含特定修饰的核苷酸的多核苷酸的任何方法中，可使用一种或多种聚合酶或扩增方法。最佳聚合条件的选择取决于应用。

如本文所用的术语“聚合酶”指催化向聚合链顺序添加单体单元，或连接两个或更多个单体单元以起始聚合链的酶。在本发明的有优势的实施方式中，“聚合酶”将通过添加单体单元而发挥作用，单体单元的身份由特定序列的模板分子确定并与该模板分子互补。例如，DNA聚合酶例如DNApol1和Taq聚合酶以模板依赖方式将脱氧核糖核苷酸添加到多核苷酸链的3’末端，从而合成与模板分子互补的核酸。可使用聚合酶来一次或反复地延伸引物或通过使用两条引物反复引导两条互补链扩增多核苷酸。

如本文所用的术语“引物”指寡核苷酸，其至少一部分序列与待扩增或复制的模板DNA的片段互补。通常，引物用于进行聚合酶链式反应(PCR)。引物与模板DNA杂交(或“退火”到模板DNA上)并被酶聚合酶用作复制/扩增过程的起点。“互补的”指引物的核苷酸序列使得引物可与模板形成稳定的氢键络合物；即，由于形成长度超过至少十个连续碱基对的碱基对，引物可与模板杂交或退火。

选择本文的引物与特定靶DNA序列的不同链“基本”互补。这是指引物必须足够互补以与其各个链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可附着在引物的5’末端，而引物序列的剩余部分与该链互补。

如本文所用的术语“蛋白”指由一条或多条氨基酸链以特定顺序组成的大分子。该顺序由编码该蛋白的基因中的核苷酸的碱基序列决定。蛋白是身体细胞、组织和器官的结构、功能和调控所需的。每种蛋白具有独特的功能。

如本文所用的术语“肽”指蛋白和其片段。本文将肽公开为氨基酸残基序列。以从氨基末端到羧基末端的方向从左向右书写那些序列。根据标准命名法，以如下所示的三字母或单字母密码子命名氨基酸残基序列：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。

术语“变体”指与参照肽或多核苷酸不同但保留了主要性质的肽或多核苷酸。典型的肽变体在氨基酸序列方面与另一个参照肽不同。一般来讲，差异是有限的以使参照肽和变体的序列整体近似且在许多区域相同。可通过一种或多种修饰(例如，置换、添加和/或缺失)引起变体和参照肽的氨基酸序列不同。肽变体包括保守修饰的变体(例如，具有约75、约80、约85、约90、约95、约98、约99％的初始序列的保守变体)。置换或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。肽变体可以是天然形成的，例如等位基因变体，或其可以是未知天然形成的变体。

如本文所用的术语“靶”指期望检测的肽、细胞、组织、肿瘤等。靶肽可以位于细胞表面上，所述细胞是从动物宿主分离到的细胞、培养的细胞或动物组织中的细胞或细胞群。

本公开内容包括可来源于天然形成的肽序列的肽。如果其可通过断裂天然形成的序列获得的话，或其可基于对天然形成的氨基酸序列或编码该序列的遗传材料(DNA或RNA)的序列的了解而被合成的话，肽被称作是“可来源于天然形成的氨基酸序列”的。包括在本公开内容的范围内的是称作是肽“衍生物”的那些分子。这种“衍生物”或“变体”与肽或肽的相似大小的片段共有基本相似性，且能够以与该肽相同的生物活性发挥功能。

如果肽的衍生物的氨基酸序列是该肽或具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的该肽的片段的氨基酸序列的至少80％、至少90％、至少95％或与之相同，则称该衍生物与该肽共有“基本相似性”。

本公开内容的衍生物包括如下片段，其除了包含与天然形成的肽的序列基本相似的序列，可在其氨基末端和/或其羧基末端包含一个或多个额外的氨基酸。相似地，本发明包括如下肽片段，其尽管包含与天然形成的肽的序列基本相似的序列，可在其氨基末端和/或其羧基末端缺少在肽上天然存在的一个或多个额外氨基酸。

本公开内容还包括具有不重要的氨基酸置换(且因此具有与天然序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列)的上述片段的显而易见或不重要的变体，条件是这些变体具有与上述衍生物的活性基本相同的活性。显而易见或不重要的置换的实例包括将一个碱性残基置换成另一个碱性残基(即，Arg置换Lys)，一个疏水残基置换成另一个疏水残基(即，Leu置换Ile)，或一个芳族残基置换另一个芳族残基(即，Phe置换Tyr)等。

可对本公开内容的肽的结构进行修饰和改变且仍获得具有与该肽相似特征的分子(例如，保守氨基酸置换)。例如，在序列中，某些氨基酸可被置换成其他氨基酸而无明显的活性损失。由于是肽的相互作用能力和性质决定肽的生物功能活性，可对肽序列进行某些氨基酸序列置换而却获得具有类似性质的肽。

在进行这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予肽相互作用生物功能方面的重要性是本领域通常理解的。已知某些氨基酸可被置换成具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸并仍产生具有相似生物活性的肽。基于其疏水性和电荷特征，为每种氨基酸指定了亲水指数。那些指数为：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

认为氨基酸的相对亲水特征决定了所得肽的二级结构，这反过来限制了肽与其他分子，例如酶、底物、受体、抗体、抗原及类似物的相互作用。氨基酸可被具有相似亲水指数的另一氨基酸置换并仍获得功能上等效的肽是本领域已知的。在这些改变中，优选其亲水指数在±2内的氨基酸的置换，特别优选在±1内的那些，且甚至更特别优选在±0.5内的那些。

特别地，当期望生物功能等效的肽或由此制备的肽用于免疫学实施方式中时，也可以基于亲水性进行相似氨基酸的置换。已给氨基酸残基指定了以下亲水值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、脯氨酸(-0.5±1)、苏氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可被置换成具有相似亲水值的另一氨基酸，且仍获得生物学上等效的肽，且特别是免疫学上等效的肽。在这些改变中，优选其亲水值在±2内的氨基酸的置换，特别优选在±1内的那些，且甚至更特别优选在±0.5内的那些。

如以上概述，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小及类似性质。考虑了各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员熟知的且包括(天然残基：示例性置换)：(Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln、His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)和(Val：Ile、Leu)。

本文互换地使用术语“受治疗者”、“个体”、“患者”和“宿主”且这些术语指任何脊椎动物、特别是任何哺乳动物，且最特别地包括人受治疗者、家畜和哺乳动物类宠物。受治疗者可以但不一定在健康保健专业人员例如医生或兽医的护理下，且可能需要本公开内容的组合物的治疗性治疗。

如本文所用的术语“稳定性”指当肽储存和暴露于将是失活条件的条件时基本上保留了其物理和化学稳定性及完整性，所述条件包括但不限于氧化、热变性、肽酶裂解及类似条件，且与肽未经受这些条件时相比，这些条件将明显减少或去除肽的生物活性或结构完整性。

如本文所用的术语“载体”是指用作能够将外源基因稳定地携带到宿主细胞内的介质的DNA分子。为了有用的应用，载体应是可复制的，具有用于将其本身引入到宿主细胞的系统，并拥有选择标志。

讨论

本公开内容包括稳定肽和多肽，尤其是体内环境中的那些肽和多肽，从而延长其半衰期并延长其作为施用的治疗剂的有效性的方法。已发现期望被稳定的第一肽可以与另一个更稳定的第二肽连接以形成肽，且发现第二肽的稳定性被赋予第一肽。例如，已发现第一肽可替换第二肽的结构域例如α-螺旋结构域并仍保留其生物活性。

例如取代的实施方式是肽钙结合蛋白D9k的一个区域被肽胰高血糖素样肽-1(GLP-1)替换。现指定为Cal.GLP的所得的接枝或融合蛋白或工程蛋白保留了GLP-1的生物和生理活性，现在其还抗蛋白水解降解和来自受体动物的血清清除。因此，所观察到的GLP-1的体内生物作用被延长。因此，本公开内容的实施方式提供了那些目前可获得的且受限于在接受者体内的相比而言较短的有效期的用于治疗2型糖尿病的替代治疗剂。

期望这种蛋白药物例如本公开内容的Cal.GLP蛋白在受体动物或人受治疗者体内具有延长的时限，所担忧的问题是由于产生有害免疫应答可最终导致灭活所施用的试剂的构建体的免疫原性。然而，本公开内容的Cal.GLP产物具有低的免疫原性，表明药物活性的任何减弱将不太可能是免疫清除的结果。

本公开内容的另一方面提供了用于修饰构建体以将其半衰期延长得更长的方法。因此，在本公开内容的示例性实施方式中，构建了蛋白Cal.GLP的变体，其中鉴定到可被置换的一个残基或多个残基，并提供了修饰性基团例如但不限于聚乙二醇(PEG)基团的附着位点。

使用本公开内容的方法，通过将肽插入到另一个肽的结构域中或取代另一个肽的结构域来稳定蛋白，进一步允许具有延长半衰期的稳定的成像造影剂的构建，延长的半衰期可允许药物在靶向组织中更大的浓度。因此，增强了成像的对比度和灵敏度，允许检测否则将被忽视的组织中的小细胞群，例如但不限于胰中的β细胞群。

例如，Cal.GLP蛋白可与在胰β细胞上发现的GLP-R选择性结合。即使钙结合蛋白的一个区域已被GLP-1肽替换，这种稳定性增强的蛋白的钙结合蛋白部分保留了结合金属核素例如Gd⁺的活性。赋予GLP的增强的稳定性允许构建体在延长的时段内集中在受治疗动物的胰的胰岛中。

因此，现已通过结合稳定的宿主蛋白，人钙结合蛋白D9k或其部分来修饰GLP-1以增加GLP-1的分子量，稳定短肽结构的流动性，并保护肽免受DPP4降解，从而增加循环半衰期。另外，进行蛋白聚乙二醇化来降低蛋白免疫原性并优化蛋白的生物分布。因此，蛋白钙结合蛋白D9k-GLP-1被成功地克隆到pRSETb质粒载体中并在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS中表达。通过热激、随后Q-柱(GE Healthcare)来纯化蛋白。

优化了半胱氨酸位点特异性聚乙二醇化的条件。在体外，基于细胞的cAMP测定表明该蛋白和其聚乙二醇化变体都可通过剂量依赖形式提高RINm5F细胞的细胞内cAMP水平，与GLP-1肽相比具有减少的IC₅₀；然而，野生型人钙结合蛋白D9k不能刺激RINm5F细胞增加细胞内cAMP。

因此，该蛋白和其聚乙二醇化变体保留了识别和活化GLP-1受体的活性。在体外，通过在50％小鼠血清中孵育蛋白，蛋白血清稳定性试验表明在37℃下持续3小时该蛋白和其聚乙二醇化变体都是血清稳定的，该蛋白甚至在多达24小时显示出很少的降解。然而，观察到聚乙二醇化蛋白的大部分降解，可能是由聚乙二醇化剂脱离该蛋白引起。

将GLP-1接枝到稳定的宿主蛋白钙结合蛋白D9k上是基于：(1)将GLP-1接枝到稳定的宿主蛋白上将稳定肽和完整蛋白的二级结构。由于GLP-1的生物活性需要螺旋结构(Thornton & Gorenstein(1994)Biochemistry 33：3532-3539)，稳定肽和蛋白应增强其活性；(2)将GLP-1接枝到稳定的宿主蛋白上将可能产生具有强的抗DPP-4裂解的折叠蛋白；和(3)将GLP-1接枝到稳定的宿主蛋白上将明显增加其血液循环时间，导致作用延长。

开发钙结合蛋白D9k或其部分以包括Gd³⁺结合位点。所开发的钙结合蛋白D9k作为MRI造影剂发挥功能，R1和R2弛豫性能都增加20倍(Yang等人，(2008)J.Am.Chem.Soc.130：9260-9267，本文通过引用将其全部并入)。之前的研究也已说明了该蛋白的长血液循环时间(Wild等人，(2004)Diabetes Care 27：1047-1053)。如图6所示，通过替换C-末端螺旋，将GLP-1接枝到宿主蛋白钙结合蛋白D9k中，这允许蛋白靶向到GLP-1受体上。本文将新产生的蛋白称为Cal.GLP。在本文通过引用将其全部并入的专利申请PCT/US2009/039276中公开了关于CA1.CD2的其他细节。

因此，本公开内容的一个实施方式提供了用作GLP-1R激动剂和用作每个Gd³⁺具有非常高的MRI造影增强能力(与Gd-DTPA的R1和R2弛豫性能相比，R1和R2弛豫性能增加20倍)的GLP-1R靶向的MRI造影剂的双功能蛋白药物。该蛋白抗DPP-4裂解(在75％的人血清中稳定至少48小时)，允许体内应用GLP-1R激动剂。与血清白蛋白相比，该蛋白的相对小的大小(约12kDa)能够实现良好的组织穿透和滞留特性和相对长的血液循环时间，这可对体内靶向GLP-1R提供巨大益处。基于细胞的体外试验已表明该蛋白具有与毒蜥外泌肽-4的生物活性相当的生物活性，表明已制备出GLP-1R激动剂。糖尿病小鼠试验表明该蛋白具有降低血糖的强且持久的体内活性。

已通过将DTPA轭合到提供β-细胞特异性造影增强作用的毒蜥外泌肽-4而证实了借助于靶向GLP-1R的β-细胞MR成像的可行性(Gotthardt等人，(2006)Regul.Pept.137：162-167)。本公开内容的蛋白药物的实施方式显示出与Gd-DTPA相比增强20倍的造影能力。我们的蛋白药物还具有与毒蜥外泌肽-4/DTPA轭合物相比有利的血液循环特性。

Cal.GLP蛋白的重要方面是该药物的能够实现有效的组织穿透和滞留的合适大小。因此，与那些白蛋白有关的药物相比，期望Cal.GLP蛋白药物可允许向胰短暂递送更高浓度的药物。该性质对于糖尿病治疗是重要的，尤其是对于响应突发的血糖升高是重要的。通过特定修饰，例如聚乙二醇化或酰化可改善循环和分布特性。聚乙二醇化之后，母体蛋白钙结合蛋白的血液循环时间可增加到大于24小时。不像肽的情形，因为聚乙二醇化位点相对远离生物活性位点，在修饰所研发蛋白中可避免生物活性的降低。

借助于靶向GLP-1R的MR成像：本公开内容的蛋白的实施方式的特性是其对Gd³⁺的高亲和力，这种高亲和力除了能够实现GLP-1R靶向能力，还能够实现非常高的MRI造影增强能力。这些特征支持将该药物作为MRI造影剂用于GLP-1R靶向胰β细胞成像的应用。关于通过靶向GLP-1R对β细胞进行MR成像，存在两个待解决的问题。(1)在目前的检测能力下，例如在处于或接近临床场强和成像序列下，受体数目是否足够提供强的MRI造影增强作用？(2)靶向GLP-1R对于胰腺β-细胞成像是否足够特异？用毒蜥外泌肽-4和Gd-DTPA轭合物对胰β细胞MR成像的成功可解决第一个问题(Gotthardt等人，(2006)Regul.Pept.137：162-167)。因为与Gd-DTPA的造影增强能力(弛豫性能)相比，本公开内容的药物的造影增强能力高出约20倍，并具有相对较长的循环时间，在GLP-1R的MR成像方面，本公开内容的药物的实施方式可提供超过毒蜥外泌肽-4和Gd-DTPA轭合物的优势。另外，胰β细胞上的GLP-1受体数目(约105/细胞)(Korner等人，(2007)J.Nucl.Med.48：736-743)不明显小于SKOV3细胞上的HER2水平(约8x10⁵/细胞)(Ross等人，(2004)Expert Rev.Mol.Diagn.4：169-188)。在小鼠异种移植模型中已观察到与HER2靶向抗体融合的本文公开的蛋白造影剂在SKOV3肿瘤成像中的强的HER2特异性造影增强作用。来自HER2靶向MR成像的结果支持在胰β细胞成像中靶向GLP-1R的可行性。

因此，GLP-1R是胰岛中的有用的β细胞特异性分子标志。已知GLP-1R还表达在许多其他器官，例如心脏、肺和中枢神经系统中。由于当胰中的GLP-1R靶向的成像对比度增强作用在糖尿病条件下减弱时，GLP-1R在其他器官部位的成像可用作参照，受体在其他器官部位的表达提供了用于胰β细胞的成像评价的对比性对照。

免疫原性：体内应用的一个忧虑是所有蛋白疗法和诊断剂的免疫原性的可能性。在兔中测试了在PCT/US2009/039276中公开并通过引用将其全部并入本文的蛋白药物CA1.CD2的免疫反应。没有佐剂存在下，在初始注射和接下来的两个月时间内的三次强化注射之后未观察到明显的免疫反应。即使使用佐剂，蛋白的聚乙二醇化极大地减少了抗体生成。Cal.GLP来源于人钙结合蛋白D9k。来自大鼠和人的GLP-1是相同的(Wang等人，(1999)Cell 97：791-803)。因此，期望该蛋白在人体内是无免疫原性的。

因此，本公开内容的一方面提供了包括其特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽的融合蛋白，其中融合蛋白比单独的第一肽更稳定。

在本公开内容的该方面的实施方式中，融合蛋白可还包括与其连接的可检测标记。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，融合蛋白的第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，第二肽可以是钙结合蛋白D9k、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

在本公开内容的实施方式中，融合蛋白的第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且第二肽可以是钙结合蛋白D9k的部分或全部、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)或其保守变体，且第二肽可具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

在本公开内容的该方面的实施方式中，融合蛋白可还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

在本公开内容的一个实施方式中，融合蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，且第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)。

在本公开内容的该方面的实施方式中，第一肽可替换第二肽的区域。

在本公开内容的该方面的实施方式中，第一肽可以是受体的肽配体，且其中当所述融合蛋白结合受体时，融合蛋白调控该受体的活性。

因此，本公开内容的一方面提供了包括其特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽的工程蛋白，其中该蛋白比单独的第一肽更稳定。

在本公开内容的该方面的实施方式中，工程蛋白可还包括与其连接的可检测标记。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，工程蛋白的第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，第二肽可以是钙结合蛋白D9k、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

在本公开内容的实施方式中，工程蛋白的第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且第二肽可以是钙结合蛋白D9k的部分或全部、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)或其保守变体，且第二肽可具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

在本公开内容的该方面的实施方式中，工程蛋白可还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

在本公开内容的一个实施方式中，基因工程蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，且第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)。

在本公开内容的该方面的实施方式中，第一肽可替换第二肽的区域。

在本公开内容的该方面的实施方式中，第一肽可以是受体的肽配体，且其中当所述融合蛋白结合受体时，工程蛋白调控该受体的活性。

本发明的另一方面提供了调控动物或人细胞葡萄糖代谢的方法，包括：使动物或人细胞与包含融合蛋白的组合物接触，所述融合蛋白包括与第二肽连接的第一肽，其中该蛋白比单独的第一肽更稳定，且其中第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其变体；第二肽可以是钙结合蛋白D9k的部分或全部、其氨基酸序列变体或其修饰的变体；且其中融合蛋白选择性地结合靶细胞的GLP-1受体，从而调控受体的活性和细胞的葡萄糖代谢。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)或其保守变体，且第二肽可具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

在本公开内容的该方面的方法的实施方式中，融合蛋白可还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

在某些实施方式中，靶细胞是分离的细胞.

在其他实施方式中，靶细胞可位于受治疗动物或人的组织内，从而减少受治疗者的血浆葡萄糖。

在本公开内容的该方面的方法的实施方式中，受治疗动物或人的组织可接受有效剂量的还包括药学可接受的载体的组合物。

本公开内容的又另一方面提供了成像探针，其中该探针为融合蛋白，该融合蛋白包括：特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽，其中第二肽增加了与其连接的第一肽的稳定性；和可检测标记。

在本公开内容的该方面的实施方式中，该标记可以是通过荧光、MRI或PET扫描可检测的。

在本公开内容的该方面的实施方式中，标记可选自由染料、荧光染料、放射性标记和金属离子组成的组。

在实施方式中，标记可连接到融合蛋白的第二肽上。

在实施方式中，融合蛋白与靶细胞结合的位点可以是所述细胞表面上的受体。

在本公开内容的该方面的实施方式中，融合蛋白的第一肽可以是靶细胞的融合蛋白结合位点的配体。

在本公开内容的某些实施方式中，融合蛋白的第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且第二肽可以是钙结合蛋白D9k的部分或全部、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

在本公开内容的某些实施方式中，第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，或其保守变体，且所述第二肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

在本公开内容的该方面的实施方式中，融合蛋白可还包括与其轭合的至少一个聚乙烯部分。

在本公开内容的该方面的一个实施方式中，该融合蛋白的第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ IDNO.：1)，第二肽可具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，且所述标记为钆(Gd⁺)，由此所述标记是通过MRI可检测的，且其中融合蛋白结合位点是胰腺细胞的GLP-1受体。

本公开内容的又另一方面提供了增强成像对比度的方法，包括：(i)向靶细胞递送包含融合蛋白的成像探针，其中融合探针包括：特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接的第一肽，其中该蛋白比单独的第一肽更稳定；和可检测标记；和(ii)检测来自所述标记的信号，从而确定靶细胞上融合蛋白结合位点的存在。

在本公开内容的该方面的实施方式中，靶细胞可位于受治疗动物或人的组织内，并可将成像探针作为药学可接受的组合物对受治疗动物或人施用。

在本公开内容的该方面的实施方式中，药学可接受的组合物可还包括药学可接受的载体。

在本公开内容的该方面的实施方式中，标记是通过荧光、MRI或PET扫描可检测的且标记可选自由染料、荧光染料、放射性标记和金属离子组成的组。

在实施方式中，标记可连接到融合蛋白的第二肽上。

在实施方式中，融合蛋白的结合位点可以是靶细胞表面上的受体且融合蛋白的第一肽可以是靶细胞的融合蛋白结合位点的配体。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，融合蛋白的第一肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且第二肽可以是钙结合蛋白D9k、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

在本公开内容的该方面的某些实施方式中，第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)或其保守变体，且第二肽可具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

在本公开内容的实施方式中，融合蛋白可还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

在某些实施方式中，融合蛋白的第一肽可具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，且标记为钆(Gd⁺)，由此所述标记是通过MRI可检测的，且其中融合蛋白结合位点是胰腺细胞的GLP-1受体。

以下具体实施例将被解释为仅说明性的，且无论如何不以任何方式限制本公开内容的剩余部分。不需要进一步的详细说明，认为本领域技术人员可基于本文的描述以其最大程度地利用本公开内容。本文提及的所有出版物在此通过引用将其全部并入。

应当强调，本公开内容的实施方式，特别是任何“优选的”实施方式只是实施的可能实施例，只为清楚地理解本公开内容的原理而提供。可对本公开内容的上述实施方式进行许多改变和修改而不明显偏离本公开内容的精神和原理。期望所有这些修改和改变包括在本文的该公开内容的范围内，并受以下权利要求保护。

提供以下实施例以向本领域普通技术人员提供对如何进行本文公开并要求保护的方法和如何使用本文公开并要求保护的组合物和化合物的充分公开和说明。已做出努力以确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指明，份数是以重量计的份数，温度以℃计，且压力是大气压下或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

应当注意本文可以以范围形式表达比例、浓度、量和其他数字数据。应当理解，为了方便和简明而使用这种范围形式，且因此应以灵活的方式理解这种范围形式不仅包括作为范围的限值明确提及的数值，而且包括包含在该范围内的所有个体数值或子范围，如同明确提及每个数值和子范围。为了举例说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应理解为不仅包括明确提及的约0.1wt％至约5wt％的浓度，而且包括在所示范围内的单独的浓度(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。在实施方式中，术语“约”可包括根据数值的有效数字的常规四舍五入。另外，短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。

实施例

实施例1

质粒构建：获得在pRSETb载体(图1所示)中编码人钙结合蛋白D9k的质粒。人GLP-1的氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)。

用于聚合酶链式反应(PCR)扩增的引物是：

正向

5’-CTTGTTCGTGGTCGTGGTGGATCCGGAGGAGCATTTGAGATCTTAGCAAATG-3’(SEQ ID NO.：5)，和

反向

5’-GAACGTGCCTTCTGCGTGTCCGGAACCCGATTT CAAAAAAGGCTTCATCTTC-3’(SEQ ID NO.：6)。

50μl的PCR混合物由以下组成：浓度为0.1μg/μl的1μl质粒载体；各自浓度约0.4μg/μl的0.3μl正向引物和反向引物；dNTP混合物0.5μl(10mM)；Pfu DNA聚合酶1μl；Pfu缓冲液5μl；和蒸馏水41.9μl。PCR在分别以94℃持续30秒，55℃持续1分钟，63℃持续6分钟的变性-退火-延伸条件下进行30个循环。

第一轮PCR之后，收集特定分子量的分离产物并在室温下在由以下组成的30μl混合物中连接4小时：25μl DNA溶液、1μl ATP(10mM)、1μlT4连接酶、3μl连接酶缓冲液。然后将连接产物转化到大肠杆菌JM109中。在氨苄青霉素LB琼脂平板上孵育后；将单菌落接种到50ml无菌LB培养基中以在37℃下过夜生长。然后收集细菌并提取质粒。

如上所述使用引物：

正向

5’-GGCCAAGCCGCCAGGGAATTCATTGCATGGCTTGTTCGTGGTCGTGGTGGAT-3’(SEQ ID NO.：7)，和

反向

5’-TTCGAGGTAGCTGCTTACGTCGCTCGTGAACGTGCCTTCTGCGTGTCC-3’(SEQ ID NO.：8)进行第二轮PCR并在分别以94℃持续30秒，55℃持续1分钟，63℃持续6分钟的变性-退火-延伸条件下持续30个循环。

另外，为了位点特异性聚乙二醇化，构建融合蛋白的钙结合蛋白部分的融合蛋白半胱氨酸突变体。用来将丝氨酸42和谷氨酸8突变成半胱氨酸的引物为：

丝氨酸42：

正向5’-TGTTTACTCAAAGGTCCAAACACCCTAG-3’(SEQ IDNO.：9)

反向5’-GGGGAATTCAGCCTGAATCAATAG-3’(SEQ ID NO.：10)，和

谷氨酸8：

正向5’-TGTGAACTGAAGAGGATTTTTGAAAAATATG-3’(SEQ IDNO.：11)

反向5’-AGGAGACTTTTTAGTACTCATATG-3’(SEQ ID NO.：12)。

表达载体pRSETb，带有氨苄青霉素抗性和多个限制性内切酶消化位点的质粒载体，编码His6标签。然而，融合蛋白的纯化不需要该标签，将其删除。通过DNA自动测序进一步验证质粒。

实施例2

融合蛋白的表达和纯化：使用BL21(DE3)pLysS表达融合蛋白。在将构建的质粒转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞中之后，在42℃热激细菌90秒并在37℃无抗生素的LB培养基中孵育30分钟，然后涂布在带有氨苄青霉素的LB琼脂平板上并在37℃下孵育过夜。第二天挑取单菌落并在50ml的带有氨苄青霉素的无菌LB培养基中孵育。37℃下过夜后，将20ml的LB培养基转移到1L的无菌LB-amp培养基中。当培养基达到A_600nm＝0.6时，用500μl IPTG(1M)诱导表达4小时。

离心1ml的培养物溶液，将细胞沉淀重悬在100μl 1xSDS-PAGE上样缓冲液中并加热到100℃持续10分钟。使用16％SDS-PAGE凝胶分析蛋白的表达。

通过离心10分钟收集细菌。用10mM Tris缓冲液(pH7.4)重悬细胞沉淀，并超声3分钟并在15,000rpm下离心30分钟。在85℃下加热上清液10分钟并再在15,000rpm下离心30分钟。收集上清液并用0.45μm注射器式滤器过滤。

用Q-柱TM(GE Healthcare)通过AKTA.RTM FPLC系统(GEHealthcare)纯化滤过的蛋白溶液。将蛋白溶液上样后，用20ml 10mM Tris缓冲液(pH 7.4)洗涤柱，并用溶于10mM Tris缓冲液(pH7.4)中的0-1MNaCl梯度洗脱出来。然后通过Bio-Rad测定确定蛋白浓度。

实施例3

位点特异性聚乙二醇化：纯化半胱氨酸突变的融合蛋白之后，将蛋白从10mM Tris缓冲液(pH7.4)透析到PBS缓冲液(pH7.0)中。使用三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(TCEP)将二聚化的蛋白还原成单体。在室温下将蛋白和TCEP孵育30分钟后，为防止氧化在N₂环境下通过带有3kDal膜的浓缩器通过反复添加PBS缓冲液最少10倍于原始体积而将TCEP透析出去。在氮气环境中在4℃下将甲氧基-PEG马来酰亚胺-MW 5kDal(Jenkem Technology)与蛋白溶液一起振荡过夜。使用透析法去除游离的聚乙二醇化剂。使用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定聚乙二醇化蛋白的分子量和聚乙二醇化效率。

实施例4

基于细胞的细胞内cAMP测试：使用Lance cAMP 384.RTM试剂盒(Perkin Elmer，Inc)比较融合蛋白和聚乙二醇化蛋白的肠降血糖素作用。在75cm²细胞培养瓶中用带有10％FBS的RPMI1640培养大鼠胰岛素瘤细胞(RINm5F)。收集细胞并用HBSS(Invitrogen Corp.)缓冲液洗三次。在37℃下将一系列的5μl受试蛋白和于刺激缓冲液(1xHBSS缓冲液，含有5mM HEPES、0.1％BSA和150mM IBMX)中5000个细胞的5μl细胞悬液和Alexa、生物素标记的cAMP抗体在384孔板中孵育15分钟。然后加入10μl的检测混合物(含有5/16μl WU-W8044和5/6μl生物素-cAMP的615μl检测缓冲液)，覆盖培养板并在室温下孵育60分钟。使用VICTOR³读板机(PerkinElmer，Inc.)检测在激发340nm和发射665nm和615nm处的荧光信号。然后用公式F＝F665nm/F615nm分析收集到的数据。

实施例5

蛋白血清稳定性测试：在37℃下以1∶1的比例将融合蛋白和聚乙二醇化蛋白与小鼠血清一起孵育1小时、3小时和24小时。然后通过16％SDS-PAGE分析样品。

实施例6

融合蛋白特异性多克隆抗体的产生：使用兔产生抗体。在免疫前，收集10ml血液作为采血前对照。在第0周，将300μg融合蛋白与完全弗氏佐剂混合以形成稳定的乳液并皮下注射到肩周围的部位，并肌肉内注射到后腿的大肌肉中。在第2周，以相同的方式注射150μg融合蛋白和相同量的完全弗氏佐剂的混合物再一次免疫。在第4周，注射带有相同量的不完全弗氏佐剂的150μg的第二次加强剂。

在第5周，第一次采血为约20-30ml。在第6周，如前注射带有相同量的不完全弗氏佐剂的150μg蛋白的第三次加强剂。在第7周，收集第二份血样。在第8和第10周，施用第四次加强剂和最后一次加强剂，并在第9和第11周，收集第三次和最后一次血样。

抗体筛选：每次采血后，通过离心净化小鼠血清。使用蛋白质印迹筛选抗体。通过16％SDS-PAGE分析蛋白，转移到在1x转移缓冲液(25mMTrizma碱、192mM甘氨酸、pH 8.3)中的PVDF膜上。在4℃下将膜在封闭缓冲液(溶于PBS缓冲液中的3％BSA、0.05％吐温20)中孵育过夜，用带有0.05％吐温20的PBS缓冲液洗涤3次，每次10分钟，并在室温下与血清样品(1∶2000稀释在封闭缓冲液中)一起孵育。再次用洗涤缓冲液洗涤膜三次并在室温下与1∶2000稀释在封闭缓冲液中的二抗孵育45分钟，并如前洗涤。最后，用Amersham ECL试剂盒检测膜。

实施例7

融合蛋白表达和纯化：表1中列出了人钙结合蛋白D9k、GLP-1、融合蛋白和其两个半胱氨酸突变体的氨基酸序列。

表1蛋白的序列

^a以加下划线的粗体表示S42C和E8C变异的位置。

CalGlp/Q26D的序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDL SKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQID NO.18)。

融合蛋白的分子量是10,289道尔顿，PI 4.97；且两个半胱氨酸突变体的分子量分别是10,305道尔顿，PI 4.97和10,263道尔顿，PI 5.13(瑞士生物信息研究所的ExPASy(蛋白分析专家系统)蛋白组学服务器)。

将编码人钙结合蛋白D9k和GLP-1融合蛋白和突变体的DNA序列克隆到pRSETb质粒载体中并由大肠杆菌BL21(DE3)pLysS宿主过表达。观察到融合蛋白的高表达水平。利用高的热稳定性的优势，在85℃下进行热激10分钟，并然后通过FPLC系统由Q-柱(GE Healthcare)纯化。两个纯化步骤之后，获得高纯度和高产量的融合蛋白。

实施例8

半胱氨酸突变体的纯化和蛋白聚乙二醇化：表达并纯化人钙结合蛋白D9k-GLP-1融合蛋白的半胱氨酸突变体以进行聚乙二醇化。在非还原条件下，大部分的蛋白是分子量约20KDa的二聚体(图2A，泳道1)；在还原条件下，大部分的蛋白是分子量约10KDa的单体(图2A，泳道4)。

优化了半胱氨酸位点特异性聚乙二醇化条件。还原条件下的蛋白(单体)具有比二聚体更好的反应性。在聚乙二醇化之前将还原剂透析出去以避免干扰。聚乙二醇化剂本身是5kDa。为证实在SDS-PAGE中观察到的蛋白条带是聚乙二醇化蛋白，如图2B所示，对同一SDS-PAGE凝胶进行碘染色(碘将对PEG(聚乙二醇)链染色)，并如图3和4所示，通过MALDI-TOF质谱进一步证实了蛋白。

实施例9

基于细胞的cAMP测定蛋白：使用体外基于细胞的cAMP测定测试融合蛋白和聚乙二醇化蛋白肠降血糖素的作用。使用Lance-cAMP 384试剂盒(PerkinElmer，Inc.)。使用GLP-1和毒蜥外泌肽-4作为阳性对照。使用母体蛋白钙结合蛋白D9k作为阴性对照。实验表明如具有约20nM的IC₅₀(IC₅₀毒蜥外泌肽4～1nM，GLP-1肽IC₅₀：～4nM)的化学合成的肽GLP-1和毒蜥外泌肽-4一样，如图9所示，工程蛋白CalGLP可以以剂量依赖的方式增加大鼠胰岛素瘤RINm5F细胞的细胞内cAMP水平。然而，即使在约200μM的浓度，单独的野生型人钙结合蛋白D9k不能增加细胞的细胞内cAMP水平，这表明融合蛋白的反应性是由于包括GLP-1而不是宿主蛋白本身。这些实验表明由将GLP-1插入宿主蛋白引起的结构变化没有消除GLP-1识别并活化GLP-1受体的能力。

实施例10

10kDa和20kDa的聚乙二醇化蛋白具有相似的刺激β细胞的细胞内cAMP的活性。通过实施例3中所述的方法用10kDa和20kDa的PEG对蛋白进行聚乙二醇化。在大鼠胰岛素瘤β细胞RINm5F中检验聚乙二醇化蛋白和未聚乙二醇化蛋白在刺激cAMP产生中的作用。使用商业化cAMP试剂盒(PerkinElmer)分析cAMP产生。如图16所示，明显的是10kDa和20kDa聚乙二醇化蛋白具有与未聚乙二醇化蛋白的活性相当的活性。

实施例11

蛋白血清稳定性测试：在37℃下以1∶1的比例将融合蛋白和聚乙二醇化蛋白与小鼠血清一起孵育1小时、3小时和过夜。然后使用SDS-PAGE分析蛋白稳定性。如图5所示，即使孵育24小时之后，融合蛋白没有表现出降解；然而，约50％百分比的聚乙二醇化蛋白在24小时之后降解，但在孵育1小时和3小时之后没有降解。聚乙二醇化蛋白的降解更可能归因于由延长的37℃孵育引起的聚乙二醇化试剂的脱离(这种脱离可能因非还原条件下的氧化所致)而不是血清蛋白酶消化。

实施例12

融合蛋白的稳定性：将融合蛋白Cal.GLP与75％人血清孵育某时间过程(多达48小时)。然后通过SDS-PAGE分析蛋白并用考马斯亮蓝染色。如图7所示，蛋白在与人血清孵育48小时之后保持完整是清楚的。融合蛋白在不同pH条件(pH 3、5、7、9、10)下的NMR和荧光光谱分析表明该蛋白在大范围的pH条件下保持折叠(图8)是蛋白在例如pH 3、7和10下的荧光光谱)，表明对pH变性的强的抗性。

实施例13

从细菌大肠杆菌中大规模表达和纯化融合蛋白：通过用GLP-1序列替换钙结合蛋白D9k的C-末端α-螺旋而工程化融合蛋白(如图6所示)。为大量产生融合蛋白，检验了不包括亲和层析的纯化程序。

在煮沸10分钟后，蛋白保持完整和折叠。该性质致使简化的一步离子交换柱层析蛋白纯化程序。将细菌裂解物煮沸10分钟。因为通过煮沸变性，大部分细菌蛋白沉淀下来。融合蛋白留在上清液中。然后通过离子交换柱进一步纯化蛋白。每升细菌培养物获得约30-50mg纯化的融合蛋白。

实施例14

融合蛋白结合GLP-R表达细胞：为检验所开发的蛋白是否确实与GLP-1R相互作用，检验了融合蛋白与两个细胞系RINm5F和CHO细胞的结合。GLP-1R在RINm5F中表达而不在CHO细胞中表达是众所周知的。将RINm5F和CHO细胞都与融合蛋白Cal.GLP(10μM)或钙结合蛋白D9k(50μM)在37℃下孵育30分钟。充分洗涤后，固定细胞并使用针对母体蛋白钙结合蛋白D9k的兔多克隆抗体进行免疫染色分析。Cal.GLP结合RINm5F细胞而不结合CHO细胞，而钙结合蛋白不结合任何一种细胞(图10)。结果表明在基于细胞的测定中，所开发的蛋白的确与GLP-1R相互作用。用RINm5F细胞和胰腺β细胞系(αTC1)进行相似的结合分析。Cal.GLP结合RINm5F而不结合αTC1细胞，表明Cal.GLP与β细胞特异性地相互作用。

实施例15

在糖尿病小鼠中融合蛋白显示出降低血糖的高且持久的活性：测试所开发的蛋白药物以确定其在糖尿病受治疗者体内是否具有降低血糖的体内能力。使用糖尿病小鼠(BKS.Cg-Lepr^db/db，The Jackson Laboratory)作为受试对象。将一组六只动物首先禁食6小时。禁食后，给动物喂食30分钟。喂食后，通过以25纳摩尔/kg的剂量腹腔注射施用蛋白药物。施用药物5小时后，再给动物喂食30分钟。在施用药物后的不同的时间点采集血液样品。使用市售试剂盒测量血液样品中的葡萄糖浓度。

在4小时的时间过程内血糖水平下降约215mg/dl是明显的。施用药物后6小时和再喂食后一小时，动物的血糖水平略微增加(图11)。对照组中，经相同剂量的母体蛋白钙结合蛋白治疗的动物的血糖水平稍微减少(图11)。作为对比，还用相同剂量的毒蜥外泌肽-4治疗动物。血糖水平非常迅速(30分钟之内)地减少(下降约189mg/dl)是明显的。毒蜥外泌肽-4治疗的动物的血糖在施用药物后4小时经历了明显增加并在药物治疗6小时和再喂食后一小时几乎达到之前相同的血糖水平(图11)。实验表明融合药物在降低糖尿病受治疗者的血糖方面是有效的。用融合蛋白药物治疗产生与毒蜥外泌肽-4相比更大的血糖下降和明显更长的有效时间。

实施例16

融合蛋白在降低血糖和刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌方面是有效的：还在糖尿病小鼠中检验了所开发的药物对降低血糖和刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌的作用。将动物首先禁食6小时。通过腹腔注射对一组八只糖尿病小鼠共施用蛋白药物(25纳摩尔/kg)和葡萄糖(15毫摩尔/kg)。在不同时间点测定血糖和胰岛素水平。作为对照，对不同组的糖尿病小鼠单独施用相同剂量的葡萄糖和共施用相同剂量的葡萄糖与母体蛋白钙结合蛋白。作为对比，还用相同剂量的毒蜥外泌肽-4进行了相同的测试。

在将葡萄糖和药物施用到糖尿病小鼠中后，毒蜥外泌肽-4和所开发的蛋白药物的施用都导致明显的血糖降低，而施用母体蛋白则没有。如在以上测试中观察到的，与使用毒蜥外泌肽-4治疗相比，施用蛋白药物导致在更长的持续时间内更大的葡萄糖降低(图12)。

观察到毒蜥外泌肽-4治疗时即时的胰岛素增加和葡萄糖减少(30分钟之内)，而对于用所开发的蛋白药物治疗的小鼠来讲，胰岛素增加和葡萄糖减少的作用持续近2小时(图12)。

实施例17

工程蛋白在降低血糖方面是有效的。在糖尿病小鼠中检验了所开发的药物和聚乙二醇化药物对降低血糖的作用。将动物禁食6小时。禁食后，对动物喂食30分钟并随后立即抽血。通过腹腔注射施用药物(图中所示为25纳摩尔/kg)。然后将动物放回笼子。在施用药物后的第30、120、240分钟抽取血液样品(～20μl)。测量血液样品中的葡萄糖。

在糖尿病小鼠中，施用聚乙二醇化和未聚乙二醇化的蛋白都导致明显的血糖降低。聚乙二醇化蛋白显示出延迟的作用(图17)。

实施例18

聚乙二醇化的工程蛋白在降低血糖方面具有长久有效性。在糖尿病小鼠中检验了所开发的药物和聚乙二醇化药物在长时间过程中对降低血糖的作用。在零时通过腹腔注射施用药物(图中所示为25纳摩尔/kg)。将动物禁食6小时。禁食之后，禁食后立即抽取血液样品(～20μl)。然后对动物喂食30分钟并随后立即抽血。然后将动物放回笼子。在所示时间点重复相同的步骤。测量血液样品中的葡萄糖。

施用一次剂量的20kDa聚乙二醇化蛋白的作用在糖尿病小鼠中持续至少24小时，而施用一次剂量的10kDa聚乙二醇化蛋白的作用在糖尿病小鼠中持续约7-9小时(图18)。

实施例19

工程蛋白在降低血糖方面具有长期作用。检验了四周疗程中所开发的药物和聚乙二醇化药物在糖尿病小鼠中对降低血糖的作用。在每天的相同时间2:00pm持续4周通过腹腔注射施用药物(图中所示为25纳摩尔/kg)。将动物放回笼子。每天在相同时间5:00pm抽取血液样品(～20μl)持续4周。测量血液样品中的葡萄糖。绘制血糖水平对天数的图。每日在抽血前称量动物体重。绘制每组六只小鼠的平均体重对天数的图。

每日施用药物促使降低并稳定糖尿病小鼠的血糖水平。所开发的药物在降低和稳定血糖方面表现出更强的作用。不像用毒蜥外泌肽-4治疗，用所研发药物治疗没有导致明显的重量增加或减轻(图19)。

实施例20

融合蛋白结合Gd³⁺并显示出高的R1和R2弛豫性能：为确保融合蛋白可用作MRI造影剂，使用众所周知的方法测定了融合蛋白的Gd³⁺结合特性和R1/R2弛豫性能。金属结合分析表明Cal.GLP具有类似于母体蛋白钙结合蛋白的Gd³⁺结合能力和金属选择性的Gd³⁺结合能力和金属选择性(表1)。使用应力松弛计在1.4T下测量Gd-Cal.GLP和Gd-钙结合蛋白的R1和R2弛豫性能表明Gd-Cal.GLP具有略微高于钙结合蛋白的R1和R2弛豫性能的R1和R2弛豫性能(表2)。Gd³⁺结合分析和弛豫性能测量表明所开发的蛋白Cal.GLP可用作具有高的造影增强能力的MRI造影剂。

表2：融合蛋白的金属结合亲和力和弛豫性能

	LgKa Gd3+	LgKa Ca2+	R1 mM-1S-1	R2 mM-1S-1
					钙结合蛋白	12.6	＜2.3	6.58	9.07
Cal.GLP/Q26D	13.5	＜2.1	20	30
					DTPA	22.5	10.8	3.8	7.1

实施例21

蛋白药物的毒性：之前分析了母体蛋白CAl.CD2的毒性，且在小鼠中无毒性。为确保新型设计(GLP-1的加入和Cy5.5的轭合)不导致药物毒性的改变，使用健康的CD-1小鼠重新检验了GLP-1R靶蛋白药物的毒性。用一次剂量的100μl药物(6mM)注射一组小鼠(每组7只)并用两次剂量的药物(100μl药物(6mM))注射另一组动物，其中两次注射之间的时间间隔为8小时。将动物放回其笼子14天。在14只受试小鼠中，无小鼠死亡。所有动物表现正常(无饮食习惯变化。没有异常的重量增加或减轻。没有异常的体毛外观)。在注射剂量(几乎是MRI实验中所用剂量的2倍)下融合蛋白药物不具有急性毒性。

实施例22

免疫原性：表征了母体蛋白CA1.CD2(没有添加GLP-1)在兔中的免疫反应。在有/无佐剂存在下，将聚乙二醇化(PEG-40)和未聚乙二醇化的CA1.CD2注射到兔体内，之后重复注射三次。每次注射后7天收集来自被注射的兔的血清样品。然后使用血清通过抗原蛋白的免疫印迹分析兔血清样品中的抗体(图15)。未混合抗原与佐剂时，未观察到明显的免疫反应。蛋白的聚乙二醇化进一步极大地减少了兔体内针对聚乙二醇化和未聚乙二醇化的CA1.CD2的抗体产生。注射四次未聚乙二醇化的抗原后，仅有相当弱的抗体产生。融合蛋白药物未在兔体内产生强烈的免疫反应。

实施例23

使用所开发的蛋白药物通过靶向GLP-1R对胰β细胞成像：我们已制备了特异性结合GLP-1R的蛋白药物。该蛋白带有合理融合的高亲和力Gd³⁺结合位点。我们的分析表明所开发的蛋白药物显示出非常高的R1和R2弛豫性能，提供了作为有效的GLP-1R靶向MRI造影剂的潜力。携带HER2靶向部分的相似宿主蛋白通过靶向癌症标志HER2已成功用于分子MR成像。因此，我们推断我们应该能够使用我们制备的GLP-1R靶向蛋白通过靶向GLP-1R用于胰β细胞的MR成像。在研发用于糖尿病的治疗药物时，特别是基于细胞和胰岛的治疗时，β细胞成像的能力是关键的。目前不能获得允许β细胞成像的成像工具，尤其是MR成像工具。

我们使用我们所开发的蛋白Gd-Cal.GLP/Q26D变体作为造影剂用CD-1小鼠进行了成像研究。体内成像实验测试了我们开发的药物是否可以通过靶向GLP-1R对小鼠的胰成像。

在此采用与我们之前的研究中所述的相同的MR成像方法对CD-1小鼠成像(Yang等人，(2008)J.Am.Chem.Soc.130：9260-9267)。我们拍摄了具有大致相同的年龄和重量的每组六只小鼠。动物被注射(尾静脉静脉注射)80μl的Gd-Cal.GLP/Q26D变体(5mM)。施用Gd-Cal.GLP/Q26DMR之后在所示时间记录MR成像。将使用带有专门制作的小鼠线圈的Varian Unity 4.7T MR扫描仪进行全部MRI扫描。在MR扫描期间，小鼠处于1.5％异氟烷的麻醉下并用加热垫保持温暖。通过T1和T2加权的快速自旋回波序列(TR＝2s，TE＝0.022s，且ESP＝0.01s，具有3×3cm的视野、256×256的矩阵和1mm的层厚度)或3D梯度回波序列(TR＝0.04s，TE＝0.029s，视野为8X4X2.8cm，矩阵为384X192X64)获得MR图像。施用Gd-Cal.GLP/Q26D之后，在不同时间点(图中所示)测量胰处的MR图像强度。明显的是，施用造影剂导致胰处的强的造影增强(图20和21)。施用Gd-CalGLP之后，在不同时间点(图21中所示)测量胰处的MR图像强度。将这些强度标准化到背景强度。误差线是8个不同的ROI的测量值的标准差。

为进一步证明胰处的MRI造影增强，注射造影剂或缓冲盐水后24小时将小鼠的胰收集在1.5ml管中。通过快速自旋回波和梯度回波序列用与小鼠MR成像相同的参数扫描收集到的胰。明显地，与来自施用缓冲盐水的小鼠的胰的造影增强相比，来自施用造影剂的小鼠的胰脏存在强的造影增强(图22A和B)。将这些强度标准化到背景强度。误差线是8个不同的ROI的测量值的标准差。

实施例24

图13A是一系列的数码图像，示出了用阴性细胞系MDA-MB-231和阳性细胞系SKOV-3接种的裸鼠。每个点的细胞数为约5x10⁶。使用KodakNIR体内FX-pro动物成像系统在注射之后21小时显示经注射双标记造影剂Gd-CA1-Affi-Cy5.5后的右侧阳性肿瘤的特异性结合。

图13B示出了施用造影剂之前和之后35min和21hr获得的快速自旋回波在4.7T下的肿瘤小鼠的横向MR数码图像。

图13C是示出通过Image J分析的借助于本公开内容的造影剂的实施方式的阳性肿瘤处的强度增强的图。

图14是示出对携带有肿瘤的小鼠的MRI成像之后来自不同器官的组织的NIR成像的数码图像。NT，阴性肿瘤；K，肾；L，肝脏；SP，脾；PT，阳性肿瘤。

Claims (48)

1.一种融合蛋白，包括第一肽，所述第一肽的特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接，其中所述蛋白比单独的所述第一肽更稳定。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，还包括与其连接的可检测标记。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，或其保守变体，且所述第二肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ IDNO.：1)，且所述第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)。

9.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一肽替换所述第二肽的区域。

10.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一肽为受体的肽配体，且其中当所述融合蛋白结合所述受体时，所述融合蛋白调控所述受体的活性。

11.一种调控动物或人细胞葡萄糖代谢的方法，包括：

使动物或人细胞与包括融合蛋白的组合物接触，所述融合蛋白包括与第二肽连接的第一肽，其中所述蛋白比单独的所述第一肽更稳定，且其中：

所述第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其变体；

所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体；且

由此所述融合蛋白选择性地结合靶细胞的GLP-1受体，从而调控所述受体的活性和细胞的葡萄糖代谢。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，或其保守变体，且所述第二肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述融合蛋白还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶细胞为分离的细胞。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶细胞位于受治疗动物或人的组织内，从而减少受治疗者的血浆葡萄糖。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述受治疗动物或人接受有效剂量的还包括药学可接受的载体的所述组合物。

17.一种成像探针，其中所述探针为融合蛋白，所述融合蛋白包括：

第一肽，所述第一肽的特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接，其中所述蛋白比单独的所述第一肽更稳定；和

可检测标记。

18.根据权利要求17所述的成像探针，其中所述标记是通过荧光、MRI或PET扫描可检测的。

19.根据权利要求17所述的成像探针，其中所述标记选自由染料、荧光染料、放射性标记和金属离子组成的组。

20.根据权利要求17所述的成像探针，其中所述标记与所述融合蛋白的第二肽连接。

21.根据权利要求17所述的成像探针，其中所述融合蛋白与所述靶细胞结合的位点是所述细胞表面上的受体。

22.根据权利要求17所述的成像探针，其中所述融合蛋白的第一肽是所述靶细胞的融合蛋白结合位点的配体。

23.根据权利要求17所述的成像探针，其中所述融合蛋白的第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

24.根据权利要求23所述的成像探针，其中所述第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，或其保守变体，且所述第二肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

25.根据权利要求24所述的成像探针，其中所述融合蛋白还包括与其轭合的至少一个聚乙烯部分。

26.根据权利要求24所述的成像探针，其中所述融合蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ IDNO.：1)，所述第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，且所述标记为钆(Gd+)，由此所述标记是通过MRI可检测的，且其中所述融合蛋白结合位点是胰腺细胞的GLP-1受体。

27.一种增强成像对比度的方法，包括：

(i)向靶细胞递送包含融合蛋白的成像探针，其中所述融合探针包括：

第一肽，所述第一肽的特征是与所述靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接，其中所述蛋白比单独的所述第一肽更稳定；和

可检测标记；

(ii)检测来自所述标记的信号，从而确定所述靶细胞的融合蛋白结合位点的存在。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶细胞位于受治疗动物或人的组织内，且其中将所述成像探针作为药学可接受的组合物对所述受治疗动物或人施用。

29.根据权利要求28所述的方法，所述药学可接受的组合物还包括药学可接受的载体。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述标记是通过荧光、MRI或PET扫描可检测的。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述标记选自由染料、荧光染料、放射性标记和金属离子组成的组。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述标记连接到所述融合蛋白的第二肽。

33.根据权利要求27所述的方法，其中所述融合蛋白结合的位点是所述靶细胞表面上的受体。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述融合蛋白的第一肽是所述靶细胞的融合蛋白结合位点的配体。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述融合蛋白的第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

36.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，或其保守变体，且所述第二肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

38.根据权利要求27所述的方法，其中所述融合蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFT SDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ IDNO.：1)，所述第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，且所述标记为钆(Gd+)，由此所述标记是通过MRI可检测的，且其中所述融合蛋白结合位点是胰腺细胞的GLP-1受体。

39.一种工程蛋白，包括第一肽，所述第一肽的特征是与靶细胞的位点选择性结合并与第二肽连接，其中所述蛋白比单独的所述第一肽更稳定。

40.根据权利要求39所述的工程蛋白，还包括与其连接的可检测标记。

41.根据权利要求40所述的工程蛋白，其中所述第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(7-36)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)或其保守变体。

42.根据权利要求40所述的工程蛋白，其中所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

43.根据权利要求40所述的工程蛋白，其中所述融合蛋白的第一肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(9-36)且所述第二肽为钙结合蛋白D9k的部分、其氨基酸序列变体或其修饰变体。

44.根据权利要求43所述的工程蛋白，其中所述第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO.：1)，或其保守变体，且所述第二肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：3)，MSTKKSPCELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：4)，MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDDLSKDELKLLIQAEFPCLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：17)和其保守变体。

45.根据权利要求44所述的工程蛋白，其中所述融合蛋白还包括与其轭合的至少一个聚乙二醇部分。

46.根据权利要求45所述的工程蛋白，其中所述融合蛋白的第一肽具有氨基酸序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ IDNO.：1)，且所述第二肽具有氨基酸序列MSTKKSPEELKRIFEKYAAKEGDPDQLSKDELKLLIQAEFPSLLKGPNTLDDLFQELDKNG(SEQ ID NO.：2)。

47.根据权利要求40所述的工程蛋白，其中所述第一肽替换所述第二肽的区域。

48.根据权利要求40所述的工程蛋白，其中所述第一肽为受体的肽配体，且其中当所述融合蛋白结合所述受体时，所述融合蛋白调控所述受体的活性。

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